1 Guia de Practicas Microbiologia Ucsur Siever Final 2

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria - 2016
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLGICAS

CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNICA
GUIA DE PRCTICA
MICROBIOLOGIA VETERINARIA
MV. SIEVER MIGUEL MORALES CAUTI

Profesor Responsable
Morales-Cauti, Siever
Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria
2016
INDICE
GRUPOS DE RIESGO ....................................................................................................................... 6
PRCTICA N 1 ................................................................................................................................. 10
BIOSEGURIDAD, RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE
LABORATORIO
10
DESCONTAMINACIN, LIMPIEZA, DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN 14
PRCTICA N 2................................................................................................................................. 18
TOMA DE MUESTRAS .................................................................................................................... 18
PRACTICA N3 ................................................................................................................................. 24
MEDIOS DE CULTIVO Y TIPOS DE SIEMBRA ..................................................................... 24
PRCTICA N 4 y 5 .......................................................................................................................... 32
TCNICAS DE COLORACIN BACTERIANA. RECONOCIMIENTO DE
ESTRUCTURAS BACTERIANAS
32
PRCTICA N 6................................................................................................................................. 40
PRINCIPALES MTODOS Y TCNICAS UTILIZADOS EN LA
IDENTIFICACIN MICROBIANA ..................................................................................................
PRACTICA N 7
ACCIN DE AGENTES ANTIMICROBIANOS
53
PRCTICA N 8................................................................................................................................. 56
MTODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN, A PARTIR DE MUESTRAS
CLNICAS, DE COCOS GRAMPOSITIVOS.
PRCTICA N 9
MTODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACILOS
GRAMPOSITIVOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS
58
PRACTICA N 10 y 11 ....................................................................................................................... 61
MTODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN, A PARTIR DE MUESTRAS
CLNICAS, DE BACILOS GRAMNEGATIVOS.
PRCTICA N 12 ............................................................................................................................... 64
MTODOS DE DIAGNOSTICO
Brucella abortus, B. suis, B. melitensis
PRCTICA N 13 ............................................................................................................................... 67
TCNICA DE MICROAGLUTINACION PARA DIAGNSTICO DE Leptospira sp. 67
PRACTICA N 14 y 15 ...................................................................................................................... 70
MORFOLOGA Y TIPOS DE REPRODUCCIN

PRCTICA 16. ..................................................................................................................................... 76
IDENTIFICACIN DE LEVADURAS
PRCTICA 17. ..................................................................................................................................... 79
TCNICAS PARA CULTIVOS CELULARES
PRCTICA 18. .................................................................................................................................... 82
INOCULACIN DE HUEVOS EMBRIONADOS Y SU COSECHA
PRCTICA N 19 ............................................................................................................................... 87
PRUEBAS INMUNOHISTOQUMICAS
BIBLIOGRAFA
91
GLOSARIO.......................................................................................................................................... 93
ANEXO ................................................................................................................................................. 94
Agradecimiento especial por la colaboracin en la re-edicin de la presente gua de

prcticas a las profesoras: Kathya Espinoza Ramrez, y Helen Dellepiane Gil.
LISTA DE FIGURAS
fig. 1. Hisopado nasal en cerdo ....................................... 19

fig. 2.Hisopado vaginal en alpaca. .................................... 19
fig. 3.Raspado de piel. ................... Error! Marcador no definido.
fig. 4 y fig. 5. Tricotoma .......................................... 20
fig. 6. Envo y transporte de muestras clnicas. ...................... 21
fig. 7 y fig. 8. Medio de transporte y Envases estriles para colocacin
de muestras. .......................................................... 22
fig. 9. Cultivo directo a partir de hisopados. ........................ 22
fig. 10. Medio Lquido ................................................ 24
fig. 11. Medios Slido : Agar sangre, Agar Trypticasa, Agar Mac Conkey
.......................................... Error! Marcador no definido.
fig. 12. Agar sangre: Crecimiento de bacterias hemolticas beta. ...... 27
fig. 13. Agar Sangre: Crecimiento de bacterias con hemolisis gamma. ... 27
fig. 14 y fig. 15 Agar Mac Conkey: Bacterias fermentadoras y no
fermentadora de lactosa ............................................... 28
fig. 16. Prueba de Oxidasa ............................................ 43
fig. 17. Prueba TSI . ................................................. 45
fig. 18. Prueba del Indol ............................................. 46
fig. 19. SIM . ........................................................ 47
fig. 20. Prueba de Citrato. ........................................... 48
fig. 21. Prueba de ureasa ............................................. 49
fig. 22. Prueba LIA: . ................................................ 50
fig. 23. Antibiograma ................................................. 54
fig. 24. Muestras de leche: diferentes caractersticas fsicas ........ 56
fig. 25.Bacillus Anthracis: Presencia de esporas ...................... 58
fig. 26. Toma de muestra: Exposicin de la vena marginal .............. 58
fig. 27.Toma de muestra: Hisopado ..................................... 59
fig. 28. Agar Sangre: Crecimiento de colonia tipo cabeza de medusa .... 59
fig. 29. Vacuna contra ntrax ......................................... 60
fig. 30. Enterobacterias ,coloracin GRAM ............................. 63
fig. 31. Testculo ovino: Superior: Normal Inf: Epididimitis y orquitis
B. ovis ............................................................... 64
fig. 32. Prueba Rosa de Bengala: Materiales ........................... 65
fig. 33. Sueros de ovino en viales plstico. .......................... 65
fig. 34. Prueba Rosa de Bengala ...................................... 66
fig. 35. Reacciones positivas a la prueba Rosa de Bengala. ............ 66
fig. 36. Aspergillus .................................................. 70
fig. 37. Penicilium y Aspergillus. .................................... 72

fig.
fig.
fig.
fig.
fig.
fig.
fig.
fig.
fig.
fig.
fig.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
Macroconidias de M. canis .................................... 73

Algunas especies de Microsporum y Trichophytom. .............. 73
Aspergiullus spp. : Caractersticas microscpicas ............ 75
CHROM Agar: Crecimiento de diferentes especies de Candida. ... 78
Huevos embrionados: Materiales ............................... 82
Huevos embrionados: Uso de ovoscopio ......................... 82
Estructura del huevo embrionado .............................. 83
Va de inoculacin en saco vitelino .......................... 84
Va de inoculacin en cavidad alantoidea ..................... 85
Va de inoculacin Corion Alantoidea ......................... 86
Tcnica de Inmunofluorescencia .............................. 89
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema
Esquema
Esquema
Esquema
Esquema
Esquema
Esquema
Esquema
1. Filtracin ................................................ 14
2. Flujo laminar ............................................. 15
3. Mtodos de Siembra: Por agotamiento ....................... 30
4. Siembra de medios slidos en tubos ........................ 30
5. Inoculacin de un tubo con caldo .......................... 30
6. Envoltura de una bacteria grampositiva .................... 34
7. Envoltura de bacteria gramnegativa ........................ 34
8. Esporas : Localizacin y morfologa de las esporas en
Bacillus sp. .......................................................... 37
Esquema 9. Sistema de identificacin bacteriano estandarizado ........ 52
Esquema 10. Procedimiento de la prueba de microaglutinacin .......... 68
Esquema 11. Hoja de trabajo de los controles y muestras en la prueba de
microaglutinacin para el diagnostico de Leptospira sp. ............... 69
Esquema 12. inmunofluorescencia indirecta ............................ 90
Esquema 13. Inmunofluorescencia directa .............................. 90
GRUPOS DE RIESGO
El trabajo con los microorganismos se clasifican segn cuatro

grupos de riesgo individual y comunitario, a saber:
Grupo de nivel de riesgo 1. (Riesgo individual y comunitario escaso o

nulo).
Grupo de riesgo constituido por microorganismos que tienen
pocas probabilidades de provocar enfermedades en humanos o en
animales.
Grupo de nivel de riesgo 2. (Riesgo individual moderado, riesgo
comunitario bajo).
Grupo de riesgo constituido por agentes patgenos que pueden
provocar enfermedades en humanos o en animales, pero que tiene
pocas probabilidades de entraar un riesgo grave para el personal
del laboratorio, la comunidad, los animales o el ambiente. La
exposicin en el laboratorio puede provocar una infeccin, pero
aplicando medidas eficaces de tratamiento y prevencin, el riesgo
de propagacin es limitado.
Grupo de nivel de riesgo 3. (Riesgo individual elevado, riesgo
comunitario moderado).
provocar enfermedades graves en humanos o en animales, con bajo
riesgo de propagarse en la comunidad. Se aplicar al diagnstico,
investigacin y produccin en el cual se trabaja con agentes que
pueden causar una enfermedad grave o potencialmente letal,
principalmente como resultado de la exposicin a aerosoles. Puede
disponerse o no de medidas eficaces de tratamiento y de prevencin.
Grupo de nivel de riesgo 4. (Riesgo individual y comunitario elevado).
provocar enfermedades graves en las personas o en los animales, con
alto riesgo de propagarse en la comunidad. No suele disponerse de
medidas eficaces de tratamiento y prevencin.
A su vez los tipos de actividades u operaciones que se pueden

realizar con los microorganismos se definen como:
A: Actividad que no multiplica ni disemina el microorganismo
B: Actividad que multiplica y/o disemina el microorganismo.

C: Trabajo con animales potencialmente infectados.

De la interrelacin entre las dos clasificaciones anteriores se
establece, para un listado de microorganismos, el nivel de
bioseguridad necesario entre los siguientes cuatro posibles:
Nivel de bioseguridad 1: Debe contemplar lo siguiente:
a) El trabajo es generalmente realizado sobre mesas abiertas y se usan
tcnicas microbiolgicas adecuadas.
b) No se requiere equipamiento de contencin ni diseo especial de
infraestructura.
c) El personal de laboratorio debe tener capacitacin continua y
supervisin de un profesional habilitado.
d) El personal debe usar indumentaria de proteccin adecuada.
Nivel de bioseguridad 2: Debe contemplar lo siguiente:
a) El personal de laboratorio debe tener entrenamiento especfico para
manipular agentes patgenos y estar supervisado por un profesional
habilitado.
b) El acceso al laboratorio debe estar restringido al personal
autorizado.
c) Se deben tomar precauciones extremas con elementos corto-punzantes.
d) Las operaciones generadoras de aerosoles potencialmente infecciosos
deben ser realizadas con equipamiento y/o procedimientos de
contencin fsica.
e) El personal debe usar indumentaria de proteccin adecuada.
Nivel de bioseguridad 3: (Laboratorios de contencin).
Se debe aplicar al diagnstico, investigacin y produccin cuando se
trabaja con agentes que puedan causar una enfermedad grave o
potencialmente letal, principalmente como resultado de la exposicin a
aerosoles. Debe contemplar lo siguiente:
a) La capacitacin debe ser especfica.
b) Todos los procesos que involucran manipulacin de este nivel de
material infeccioso deben ser realizados en cabinas de seguridad
biolgica.
c) El personal debe usar indumentaria de proteccin adecuada y
disponer de vestuario doble con ducha.
d) El laboratorio debe tener diseo e instalaciones adecuadas para la
contencin.
e) Es necesario el tratamiento de los efluentes lquidos.
f) Se debe usar filtracin absoluta HEPA del aire extrado y presin
negativa en el laboratorio.
Nivel de bioseguridad 4:
contemplar lo siguiente:
(Laboratorio
de
mxima
contencin)
Debe

a) El acceso al laboratorio debe ser estrictamente controlado (ingreso
y egreso documentados) y debe estar aislado del resto de las
instalaciones.
b) Dentro de las reas todas las actividades deben estar confinadas a
gabinetes de seguridad biolgica Clase 3 o gabinetes de seguridad
biolgica Clase 2 con traje presurizado para el operador.
c) Se debe realizar el tratamiento in situ de los efluentes.
d) Se debe usar filtracin absoluta doble HEPA del aire extrado, y
aplicar presin negativa en el laboratorio.
Cada nivel de bioseguridad incluye las medidas del nivel anterior.
La norma aclara que en el caso que durante una investigacin
microbiolgica se produzca evidencia de la presencia de un microorganismo
que requiera un nivel de bioseguridad superior al del mbito donde se
efecta el trabajo, toda manipulacin posterior con dicho microorganismo
se realizar nicamente en un mbito de nivel de bioseguridad
correspondiente o se proceder a su destruccin de acuerdo con las
reglamentaciones legales vigentes.
PRCTICA N 1
BIOSEGURIDAD, RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO

BIOSEGURIDAD: Es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr
actitudes y conductas que disminuyan el riesgo del trabajador de la salud
de adquirir infecciones en el medio laboral. Son todos aquellos
principios, normas y estrategias de disminucin de riesgos.
Seal de
peligro
biolgico
Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:

A) Universalidad: Todo el personal debe seguir las precauciones
estndares rutinariamente para prevenir la exposicin de la piel y de las
membranas mucosas, en todas las situaciones que puedan dar origen a
accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro
fluido corporal del paciente (muestras orgnicas), cultivos bacterianos
vivos, etc.
B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposicin directa

a sangre y otros fluidos orgnicos potencialmente contaminantes, mediante
la utilizacin de materiales adecuados que se interpongan al contacto de
los mismos. La utilizacin de barreras (Ej. Guantes, mascarillas) no
evitan los accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen las
consecuencias de dicho accidente.
C) Medios de eliminacin de material contaminado: Comprende el conjunto de

dispositivos y procedimientos adecuados a travs de los cuales los
materiales utilizados en la obtencin de muestras y procesamiento de las
mismas, son depositados y eliminados sin riesgo.
10

RECOMENDACIONES A SEGUIR EN EL LABORATORIO:
1.
Proteccin de la piel: Usar guantes limpios, no necesariamente

estriles, previo al contacto con: sangre, fluidos corporales,
secreciones, excreciones, mucosas y materiales contaminados. Para
procedimientos invasivos se deben usar guantes de ltex, estriles
y luego descartarlos.
2.
Proteccin ocular: La proteccin ocular y el uso de mascarillas

tiene como objetivo proteger membranas mucosas (ojos, nariz y boca)
durante procedimientos que puedan generar aerosoles y salpicaduras
de sangre, de fluidos corporales, secreciones y excreciones. Los
lentes y mascarillas deben ser amplios y ajustados al rostro para
cumplir eficazmente con la proteccin
3.
Proteccin corporal: A travs del mandil blanco de manga larga.
4.
No comer, beber, ni fumar en el laboratorio
5.
No manipular el sistema elctrico con las manos hmedas.
6.
Las mesas de trabajo deben estar desinfectadas antes de inicio y

trmino de la prctica. Para ello, se puede emplear amonio
cuaternario, bicloruro de mercurio al 1%, formol al 2%, cido
fnico al 5%, alcohol yodado, etc. Las cuales son soluciones
desinfectantes no corrosivas para la piel.
7.
Ser cuidadosos en el manejo de los equipos y material de trabajo.
8.
Coordinar permanentemente con el responsable de la prctica el

manejo de material infeccioso.
9.
Antes de realizar observaciones en el microscopio, analizar

previamente las condiciones en que se encuentra el microscopio
(espejo, diafragma abierto o cerrado, etc.) Para la observacin,
usar el objetivo de 100 x con aceite de inmersin. Al finalizar las
observaciones limpiar el objetivo de 100x con papel lente.
10. Revisar que los grifos queden cerrados.

