EL EMBRIN DE POLLO COMO MODELO DE EXPERIMENTACIN:

VEN Y DESCUBRE LA EMBRIOLOGA

XIV Semana de la Ciencia en Madrid.
Julio Contreras Rodrguez, Pilar Martnez Sainz, Inmaculada Santos Rodrguez y Concepcin
Rojo Salvador.
Dpto. Anatoma y Anatoma Patolgica Comparadas.
Facultad de Veterinaria. UCM

I.

INTRODUCCIN

La gran contribucin de las aves como modelo de investigacin biomdica es

incuestionable. Distintas especies (gallina, codorniz, pato...) han sido utilizadas como
modelos en estudios tanto del desarrollo, como en ciertas patologas o estudios quirrgicos.
Adems, el hecho de ser las aves susceptibles a diversos virus las ha convertido en objeto de
inters para microbilogos y se han utilizado para el consiguiente desarrollo de vacunas.
El huevo de ave ofrece un mecanismo para el estudio del desarrollo embrionario y la
patologa de forma muy accesible y detallada, sirviendo como modelo para el estudio de
mltiples aspectos ontognicos y teratognicos.
Existen ventajas importantes para el uso de las aves como modelo de investigacin, y
concretamente del embrin de pollo en el que nos centraremos:
1. Los huevos fertilizados de pollo son baratos, se desarrollan en 20-21 das y
pueden ser fcilmente mantenidos en incubadores comerciales, con gran
adaptacin al laboratorio, sin necesidad de grandes instalaciones ni
atenciones.
2. A diferencia de otras especies tradicionales de animales de laboratorio, su
mantenimiento es mucho menor y los costes se reducen mucho.
3. Este embrin es accesible y fcilmente manipulable, siendo numerosos los
experimentos en que se intercambian regiones en desarrollo incluso entre
especies (quimeras).
4. Adems, clulas y distintos tejidos del pollo son factibles de ser llevados a
condiciones de cultivo celular, lo que ampla como veremos ampliamente las
posibilidades de trabajar, pues a los posibles tratamientos o modificaciones
in vivo se aaden una gran cantidad de posibilidades de trabajo in vitro.

II. EL HUEVO DE LAS AVES

Debemos conocer y comprender la estructura del huevo para su posterior
manipulacin en los distintos experimentos que planteemos. El huevo de un ave es en
realidad un oocito u ovocito gigantesco, con gran cantidad de yema o vitelo y que se va
formando en el tracto reproductivo de la hembra (en el caso que nos ocupa de la gallina). El
huevo de gallina es por tanto macrolectico y telolectico (mucho vitelo que se dispone en un
polo o extremo) a diferencia de los mamferos que ser microlectico e isolectico (poco
vitelo de distribucin homognea). Esta caracterstica es la que condiciona las fases
tempranas del desarrollo muy diferentes en aves a las de los mamferos.
El ovario de la gallina contiene muchos folculos que varan en tamao dependiendo
de la cantidad de yema que acompae al oocito. El ovocito estar formado por un ncleo o
vescula germinal, un citoplasma formativo o mancha germinal, en conjunto por el
disco germinal. Adems est el vitelo o yema, formado por una masa central blanca o
latebra, rodeada por capas concntricas de vitelo blanco (protico) y vitelo amarillo
(lipdico).Tras la ovulacin el ovocito recubierto por su membrana vitelina, o membrana
secundaria segregada por el ovario (su porcin o capa interna), progresa por el oviducto
izquierdo (no hay tero en aves y el oviducto y ovario derecho degeneran tras nacer) donde
se ir recubriendo de las membranas terciarias, cuya misin ser proteger al embrin y
contribuir a su nutricin. Estas membranas sern:
-La porcin externa de la membrana vitelina. Dicha membrana en su conjunto
parece que juega un importante papel en el intercambio de agua o algunas
sustancias.
-El albumen o albmina que rodea al ovocito. Tiene dos componentes, uno
denso y otro claro. Adems existen unos ligamentos que se condensan alrededor de
la membrana vitelina, las chalazas, que mantienen al ovocito en el centro del
albumen.
-Las membranas testceas, interna y externa. Formadas por fibras de
queratina entrecruzadas. A nivel del polo obtuso del huevo se separan y dejan entre
ellas un espacio o cmara de aire, que equilibra la presin en el interior del huevo
conforme se evapora el agua que contiene.
-La cscara o cubierta externa del huevo de carbonato clcico, que se aplica
directamente contra la membrana testcea externa. Contiene muchos poros de
pequeo dimetro y cerrados por una cutcula proteica.

