Electroforesis: Migracin de una partcula cargada en un campo elctrico

(voltaje determinado).
Voltaje mayor, mayor fuerza, mayor velocidad de migracin.
Tambin separa las molculas de acuerdo a sus cargas.
Carga 3 mlV. La que tiene masa menor va a migrar al electrodo positivo que
la que tiene una masa mayor.
Es un mtodo separativo con una relacin masa/carga.
S o s necesitamos una partcula cargada para que pueda migrar al electrodo
correspondiente.
Qu hace que est cargada positiva o negativamente? Depende de los
residuos de aa, de los grupos terminales, de los radicales de los aa, para
ofrecer carga positiva o negativa de acuerdo al tipo de entorno en el cual se
encuentra.
Normalmente se intenta simular las condiciones del medio sobre todo cuando
se trabaja con biomolculas que estn en los organismos vivos, por ejemplo
para simular condin de enzimas de pncreas, se utiliza pH 8 ms bien son pH
bsicos que hacen disociaciones ms bien de todos los aa, pero no siempre es
as, pe puede trabajar con hongos, bacterias, etc.
Tipos de electroforesis:
1. De frente mvil: Tubo en forma de U, se coloca agar, dos electrodos,
agraga pool de protenas, se aplica voltaje, con una fuente de poder, se
produce separacin en bandas de las protenas.
2. De zona:
Soporte Inertes: No interaccionan con las partculas cargadas.
Papel: Papel de filtro con un buffer de corrida electrofortica. Molculas
bien cargadas. Aplicacin: Purificacin de aa y las pequeas molculas
no puede separar muy bien el papel. La mejor forma para separar pool
de pptidos primero utilizar soporte en papel y despus uno va a los
distintos geles para poder utilizarlo como soporte.
Se puede trabajar con un patrn e peso conocido.
Pool de vegetales, tiene ms proteasa. La proteasa como tiene bajo peso
molecular va a migrar ms que la enzima de inters que tiene mayor
cantidad de masa molar. Vamos a suponer que nos da una fraccin de 50
kilo Dalton (50000 gramos/mol) me dice que hay una protena (bibsica
creo) . Que puede estar presente, es ms o menos como un indicador.
La textura del papel no se puede variar fcilmente, las tramas de los geles s.
GELES
1. Gel de Almidn: Para isoenzimas. Por ejemplo: Calcio ATPasa de
eritrocitos con respecto a Calcio ATP asa de Islotes de Langerans, puede
discriminarse o separase. Esa relacin de cargas va contemplando mejor

el gel de almidn que otros tipos de geles. Contiene una trama de

uniones glicosdicas que no se carga muy fcilmente como los otros tipos
de geles. Hasta el papel por friccin se puede llegar a cargar. Se separa
solamente determinando las cargas que tienen esas isoenzimas (tienen
masa parecidas). Tambin separa protenas que son pequeas. Se utiliza
electroforesis horizontal. El espesor del gel es mucho ms grande que lo
que sera una lmina de papel. Para cargar la muestra se hace una fisura
de tal manera que la protena va migrando a travs del soporte

2. Gel de Poliacrilamida: Tiene varios entrecruzamientos, entramados de

diferentes concentraciones de acuerdo a la concentracin de acrilamida
que se le vaya poniendo, entonces se puede lograr geles al 5%, 10%,
50% etc. Separa protenas, pero permite conocer cmo se separa las
subunidades de las protenas, si se tiene un tetrmero, es muy
posible que se separe en 4 de subunidades de protenas. Tcnica
combinada con Dodecil Sulfato de Sodio que es un agente
desnaturalizante (detergente) hace que las estructuras, las subunidades
vayan separndose y permite estimar las masas molares de cada
una de las subunidades, se puede reconocer tambin el nmero de
subunidades presentes.
Los geles y el papel permiten recortar las bandas del electroforetograma de
tal manera que se pueda eluir en un disolvente Buffer de elusin (puede ser el
mismo buffer de corrida electrofortica)
En gel de poliacrilamida usando SDS ya no se puede hacer ya es una
tcnica destructiva de la protena nativa, ya no se puede reconstituir.
Luego los investigadores empezaron a diferenciar dos tipos de geles en las
electroforesis verticales que son:
Gel de concentracin y Gel de Separacin.

ELECTROFORESIS DSCONTNUA, PREVIAMENTE HAY UNA CONCENTRACIN Y

LUEGO UNA SEPARACIN.
Tambin permite separar por PUNTOS ISOELCTRICOS, mismas masas pero con
Puntos Isoelectricos distintos. Se puede tener una variacin de polielectrolitos
que se puede ir poniendo gradiente de polielectrolitos en el buffer de
separacin, son polielectrolitos distintos que estn a distintos valores de pH, se
comparan por ejemplo los de pH = 7, pH = 8 y pH= 9 por ejemplo.
Gel de concentracin ms entramado que el gel de separacin. Lo que hace es
concentrar a las protenas que ha sido sembrada en diferentes canalculos.
El gel de separacin va separando las bandas correspondientes, en relacin a
la masa/ carga.
NORMALMENTE EL DEL PAPEL Y ALMIDN SON HORIZONTALES, EL DEL
GEL DE POLIACRILAMIDA ES VERTICAL.
EQUIPOS:
Cuba electrofortica.
3. Gel de Agarosa: Son geles horizontales, especial para DNA doble hebra
de simple hebra.
WEBER Y OSBOR

Demostraron que si una serie de protenas de peso molecular conocido

eran sometidas a electroforesis en gel, stas se separan en bandas.