11. Tomar atencin de las zonas protegidas para casos de sismos.
RECOMENDACIONES PARA ALUMNOS:

1.-
La asistencia a las prcticas es obligatoria: si pierde una prctica

no tendr oportunidad de repetirla.
2.-
El estudiante ingresar al saln de prctica llevando consigo,

mandil blanco y el manual de prcticas.
3.-
El alumno deber leer con anticipacin la prctica correspondiente a

la fecha, a fin de verificar el material necesario.
4.-
Los alumnos se agruparn en las mesas de trabajo y realizarn las

experiencias bajo la direccin de un profesor instructor.
5.-
No efectu las experiencias mecnicamente, sino entendiendo el

fundamento de las mismas.
6.-
No se debe comer, fumar ni beber agua de los grifos.
7.-
Debe cuidarse el equipo y material, cumpliendo las instrucciones del

profesor para evitar accidentes y rotura de material.
8.-
Cualquier accidente como rotura de tubos con medios o derrame de

alguno de los cultivos deber comunicarse a la persona responsable
de la prctica, para que se tomen las medidas adecuadas.
9.-
Durante la prctica anotar todas las ocurrencias

las tcnicas utilizadas.
10.-
Las mesas de trabajo deben mantenerse libres de material innecesario

(prendas de vestir, libros y otros).
11.-
Etiquetar el material cuando sea necesario para que pueda ser

fcilmente identificado.
12.-
Tener especial cuidado cuando maneje material contaminado

descartarlo en los recipientes que se colocarn para este fin.
13.-
Al finalizar la prctica deber ordenar el material utilizado sobre

la mesa de trabajo y, cuidar que los grifos de agua estn cerrados
as como las llaves de gas.
en el manejo de
12

EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO
Para trabajar en las prcticas de microbiologa, se requiere de

equipos y materiales especiales, as como de un comportamiento y normas
estrictas.
OBJETIVO:
Reconocer el material y la utilidad de los mismos en el laboratorio.
EQUIPOS:
Microscopio ptico, Flujo laminar, Refrigeradoras, Congeladora, Lector de
ELISA, Centrfuga, Bao Mara, Autoclave, Estufas, Homogenizador,
Potencimetro, Agitador magntico, Contador de colonias, Balanza,
Estereoscopio, Equipo de PCR en tiempo real
MATERIAL DE VIDRIO:
Laminas portaobjetos, Campana de Anaerobiosis, Laminillas, Placas petri,
Tubos de ensayo, Tubos de centrfuga, Pipetas graduadas, Pipetas, Micro
pipetas, Beakers, Pipetas Pasteur, Erlenmeyer, Embudos, Probetas.
MATERIAL DE CIRUGA
Tijera punta recta y curva, Pinza simple, Pinza ranurada, Esptula,
Bistur, Mango de bistur, Bandejas, Bolsas estriles, Guantes
OTROS
Filtros, Frascos con desinfectante, Ansas de siembra, Gradillas,
Mecheros, Medios de cultivo, Porta lminas, Magnetos, Papel lente,
Goteros, Colorantes, Papel toalla, Jeringas, Gas pack, Refrigerante,
Reactivos.

DESCONTAMINACIN, LIMPIEZA, DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN
1.
ESTERILIZACIN:
Puede definirse la esterilizacin la como destruccin completa de todas

las formas de vida microbiana (virus, bacterias y hongos), en trminos de
la capacidad del microorganismo para reproducirse, incluidas las esporas
contenidas en un producto. No existen grados de esterilidad. Un objeto es
estril o no lo es. La esterilizacin se consigue por una serie de
agentes fsicos o qumicos.
ESTERILIZACIN POR MTODOS FSICOS:
CALOR SECO (HORNO)

Elimina bacterias y esporas por destruccin oxidativa de los
componentes celulares a temperaturas de 160 C por una hora, tiempo
en el que las bacterias ms resistentes y las esporas mueren.
CALOR HMEDO:
-
Ebullicin: El agua hirviendo a temperatura de 100C por 10

minutos destruye todos los microorganismos no esporulados.
Autoclave: El vapor a 15 libras de presin y una temperatura de 121

C., el cual es capaz matar a las esporas en 15 minutos.
FILTRACIN:
FILTROS:
Se realiza a travs de filtros de membrana. Estos poseen varios grados
de porosidad. El dimetro de los poros oscila desde 0.22 a 0.10 um. Se
emplean para la purificacin de medios a travs de la retencin de
bacterias. Ej: filtros Seitz.
Esquema 1. Filtracin
14
RADIACIN:
La luz solar directa destruye con bastante rapidez las formas
vegetativas de los microorganismos que carecen de proteccin. La
accin bactericida de la luz solar se debe a la banda ultravioleta del
espectro.
LUZ ULTRAVIOLETA:
Es utilizada en flujo laminar, quirfanos y otras zonas, con el fin de
disminuir las infecciones transmitidas a travs del aire.
Esquema 2. Flujo laminar
ESTERILIZACION POR MTODOS QUMICOS

Pueden utilizarse como desinfectantes muchas sustancias
qumicas, dado que el nmero y la variedad de productos es cada vez
mayor; deben elegirse cuidadosamente las formulaciones de acuerdo a las
necesidades concretas.
La actividad germicida de muchas sustancias qumicas pueden ser
modificadas u optimizadas por factores externos como: La temperatura,
pH, tiempo de actividad, naturaleza del microorganismo, presencia de
material extrao, etc.
2.
DESINFECCIN:
Proceso mediante el cual un agente qumico destruye microorganismos

capaces de producir una infeccin, eliminando o disminuyendo a cantidades
mnimas
los
microorganismos
patgenos
existentes.
Todos
los
desinfectantes son eficaces frente a las formas vegetativas, pero no
necesariamente actan frente a las esporas.
Pasteurizacin: En la pasteurizacin lenta,
63C y debe permanecer durante 30 minutos y
la temperatura debe estar a 72 C durante 15
bacterias en forma vegetativa que resisten al
la temperatura alcanza los

en la pasteurizacin rpida
minutos. Sobreviven algunas
calentamiento.
OBJETIVOS:
Aprender a utilizar las tcnicas de esterilizacin.

Controlar y verificar la esterilizacin de los materiales usados.
TRABAJO PRCTICO:
1. Caldo tripticasa de soya (TSB)100 ml
2. 08 Tubos de ensayo con algodn
3. Ansas de siembra
4. Lminas portaobjeto
5. Inoculo bacteriano
6. 04 Placas petri
7. Filtros Seitz para lquidos 0.22 u
8. Algodn
9. Papel craft
1. ESTERILIZACIN EN AUTOCLAVE:
PROCEDIMIENTO:
Hacer coloracin Gram a partir del tubo con Escherichia coli.

Observar al microscopio.
Autoclavar (15 lbs/15m) los tubos para su esterilizacin.
Hacer la coloracin Gram del cultivo ya esterilizado.
Sembrar los tubos con el cultivo ya esterilizado en tubos con
caldo Trypticasa de soya (TSB).
Utilizar un tubo con caldo nutritivo e inoculo sin autoclavar
(control)
16

Incubar a 37 C por 24 horas.
Observar y evaluar las diferencias, causas y efectos.
2. ESTERILIZACIN EN EL HORNO:
MATERIAL DE CIRUGA:
Envolver por separado
-
(tijeras, pinzas, etc.) con papel kraft.
Placa petri
Porta placas
Pipetas
Porta pipetas
Tubos
Algodn
Papel kraft
Cinta de autoclave
PROCEDIMIENTO:
Envolver con el papel kraft las placas individualmente.

Tapar los tubos con algodn y luego envolverlos en grupos.
Llevar al horno a 160 C por una hora.
Evaluar las causas y efectos del procedimiento.
Cuestionario
1. Enumere las utilidades de uso de tres mtodos de esterilizacin
respecto a materiales y equipos de laboratorio
2. Cules son los factores externos que afectan la potencia
desinfectante de los diferentes agentes qumicos y como modifican
su actividad?
3. Que sustancias qumicas pueden ser usadas para esterilizacin?

PRCTICA N 2
TOMA DE MUESTRAS
Para la obtencin de una muestra microbiolgica es fundamental realizar
adecuadamente la recogida de muestra a partir de una correcta
manipulacin para mantener la viabilidad del agente etiolgico y evitar
contaminacin en su transporte y procesamiento. Todas las muestras deben
remitirse al laboratorio rpidamente por la importancia del patgeno
potencial y el riesgo que este representa.
Los resultados pueden verse influenciados por la presencia de
microorganismos que son parte de la microflora normal, migracin
bacteriana pos-mortem o por la aplicacin de antimicrobianos antes del
envo de la muestra.
Para llevar a cabo la toma de muestra, se deber considerar:
1. Normas generales para la toma de muestra:
Tomar la muestra del rea ms representativa del problema.
Las muestras deben colectarse bajo estrictas condiciones de
antisepsia, tanto el material de coleccin como el recipiente en el
que la muestra ser transportada debern ser estriles.
La toma de muestra en animales vivos deben realizarse durante la
inspeccin del animal, realizando una buena sujecin para evitar
heridas o sufrimiento al animal y cualquier peligro para el operador,
incluso se puede usar tranquilizantes.
Las muestras deben identificarse
mediante el uso de marcadores
indelebles que puedan aguantar la humedad o congelacin; debe contener
los siguientes datos: Especie, raza, edad, sexo, nombre del animal,
etc. y la informacin e historial del caso debe acompaar a las
muestras.
2 Tipos de toma de muestra :
2.1 Hisopado:
El hisopado como tcnica de toma de muestra se usa en microbiologa para
aislamiento de diferentes microorganismos. Esta tcnica se usa en zonas
hmedas como mucosas (nasales, oculares, rectal/ cloacales, vaginales,
etc.) y lesiones hmedas.
18

Pasos:
Se usa hisopos estriles los cuales se rota ligeramente con la finalidad
de establecer el mayor contacto con las mucosas por lo menos 20 seg .
fig. 1. Hisopado nasal en cerdo
fig. 2.Hisopado vaginal en alpaca.
2.2
Raspados y Tricotoma
Para el examen de la piel y pelos se usa como primer mtodo diagnstico

los raspados o tricotomas a cualquier animal, que presente: prurito,
enrojecimiento, alopecia, ppulas o pstulas en alguna zona de la
superficie del animal. Estas tcnicas se usan para la deteccin de hongos
y caros por examen directo.
Raspados de piel:
- Seleccionar una zona con lesin, la cual debe ser seca.
- Antes de realizar el raspado se debe limpiar la zona afectada con
alcohol (70%) para eliminar la flora bacteriana, exudacin o restos
de excipientes de tratamientos previos.
Fig 3. Raspado de piel
20
Se realiza un raspado profundo con la ayuda de una hoja de bistur.
Tricotoma:
-
Arrancar los pelos de la zona alopcica y la de los bordes de la

lesin.
Colocar los pelos con las races en una placa Petri o medio de
transporte.
fig. 3 y fig. 4. Tricotoma (extraccin del pelo)
2.3
Muestras liquidas
Muestras de leche:
Pasos:
- Las muestras de leche deben tomarse despus de limpiar y secar el
pezn del animal, evitando el uso de antispticos.
- Luego se debe desecharse el primer chorro de leche.

-
Se llenar un tubo los dems chorros de leche que sean necesarios

para la muestra.
Para algunas pruebas, se puede tomar la muestra de leche
directamente del tanque de almacenamiento.
Muestras sangunea:
Las muestras de sangre se usan para el anlisis hematolgico, para

cultivos y/o para el examen directo de bacterias, virus o protozoos, en
cuyo caso es normal el uso de anticoagulantes, como el EDTA o la
heparina. Tambin se usa en anlisis serolgicos, para lo cual se usa
busca obtener el suero sanguneo, por lo tanto no es necesario usar
anticoagulantes. En la mayora de los grandes mamferos, se utiliza la
vena yugular o una vena caudal, pero tambin se pueden utilizar venas
braquiales y mamarias.
Pasos:
- Se debe tener el rea lo ms limpia posible, para lo cual es ideal
rasurar (o desplumar) la piel del lugar de la puncin, frotarla con
alcohol etlico al 70% y dejarla secar.
Luego se toma la sangre mediante venepuntura o venopuncin, usando

una jeringa con aguja o con una aguja y un tubo al vaco.
Se introduce la aguja con el bisel hacia arriba y se procede a
introducir la aguja en la vena.
Luego se procede a jalar el embolo para aspirar la sangre en la
jeringa, hasta obtener la cantidad de muestra necesaria.
10. Envi y Transporte:

Una vez colectadas las muestras deben ser acondicionadas a un
embalaje seguro, colocndose en un envase secundario, el cual puede ser
de material plstico o se deben colocar dentro de una caja de tecnopor
con hielo gel refrigerante, mantenindolas a una temperatura de 4C por
no ms de 24 horas hasta ser procesadas en el laboratorio.
fig. 5. Envo y transporte de
muestras clnicas.
En el caso de toma de muestra mediante hisopados se debe enviar en un

medio de transporte (Stuart, Carry-Blair, entre otros) que nos ayudaran
a la preservacin de la bacteria pero no a la multiplicacin de estas.
En el caso de muestras liquidas (leche), raspados o tricotoma se deben
poner en recipientes estriles.
22
fig. 6 y fig. 7. Medio de transporte y Envases estriles para colocacin de

muestras.
fig. 8. Cultivo directo a partir de

hisopados.

Objetivos:
-
Identificar los materiales necesarios para a coleccin, envi y

transporte de muestras representativas de un proceso infeccioso a travs
de diferentes tcnicas de toma de muestras.
Explicar los procedimientos generales para la coleccin, transporte y

envi de muestras clnicas para el diagnstico bacteriolgico y
micolgico.
Trabajo prctico:
Realizar la toma de muestras para:
-
Piel y pelos.
Sangre.
De alguna mucosa.
Materiales:
-
Hoja de bistur
Lamina portaobjetos
Placa Petri o medios de transporte
Guantes
Jeringas y agujas
Alcohol
Cuestionario:
1. Describa la toma de muestra para una lesin seca.
2. En un establo lechero se realiz una prueba de campo para mastitis
subclnica, de las cuales 2 salieron positivas, se necesita
confirmar dichos caso mediante tcnicas microbiolgicas. Describa
el proceso de toma de muestra.