III. EMBRIOLOGA BSICA EN AVES

A. Formacin de las membranas extraembrionarias
Distintas capas distales al embrin temprano (somatopleura y esplacnopleura) se
extienden sobre el vitelo, ms all del cuerpo del embrin, constituyendo las membranas
extraembrionarias. Lo primero en aparecer ser el saco vitelino, y tendr gran importancia
por la red vascular que lleva asociada (vasos vitelinos). Conforme se limita el cuerpo del
embrin los pliegues laterales que se forman se hacen mayores y tienden a cerrarse por
encima del embrin, conformando el amnios y el corion. Por ltimo tendremos el alantoides,
que aparece como un divertculo del intestino posterior y crece hasta fusionarse con el
corion. Los vasos del alantoides son fundamentales para el intercambio gaseoso del
embrin.

B. Estadios iniciales del desarrollo

El conocimiento del desarrollo del embrin de pollo nos ayudar a tener una
perspectiva dinmica de la anatoma al mostrar una visin histrica de la gnesis de los
distintos tejidos y rganos del animal, lo que a su vez nos permite comprender con ms
facilidad la morfologa del ave adulta. De esta manera podremos elegir el momento concreto
del desarrollo en que queremos actuar en nuestra experimentacin. Por otro lado,
conociendo la embriologa del ave podemos analizar las diferencias con los mamferos, lo
que ser de utilidad a la hora de plantear nuestra investigacin, decantndonos por el
modelo animal ms apropiado para el experimento concreto a realizar.
La fertilizacin tiene lugar en el infundbulo del oviducto de la gallina, que es la
primera porcin del mismo. Conforme el huevo progresa por el oviducto, como ya hemos
visto, el embrin sufre en primer lugar los procesos de SEGMENTACIN o divisin ovular.
Esta divisin ser condicionada por el vitelo, y ser incompleta o meroblstica, con cuatro o
cinco divisiones con carioquinesis o divisin del ncleo completas, pero con citoquinesis o
divisin del citoplasma incompletas. Estas clulas abiertas estarn abiertas a la masa
vitelina. En este momento el disco germinal pasa a denominarse blastodermo o blastodisco.

Alrededor de la segmentacin en estadio de 64-clulas tendremos clulas como tal,

llamadas blastmeras. Pronto se limitan los elementos celulares y se separan del vitelo
subyacente, apareciendo entre ambos un espacio o cavidad subgerminal. Las blastmeras
que cubren directamente la cavidad son las blastmeras centrales, que al igual que el nudo
embrionario de mamferos formar las estructuras embrionarias. Las clulas ms perifricas,
las blastmeras marginales, formarn algunas de las membranas extraembrionarias. En este
momento tendremos un blastodermo que presenta externamente dos regiones: el rea
pelcida, o central que se sita encima de la cavidad subgerminal, y el rea opaca, o
perifrica. En el transcurso de la segmentacin se establecen los ejes de polaridad del
embrin: primero el eje dorso-ventral y despus el craneo-caudal.
Aproximadamente en el momento de la puesta se desprenden clulas del
blastodermo por un proceso de delaminacin, que comienza en el polo caudal,
obtenindose una BLSTULA con clulas en la superficie, o epiblasto, y clulas en
profundidad, o hipoblasto. Entre ambas poblaciones tendremos una cavidad o blastocele.

