Curso de Inmunologa General Laboratorio

Semestre 2016-1

EJERCICIO EXPERIMENTAL 5
Doble difusin en placa Ouchterlony
OBJETIVO
Conocer la identidad antignica de un suero problema.
CMO?
Mediante el mtodo de doble difusin en placas descrito por Ochterlony, que
consiste en poner en pozos hechos en una placa de gel de agar, el antgeno
(Ag) y el anticuerpo (Ab), de tal forma que ambos difunden radialmente y al
encontrarse en concentraciones equivalentes forman una o varias bandas de
precipitacin dependiendo del nmero de sistemas AgAc presentes.
MATERIALES
1 caja Petri de 60 x 15 mm.
1 nivelador
1 placa de vidrio
1 caja petri (Para hacer la cmara hmeda)
1 micropipeta.
1 mechero
1 vaso de pp 250mL
1 horadador
7 mL de solucin de agar 1.5% en PBS. (Tubo con tapa color negro)
1 mL de solucin de agar 0.3% en PBS. Sellador (Tubo con tapa color
naranja)
Suero de conejo anti-suero humano. (Tubos eppendorf color Rojo).
Suero humano (Tubos eppendorf color Azul).
Albmina Srica Humana purificada (ASH). (Tubos eppendorf color Verde).
Fraccin gamma purificada de suero humano (tubos eppendorf color
Amarillo).
Suero problema (tubos eppendorf con el nmero del equipo correspondiente)
Introduccin
Doble difusin en placa (Ouchterlony)
Las macromolculas pueden difundir libremente a travs de geles. Esta
difusin esta limitada por la concentracin del gel y el peso molecular de la
molcula que difundir. Empleando soportes adecuados, en especial aquellos
que como base tienen agar disuelto en soluciones amortiguadoras, los
antgenos y/o anticuerpos pueden migrar y al encontrarse en concentraciones
equivalentes forman una o varias bandas de precipitacin dependiendo del
nmero de sistemas AgAc presentes.
Los precipitados que se originan, se visualizan como ntidas bandas de
precipitacin, que permanecern estables mientras un mayor aflujo de
molculas de los reactivos no provoquen su redisolucin. Todo esto es una
consecuencia de las leyes generales de la difusin, que establecen que la

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Introduccin a la inmunologa celular
Semestre 2013-I
distancia a la que una sustancia difunde est en relacin directa con su
concentracin y en relacin inversa con su peso molecular.
Originariamente Ochterlony describi, de acuerdo a este hecho tres tipos de
reacciones que fueron denominadas como reacciones de identidad, no
identidad e identidad parcial. En el primer caso, los dos sistemas reactivos se
unen en una nica banda de precipitacin. Si los sistemas no son iguales
(reacciones de no identidad), cada uno reacciona independientemente
originando bandas de precipitacin que se cruzan. Cuando uno de los
antgenos analizados tiene algn componente capaz de dar una reaccin
cruzada con el anticuerpo elaborado por el otro (identidad parcial), las bandas
de precipitacin de ambos sistemas se unen parcialmente en una banda,
apareciendo una prolongacin que correspondiente al antgeno que se emple
para la obtencin del anti-suero. Esto indica que en este antgeno hay
componentes antignicos no compartidos con el restante.

METODOLOGA
1. Fundir en un bao Maria las dos soluciones de agar (1.5 y 0.3%)
2. Colocar una caja petri de 15 X 60 mm sobre una superficie plana (placa de
vidrio), nivelada.
3. Verter 4 mL de la solucin 1.5% de agar en PBS en un caja petri de 15 X 60
mm.
4. Permitir que solidifique el agar a temperatura ambiente. (Se puede colocar
en el refrigerador durante 5 minutos).
5. Con ayuda del horadador hacer seis perforaciones en forma de roseta: uno
central y 5 perifricos, usando un papel con el esquema de las perforaciones
debajo de la caja.
Es importante que las perforaciones se encuentren de 6-7 mm del centro y
distribuidas de manera equidistante
Extraer el gel de agar de los cortes con ayuda de una aguja (25G x16mm).

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7. Sellar con la solucin de agar al 0.3 % en PBS, formando una pelcula
delgada sobre las seis perforaciones realizadas.
8. Permitir que solidifique el agar a temperatura ambiente.
9. Colocar 20 L aproximadamente de cada uno de los antgenos o del suero
anti-Suero humano de acuerdo a la siguiente relacin.
ID. MUESTRA
1 Suero de conejo, Anti- suero humano
2 Suero de conejo
3 Suero humano
4. Suero de ratn
5 Albmina Srica Humana (ASH)
6 Muestra problema
10. Introducir la caja petri en la cmara hmeda, cerrarla e incubar 24 horas a
temperatura ambiente. (La cmara hmeda se realizara con un trozo de papel
filtro, humedecido en una caja petri de 20X80 mm.
11. Realizar la lectura e identificar las bandas de identidad, no identidad e
identidad parcial.