PRACTICA N3
MEDIOS DE CULTIVO Y TIPOS DE SIEMBRA
MEDIOS DE CULTIVO
Estos contienen una base mineral, fuente de carbono, nitrgeno y
azufre, atmsfera adecuada y factores de crecimiento necesarios para el
desarrollo de las diferentes especies bacterianas u hongos. La mayora de
estos desarrollan en medios neutros o ligeramente alcalinos, mientras que
existe un grupo minoritario que prefiere un medio cido. La temperatura
adecuada para el desarrollo de microorganismos mesfilos vara entre los
15 y 43C. En cambio, los microorganismos psicrfilos desarrollan hasta
los 0C; y otros, como los termfilos, pueden crecer hasta los 80C.
Los microorganismos patgenos en general, estn limitados por una escala
de temperaturas, comparativamente estrecha, alrededor de 37C.
CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. POR SU CONSISTENCIA
a) MEDIOS LQUIDOS (CALDO)
Es un medio de cultivo lquido, libre de Agar que contiene productos
crnicos o proteicos (peptonas, extractos), con adicin de algn tampn
para mantener el pH adecuado. Ej.: Caldo Trypticasa de Soya, Caldo
Infusin Cerebro-Corazn, Caldo Thyoglicolato.
fig. 9. Medio Lquido: En la siembra se observan, pelcula,

sedimento y turbidez
24
b) MEDIOS SLIDOS (AGAR)

Es un medio para verter en placas petri o en tubos, donde un
el 1 a 2% es agar. En estos medios, se obtienen colonias aisladas
(conjunto de bacterias que provienen de una clula madre), las
cuales presentan las mismas caractersticas morfologicas,
genticas y fisiolgicas.
Ejemplo: Agar trypticasa de soya, Agar sangre, Agar chocolate,
Agar Mac Conkey y Agar Salmonella-Shigella.
c) MEDIOS SEMISLIDOS (MEDIO)

Un medio es semislido cuando contiene menos del 1% de Agar en su
composicin. Ej.: Medio SIM.
fig. 10. Mdios Slidos: Agar sangre, Agar Trypticasa y otros
2. POR SU ESPECIFICIDAD
a) MEDIOS GENERALES
Son medios que carecen de inhibidores, por tanto, permiten el
desarrollo en el cultivo de un sin nmero de bacterias, tanto
grampositivas como gram negativas. Ej.: Agar TSA.
b) MEDIOS SELECTIVOS
Son
medios
que
contienen
antibiticos,
que
permiten
el
determinados microorganismos.
sustancias
desarrollo
inhibidoras
selectivo
o
de
Ejemplo: Agar Mac Conkey (permite unicamente el crecimiento de

bacterias gramnegativas).
c) MEDIOS ESPECFICOS
Son medios que permiten el desarrollo de un microorganismo
determinado a partir de poblaciones mixtas, ya que contienen
nutrientes que favorecen el desarrollo de microorganismos especficos.
Agar
Agar
Agar
Agar
Agar
Agar
SS.
Baird Parker.
Corynebacterium.
Verde Brillante.
SPS.
XLD.
PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LA PREPARACIN DE DIVERSOS MEDIOS DE CULTIVO
En una probeta medir 100ml de agua destilada.

Pesar el medio de cultivo segn indicacin del frasco y colocarlo en
un Erlenmeyer.
Agregar los 100 ml de agua destilada al Erlenmeyer y mezclar.
Hervir el medio hasta disolver los ingredientes agitando suavemente.
Ajustar el pH a 7.3 +/- 0.2 a temperatura de 25 C, o segn la
indicacin.
Tapar y rotular el frasco con el medio de cultivo.
Esterilizar (si es necesario) en autoclave a 15lbs de presin
durante 15 minutos a 1210 C.
PROCEDIMIENTO PARA EL LLENADO DE PLACAS PETRI.

Se vierte el agar en placas petri con mucho cuidado, esta operacin se
realiza en el flujo laminar y/o al lado del mechero, sin hablar (de
preferencia con mascarilla), para evitar que se contamine.
Inmediatamente despus (antes que comience a solidificarse) se flamea

la superficie del agar con la llama del mechero. El fin de esta
operacin es eliminar las burbujas de la superficie del agar.
Cuando el agar este solidificado, invertir las placas e incubarlas a

37 C durante 24-48 horas y verificar la esterilidad; eliminando la
placa que estuviera contaminada.
Las placas se conservarn a 4 C hasta el momento de ser utilizado.
26

MEDIOS DE CULTIVO DE USO HABITUAL:
a. MEDIO DE AGAR SANGRE
Es un medio diferencial que permite revelar caractersticas de
diversos microorganismos. Permite el crecimiento tanto de microorganismos
exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y
anaerobias, aunque no es medio de eleccin para anaerobios.
Permite visualizar reacciones hemolticas que producen muchas
especies bacterianas debido a la accin de sus hemolisinas sobre la
sangre contenida en el agar. La hemlisis observada puede ser completa
(hemlisis beta, produce un halo transparente alrededor de la colonia
hemoltica), parcial (hemlisis alfa, coloracin verdosa alrededor de la
colonia) o ausencia de hemlisis (hemlisis gamma).
fig. 12. Agar Sangre: Crecimiento de
bacterias con hemolisis gamma.
fig. 11. Agar sangre: Crecimiento de
bacterias hemolticas beta.
Preparacin
fig. 4 Agar sangre: Crecimiento de
fig. 1 y fig. 2. Agar Mac Conkey:
Se
prepara
a partirbeta.fig.
de agar
de soya.
Este se esteriliza,
bacterias
hemolticas
5. trypticasa
Bacterias
fermentadoras
de lactosa y y
cuando
se encuentre
a de
una temperatura
40 a 45
C, se adiciona
Agar Sangre:
Crecimiento
no entre
fermentadora
de lactosafig.
3
bacterias
con
hemolisis
gamma.
Agar
sangre:
Crecimiento
de
de 5% a 10% de sangre estril preferentemente de ovino.
bacterias hemolticas beta.
b. MEDIO AGAR MAC CONKEY
Generalmente es usado para el aislamiento selectivo de bacilos
gramnegativos (enterobacterias y coliformes). Las sales biliares y el
cristal violeta inhiben bacterias grampositivas
Para el cultivo en este medio se toma como muestra sobretodo rganos,
muestra de agua para contaje de coliformes y diferenciacin de
bacterias patgenas en productos lcteos, realizndose una siembra
directa de dichas muestras.

La lactosa y el indicador rojo neutro presentes permiten diferenciar a
las bacterias fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras de
lactosa, las que le imparten un color rosado transparente a un pH 8,
como Salmonella spp. (lactosa -). Las colonias fermentadoras de
lactosa producen una cada localizada del pH a 6.8, seguido por la
absorcin del rojo neutro, lo que le imparte un color rojo-fucsia.
Ej.: colonia de Escherichia coli (lactosa +).
28
fig. 13 y fig. 14 Agar Mac Conkey: Bacterias fermentadoras de lactosa y no
fermentadora de lactosa
Preparacin.
fig. 6 y fig. 7. Agar Mac Conkey: Bacterias fermentadoras de lactosa y no
Pesarde5glactosa
de agar mac conkey y colocar en un matraz.
fermentadora
Agregar 100ml de agua destilada y mezclar.
Calentar hasta disolver el Agar.
Medir el pH 7.1+/-0.2.
Esterilizar en autoclave.
c.
MEDIO AGAR MUELLER HINTON
ste medio carece de inhibidores e indicadores, lo que permite el

crecimiento de una gran variedad de microorganismos, tanto
grampositivos como gramnegativos. Se utiliza para realizar pruebas de
sensibilidad antimicrobiana (antibiograma).
Preparacin:
Pesar 3.8g de Mueller hinton y colocarlo en un matraz.

Agregar 100ml de agua destilada y mezclar.
Calentar hasta disolver agitndolo.

d.
MEDIO AGAR SABOURAUD (Agar glucosado de Sabouraud)
Es un excelente medio basal, al cual se le puede aadir antibiticos

y otros inhibidores para el cultivo selectivo de varios grupos de
hongos (levaduras y mohos). El contenido de glucosa y el pH cido
facilitan el crecimiento de los mismos.
Preparacin:
Pesar 6.5g de Agar Sabouraud, colocarlo en un matraz.
Agregar 100ml de agua destilada.
Calentar hasta disolver agitndolo.
Antes de colocar en placas, adicionar antibitico si es
necesario.
1. MTODOS DE SIEMBRA
Los mtodos de siembra varan de acuerdo al medio y al tipo de muestra a
utilizar; por ejemplo, se pueden utilizar agares en placas petri, caldos,
medios semislidos y slidos en tubos; y cada uno puede ser inoculado con
la muestra de manera distinta.
A. Inoculacin de medios slidos en placas petri

La superficie del agar de las placas de petri se puede inocular con la
muestra por varios mtodos. El inoculo primario se puede efectuar con un
ansa, un hisopo, o directamente con una impronta del rgano. Una vez
hecho el inoculo primario, se emplea un ansa a fin de diseminar el
material en toda la placa. La siembra puede realizarse de 2 maneras:
a. Por estras:
El inoculo se disemina en la placa a travs de estras sucesivas, con un
movimiento hacia los lados asemejando una S. El propsito de esta
tcnica es reducir el inoculo lo suficiente hasta obtener colonias
bacterianas aisladas, las que posteriormente se podrn cultivar en medios
diferenciales para su posterior identificacin.
b. Por agotamiento
Esta tcnica se utiliza sobretodo en ocasiones donde las muestras son
copiosas o densas (moco, heces, etc.), se toma con el ansa una pequea
cantidad de la muestra y se esparce hacia los lados dndole la vuelta a
la placa en ngulos de 90. El ansa se debe esterilizar entre las
sucesivas estras y esparciendo la muestra desde el ltimo punto donde se
coloc; de esa manera, tendremos colonias que crecern aisladas unas de
otras, como se muestra en el siguiente esquema.
Esquema 3. Mtodos de
Siembra: Por agotamiento
30
B. Medios semislidos slidos en tubos

Los tubos con medios en picos de flauta se inoculan primero, atravesando
el agar en profundidad con un ansa recta y se contina sembrando por
estras en la parte inclinada de abajo hacia arriba. Cuando se inoculen
medios semislidos para pruebas de movilidad el ansa se sumergir en
profundidad en ngulo recto y se retirar cuidando que sea por el mismo
trayecto de entrada.
Esquema 4. Siembra de medios slidos en
tubos
A.
B.
Atravesar el agar con el ansa

recta.
Retirar el ansa y sembrar por
estras la superficie del agar
C. Medios lquidos
Los medios lquidos se pueden inocular inclinando el tubo a un ngulo de
aproximadamente 30 y acercar un ansa con el inoculo a la superficie del
vidrio justo en el punto que se muestra en el esquema y diluir el inculo
poco a poco con el caldo.
Esquema 5. Inoculacin de un tubo con caldo
A. Inclinar el tubo e inocular en el sitio

indicado
B. Volver el tubo y diluir la muestra con
el caldo.
Cuestionario
1. Fundamente y esquematice los medios y mtodos de siembra para cinco
diferentes muestras de secreciones y excreciones de diferentes animales
de importancia pecuaria.
2. Diferencia entre un medio enriquecido y un medio de enriquecimiento;
entre un medio diferencial y selectivo. De ejemplos
3. Cules son los factores necesarios para el crecimiento de un
microorganismo en un medio de cultivo? Fundamente.
PRCTICA N 4 y 5
TCNICAS DE COLORACIN BACTERIANA. RECONOCIMIENTO DE ESTRUCTURAS

BACTERIANAS
Los mtodos de coloracin han servido en el conocimiento de las clulas,

determinando e identificando las diversas estructuras y componentes
qumicos que poseen stas. En nuestro estudio se utilizan para determinar
la morfologa bacteriana por afinidad de algunas estructuras por ciertos
colorantes. Los colorantes normalmente son soluciones acuosas, por lo
cual utilizan alcohol y mayor proporcin de agua destilada, ya que el
exceso del primero deshidratara demasiado a las clulas objetivo. Estos
compuestos qumicos son utilizados para aumentar el contraste.
Para la observacin se usa el microscopio con el objetivo de 100X y
aceite de inmersin, observndose los microorganismos teidos. Casi todos
los colorantes son sales (compuestos formados por iones cargados). Los
colorantes bsicos son aquellos en los cuales el agente que tie es el
in cargado positivamente; mientras que en los cidos, el colorante es el
in cargado negativamente.
OBJETIVOS:
Realizar las coloraciones con la finalidad de observar caractersticas
estructurales como cpsula, espora, etc. de los diversos gneros
bacterianos, as como, comprender el fundamento de las reacciones
qumicas que se presentan.
Existen 3 tcnicas de coloracin:
1. Coloracin simple:
Se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico. El empleo de
ste colorante es slo para incrementar el contraste. Ej. Azul de
metileno
1.
2.
3.
4.
5.
Preparar el frotis.
Fijar a la llama.
Colorear: colocando azul de metileno (2 3).
Lavar con agua corriente, secar.
Observando al microscopio con objetivo de 100x y aceite de
inmersin las bacterias se tien de color azul.
32
2. Coloracin diferencial
Se usa dos o ms colorantes para distinguir tipos de microorganismos,
esta tcnica consta de dos etapas, una tincin primaria seguida de una
tincin de contraste. En la tincin de contraste se utiliza otro
colorante que tie los microorganismos no teidas por el primer
colorante.
Ej. Tincin Gram, Tincin cido alcohol resistente.
2.1. Mtodo de coloracin GRAM

Este mtodo tiene utilidad prctica, porque nos permite diferenciar la
morfologa bacteriana (cocos, bacilos, espiroquetas). Sobre la base de su
reaccin a la tincin de gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, grampositivas y gramnegativas.
a. Si la muestra proviene de un lquido:

Se toma una gota del liquido con el aro de ansa de siembra y se coloca en
el centro del portaobjetos, se procede a extenderla en forma circular en
un rea de 1 x 1cm; se fija a la llama, pasando suavemente a unos
centmetros por encima de ella evitando que no ebulla o se queme (el
calor de la llama mata las clulas microbianas por desnaturalizacin de
sus protenas).
b. Si la muestra proviene de un slido:

Primero, se coloca una gota de agua destilada sobre el portaobjetos y
luego, con el ansa de siembra se coloca una cantidad pequea de muestra
(colonia bacteriana) y se hacen las extensiones mezclando con el agua,
luego se fija a la llama hasta secar. En caso de tratarse de rganos se
hacen improntas directamente a la lmina.
Pasos:
1. Preparar el frotis.
2. Fijar por calor (en la llama).
3. Colorear con cristal violeta, dejar un minuto.
4. Lavar con agua corriente.
5. Cubrir el preparado con lugol y dejar un minuto.
6. Decolorar: eliminar el lugol y lavar la lmina con alcohol-acetona
hasta observar que ya no sale ms colorante.
7. Lavar la lmina con agua corriente.
8. Coloracin de contraste: colocar fucsina bsica o safranina 1 min.
9. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio con
aceite de inmersin (100X).
FUNDAMENTO DEL MTODO DE GRAM

Las bacterias grampositivas protegen su membrana con una gruesa
pared celular. El principal constituyente de la pared es un polmero
complejo de azcares y aminocidos denominado murena o peptidoglucano.
La murena es el componente crtico para el mantenimiento de la
forma y la rigidez de los microorganismos grampositivos y gramnegativos,
pero desempea un papel importante en la proteccin de la membrana
celular de los microorganismos Gram positivos, que poseen una pared
celular muy gruesa.
Pared celular bacteriana
Espacio
Periplasmti
co
Membra
na
Esquema 6. Envoltura de una bacteria

grampositiva
Esquema 7. Envoltura de bacteria gramnegativa
34
Los microorganismos gramnegativos han optado por una solucin

radicalmente diferente para el problema de la proteccin de la membrana
citoplasmtica. Elaboran una estructura totalmente diferente, una
membrana externa, que es construida fuera de la pared celular de murena.
La membrana externa es qumicamente diferente de las membranas biolgicas
habituales y tiene la capacidad de resistir a las sustancias qumicas
lesivas.
La membrana externa es una estructura de dos capas, pero su hoja externa
contiene un componente nico adems de los fosfolpidos. Se trata de un
lipopolisacrido bacteriano o LPS, una molcula compleja que no se halla
en otros sitios en la naturaleza.
a.
Las bacterias gramnegativas poseen ms cantidad de lpidos en su

pared celular.
Las bacterias grampositivas poseen una capa de glucopptido ms

gruesa que las hace ms resistentes a los agentes mecnicos.
Coloracin
Alcohol-cido
Modificado)
Resistente
(Tincin
de
ZielhNeelsen
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos

grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que
les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido,
despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan
cido-alcohol
resistente.
Tienen
un
alto
contenido
lipdico,
fundamentalmente fosfolpidos y ceras.
Es til para el diagnstico de Mycobacterium sp. y Brucella sp. El
complejo fucsina-fenol resiste la decoloracin (alcohol cido) porque
est ligado a los lpidos y se consigue por el calor o aumentando el
tiempo de contacto para que la fucsina penetre profundamente y pueda
resistir la accin decolorante del alcohol-cido, resultando los bacilos
de color fucsia sobre un fondo azul.
Procedimiento
1. Hacer el frotis y fijar a la llama.
2. Colorear con Fucsina fenicada por 5 minutos.
3. Calentar a la llama hasta que empiece a desprender vapor, evitando que
ebulla o se seque.
4. Dejar enfriar, luego lavar con agua corriente.
5. Decolorar con alcohol-cido.