El proceso de GASTRULACIN se inicia con un engrosamiento en el polo posterior del

blastodisco, en la zona marginal posterior, por una expansin en esta zona del epiblasto. Se
inicia as un desplazamiento hacia la lnea media de las clulas del epiblasto en una
secuencia caudorrostral, acumulndose clulas en la lnea media caudal. Esta convergencia
progresiva de clulas en la lnea media es la lnea primitiva, que marca la situacin del futuro
eje longitudinal del embrin. El extremo craneal de sta lnea primitiva se ensancha y
conforma el denominado nudo primitivo o nudo de Hensen.

A partir de la lnea primitiva, y concretamente del surco primitivo, clulas de origen

epiblstico abandonan su localizacin y por un lado alcanzan el hipoblasto, al que desplazan,
formando el endodermo intraembrionario. Por otro lado, la mayor parte de clulas que
abandonan el epiblasto por la lnea primitiva forman una poblacin mesenquimatosa que
forma el mesodermo. Este proceso que sufren las clulas epiblsticas se denomina
involucin. El resto superficial de epiblasto se transforma en un epitelio que se denomina
ahora ectodermo, con lo que ya tendremos las tres hojas germinales del embrin.
Acompaando a este proceso la lnea primitiva, tras llegar a su mximo desarrollo, sufre una
regresin durante la cual se forma el esbozo de la notocorda y el mesodermo paraaxial o
somtico. Este mesodermo forma los somitos, que son bloques pares que irn apareciendo y

que nos servirn, junto con otras caractersticas, a asignar al embrin un estadio conforme a
la clasificacin de Hamburger y Hamilton (1951). Estos somitos se diferenciarn en
dermatomo (origen de la dermis), miotomo (origen de msculos) y esclerotomo (origen de
estructuras esquelticas).
A partir de este momento, y contando ya con las tres hojas germinales embrionarias,
comienza el PERIODO ORGANOGENTICO. A partir de dichas hojas, aparecen los esbozos de
los rganos. En primer lugar se produce un fenmeno de neurulacin inducido por la
notocorda.
C. Neurulacin y formacin del Sistema Nervioso en aves
Durante la fase de la neurulacin tiene lugar la formacin del tubo neural, y adems
el comienzo del desarrollo del tubo digestivo, del corazn y de la delimitacin del cuerpo
embrionario a partir de las tres hojas embrionarias.

La neurulacin
comienza
con
un
engrosamiento
del
ectodermo en la lnea
media dorsal, que formar la placa neural, cuyos bordes laterales se elevan dando los
pliegues neurales. Posteriormente la depresin de la placa conforma el canal neural. La
confluencia en la lnea media de los pliegues termina en la fusin de los mismos,
formndose el tubo neural. La parte ms dorsal de los pliegues dar adems la cresta neural.
Los extremos son los ltimos en cerrarse, dejando los denominados neuroporo rostral y
caudal. Simultneamente a la formacin del tubo neural, la regin ceflica del embrin crece
sobre la superficie del blastodisco y se alarga, formando el pliegue ceflico. El conjunto de
tejidos ceflicos elongados se llaman proceso ceflico.

La porcin ceflica del tubo neural, que

presenta en un principio tres vesculas que
rostrocaudalmente son: prosencfalo, mesencfalo y
rombencfalo. La primera de ellas se dividir a su vez
(estadio 12) en telencfalo y diencfalo, y la ltima en
otras dos (estadio 11): metencfalo y mielencfalo.
El sistema nervioso perifrico se forma desde
clulas de la cresta neural que darn, entre otros tipos
celulares, neuroblastos que producirn clulas
sensoriales y autnomas, que a su vez formarn parte
del sistema simptico y parasimptico. En su conjunto,
la cresta neural produce muy diversos derivados en el individuo, y sufre durante el
desarrollo una interesante migracin celular, muy estudiada utilizando el pollo como
modelo.