Lneas rectas. Grfico Distancia migrada en funcin al Log M. Precisin 5

10% (+) para conocer PM de muestras desconocidas.
Mtodo comnmente utilizado en gel de poliacrilamida para reconocer
las masas molares de las subunidades de una protena.
Deteccin de protenas con abundante residuos y uniones S-S.
Glicoprotenas no es utilizable.

AUDIO
Trabajaron con la velocidad de migracin y graficaron Log PM en funcin al Log
Mobilidad electrofortica. Vean menor PM mayor movilidad electrofortica.
Los patrones de masas molares que hoy se utiliza, puede ser un mix de 6, 7
protenas, cuantas ms protenas tenga, es ms costoso. Un mix si est en gel
de poliacrilamida o en gel de almidn, se separn de esta manera, ya que
tienen cierta movilidad electrofortica para cada una de las masa molares
correspondientes.
En funcin a eso si tengo una muestra desconocida y si quiero conocer su
masa molar, contemplar en el mismo experimento y calcular movilidad
electrofortica y de esa manera se puede estimar su peso molecular.
A parte de ser un mtodo separativo es un mtodo para estimar la masa molar
de la biomolcula, pero hay que hacerlo en el mismo experimento.
SON MTODOS FISICOQUMICOS COMPLEMENTARIOS UTILIZADOS EN LA
MICROSECUENCIACIN DE PPTIDOS Y AA.
Con la degradacin? Se puede estar seguro que se haya separado de sus
subnidades con las tcnicas de electroforesis se puede estar seguro y evaluar
en funcin a los experimentos de Orborn la masa molar de las subunidades.
Deteccin de protenas con abundantes residuos y uniones SS.
SDS PAGE
Tcnicas estandarizadas para la determinacin de pesos
moleculares de cadena simple y de polipptidos. Ejemplo Fraccin de Ig.
Fundamento: Intercalacin con SDS, se generan estructura de ramdom coil
que va migrando dentro del gel de separacin.
Reactivos: 1 %
desnaturalizacin.

SDS,

0,1

de

mercaptoetanol

para

favorecer

la

A pH neutro. Hay una prdida de estructura secundaria con formacin de

ramdom coil que facilita la separacin en subunidades.
RESUMEN
Electroforesis: Migracin de partculas cargadas en un campo elctrico
(diferencia de potencial determinada).
Es un mtodo separativo tomando en cuenta relacin masa/carga.

Sirve para ESTIMAR (no para calcular) la masa molar de DNA, RNA, de aa,
polipptidos, protenas, isoenzimas, enzimas etc.
Puede ser de dos tipos:

Movimiento libre.
Movimiento zonal: Utiliza soporte que puede ser de gel de almidn,
papel, gel de agarosa etc.

En funcin a los tipos de geles hay electroforesis verticales y horizontales.

Tcnicas separativas:

Electroforesis: Separar.
Sedimentacin: Solo para separar.
Filtracin: Separar, purificar y concentrar.

Una vez que tengo un extracto debo hacer SEDIMENTACIN, LUEGO

FILTRACIN Y POR LTIMO ELECTROFORESIS.

Se aplica cuando la partcula sedimenta muy lentamente. Velocidades

mayores que la centrifuga.
Si el pellet obtenido por centrifugacin es de difcil resuspencin.
En paquetes de clulas radiactivo. Cuando hay biomembranas que estn
marcadas con isotopos radiactivos.
Metodologa alternativa a la sedimentacin.

Aplicaciones:

Purificacin, eliminacin de impurezas indeseables que quedan en el

filtro o pasan al filtrado. Por ejemplo: Desalado, no solo por dilisis
tambin por gel filtracin usando Sephadex de 100, 200
Esterilizacin de sustancias y soluciones (agua estril, solucin buffer,
estril, solucin ringer o sueros estriles).
Separacin de distintas formas de ADN (lineal o circular) de doble o
simple hebra por un proceso de Absorcin selectiva (fenmenos de
superficies, fenmenos de transporte, hay transporte a travs de los
filtros, hay fenmenos de absorcin superficial).
Concentracin Ultrafiltracin, logra gran cantidad de salida de agua
superficial de las protenas, s o s debe hacerse ultrafiltracin al liofilizar
las protenas.
Inmovilizacin en filtros, para preparacin de improntas. Test de
ELISA. 1.09