6. Coloracin de contraste: vertiendo azul de metileno, dejar por 30
7. Lavar con agua, secar y observar al microscopio.
3. Coloracin especfica:
Incrementan el contraste en las clulas microbianas y revelan estructuras
particulares, entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y
las cpsulas. Ej. Tincin de cpsula (tinta china) y esporas de WirtzConklin.
3.1 Coloracin de Cpsula por el Mtodo de la Tinta China:
Esta es una tcnica de coloracin considerada como tincin negativa,
ya que, las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el
medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las
clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material
opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que
simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una
suspensin de partculas de carbono coloidal).
Materiales
1.
2.
3.
4.
5.
Lminas limpias
Tinta china
Suspensin bacteriana
Ansa de siembra
Laminilla cubre objetos
Procedimiento
1.
2.
3.
4.
5.
Poner en una lmina una gota del microorganismo diluido, bien

mezclado.
Aadir una gota de tinta china.
Mezclar bien.
Cubrir con una laminilla.
Observar al microscopio con lente de inmersin reduciendo la luz.
3.2 Coloracin de Espora: Mtodo de Wirtz:

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y
Bacillus, producen en su interior forma resistentes denominadas
esporas. Estas se producen cuando las condiciones ambientales son
desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas,
radiaciones, compuestos txicos, etc.), formndose una espora en cada
forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula
vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente
36

es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa.
La capacidad de germinar perdura durante aos.
Las esporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes
a los factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que
las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras
refringentes y de difcil tincin. La tincin especfica de esporas
requiere dos colorantes:
1. Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.
2. Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en
el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn
teidas con el segundo colorante.
Materiales
1. Lminas porta objetos
2. Suspensin del microorganismo
3. Ansa de siembra
4. Colorante verde malaquita
5. Colorante safranina
Procedimiento
1. Hacer el frotis y fijarlo al calor.
2. Aadir verde Malaquita y calentar a llama dbil por 2 a 3
(evitar ebullicin).
3. Lavar con agua corriente ms o menos 30.
4. Aadir fucsina o safranina por 30. Lavar y observar con
objetivo de 100x y aceite de inmersin.
Se observarn las esporas de color verde brillante y el resto color rosado.
Esquema 8. Esporas : Localizacin y morfologa de las

esporas en Bacillus sp.
Cuestionario
1.
Explique como la coloracin Gram funciona para diferenciar entre

gramnegativas y grampositivas.
2.
Por qu es necesaria la fijacin en la mayora de tcnicas de

coloracin?
3.
Nombre 2 enfermedades que pueden ser diagnosticadas utilizando la

coloracin alcohol-acido resistente. Y Por qu?
38
PRCTICA N 6
PRINCIPALES MTODOS Y TCNICAS UTILIZADOS EN LA IDENTIFICACIN
MICROBIANA
La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn segn
una clasificacin dada. Consiste en la determinacin de las
caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de estas
caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin
considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende
principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la
identificacin. El sistema de clasificacin de bacterias ms comnmente
utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology en el cual
se detallan los nombres cientficos y su relacin con otras bacterias.
La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse
utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes
criterios en la evaluacin de similitudes. Para evaluar caractersticas
bacterianas se pueden utilizar diversos mtodos, uno de los ms conocidos
son los ensayos bioqumicos, llamadas pruebas bioqumicas convencionales,
generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de
reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio
de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.
Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han
desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica
bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad
enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a
una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores,
etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo
bacteriano.
Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de
trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser
diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes
microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento
el medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares
cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente.
REQUISITOS PARA IDENTIFICAR UNA BACTERIA MEDIANTE PRUEBAS BIOQUIMICAS

La realizacin de una prueba bioqumica implica:
1. Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado
sustrato o inhibidor y luego de la incubacin visualizar el
40

crecimiento y la degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de
un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la
presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin.
2. Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga
el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubacin
demostrar la actividad enzimtica.
3. Tener un cultivo fresco de la bacteria (18-24 hrs. de incubacin)
en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma ptima,
a pH, fuerza inica, atmsfera y temperatura adecuados.
4. LLevar a cabo los correspondientes controles de calidad de los
medios de cultivo utilizados, sembrando en dicho medio una cepa
positiva y otra negativa para ese prueba.
MEDIOS UTILIZADOS PARA LA DIFERENCIACIN BIOQUMICA DE LAS BACTERIAS:
Citrato de Simmons
TSI y/o Kliger
Caldo de rea
Lisina
Rojo de Metileno (RM)
Voges-Proskauer (VP)
Caldo Malonato
Esculina
SIM
LIA
Nitratos
Medios de carbohidratos
Gelatina
Leche tornasolada
Prueba de oxidasa
Reactivo de Kovacs o James
Prueba de la Catalasa
PRINCIPALES
BACTERIANA.
PRUEBAS
BIOQUIMICAS
UTILIZADAS
EN
LA
IDENTIFICACION
Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas

con fines de identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se
utilizan ms frecuentemente, agrupadas segn el tipo de ensayo y se
denominan segn su nombre corriente.

1. Prueba de la catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin el perxido de
hidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los
microorganismos aerbicos y anaerbicos facultativos, excluyendo los
estreptococos.
1.1. Material
Agua oxigenada, cultivo bacteriano y portaobjetos.
1.2. Interpretacin
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia
rpida con desprendimiento de burbujas: la enzima catalasa convierte el
perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular.
Esta prueba se emplea para diferenciar los gneros: Micrococcus y
Staphylococcus (catalasa positivo) del gnero Streptococcus (catalasa
negativo).
2. Prueba de la oxidasa (citocromo c oxidasa)

Los citocromos son enzimas que forman parte de la cadena de transporte de
electrones en la respiracin aerbica, transfiriendo electrones al
oxgeno, con la formacin final de agua.
2.1. Material
Tiras de papel con reactivo de oxidasa, pipeta Pasteur y cultivo
microbiano.
2.2. Tcnica
Con una pipeta Pasteur, cerrada y cargada de bacterias, se trazan rayas
sobre una tira de papel impregnada en solucin acuosa al 1% de cloruro de
tetrametil para-fenilendiamina.
2.3. Interpretacin
En caso positivo el papel cambia de color pasando a prpura y negro en
10-20 segundos, como consecuencia de que el reactivo se oxida en
presencia de citocromo c oxidasa formndose azul de Wuster. En caso
negativo la tira de papel no cambia de color.
42
fig. 15. Prueba de Oxidasa:

Interpretacin de resultados de las tiras
reactivas.
3. Fermentacin de azucares
Esta prueba se suele usar en la identificacin inicial de bacilos
gramnegativos y especialmente de enterobacterias.
En este estudio se observa la fermentacin de lactosa y/o glucosa y/o
sacarosa con produccin de cido y/o gas y la produccin de H2S.
3.1. Material
Asa e hilo de siembra, tubos con medio TSI y cultivo bacteriano.
3.2. Tcnica
Con el asa recto se toma de la colonia y se siembra en picadura; despus
se siembra en la superficie por estra. Incubar a 37C durante 24 horas.
Observar los resultados.
3.3. Interpretacin
La interpretacin de los resultados se har de la forma siguiente:
Fermentacin de glucosa: fondo amarillo.

Fermentacin de sacarosa: parte central amarilla.
Fermentacin de lactosa: superficie amarilla.
Produccin de SH2: picadura negra.
Produccin de gas: burbujas o rotura del agar.
3.4. Fundamentos de la fermentacin de azucares

3.4.1. Fermentacin de glucosa
Se aprecia en el viraje a amarillo del indicador de pH (rojo de
fenol) nicamente en la parte inferior del tubo. Esto es debido a la
pequea proporcin de glucosa que existe en el medio (0,1%), que al ser
fermentada en el fondo del tubo, donde existen condiciones de

anaerobiosis, produce suficiente cido para que vire el indicador, pero
no a medida que nos aproximemos a la superficie, donde las condiciones
son ms aerbicas, all la bacteria respira y la produccin de cido es
menor, permaneciendo esa zona de color rojo. Si el microorganismo
sembrado no fermenta la glucosa con produccin de cidos, todo el tubo
toma una coloracin roja. Incluso, una vez que la glucosa ha sido
degradada la bacteria comienza a utilizar los aminocidos, liberndose
aminas, que elevan el pH, por lo que el color rojo puede ser ms intenso.
3.4.2. Fermentacin de lactosa

Se pone de manifiesto por el viraje a amarillo del indicador, tanto en el
fondo del tubo como en la superficie. La concentracin de lactosa es diez
veces mayor que la de glucosa, con lo que la produccin de cido formado
es tan elevada que hace virar el indicador en todo el tubo. El hecho de
que la fermentacin de lactosa enmascare la de la glucosa no tiene
importancia, ya que para que una bacteria fermente lactosa debe ser capaz
de fermentar glucosa. Si la bacteria no es capaz de fermentar la lactosa,
una vez que la glucosa ha sido degradada, como ya se ha comentado, la
bacteria comienza a utilizar los aminocidos, liberndose aminas, que
neutralizan la pequea cantidad de cidos presentes en la porcin
inclinada del medio y elevan el pH. Por lo tanto, la zona inclinada del
tubo aparecer de color rojo intenso y el fondo de color amarillo debido
a la fermentacin previa de la glucosa.
3.4.3. Produccin de gas

La produccin de gas en la fermentacin se manifiesta por la aparicin de
burbujas, rotura o elevacin del agar en el fondo del tubo.
3.4.4. Produccin de SH2

Para detectar la produccin de H2S a partir de tiosulfato sdico debe
incorporarse al medio de cultivo un indicador, dado que el H2S es
incoloro. Para tal fin se suele utilizar alguna sal de hierro que
reacciona con el H2S, para producir un precipitado negro de sulfuro de
hierro. La produccin de H2S tiene lugar en ambiente cido, de ah que el
precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan
cidos a partir de la glucosa. As, un fondo negro indica que existe
acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya enmascarado
con el precipitado negro.
44
a)
b)
c)
d)
a)
a)
a)
a)
fig. 16. Prueba TSI: a) Negativo a TSI; fermentacin de los tres azucares; b) positivo a los tres
azucares y positivo Sulfidrilo; positivo a Glucosa y Sacarosa, y c) negativo a Sacarosa.
4. Reduccin de nitratos
La reduccin de nitratos a nitritos es una caracterstica propia de
varios microorganismos que utilizan nitrato como aceptor final de
electrones en la respiracin anaerbica. Esta prueba es til en la
identificacin de microorganismos pertenecientes a las enterobacterias
aunque tambin sirve para identificar otros microorganismos.
4.1. Material
Un tubo con caldo nitratado, cultivo bacteriano, solucin de cido
sulfanlico al 8 por mil y solucin de -naftilamina al 5 por mil (ambos
en cido actico 5N) y polvo de zinc.
4.2. Tcnica
Inocular el medio lquido e incubar a 37C durante 24-48 horas. Pasado
ese tiempo, aadir al cultivo unas gotas de solucin de -naftilamina y
unas gotas de solucin de cido sulfanlico.
4.3. Interpretacin y fundamento
El desarrollo de una coloracin roja en el medio de cultivo, tras la
adicin de los reactivos, pone de manifiesto la presencia de nitritos y
por tanto la prueba de reduccin de nitratos se considera positiva. Este
color se debe a la formacin de un compuesto coloreado, denominado psulfobencenoazo--naftilamina.

Si no se desarrolla color, la prueba puede considerarse negativa (no se
han reducido los nitratos) o bien se han reducido originando otros
compuestos (amonaco, nitrgeno molecular, xido ntrico u xido nitroso)
por lo que la lectura se corresponde con un falso negativo. En este caso
se puede aadir al medio de cultivo una pequea cantidad de polvo de
zinc, que reduce los nitratos del medio a nitritos. El desarrollo de un
color rojo, indica la existencia de nitratos en el medio y confirma que
la reaccin es negativa.
46
5. Produccin de indol
El indol es uno de los productos de degradacin del metabolismo del
aminocido triptfano. La presencia de la enzima triptofanasa en la
bacteria provoca la hidrlisis del triptfano y su desaminacin,
produciendo indol, cido pirvico y amonaco.
5.1. Material
Medio de cultivo con peptona, cultivo bacteriano y reactivo de Ehrlich o
kovac.
5.2. Tcnica
Inocular el caldo con el microorganismo e incubar a 37C durante 24-48
horas. Transcurrido ese tiempo, aadir al cultivo 1 ml de reactivo de
Ehrlich (para-dimetilamino benzaldehido en etanol), resbalando por la
pared del tubo sin agitar.
5.3. Interpretacin
La aparicin, transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en
la interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol
y, por tanto, la prueba se considera positiva. El indol es capaz de
reaccionar con el grupo aldehdo del reactivo originando un complejo de
color rojo.
fig. 17. Prueba del Indol :(Formacin

del anillo fucsia)

6. Movilidad
Es otra caracterstica til en la identificacin de los
microorganismos. Se puede llevar a cabo observando el crecimiento en un
medio semislido.
6.1. Material
Hilo de siembra, medio semislido (agar movilidad), y cultivo
bacteriano.
6.2. Tcnica
Sembrar, por picadura, con hilo de siembra en medio semislido,
incubando a 37C durante 48 horas.
6.3. Interpretacin
La baja concentracin de agar de este medio permite que las
bacterias se desplacen si son mviles. Por ello, observando si el
crecimiento est slo en la picadura o se extiende a los lados de ella,
se puede determinar si el microorganismo es inmvil o mvil.
b)
c)
a) (no turbio); b) positivo

a) a movilidad
fig. 18. SIM: a) Prueba sin reaccin
(turbidez en todo el Agar) y c) Sulfhdrilo y movilidad positivo.
7. Crecimiento en citrato
Algunos microorganismos utilizan el citrato presente en el medio de
cultivo como nica fuente de carbono, esta caracterstica es importante
en la identificacin de microorganismos pertenecientes a las
enterobacterias.