IV. TCNICAS DE ESTUDIO

Existen muchas y variadas tcnicas de estudio que utilizan el embrin de pollo como
modelo experimental. A continuacin pasaremos a comentar algunos aspectos prcticos de
su uso en una experimentacin, aportando ejemplos concretos que muestren las ventajas
que proporciona dicha utilizacin.
A. Incubacin
Comenzaremos hablando sobre cmo obtener embriones de pollo, primer paso a la hora
de plantear cualquier estudio en embrin de ave. Normalmente se trabaja con huevos
fertilizados o embrionados proporcionados por granjas productoras de los mismos o de
pollos de un da, que son los que se venden habitualmente a las granjas para su engorde.
Estos huevos deben mantenerse a una temperatura ideal de 10-12C antes de incubar,
tiempo que debe ser el menor posible pues darn mejor resultado los huevos frescos.
Huevos conservados por debajo de 4C reducen su viabilidad para incubar. Por encima de
27C comienza el desarrollo aunque de forma alterada. Utilizaremos un incubador comercial
que consta de una cmara con termostato ajustado a la temperatura idnea, que ser de 3738C, la cual debe mantenerse constante. Debe tambin evitarse la deshidratacin del
embrin, para lo que se dispondr de un recipiente con agua en la base del incubador, que

asegura una humedad alta. Adems, si se realizan experiencias que sobrepasen la semana de
incubacin, deber contar el incubador con un sistema de volteo del huevo que favorecer
el desarrollo del animal y evitar que ste se pegue a las membranas testceas o de la
cscara.
B. Datacin del embrin
Es importante conocer la edad del embrin en el momento concreto de su
utilizacin. La mayora de los procesos embriolgicos tienen una historia muy definida y
elegiremos un momento concreto para realizar nuestro experimento. Por ello existen
diversas clasificaciones de los distintos estadios del desarrollo. Estas clasificaciones se
denominan tablas normales, y la ms ampliamente utilizada en el caso del pollo es la tabla
de Hamburger y Hamilton (1951, 1992), basada en signos externos apreciables en el
embrin y permite un rpido reconocimiento del estadio a utilizar. En las prcticas
manejaremos estas tablas para familiarizarnos con la datacin del embrin. No obstante y
como en algunas edades plantea algn problema de correlacin, sobre todo en fases muy
tempranas, y tambin en relacin con las horas para cada estadio, lo mejor es realizar una
tabla personal de horas con el incubador a utilizar y su correlacin con la tabla de
Hamburger y Hamilton. Adems si trabajamos con animales mayores de 4 das lo normal es
referir cada edad en base al nmero de das de incubacin.
C. Tcnicas in ovo
Se pueden realizar muchos experimentos permitiendo que el desarrollo del animal
contine tras nuestra manipulacin, pudiendo comprobar el resultado de nuestra
intervencin en el tiempo. En este tipo de experimentos el embrin de pollo es muy
interesante, y la existencia del huevo facilita mucho el manejo y las manipulaciones a
realizar en el embrin.

En esta lnea estn todas las experiencias de

quimeras, que tantos resultados han
prestado y prestan en la actualidad a la
embriologa experimental. Por medio de las
quimeras podemos realizar transplantes de
grupos de clulas o tejidos en otra especie
que permita una diferenciacin del
hospedador y el injerto. Esto es posible con
la codorniz y el pollo. Las clulas de la
codorniz presentan un gran nucleolo, con
una heterocromatina densa, mientras que
en el pollo normalmente hay dos o ms
nucleolos (le Douarin, 1969). De esta forma
se pueden diferenciar los tejidos mediante
la tcnica de Feulgen (que marca ADN) o
una modificacin del mtodo de
hematoxilina de Harris.

codorniz

pollo

Diversos injertos autlogos o heterlogos en la misma especie se pueden tambin

realizar para comprobar como se desarrolla el injerto en otro lugar diferente al fisiolgico. El
grado de implantacin y supervivencia en el pollo es muy alto, lo que convierte a esta
especie y al modelo embrionario en el de eleccin para muchas experiencias con injertos.