7.1. Material
Un tubo con medio citratado de Simmons y cultivo bacteriano.
7.2. Tcnica
Sembrar en la superficie inclinada del medio e incubar a 37C
durante 24-48 horas.
En caso positivo, el medio de cultivo vira de color verde a azul.
Si el microorganismo utiliza el citrato como fuente de carbono, tambin
utiliza las sales de amonio como fuente de nitrgeno, con produccin de
amonaco, lo que da lugar a una alcalinizacin del medio. Esto se pone de
manifiesto por un viraje del indicador de pH azul de bromotimol, de verde
a azul intenso, a la vez que se observa crecimiento en la superficie.
a)
b)
fig. 19. Prueba de Citrato: a) Reaccin negativa a Citrato; b) reaccin positiva a Citrato.
8. Produccin de ureasa
La ureasa es una enzima presente en numerosos microorganismos. Esta
enzima cataliza la hidrlisis de la urea, con produccin de dixido de
carbono y amonaco, lo que causa una alcalinizacin del medio.
8.1 Material
Un tubo con
agar urea de Christensen y cultivo bacteriano.
8.2. Tcnica
Inocular el medio de cultivo mediante estra en superficie e
incubar a 37C durante 24 horas.
48

Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen que el medio de
cultivo tome color fucsia, debido a la alcalinizacin del mismo por
produccin de amonio a partir de la urea, que se pone de manifiesto por
un viraje del indicador de pH (rojo de fenol).
a)
b)
fig. 20. Prueba de ureasa: a) Ureasa negativa; b) Ureasa positivo.
9. Descarboxilacin de aminocidos
Las descarboxilasas son un grupo de enzimas sustrato-especificas,
capaces de actuar sobre la porcin carboxilo de los aminocidos, con
formacin de aminas de reaccin alcalina. Esta reaccin conocida como
descarboxilacin produce dixido de carbono como producto secundario.
Cada uno de las descarboxilasas es especfica para un aminocido lisina,
ornitina y arginina son los tres aminocidos ensayados habitualmente en
la identificacin de las enterobacterias y producen las siguientes aminas
especficas:
Lisina cadaverina
Ornitina putrescina
Arginina citrulina
En la conversin de arginina a citrulina interviene una dihidrolasa

ms bien que una descarboxilasa ya que en primer trmino un grupo NH2 es
eliminado de la arginina. La citrulina es transformada en ornitina, que
luego sufre descarboxilacin para formar putrescina.
9.1. Materiales
Caldo descarboxilasas, asa de siembra, cultivo bacteriano, parafina
liquida
9.2. Tcnica
Con el asa de platino transfiera una porcin de cultivo puro al
caldo lisina. Incube a 37C por 24 horas. Cubra los tubos inoculados con
una capa de 4-5 mm de parafina estril.
50

Las enterobacterias, por fermentacin de la glucosa producen cido,
el cual hace virar el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee
una lisina descarboxilasa, por la descarboxilacin de la lisina se
producir una amina, la cual neutralizar el cido producido por la
fermentacin de la glucosa retornando el medio a su color original
violeta.
a)
b)
c)
fig. 21. Prueba LIA: a) Reaccin negativa a LIA; b) reaccin positiva a LIA; c)
K/A (alcalino/cido).
Cuestionario
1. Escriba el fundamento de las siguientes pruebas bioqumicas para la
identificacin bacteriana: Prueba de CAMP y Prueba de la Coagulasa,
Prueba de la Esculina, Prueba de Voges Proskauer, Hidrlisis de la
Gelatina,

KITS COMERCIALES DE IDENTIFICACION BACTERIANA
Una de las pruebas que se utilizan para la identificacin de

enterobacterias es el Kit API-20E (Laboratorios Bio.Merieux), el cual las
identifica en forma fcil y rpida. Esto es importante porque el
diagnstico es efectivo, permitiendo un tratamiento rpido y apropiado.
Ej. API 20E consiste en una tira de 20 microtubos conteniendo substratos
deshidratados para la demostracin de la actividad enzimtica o la
fermentacin de estos azcares.
Los microorganismos reaccionan con el contenido de los microtubos entre
24 y 48 horas de incubacin.
MATERIALES
Kits API 20E (tira de 20 microtubos).

Suero fisiolgico 0.85%.
Bacteria problema.
Aceite mineral o parafina lquida.
Hidrxido de Potasio 40%.
Alfa naftol.
Reactivo de Kovac.
Manual para la identificacin del API 20E.
Estufa a 37 C.
Escala de Mc Farland.
Tiras para la prueba de oxidasa.
PROCEDIMIENTO:
1. Tomar la cepa problema (previa determinacin de la prueba de oxidasa)
y colocarla dentro de un tubo con suero fisiolgico.
2. Observar que la turbidez del tubo con la cepa problema este en 0.5 de
la escala de Mc Farland.
3. Llenar los pocitos de la cmara de plstico con agua destilada.
4. Colocar la tira de API 20 E dentro del estuche.
5. Inocular la cepa problema a cada microtubo de la tira de API 20E,
usar pipeta Pasteur llenando la parte cerrada del micro tubo.
6. Para la prueba de citrato llenar todo el microtubo.
7. Las pruebas de LDC, ODC, URE se completa con aceite mineral.
8. Las pruebas de IND, VP llenarlas completamente.
9. Tapar el estuche de plstico e incubar a 37 por 24 horas segn
indicacin del Kit comercial.
LECTURA
1. Hacer la lectura de las reacciones observando el cambio de coloracin
e interpretar los resultados de acuerdo al manual.
2. Leer VP 5 a 10 minutos despus de la adicin de 1 gota de hidrxido
de potasio y Alfanaftol.
3. Adicionar 1 gota del reactivo de Kovacs al IND.
4. Anotar los resultados numricamente en la tarjeta de identificacin.
5. Sumar cada 3 reactivos, el cual nos dar un nmero con 7 dgitos (de
acuerdo al cdigo).
6. Usar la tabla de identificacin la cual contiene cdigos con el
nombre de cada enterobacteria correspondiente.
LECTURA DE RESULTADOS DEL SISTEMA DE IDENTIFICACION BACTERIANO

ESTANDARIZADO
RESULTADOS BIOQUIMICOS DE DIFERENTES AGENTES BACTERIANOS
Cuestionario
1. Indique
los
bacteriana.
tipos
de
API
que
existen
para
la
identificacin
2. Esquematice una tira de API con una bacteria inoculada indicando las
reacciones positivas y negativas para una bacteria.
Esquema 9. Sistema de identificacin bacteriano estandarizado
Cuestionario:
1.
Esquematice una reaccin positiva a alguna enterobacteria de

importancia clnica veterinaria
52

PRACTICA N 7
ACCIN DE AGENTES ANTIMICROBIANOS
SISTEMA KIRBY - BAUER
La prueba de sensibilidad, incluye el uso del medio Mueller Hinton y

discos de antibiticos. Se utiliza para determinar la sensibilidad o
resistencia de bacterias patgenas que poseen un crecimiento rpido en
relacin a la difusin radial de los antibiticos elegidos.
OBJETIVO
Realizar pruebas de sensibilidad de microorganismo grampositivas y
gramnegativas patgenos, causantes de los procesos infecciosos.
Determinando el halo de inhibicin que permita conocer la sensibilidad o
resistencia de estas bacterias frente a cada uno de los antibiticos.
MATERIALES
Placa petri con agar Mueller-Hinton estril
Discos con antibiticos
Colonia bacteriana
Suero fisiolgico
Hisopo estril
Pinza estril
Mechero
Regla Kirby Bauer.
Tablas con los estndares de interpretacin
Escala de Mc Farland
Estufa.
PROCEDIMIENTO:
1. Trabajar con el mechero encendido
2. Seleccionar 1 colonia caracteristica y colocarlas dentro de un tubo
con suero fisiolgico, hasta obtener una turbidez de 0.5 en la escala
de Mc Farland.
3. Introducir un hisopo dentro del tubo, esperar 5
4. Sembrar toda la superficie de la placa con el hisopo y mantenerlo a
temperatura ambiente hasta por 20 minutos.
5. Utilizar una pinza estril y depositar los discos de antibiticos
sobre la siembra manteniendo una equidistancia entre ellos.
6. Incubar la placa a 37 C por 18 24 horas aproximadamente.
7. Lectura: Medir milimtricamente los halos de inhibicin, comparndolos
con los estndares de sensibilidad y resistencia.
PASOS A SEGUIR EN LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD
54
fig. 22. Antibiograma

AGENTE ANTIMICROBIANO
AMIKACINA
AMPICILINA
AMOXICILINA
AMOX-AC.CLAV
AC. NALIDIXICO
CEFADROXILO
CEFALOTINA
CEFUROXIMA
CLINDAMICINA
CLORANFENICOL
CLOXACILINA
COLISTIN
DIBEKACINA
DOXICICLINA
ENOXACINO
ERITROMICINA
ESTREPTOMICINA
FOSFOMICINA
FLUCLOXACILINA
FURAZOLIDONA
GENTAMICINA
KANAMICINA
LINCOMICINA
NEOMICINA
NITROFURANTOINA
NORFLOXACINO
OXACILINA
PENICILINA G
PENICILINA G (Enterococo)
RIFAMPICINA
SULFATRIMETOPRIM
SULFONAMIDA
TETRACICLINA
TRIMETOPRIM
VANCOMICINA
SIGLA
Ak
A
AX
AMC
W
CPH
CF
CXM
D
C
CXM
CL
DK
DXS
E
EM
S
FO
FX
FZ
GE
K
L
N
NI
NOR
OX
P
R
SX
SF
T
TMP
VA
POTENCIA
30mcg
10mcg
25mcg
20/10mcg
30mcg
30mcg
30mcg
5mcg
30mcg
1mcg
10mcg
10mcg
30mcg
10mcg
15mcg
10mcg
50mcg
5mcg
100mcg
10mcg
30mcg
2mcg
5mcg
30mcg
10mcg
1mcg
1mcg
10uof
10 uof
5cmg
250mcg
30mcg
5mcg
30mcg
30mcg
RESISTENCIA
14mm
13mm
11mm
13mm
13mm
14mm
14mm
14mm
14mm
12mm
10mm
8mm
12mm
12mm
14mm
13mm
11mm
11mm
10mm
14mm
12mm
13mm
14mm
12mm
14mm
12mm
10mm
28mm
14mm
16mm
10mm
12mm
14mm
10mm
9mm
SENSIBLE
17mm
17mm
14mm
18mm
19mm
18mm
18mm
18mm
21mm
18mm
13mm
11mm
15mm
16mm
18mm
23mm
15mm
15mm
18mm
17mm
15mm
18mm
21mm
17mm
17mm
17mm
13mm
29mm
15mm
20mm
16mm
17mm
19mm
16mm
12mm
Cuestionario
1.
Cul es el fundamento y utilidades de la prueba de sensibilidad?
2.
Cul es la interpretacin, luego de la lectura de la prueba de una

sensibilidad hecha a una bacteria X con resultado sensible a una
antibitico Y?

PRCTICA N 8
MTODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN, A PARTIR DE MUESTRAS CLNICAS, DE

COCOS GRAMPOSITIVOS.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN BACTERIANA DE MUESTRAS DE LECHE MASTTICA
La leche es un excelente medio de cultivo para una gran variedad de
microorganismos. Tanto los patgenos, oportunistas y saprofitos pueden
llegar a reproducirse en ella.
La leche masttica se caracteriza por sufrir diversas alteraciones:
Fsicas (color, consistencia, viscosidad, densidad, etc.)

Qumicas (pH, etc.)
Existe un gran nmero de agentes infecciosos productores de mastitis,

siendo los ms frecuentes en bovinos:
Streptococcus (cocos)
Staphylococcus (cocos)
Corynebacterium (bacilos)
Pseudomonas (bacilo)
Klebsiella (cocobacilo)
Escherichia coli (bacilo)
fig. 23. Muestras de leche: diferentes caractersticas fsicas
OBJETVOS DE LA PRCTICA:
1. Sembrar las muestras de leche aplicando los mtodos de siembra.
2. Sembrar las muestras de leche en los medios de cultivo adecuados.
MATERIALES:
56

1.
Placas con agar sangre (agar TSA (Merck)

desfribrinada de ovino)
2. Placas de agar Mc Conkey
3. Ansas de siembra
4. Perxido de hidrogeno
5. Tiras reactivas de la prueba de oxidasa
6. Placa de agar DNAsa Oxoid/Merck
7. Laminas portaobjeto
8. Kit de coloracin gram
9. Muestra de leche con mastitis
10.
Muestra de hisopado de otitis externa
11.
Microscopio ptico
8%
de
sangre
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Prender el mechero.
Agitar el frasco para homogenizar la muestra.
Abrir y flamear la boca del frasco que contiene la muestra de leche.
Flamear el ansa de siembra, introducir el ansa dentro del frasco la
muestra, y tomar la muestra.
Sembrar por estra o por agotamiento en el agar, luego flamear el ansa
de siembra.
Incubar por 24 horas a 37oC para que se desarrollen las colonias.
Observar las caractersticas de las colonias.
Hacer tincin gram a las colonias que hayan crecido y observar al
microscopio.
Determinar la morfologa de las colonias bacterianas y orientar el
diagnstico.
Cuestionario
1. Menciones los principales agentes etiolgicos que causan mastitis.
2. Qu prueba de campo se usa para detectar mastitis subclnica?
Describa la reaccin de esta prueba.
3. Enumere y mencione cuales cree que son los pasos para evitar la
mastitis durante el ordeo.

PRCTICA N 9
MTODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAMPOSITIVOS
AEROBIOS Y ANAEROBIOS
Una de las principales bacterias causantes de enfermedades sistmicas, es
el Bacillus anthracis, que afecta principalmente a animales herbvoros y
al hombre. Ocasiona un cuadro septicmico de carcter grave caracterizado
por la presencia de hemorragias por las aberturas naturales,
esplenomegalia y aspecto oscuro de la sangre (antrax=carbn).
58
Materiales:
Muestra (oreja).
Agar sangre.
Agar Tripticasa Soya (TSA).
Caldo Tripticasa Soya (TSB).
Ansa de siembra.
Mechero guantes.
Mascarilla
Cepa de Bacillus anthracis.
fig. 24.Bacillus Anthracis:
Presencia de esporas
Procesamiento de la muestra:
Primero diseccionar la cara externa de la oreja hasta exponer la

vena marginal.
fig. 25. Toma de muestra: Exposicin de la

vena marginal
Luego con la punta del bistur se incide, con un hisopo estril

se toma la gota de sangre para inocularla en el caldo tripticasa
de soya (TSB) por 2 minutos a temperatura ambiente.
fig. 26.Toma de muestra: Hisopado
Tomar con el ansa una gota de la muestra de sangre, ponerla en la

lmina portaobjeto y realizar la coloracin azul de metileno o
Gram.
Observar con el objetivo 100X de inmersin, bacilos de bordes
rectos, espora central no deformante, en cadenas.
Sembrar en caldo tripticasa de soya y en agar sangre.
A las 24 horas observar en agar sangre colonias tpicas en forma
de cabeza de medusa, en agar sangre se observa la misma
morfologa sin presentar hemlisis.
fig. 27. Agar Sangre: Crecimiento de colonia

tipo cabeza de medusa
Las esporas son importantes porque pueden conservarse en estado de

desecacin durante muchos aos sin prdida de su viabilidad y se le puede
encontrar en el suelo, agua o aire de las zona contaminadas.
Los
pastos conservan estos estadios durante aos; el heno
producido en tales terrenos puede transmitir la enfermedad; las esporas

se difunden por aguas que inundan los campos contaminados. Si bien hay
variacin en la resistencia de las esporas de diferentes cepas de
Bacillus anthracis, todos ellas presentan resistencia extremadamente alta
al calor. Soportan la ebullicin durante varios minutos, de modo que para
matarlos es necesario someterlos a una temperatura de 135 C, sin
humedad, durante 5 a 10 minutos.
El factor de virulencia del Bacillus anthracis est dado por una
exotoxina que es la actividad de los tres factores, el cual est
constituido por:
60
fig. 28. Vacuna contra ntrax
Cuestionario
1. Enumere las especies ms susceptibles y resistentes a la infeccin

por Bacillus anthracis.
2. Enumere 10 medidas de precaucin que se deben tener en cuenta en
caso de presentarse un animal sospechoso de ntrax.
3. Existe un programa de erradicacin de ntrax en el pas?, cuales
son los aspectos ms relevantes de esta norma
4. Usted como mdico veterinario de una granja ve muertes sbitas de
los animales que medidas sanitarias tomara en cuenta.

PRACTICA N 10 y 11
MTODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAMNEGATIVOS, A PARTIR

DE MUESTRAS CLNICAS. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE
Las enterobacterias son un grupo de bacilos gramnegativos aerbicos
y anaerbicos facultativos que se encuentran difundidos en la naturaleza,
siendo su hbitat principal el intestino del hombre y animales. Existen
especies capaces de producir enfermedades debido a las toxinas que poseen
y otras que causan enfermedades debido a la accin directa de estas
especies patgenas.
Las excretas son consideradas una de las causas de contaminacin del
medio ambiente; estos microorganismos se encuentran en el agua, tierra,
vegetales, alimentos y medio ambiente.
Entre las principales enterobacterias se encuentran: Escherichia
coli, Salmonella spp., Klebsiella sp., Yersinia sp., Citrobacter sp.,

Proteus sp. y Shigella sp.
Objetivo:
1. Conocer diferentes medios y mtodos de cultivo para muestras
procedentes del contenido intestinal.
2. Identificar los microorganismos causantes de los procesos
diarreicos en animales domsticos.
Materiales:
-
Placas con agar sangre (agar TSA (Merck) + 8 a 10% de sangre

desfribrinada de ovino)
Placas con agar Mc Conkey
Tubos con caldo tetrationato activado
Ansas de siembra
Perxido de hidrogeno
Tiras reactivas de la prueba de oxidasa
Laminas portaobjeto
Kit de coloracin gram
Tubos de ensayo con pruebas bioqumicas: tres azucares, lisina,
SIM, citrato de simmons, caldo urea.
Muestra de intestino
Cepas aisladas conservadas
Microscopio ptico
SECUENCIA DE LAS TCNICAS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE

ENTEROBACTERIAS
Heces, Intestino, Ganglio Mesentrico
Descartar
Salmonella
Siembra
Directa
Agar Mac Conkey

Agar sangre
Lactosa
+
Lactosa
-
Enriquecimiento
en Caldo
tetrationato,
Caldo selenito
Siembra directa:
Agar
SS, XLD Mac Conkey
Resiembra en: Agar

VB, SS, XLT, Mac C,
Desarrollo de colonias tpicas

Sospecha de Salmonella
Pruebas Bioqumicas
confirmatorias
Ej:
Escherichia coli
Salmonella
Aglutinacin
Determinacin fimbrial
Pruebas de aglutinacin
PROCEDIMIENTO
1. Colocar el material biolgico en una fuente (intestino).
2. Observar si los rganos muestran lesiones macroscpicas.
3. Determinar la zona afectada de la muestra (lesiones).
62

4. Proceder a quemar esta regin con esptula incandescente.
5. Usar la pinza y tijera estril, hacer un piquete y sacar una
muestra con una pipeta Pasteur o ansa.
6. Realizar coloracin Gram del contenido intestinal y observar al
microscopio con objetivo de inmersin (G +, G -, cpsulas, esporas,
etc.)
7. Colocar la muestra en el medio de cultivo adecuado (Agar Sangre,
Mac Conkey, Caldo tetrationato). Ver grfico.
8. Con un ansa sembrar por agotamiento en medios slidos.
9. Si el medio es lquido usar pipetas pasteur estril.
10.Si los microorganismos pertenecen al grupo entrico (Salmonella
spp.), colocar en medios de enriquecimiento (caldo tetrationato,
caldo selenito) a 42 C y si se sospecha de Escherichia coli
llevar a estufa a 37 C (ver el grfico anterior).
1. Agar Mac Conkey, SS, XLD:

Observar las colonias (color). Diferenciar las colonias: lactosa +
como Escherichia coli y Klebsiella sp. (fermentadoras de lactosa).
Diferenciar las colonias: lactosa - como Salmonella sp y Shigella
sp. (no fermentadoras de lactosa).
Hacer coloracin Gram y observar.
Realizar la prueba de aglutinacin si se sospecha de Salmonella.
Sembrar las colonias en LIA,Citrato de Simmons, TSI, Urea y SIM.
Hacer la lectura a las 24 horas.
fig. 29. Enterobacterias coloracin

GRAM
Cuestionario
1.
Cul es la importancia del uso de medios de enriquecimiento?,

ejemplos
2.
Cules son los medios de cultivo elegidos para el aislamiento e

identificacin del agente causal bacteriano en un proceso infeccioso
del sistema digestivo? porque?

PRCTICA N 12
MTODOS DE DIAGNOSTICO
Brucella abortus, B. suis, B. melitensis

Dentro de las enfermedades infecciosas del ganado, son de carcter
importante dentro de las explotaciones pecuarias, las que causan
trastornos de tipo reproductivo como el aborto, nacimiento de cras
muertas, cras que se mueren en pocas horas de nacidas (12-24 h),
infertilidad, retenciones placentarias, reabsorciones fetales o muerte
embrionaria. As como la prdida econmica tan fuerte por la baja
produccin de recra, ya que la nica justificante que tiene una hembra
dentro de la granja es que produzca un nmero de cras al ao. Todo esto
repercute en prdidas por retraso en el mejoramiento gentico y gastos
por medicamentos, siendo todo esto englobado a prdidas econmicas
elevadas y baja eficiencia en la productividad de las explotaciones.
La mayora de los problemas abortivos en el ganado y muerte de animales
recin nacidos se deben a problemas no infecciosos (que normalmente no se
toman en cuenta) desbalances nutricionales, problemas genticos, agentes
teratognicos,
plantas
txicas,
factores
traumticos,
problemas
hormonales, administracin de medicamentos, micotoxinas y endotoxinas.
fig. 30. Testculo ovino: Superior: Normal

Inf: Epididimitis y orquitis B. ovis
OBJETIVO
-
Reconocer las diferentes bacterias que causan aborto

Conocer tcnicas para el diagnstico de bacterias causantes de
aborto y formas adecuadas de remisin de una muestra.
64

MATERIALES:
-
Placa de aglutinacin
Suero sanguneo de canino, bovino, y caprino
Frasco de Reactivo de rosa de bengala (INS)
Homogenizadores
Micropipetas de 20 a 200ul
Racks de tips o puntas de 200ul
Lmpara de lectura
fig. 31. Prueba Rosa de Bengala: Materiales
fig. 32. Sueros de ovino en viales

plstico.
PROCEDIMIENTO:
sta prueba de aglutinacin consiste en cuantificar por
inmunodifusin radial, la concentracin de las IgG en la muestra
problema, el agar gel difusin frente a las muestras y patrones, mediante
lavado, secado y tincin del gel, se determina por la medida de los aros

de precipitacin. Con estos resultados, se realiza una recta de calibrado
para calcular la concentracin de Igs G en los sueros problemas.
REACCION POSITIVA: se identifica con el signo +

o Los sueros que presentan formacin de arenilla a manera de precipitados
sern positivos.
REACCION NEGATIVA: se identifica con el signo o Los sueros que no presentan ningn tipo de precipitacin sern negativos.
No se admite la clasificacin de sospechoso.
fig. 33. Prueba Rosa de Bengala
fig. 34. Reacciones positivas a la prueba Rosa de Bengala.
Cuestionario
1. Que implica una reaccin positiva a una prueba de Rosa de bengala.
2. Existe un programa de erradicacin de Brucella en el pas?,
cuales son los aspectos ms relevantes de esta norma
3. Mencione que especies de Brucella son de importancia zoontica
Por qu?
4. Cules son las medidas de control de la brucelosis en el pas segn
SENASA
66

PRCTICA N 13
TCNICA DE MICROAGLUTINACION PARA DIAGNSTICO DE Leptospira sp.
Esta tcnica se emplea para detectar anticuerpos anti-leptospiras
en el suero, identificar los aislamientos, clasificar cepas y servir de
base para evaluar cualquier otro mtodo serolgico para el diagnstico de
esta enfermedad.
La batera que se usa como antgeno est representada por los
serovares ms prevalentes del rea. Sin embargo, en aquellas regiones en
donde no se conoce los serovares circulantes, la OMS recomienda por lo
menos una cepa de referencia de los serovares ms representativos de las
especies ms frecuentes.
Se emplean como antgeno las cepas de referencia que deben ser
replicados semanalmente para realizar la prueba. Una vez revisado los
cultivos, se eligen aquellos que tengan buen crecimiento y no formen
aglutinaciones entre ellas. Cuando los cultivos estn muy densos se deben
diluir con buffer fosfato salino PBS pH 7,2-7,4 o solucin salina
fisiolgica 0,85%.
Para que el antgeno sea ptimo para la prueba tiene que observarse
en el microscopio de campo oscuro entre 150 a 200 leptospiras por campo o
hasta lograr una opalescencia de 0,5 de la escala de Mc Farland.
La prueba se basa en enfrentar diluciones seriadas de suero con
igual volumen de una suspensin de leptospiras (antgeno) para luego
observarse en microscopio de campo oscuro para estimar el 50% de
aglutinacin como el punto final de la reaccin antgeno-anticuerpo.
REACTIVOS:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Suero fisiolgico estril.

Medio Fletcher (DIFCO)
Medio Stuart (DIFCO)
Na2HPO4 anhidro
KH2PO4
Glicerina
Agua destilada estril
MATERIALES Y EQUIPOS:
1.
2.
3.
4.
5.
Erlemeyer de 1-2 litros

Pipetas serolgicas
Pipetas pasteur
Portapipetas
Micropipetas simples y multicanales

6. Tips o puntas
7. Estufa a 28 C
8. Medidor de pH
9. Bao mara
10.Autoclave
11.Recipientes para descarte.
12.Solucin desinfectante de hipoclorito de sodio
Esquema 10. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA DE MICROAGLUTINACION
68
En una microplaca de 96 pozo, colocar en la columna
No. 1 la primera dilucin de los sueros 1:50
Con una micropipeta multicanal realizar diluciones dobles

de los sueros en las siguientes columnas
1.:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
Control
(Slo Leptospira)
Aadir el antgeno (serovar) en volumen de 50l
Incubar la microplaca por 2 horas a 28 C
Sacar de cada dilucin y del control 50 l y colocarlo

sobre un portaobjetos limpio
Observar en un microscopio de campo oscuro a 10X. El

50% o ms de Leptospiras aglutinadas se considera (+)
Esquema 11. HOJA DE TRABAJO DE LOS CONTROLES Y MUESTRAS EN

LA PRUEBA DE MICROAGLUTINACIN PARA EL DIAGNOSTICO DE
Leptospira sp.
Cuestionario
1. En base al fundamento de la prueba de Microaglutinacin, cuales son

las utilidades en Medicina Veterinaria.
2. Cuales son las medidas de control frente a un caso de Leptospirosis
en animales

PRACTICA N 14 y 15
MORFOLOGA Y TIPOS DE REPRODUCCIN
CULTIVO Y AISLAMIENTO DE HONGOS DE IMPORTANCIA EN MEDICINA VETERINARIA
El diagnstico especfico de los hongos requiere principalmente de

un estudio microscpico y macroscpico de las estructuras vegetativas y/o
reproductivas, las cuales varan de forma, dimensin, color, textura,
etc. Se presentan en muchos casos estructuras especficas de funcin
definida, adems, en la actualidad los datos morfolgicos se complementan
con los aportes bioqumicos, serolgicos y moleculares para permitir una
mejor clasificacin de algunos hongos.
Cuando se recolectan raspados de piel para cultivo de dermatofitos,
la lesin se limpia con alcohol al 70 %; se realiza un raspado de la
porcin marginal de la lesin, los pelos se retiran con pinzas para
cultivarse, las uas se obtienen por corte y la superficie de las
estructuras muy queratinizadas se raspan para tener acceso a porciones
ms profundas. El contenido de la pstula, ndulos, vesculas, se obtiene
con jeringa estril. Si los hongos no crecen pueden requerirse de
biopsia; sta incluir tejido normal y porciones de la zona de lesin. La
orina se obtiene mejor por cistocentesis, la cual asegura que la muestra
no se contamine con la flora bacteriana mictica del tracto
genitourinario inferior.
Las muestras que no se procesen pronto
congelarlos por perodos de hasta 12 a 15 horas.
se
refrigeran
sin
Entre los hongos ms comunes causantes de micosis en veterinaria se

encuentran:
Epidermophyton floccosum
- Microsporum canis y M. gypseum

- Trichophyton mentagrophytes,
T. rubrum, y T. tonsurans
- Malassezia pachydermatis
- Candida albicans
Entre los hongos que afectan a los
insumos alimenticios se encuentran:
Aspergillus spp
Fusarium spp
Penicilium spp
Rhizopus spp
fig. 35. Aspergillus
70
ESTUDIO MACROSCPICO:
La descripcin de las caractersticas de los hongos son usualmente
basadas en el crecimiento de la colonia fngica estndar como los que
crecen en el agar Sabouraud Glucosado.
Estas caractersticas de crecimiento pueden variar de acuerdo al
pH, temperatura, etc.; por lo que es necesario considerar todos estos
factores para una identificacin correcta de los hongos.
Caractersticas de la Colonia
a. ASPECTO:
Se refiere a las caractersticas de crecimiento del micelio areo:
elevacin y densidad. Ejemplos: lanoso, algodonoso, aterciopelado, borde
irregular, etc.
b. SUPERFICIE:
Se refiere a las caractersticas de crecimiento en la superficie:
prominencias y depresiones de la colonia. Ejemplos: planas, rugosa,
monticulada, cerebriforme, crateriforme, etc.
c. COLOR:
Varan de acuerdo a la especie del hongo: blanco, amarillo, verde, pardo,
gris, marrn, negro, etc. Adems la colonia puede difundirse en el medio
de diferentes colores.
e. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO: rpida, moderada o lenta.
ESTUDIO MICROSCPICO:
1. ESTRUCTURAS VEGETATIVAS
a. LEVADURAS:
Son hongos unicelulares que presentan una forma redondeada u
ovalada; reproducindose asexualmente por medio de yemas o
blastosporas. Ej.: Candida, Saccharomices, Rhodotorula.