Otras tcnicas in ovo sern las inyecciones o duchas de alguna sustancia como
pueden ser anticuerpos bloqueantes, o las bolitas impregnadas de una molcula a testar, o
transferencia de genes por medio de virus, que permitan sobreexpresar la molcula que nos
interese estudiar.
La secuencia de trabajo en todas estas tcnicas ser la misma. Tenemos que exponer
el embrin a nuestra manipulacin pero de manera que el animal pueda proseguir su
desarrollo y obtener un porcentaje de supervivencia aceptable. Este porcentaje vara segn
la tcnica realizada, el estadio del que se parte y al que queremos llegar, etc.
D. Otras tcnicas de estudio.
Dentro de este epgrafe comentaremos algunas tcnicas ampliamente utilizadas que
no se realizan in ovo.
Por un lado hablaremos de tcnicas o estudios de expresin, por las que
evidenciaremos aspectos morfolgicos (histologa e inmunohistoqumica) o bien
analizaremos la expresin del elemento que nos interese estudiar (inmunohistoqumica e
hibridacin in situ). La mayora de experiencias in ovo terminan con un estudio morfolgico
en el que se busca encontrar un marcador determinado para evidenciar las modificaciones
provocadas por nuestra actuacin. Todas estas tcnicas tienen como denominador comn la
extraccin del embrin en un estadio determinado (tabla de Hamburger-Hamilton) y una
posterior preparacin para la realizacin de la tcnica, que habitualmente se inicia con la
fijacin del embrin o regin del embrin a estudiar.

Otras tcnicas sern los estudios in vitro, donde se realizan cultivos de partes u
rganos en formacin del embrin, constituyendo un modelo experimental muy interesante
para el estudio de mecanismos del desarrollo.

V. DESARROLLO PRCTICO DEL TALLER

Realizaremos el estudio del desarrollo de las primeras fases del embrin de pollo con el
fin de comprender como tienen lugar algunos de los procesos fundamentales en embriologa,
as como la utilidad de este modelo en experimentacin animal y la importancia de conocer los
distintos fenmenos ontognicos.
Realizamos la apertura del huevo como si quisiramos realizar alguna tcnica in ovo.
Tenemos que exponer el embrin a nuestra manipulacin pero de manera que el animal
pueda proseguir su desarrollo y obtener un porcentaje de supervivencia aceptable. Para
exponer el embrin se realizan dos orificios en los polos del huevo y a continuacin se
levanta la cscara con cuidado, y ayudados por la punta de una tijera, se rasgan las
membranas testceas y se aade suero o un tampn, que separa el embrin y vitelo de la
cscara. Ahora se extrae albmina (clara) para conseguir reducir un poco el volumen del
contenido del huevo, y que el embrin descienda, quedando un espacio entre las
membranas testceas y el contenido del huevo. Ahora disecamos las membranas testceas y
aadimos una solucin del colorante rojo neutro al disco embrionario o al embrin, que nos
permitir visualizar mejor el embrin in toto y el resto de las estructuras. Procederemos a la
datacin (clasificacin Hamburger y Hamilton, 1951) y estudio de embriones de ave de distintos
estadios HH, que correspondern a 24, 48, 72, 96 horas de incubacin.
Tambin procederemos a aislar el embrin y observarlo detenidamente tras una
seccin en U de las envueltas del mismo, lo recogeremos con unas pinzas finas sin tocarle.
Posteriormente lo depositaremos en una placa de Petri con una solucin tampn o agua, y
bajo lupa realizaremos una diseccin consistente en eliminar todas las envueltas que
acompaan al embrin (restos de vitelo, membrana vitelina, amnios...) para una mejor
visualizacin de las distintas estructuras y regiones de inters embrionario.
Embrin de los estadios HH 4-6 (18-24 horas de incubacin).
Identificacin de las reas pelcida y opaca y formacin de la lnea primitiva, surco
primitivo y nodo de Hensen.

Embrin de los estadios HH 13-15 (48-55 horas de incubacin).