Poseen pseudomicelio, que son estructuras producto de la elongacin
de una blastospora o yema, presentando a su vez brotes sucesivos.
Ejemplo Candida albicans.
b. HONGOS FILAMENTOSOS:
Son hongos pluricelulares constituidos por hifas, pueden ser
septadas (Ascomycetes, Deuteromycetes) o aseptadas (Zygomicetes ejm
Mucor, Rhizopus, Absidia, etc.).
fig. 36. (a y b) Penicilium; (c y d) Aspergillus.
2. ESTUCTURAS DE REPRODUCCIN:
La reproduccin de los hongos puede ser sexual o asexual,
dependiendo de las condiciones del substrato y condiciones ambientales.
Los hongos pueden presentar una o ambas formas de reproduccin.
Conidias:
Elementos fngicos externos que se originan a partir de una clula
conidigena a travs de una serie de eventos llamados conidiognesis, los
cuales favorecen la propagacin de los hongos.
72
fig. 37. Macroconidias de M.

canis
fig. 38. Algunas especies de Microsporum y Trichophytom.
PREPARACIN DE ACLARANTES , COLORANTES Y DESINFECTANTES

Para el estudio de los hongos es necesario el uso de reactivos o
colorantes especiales. Si se trata de una muestra patolgica (pus,
esputo, escamas, etc.) es necesario el empleo de aclarantes que permitan
resaltar las estructuras fngicas al disolver la mucina o queratina de la

muestra; tambin
laboratorio.
se
pueden
utilizar
los
colorantes
comunes
de
1) ACLARANTE
Solucin acuosa de KOH al 10 o 20 %.
Perlas de KOH: 10 o 20 g.
Agua destilada: 100ml.
Disolver suavemente con ayuda del calor, las perlas de KOH en
agua destilada.
2) COLORANTE
Azul de Metileno o Lactofenol.
Lactofenol de Amman: 100ml.
Azul de algodn: 0.05.
Agregar al lactofenol de Amman, el azul de algodn.
3) DESINFECTANTE
Alcohol corriente: 100ml

Yodo metlico: 2g
Agregar el yodo metlico al alcohol. Agitar hasta que se
disuelva completamente.
Los dermatofitos son hongos filamentosos patgenos, estn agrupados

en los gneros:
Microsporum, Epidermophyton y Trichopyton, estos microorganismos tienen
tropismo por el tegumento cutneo, en donde proliferan a expensas de la
queratina, cistina y metionina.
PROCEDIMIENTO:
En preparaciones frescas se suspende el material (pelo o piel)

de la muestra sobre el portaobjeto en solucin de KOH al 10%.
Cubrir la muestra con una laminilla cubreobjeto.
La preparacin se pasa por la flama varias veces.
Evitar hervir la mezcla.
El KOH limpia la preparacin de los agregados de tejido y deja
los elementos micticos intactos.
El examen se inicia con el objetivo de menor aumento y el
condensador en posicin baja; para lograr un mximo contraste.
Observar estructuras micticos a 10x, luego pasar a 40x para
mejor observacin.
74

La tincin GRAM se utiliza para muestras sospechosas de Cndida,
Malassezia, Geotrichum, Trichosporum, la forma de levadura de
Sporothrix spp.
Cultivo de las muestras:
Con el ansa de siembra en ngulo, tomar una porcin de la muestra y
sembrar por puntos en la superficie del medio de cultivo, incubar a
26 C o temperatura ambiental durante 7 a 21 das.
Tcnica del microcultivo:
-
Con el bistur, cortar un trozo de agar Sabouraud de 0.6 x 0.6cm y

depositarlo sobre la lmina portaobjetos.
Con el ansa de siembra en ngulo recto, coger una pequea porcin
del cultivo de hongos y depositarlos en uno de los lados del agar,
repetir el procedimiento en los lados restantes.
Cubrir con una laminilla y depositarla en una placa petri.
Depositar un trozo de algodn hmedo estril dentro de la placa
petri.
Incubar al medio ambiente por 3 a 7 das, el hongo ambiental y los
dermatofitos hasta los 21 das.
Montaje de lminas
-
Con ayuda de una pinza, levantar la laminilla y depositarla sobre

una lmina portaobjetos donde previamente se ha colocado una gota
de azul de metileno, retirar el exceso de colorante, sellar la
lmina con esmalte de uas.
Observar al microscopio, con lente de 100x y aceite de inmersin.
fig. 39. Aspergiullus spp. : Caractersticas

microscpicas
Cuestionario
1.
Describa 3 mtodos empleados en el aislamiento e identificacin de

hongos.
2.
Mencione las principales caractersticas y utilidades

diferentes agares usados en el cultivo de hongos.
3.
Describa la reproduccin del hongo filamentoso de su eleccin, y

mencione que especie y/o genero.
de
los
76
PRCTICA 16.
IDENTIFICACIN DE LEVADURAS
LEVADURAS
Las levaduras son hongos que se presentan en forma de una clula. Algunas
levaduras cuentan con un tubo germinal, el cual se define como una
extensin filamentosa de una levadura que tiene casi la mitad del ancho y
es a cuatro veces la longitud de la clula madre. Para sospechar de
levaduras en los medio de cultivo, se debe observar principalmente el
aspecto de la colonia (liso, cremoso, viscoso y pastoso).
Las levaduras con mayor importancia en medicina veterinaria son: Especies
de Candida, Candida albicans, especies de Crytococcus, Malassezia spp.,
entre otras.
Principales levaduras en Medicina Veterinaria:
Malassezia
Las especies del gnero Malassezia son un grupo de levaduras lipoflicas
que forman parte de la microbiota de la piel del ser humano y animales.
Actualmente se conocen 14 especies de Malassezia.
Donde la Malassezia pachydermatis es la nica no lipodependiente, por lo
que crece en medios comunes como el agar Sabouraud. Es considerada una
levadura zooflica porque est presente en la piel y conducto auditivo
externo de animales silvestres y domsticos, pudiendo provocar en stos
dermatitis y otitis.
Examen microscpico directo de lesiones de piel:
- Puede obtenerse una muestra por raspado superficial y colocarlo en
una lmina portaobjeto.
- Aplicar 1 gota de KOH al 40% o azul de metileno.

-
Las levaduras se presentaran de forma globosa a elipsoide,
generalmente en grupos, con o sin micelio grueso de corta longitud.
Cultivo:
- Las muestras obtenidas por raspado de piel deben ser sembradas en
agar Sabouraud. As tambin se pueden usar muestras a partir de
secreciones como las del odo.
- Dejar la muestra incubar por 10 das a 32C.
El cultivo en CHROM agar Malassezia a 32C por 10 das permite, por el
color de las colonias, diferenciar algunas especies del gnero.
Malassezia pachydermatis produce colonias lisas de color rosado plido.
Candida
Las especies del gnero Candida son levaduras mitospricas que forman
parte de la microflora saprofita en mucosas de humanos y animales. Se han
identificado 17 especies de este gnero como patgenas siendo la Candida
albicans de importancia veterinaria. La aparicin de la infeccin por
Candida albicans esta relacionadas con inmunosupresin del hospedero.
Crece en agar Sabouraud glucosa formando colonias de color crema y
normalmente lisa.
Cultivo:
- Extender la muestra para aislamiento en la superficie del medio
CHROMagar.
- Si la muestra se cultiva de una torunda, hacerla girar sobre una
superficie pequea de la superficie cercana al borde, para luego
extenderla a partir de dicha zona con un asa.
- Incubar las placas a 35 2 C durante 20 48 h. Requiriendo una
incubacin de 42 para que se desarrolle por completo el color de las
colonias Candida.
- No exponer a la luz antes de la incubacin y durante ella.
Medio de cultivo:
CHROMagar Candida Medium es un medio selectivo y diferencial para el
aislamiento de hongos. Con la inclusin de sustratos cromgenos en el
medio, las colonias de C. albicans, C. tropicalis y C. krusei produciendo
colores diferentes, lo que permite la deteccin directa de estas especies
de levaduras. Inhibiendo el crecimiento de bacterias; tambin puede

utilizarse como medio selectivo para otras especies de levaduras y para
hongos filamentosos.
El agar est formado por sustratos artificiales (cromgenos), que liberan
compuestos de colores diferentes al ser degradados por enzimas
especficas. Es posible que otras especies de levaduras produzcan su
color natural (crema) o presenten un color rosado o malva de claro a
oscuro. El medio tambin permite a deteccin de cultivos mixtos, debido a
los diferentes colores que presentan la colonia.
78
fig. 40. CHROM Agar: Crecimiento de
diferentes especies de Candida.
Objetivos:
Conocer el cultivo especfico para hongos unicelulares (levaduras)
de importancia veterinaria.
Materiales:
- Ansa o asa en aro de siembra
- CHROMagar
- Incubadora
- Mechero
Cuestionario: Mencione como cultivara una muestra tica si sospechamos
de Malassezzia.
1. Existen otros medios de cultivo para levaduras, mencione dos que
puedan ser usados en medicina veterinaria.

Prctica 17.
TCNICAS PARA CULTIVOS CELULARES

Las tcnicas de cultivo celular avanzaron significativamente en los 40 y
50, como soporte a la investigacin en virologa. La utilizacin de
cultivos celulares para producir virus permiti preparar virus
purificados para ser utilizados en vacunas. La vacuna Salk de la polio
fue una de los primeros productos producidos en masa usando tcnicas de
cultivos celulares. Esta vacuna fue posible gracias a la investigacin de
John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller y Frederick Chapman Robbins,
quienes fueron galardonados con el Premio Nobel por el descubrimiento de
un mtodo de crecimiento de virus en cultivos celulares de rin de mono.
La capacidad de tener muchas clulas eucariotas de crecer in vitro
formando una monocapa ha sido aprovechada para la elaboracin de cultivos
celulares, la cual constituye una importante herramienta en la
investigacin, y en el diagnstico de muchas enfermedades virales. El
cultivo permite el cultivo e incluso el aislamiento de numerosos agentes
virales, adems su uso se ha extendido para
el trabajo con ciertas
toxinas bacterianas y en la preparacin de vacunas para uso humano y
animal.
Se puede definir a un cultivo celular primario como aquel que esta
formado por clulas recientemente aisladas a partir de tejidos u rganos;
despus de un primer subcultivo o pasaje, el cultivo celular llega a ser
una lnea celular y puede ser cultivada hasta por 10 a 12 veces. Con el
tiempo una lnea celular llega a una etapa de envejecimiento puede llegar
a sufrir un proceso llamado: transformacin in Vitro formando las
denominadas lneas celulares continuas o inmortales. Las lneas celulares
transformadas estn formadas por clulas que contienen un origen tumoral
o han sido manipuladas de algn modo (Transfeccin con oncogenes o
tratamientos con carcingenos).
Los cultivos celulares son un tipo de biosustrato empleados para la
propagacin de los virus: dentro de stos, los ms usados son los
cultivos en monocapa, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensin,
explantos, cultivos de rganos, cultivos en microcarriers, etc). Los
cultivos celulares en monocapa consisten en una capa de clulas que
crecen adheridas a la superficie del recipiente que las contiene. Estos
cultivos se preparan tratando el tejido original u otra monocapa con un
agente que dispersa las clulas (una enzima o un agente quelante, o ambos
combinados) para luego transferir la suspensin celular obtenida a un

recipiente de vidrio o plstico en donde las clulas se adhieren
multiplican.
Los cultivos celulares se dividen en:
CULTIVOS PRIMARIOS
tejidos, u rganos,
LINEAS CELULARES
Son originados a partir de embriones, clulas de

tomados directamente del organismo.
Son de varios tipos:
1. Las que surgen de cultivos secundarios o terciarios originados de un

cultivo primario. Estas lneas surgen por pasajes sucesivos de clulas
diploides (cultivo primario),
hasta aproximadamente 50 subcultivos
conservando por lo menos un 75% el cariotipo correspondiente a la especie
de que provienen.
2. Lnea continua permite un nmero indefinido de subcultivos, siendo en
general clulas heteroploides. El origen de stas lneas continuas, puede
ser el producto de subcultivar una lnea de clulas diploides ms all
de 50 subcultivos (alrededor de unos 70 pasajes), lo cual provoca una
alteracin en la carga gentica de dichas clulas o por provenir de
clulas transformadas (tipo clulas cancerosas) cuya carga gentica ya
est modificada (clulas heteroploides). Tanto los cultivos primarios
como los cultivos de lnea diploides, as como las lneas celulares
continuas ofrecen ventajas y desventajas que son evaluadas segn el tipo
de trabajo que se plantee.
Ejemplos de LINEAS CELULARES:
HEP-2: Clulas heteroploides humanas derivadas de carcinoma
larngeo. Recomendadas para RSV y ADENOVIRUS.
MDCK: Lnea celular diploide de rin canino; para INFLUENZA y
ocasionalmente PARAINFLUENZA.
LLC-MK2: Lnea celular heteroploide de rin de mono Rhesus. Se
recomienda para el aislamiento del virus PARAINFLUENZA. Requiere
el agregado de tripsina cristalina al medio.
MRC5: Lnea celular diploide fibroblstica de pulmn embrionario
humano. Se recomienda para el aislamiento de CITOMEGALOVIRUS,
HERPESVIRUS.
Materiales:
- 2 Feto bovino u ovino
- Un frasco de suero fisiolgico
- Un frasco de medio de crecimiento (10% de suero fetal Bovino)
- Material de ciruga estril (pinza y tijera)
- Alcohol al 70%
80

-
Un frasco de vidrio de boca ancha

Un Erlenmeyer de 250ml con magneto
2 placas petri
Frasco para cultivo celular
2 pipetas de 10ml, 1 pipeta de 5ml
2 tubos de centrifuga de 10ml
Centrifuga
Agitador magntico
Mechero
METODO POR EXPLANTE

1. Extraer el rgano a ser cultivado que podra ser: cornete nasal,
plexo coroideo, bazo, timo, o clulas de los fetos proporcionados
2. Colocar el pedazo de tejido extrado en una placa petri, cortar una
seccin de aproximadamente 1 x 1cm y colocarlo en un recipiente de
boca ancha o en una placa petri; luego cortar con una tijera
estril en pedacitos tan pequeos como sea posible.
3. Aadir al tejido cortado 5ml de medio de crecimiento y colocarlos
en un frasco para cultivo celular.
4. Rotular el frasco con el tipo de tejido, el nmero del subgrupo y
la fecha para ser llevado a la estufa a 37C por 10 a 15 das.

PRCTICA 18.
INOCULACIN DE HUEVOS EMBRIONADOS Y SU COSECHA

Los huevos embrionados aviares, es un sistema que permite, el
cultivo viral en el laboratorio de una forma sencilla, barata y que no
requiere de equipos sofisticados.
La inoculacin de los huevos embrionados fue uno de los mtodos
empleados para el cultivo de virus, por la susceptibilidad de sus
diversos tejidos a una gran numero de virus tanto aviares, como de otros
animales domsticos y del hombre.
Los huevos embrinados de ave al igual que el cultivo celular sirve
con fines de diagnostico, investigacin, preparacin de vacunas, etc;
debindose emplear huevos libres de agentes patgenos contaminantes.
fig. 41. Huevos embrionados: Materiales
fig. 42. Huevos embrionados: Uso de ovoscopio
82
Materiales:
-
Huevos embrionados de pollo de 6 a 10 das de edad

Taladro y broca de diverso dimetro
Jeringa hipodrmica de tuberculina y agujas
Viales conteniendo los inculos
Colorante Jimnez
Papel watman
Tubos de ensayo y viales estriles
Estufa
Ovoscopio
Desinfectantes (solucin yodada y alcohol al 70%)
Algodn
Bombillas de jebe
Pipetas Pasteur
fig. 43. Estructura del huevo embrionado
I.
Inoculacin en saco vitelino:
La edad ms adecuada de los huevos embrionados

das.
La aguja correcta para la inoculacin : N 23 de 1 o 1

pulgadas
Observar el embrin empleando el ovoscopio. Utilizando con un

lpiz marcar X la cscara del huevo sobre la sombra del
embrin y delimitar la cmara de aire.
es de 5 a 6
Desinfectar el rea con solucin yodada. Colocar el huevo

embrionado sobre el porta huevos, en posicin vertical y con
cmara de aire hacia arriba.
Con el taladro realizar un pequeo agujero en el centro de la

cmara de aire mostrando en forma intacta la membrana de la
cscara.
Tomar la jeringa de tuberculina

de 1 o 1 pulgadas.
Tomar el inoculo (Clamidia) y aspirarlo con la jeringa segn el

numero de huevos por trabajar (0.2ml de inoculo por huevo).
Eliminar las burbujas del inoculo: tomar la jeringa en forma

vertical y colocarlo un pedazo de algodn con alcohol sobre la
aguja, presionar suavemente el embolo hasta eliminar las
burbujas.
Introducir la aguja en forma perpendicular sobre el agujero

atravesando las membranas hasta llegar al saco vitelino y con el
dedo indice presionar el embolo e inocular al saco vitelino de
0.2 a 0.3 ml del inoculo.
y colocarle una
aguja N 23
fig. 44. Va de inoculacin en saco vitelino
II.
Inoculacin en Cavidad Alantoidea

das.
La aguja correcta para la inoculacin : N 25 de
Observar el embrin empleando el ovoscopio. Identificar la

sombra del embrin y la camara de aire, marcar X la cscara
del huevo.
es de 8 a 9
pulgadas
84
Desinfectar el rea con solucin yodada. Colocar el huevo

Con el taladro realizar un pequeo agujero junto a la linea

marcada de la cmara de aire, dejando en forma intacta la
membrana de la cscara.

de pulgadas.
Tomar el inoculo (Virus del New Castle) y aspirarlo con la

jeringa segn el numero de huevos por trabajar (0.2ml de
inoculo por huevo).

aguja, presionar suavemente el embolo hasta eliminar las
burbujas.

dedo ndice presionar el embolo e inocular al saco vitelino de
0.2 ml del inoculo.
y colocarle una
aguja N 25
fig. 45. Va de inoculacin en cavidad alantoidea
III.
Inoculacin en la cavidad corioalantoidea

das.
La aguja correcta para la inoculacin : N 26 de
es de 10 a 12
pulgadas
Observar el embrin empleando el ovoscopio. Identificar la

sombra del embrin y la camara de aire, marcar X la cscara
del huevo.
Desinfectar el rea
con solucin yodada. Colocar el huevo
Con el taladro realizar un pequeo agujero en el centro de la

cmara de aire, dejando en forma intacta la membrana de la
cscara.

de pulgadas.
Tomar el inoculo (Virus de la viruela aviar) y aspirarlo con la

jeringa
segn el numero de huevos por trabajar (0.2ml de
inoculo por huevo).

aguja, presionar suavemente el embolo hasta
eliminar las
burbujas.

dedo indice presionar el embolo e inocular al saco vitelino de
0.3 ml del inoculo.
Sellar la ventana con parafina o cinta masquintape.
y colocarle una
fig. 46. Va de inoculacin Corion Alantoidea
aguja N 26
86

PRCTICA N 19
PRUEBAS INMUNOHISTOQUMICAS
(PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA)
Inmunofluorescencia es una tcnica de laboratorio y su exactitud puede

variar dependiendo del anticuerpo especfico que se est investigando y
del laboratorio que la est aplicando. Por lo general, las clulas, el
tejido o alguna otra sustancia se coloca en el portaobjeto de un
microscopio, luego una pequea cantidad de muestra que contiene los
anticuerpos (tpicamente suero, parte lquida de la sangre).
Existen 2 mtodos
para detectar anticuerpos fluorescentes:
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

Se utiliza el isotiocianato de fluorescena, esta tcnica es empleada por
su especificidad, en la cual se puede observar la clula y comprobar que
la reaccin inmunolgica se produce en un sitio especfico con la
sensibilidad de las tcnicas inmunolgicas. Esta tcnica utiliza
normalmente cultivos de microorganismos sobre la que se desea comprobar
si hay o no anticuerpos en el suero problema. Tras la incubacin con el
suero problema; si hay anticuerpos se unirn a las clulas infectadas
pero no a las no infectadas (especificidad histolgica observable).
La unin se visualiza tras la adicin de un conjugado antiinmunoglobulina marcado con isotiocianato y la posterior observacin al
microscopio de fluorescencia o al convencional, respectivamente.
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD)

La prueba detecta positivos y negativos siendo positiva la muestra
en la cual se evidencia mediante la fluorescencia de la bacteria, lo cual
se produce por la adhesin de los anticuerpos presentes en los sueros a
los que a su vez se adhiere el anti-anticuerpo de la especie conjugado
con la fluorescena.
TCNICA DE IFD
MATERIALES
-
Tubos de portaobjetos de 12 pocillos para IF

Cubreobjetos 24 x 48MM.
Tips.
Pipeta automtica de 20ml.
Cmara hmeda.

-
Estufa de cultivo.
Microscopio para IF.
Agitador rotativo.
Jarra de coplin.
SOLUCIONES Y REACTIVOS
-
Solucin bufferada (pH 7.2) fenolada o formolada al 0,51 (de

muestreos: transporte en refrigeracin).
Solucin de PBS (pH 7.2) (para dilucin y lavados) en
refrigeracin.
Gamma Globulina anti-campylobacter conjugada con Isotiocianato de
Fluorescena (mantener en congeladora).
Glicerina bufferada pH 8.0.
Acetona.
Controles positivos y negativos de Campylobacter.
DILUCIN DE LA GAMMA GLOBULINA:

Se realiza de acuerdo al equipo y lmpara a utilizar con solucin
de PBS (pH 7.2) (estril); fraccionndola en volmenes pequeos para
evitar manipuleos innecesarios.
CONSERVACIN
-
Conjugado puro: a 20 C
Conjugado diluido: 4- 8 C (7 das)
PROCEDIMIENTOS:
-
Identificar y rotular las muestras.

Centrifugacin de limpieza: a 500 (g) durante 5 minutos.
Se traspasa a tubos, descartando el sedimento.
Centrifugacin final: a 5,000 (g) durante 30m.
Se descarta el sobrenadante y se trabaja con el sedimento.
Montaje de la muestra.
En el portaobjeto de 52 pocillos limpios y desengrasados se coloca
en el primer pozo 1 gota de control negativo y en los dems pozos
una gota (20ul) del sedimento de las muestras a investigar
utilizando la pipeta automtica.
Secar los portaobjetos a temperatura ambiente.
Fijar los portaobjetos por 10 minutos en acetona.
Lavarlos con solucin de PBS (pH 7.2) x 10 minutos.
88

-
Secar en estufa.
Colocar 1 gota del conjugado diluido (10ml) en c/u de los pocillos
e incubar en la cmara hmeda a 37 C durante 30-45 minutos.
Lavar 2 veces el porta x 10 minutos con solucin de PBS (pH 7.2).
Secar en estufa.
Colocar el cubreobjeto con una gota de glicerina bufferada (pH
8.0).
Observar al microscopio con no menos de 400x.
Se confirma la presencia de formas compatibles con Campylobacter
mediante la observacin a 1000x.
fig. 47. Tcnica de Inmunofluorescencia : Se usa diferentes marcadores de

fluorescencia como: Izquierda rodamina (rojo) y Derecha -fluorescena (verde)
Esquema 12. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Se le aade la muestra
problema (suero)
Portaobjetos conteniendo
cultivos celulares infectados con
el virus o bacteria en estudio
Observacin en el microscopio
de Fluorescencia
Se realiza un lavado para

eliminar Acs no especficos
Se agrega conjugado conteniendo

antinmunoglobulina marcada con
isotiocianato de fluorescena
Esquema 13. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
Sobre un porta depositamos una

muestra en la que buscamos
presencia de un determinado
antgeno.
Aadimos un suero especfico del

antgeno problema marcado con
isotiocianato de fluorescena
(conjugado).
En caso contrario el conjugado se

elimina con un lavado del porta.
Si el antgeno problema se
encuentra presente en la
muestra, se une el conjugado.
90
BIBLIOGRAFA
Atlas, R.M. Microbiologa. Fundamentos y aplicaciones. Cia. El Cont. S.
A. de C. V. 1998.
Bach, Jean
Francois; Ph. Lesarve. Inmunologa. Ed. Masson 1990.
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Tortora G, Funke B, Case Microbiologia. 10 Edicin. Artmet. Brasil,

2012.
92
GLOSARIO
Acidfilo
Bacterias que desarrollan mejor a pH menor a 5.5
Aerbico
Requiere oxgeno libre para la respiracin.
Aerobio facultativo
Crecimiento bacteriano en presencia o ausencia de

oxigeno libre.
Alcalofilo
Bacterias que desarrollan mejor a pH mayor a 8.0
Anaerobio
No requieren oxigeno libre para la respiracin.
Anaerobio obligado
Muerte de bacterias en presencia de oxigeno,

crecimiento solo en ausencia del mismo.
Antibacteriano
Agente que destruye a las bacterias.
Bactericida
Con actividad letal antibacterial.
Bacteriosttico
Agente que detiene el crecimiento bacterial.
Colonia bacteriana
Agrupacin de un tipo de clulas bacterianas

sobre un medio de cultivo.
Cultivo diferencial
Crecimiento de los microorganismos, causando un

cambio visual en el medio de cultivo.
Cultivo selectivo
Permite el crecimiento particular de

bacteria, por que hace uso de inhibidores.
Fisin binaria
Proceso a travs del

bacterianas se replican.
UFC
Unidad formadora de
colonias (en gramo o
mililitro), esta es la forma estndar de medir a
nivel bacteriano.
Mesfilos
ptimo crecimiento entre 25 y 40 C
Microaerfilos
ptimo crecimiento en bajas concentraciones de

oxigeno.
Psicrfilo
ptimo crecimiento entre 4 y 20 C algunos hasta

0C.
Termfilo
ptimo crecimiento entre 50 y 60 C algunos

hasta 100 C
Sensibilidad
Susceptibilidad
antibacteriano.
Serologa
Parte de la medicina que estudia los sueros y sus

propiedades, especialmente las inmunolgicas.
de
una
cual,
las
bacteria
una
clulas
hacia
un
ANEXO
1. .Materiales de laboratorio
94
Figura 1.- Asa en aro
Figura 2.- Asa en recta
Figura 3.- Autoclave
Figura 4.-Beaker
Figura 5.- Centrifuga
Figura 6.- Esptula c/ mango de madera
96
Figura 7.- Horno o estufa para

esterilizacin
Figura 8.- Incubadora de

laboratorio
Figura 10.- Lminas portaobjeto
Figura 11.- Pinza de madera
Figura 12.-Probetas
98
GLOSARIO MICROBIOLOGICO.
1.
....................................,
2.
.....................................,
3.
......................................,
4.
....................................,
5.
.....................................,
6.
......................................,
7.
....................................,
8.
.....................................,
9.
......................................,
10.
....................................,
11.
.....................................,
12.
......................................,
13.
....................................,
14.
.....................................,
15.
......................................,

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Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria - 2016

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLGICAS

MV. SIEVER MIGUEL MORALES CAUTI

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria - 2016

Agradecimiento especial por la colaboracin en la re-edicin de la presente gua de

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

fig. 1. Hisopado nasal en cerdo ....................................... 19

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria - 2016

Macroconidias de M. canis .................................... 73

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

El trabajo con los microorganismos se clasifican segn cuatro

Grupo de nivel de riesgo 1. (Riesgo individual y comunitario escaso o

A su vez los tipos de actividades u operaciones que se pueden

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria - 2016

B: Actividad que multiplica y/o disemina el microorganismo.

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria - 2016

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

BIOSEGURIDAD, RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO

Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:

B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposicin directa

C) Medios de eliminacin de material contaminado: Comprende el conjunto de

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria - 2016

Proteccin de la piel: Usar guantes limpios, no necesariamente

Proteccin ocular: La proteccin ocular y el uso de mascarillas

Proteccin corporal: A travs del mandil blanco de manga larga.

No comer, beber, ni fumar en el laboratorio

No manipular el sistema elctrico con las manos hmedas.

Las mesas de trabajo deben estar desinfectadas antes de inicio y

Ser cuidadosos en el manejo de los equipos y material de trabajo.

Coordinar permanentemente con el responsable de la prctica el

Antes de realizar observaciones en el microscopio, analizar

10. Revisar que los grifos queden cerrados.

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

RECOMENDACIONES PARA ALUMNOS:

La asistencia a las prcticas es obligatoria: si pierde una prctica

El estudiante ingresar al saln de prctica llevando consigo,

El alumno deber leer con anticipacin la prctica correspondiente a

Los alumnos se agruparn en las mesas de trabajo y realizarn las

No efectu las experiencias mecnicamente, sino entendiendo el

No se debe comer, fumar ni beber agua de los grifos.

Debe cuidarse el equipo y material, cumpliendo las instrucciones del

Cualquier accidente como rotura de tubos con medios o derrame de

Durante la prctica anotar todas las ocurrencias

Las mesas de trabajo deben mantenerse libres de material innecesario

Etiquetar el material cuando sea necesario para que pueda ser

Tener especial cuidado cuando maneje material contaminado

Al finalizar la prctica deber ordenar el material utilizado sobre

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria - 2016

Para trabajar en las prcticas de microbiologa, se requiere de

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

Puede definirse la esterilizacin la como destruccin completa de todas

CALOR SECO (HORNO)

Ebullicin: El agua hirviendo a temperatura de 100C por 10

Autoclave: El vapor a 15 libras de presin y una temperatura de 121

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria - 2016

Esquema 2. Flujo laminar

ESTERILIZACION POR MTODOS QUMICOS

Gua de Prctica de Microbiologa Veterinaria

Proceso mediante el cual un agente qumico destruye microorganismos

la temperatura alcanza los

Aprender a utilizar las tcnicas de esterilizacin.