Estudio de los derivados de las capas germinales primordiales. Derivados ectodrmicos:
vesculas enceflicas (prosencfalo, mesencfalo y rombencfalo), esbozo de las vesculas
ptica y tica o auditiva, tubo neural y neuroporo caudal, flexura craneal. Derivados
mesodrmicos: notocorda, somitos. Endodermo: tubo digestivo. Inicio de la vascularizacin
extraembrionaria (venas vitelinas, rea vasculosa y seno terminal). Corazn latiendo y
establecindose la circulacin embrionaria primitiva. Formacin del primer par de arcos
viscerales y arcos articos. Cabeza rotada hacia la izquierda y pliegue ceflico amnitico
revistiendo las vesculas enceflicas.
Embrin del estadio HH 20-25 (72-96 horas de incubacin).
Establecimiento de los pliegues corporales laterales y rotacin del cuerpo. Cierre del
amnios. Esbozo de miembros torcicos y pelvianos. Cuatro-cinco arcos viscerales o branquiales
y arcos articos. Flexura cervical y cabeza rotada centralmente. Diferenciacin de las vesculas
enceflicas definitivas. Circulacin embrionaria y extraembrionaria.

Nivel del corte para

extraer el embrin.

Bibliografa
A series of normal stages in the development of the chick embryo. V. Hamburger and H.L.
Hamilton. J. Morphol. 88, 49-92 (1951). (Reprinted 1992, Develop. Dynamics 195, 231-272)
Atlas of Avian Radiographic Anatomy. S.A. Smith and B.J. Smith, Philadelphia: Saunders,
1992
The Avian Egg: Chemistry and Biology. R.W. Burley and D.V. Vadehra, John Wiley & Sons,
New York, 1989

Genetics and Evolution of the Domestic Fowl. L. Stevens, CambridgeUniversity Press, New
York, 1991
A Stereotaxic Atlas of the Brain of the Chick (Gallus domesticus). W.J. Kuenzel and M.
Masson, The Johns Hopkins University Press,Baltimore, MD; 1988
Essential developmental biology: a practical approach. C.D. Stern and P.W.H. Holland, IRL
Press at Oxford University Press, 1993 (avian embryos, pp.45-54)
The atlas of chick development. R. Bellairs and M. Osmond, Academic Press, 1998
Embriologa de los animales domsticos. D.M. Noden y A DeLahunta, Acribia, 1990
An atlas of embriology. Freeman and Bracedirdle, Heinemann educational books, 1972
Developmental biology. W.A. Mller, Springer, 1997
Lecciones de embriologa veterinaria. A. Snchez y I. Von Lawzewitsch, Ed. Hemisferio Sur,
1984
Embriologa bsica de Patten. B.M. Carlson, Interamericana-McGraw-Ill, 1990.
Transplantation in avian embryos C.D. Stern, from Essential developmental biology: a
practical approach, IRL Press at Oxford University Press, 1993.
Atlas y gua de laboratorio de embriologa de vertebrados. S. Wischnitzer, Ed. Omega,
1980.

Pginas de inters en la red: Muchas de estas pginas estn relacionadas con el desarrollo
en general o de aves en particular, y otras tratan exclusivamente del mundo del ave
http://www.ucalgary.ca/UofC/eduweb/virtualembryo/chick.html
http://www.devbio.com/
http://www.vlib.org/Biosciences.html
http://sdb.bio.purdue.edu/Other/VL_DB.html
http://ag.ansc.purdue.edu/poultry/
http://anatomy.med.unsw.edu.au/cbl/embryo/Embryo.htm
http://www.med.unc.edu/embryo_images/
http://www.med.uc.edu/embryology/contents.htm
http://prex.las.vet.uu.nl/nca/
http://www.msichicago.org/exhibit/chick/chick.html
http://www.urbanext.uiuc.edu/eggs/index.html
http://www.msstate.edu/dept/poultry/avianemb.htm
http://www.augie.edu/perry/ear/portalaudiology.htm
http://www.lehman.cuny.edu/depts/biology/aisemberg/LabGuide.html#four
http://www.uoguelph.ca/zoology/devobio/24hrchck/24ckintr.htm
http://www.bib.ub.es/www4/4wembrio.htm#ema
http://chickscope.beckman.uiuc.edu/resources/weblinks/
http://www.msstate.edu/dept/poultry/avianemb.htm#stages