RNA: Qumica y estabilidad

Ribosa: 2 OH

Conformacin en hlice A
Inestable a la hidrlisis

Direccional: extremos 5 y 3
Bases modificadas
Estructura secundaria

Hlice exclusivamente en conformacin A

Grupo 2OH permite

rpida hidrlisis

Mezcla de
2 y 3 NMP

Enrique Castro, 2003

Nucletidos exticos en RNAs

Enrique Castro, 2003

RNA: estructura y tipos

RNA ribosmico (rRNA)

Cadena simple
Alta estructura secundaria

(hlice en bucles intracatenarios)

120 nts (5S)

1542 (16S)
2904 (23S)
80 % RNA total

Estructural (ribosoma)
Cataltico

rRNA 16S

RNA de transferencia (tRNA)

Cadena simple
Estructura secundaria media

(hlice en bucles intracatenarios)

73-90 nts
15 % RNA total

Abundancia de bases modificadas

Adaptador del cdigo gentico

RNA pequeo nuclear (snRNA)

Cadena simple
Alta estructura secundaria

<300 nts
3 % ? RNA total

(hlice en bucles intracatenarios)

Ricos en U
Estructural (partculas snRNP, espliceosoma)
Cataltico (eliminacin de intrones)

RNA heterogneo nuclear (hnRNA)

Cadena simple
Baja estructura secundaria
Informativo: transcritos primarios de genes

RNA mensajero (mRNA)

75-3000 nts

Cadena simple
2 % RNA total
Baja estructura secundaria
Informativo: codificacin de protenas
(madurado a partir de hnRNA)

Enrique Castro, 2003

Transcripcin: proceso general

Start site

promoter

Transcripcin: polimerizacin de RNA

Estructura de las RNApol
Estructura de los promotores
Mecanismo de la transcripcin
Ensamblaje
Iniciacin
Elongacin
Terminacin

Procesamiento del transcrito primario (pre-mRNA)

Caperuza 5
Corte y poliadenilacin 3
Eliminacin de intrones (splicing)
Edicin

Transporte nucleo-citoplasmtico

Enrique Castro, 2003

Convenios y nomenclatura en el
sentido de transcripcin y
traduccin
con sentido
Hebra codificante
No molde
53

sin sentido
Hebra molde
No codificante
35
mRNA 53
Secuencia de hebra codificante
Complementario a molde 35

Protena NC
Traducido de mRNA 53

Hebra codificante 53
Enrique Castro, 2003

RNA polimerasa bacteriana

RNA pol de E. coli

Hexmero de 465 kD (2)

Requiere molde de DNA
Utiliza NTP, libera PPi
No necesita cebador
Carece de 3exonucleasa (correccin)
Transcribe todos los tipos de RNA
rifampicina

(155 kD)

(151 kD)

Liga DNA molde

Liga NTPs,
centro cataltico

(36.5 kD)
Ensamblaje del holoenzima
unin a secuencias
y protenas reguladoras

(fosfodister)

se une a

(11 kD)

sin funcin
conocida

DNA

reconocimiento del promotor

variable (70, 32, 54) :
disociable

RNAn-1 + NTP RNAn + PPi

Enrique Castro, 2003

Inhibidores de RNA polimerasas

Rifampicina:
se une a RNApol (bacterias)
impide desalojo el promotor
Carece de 3'OH
impide crecimiento
(pro/eucariotas)

Actinomicina D:
intercala entre GC adyacentes
distorsiona dplex
impideprogreso de la burbuja (RNApol)
(pro/eucariotas)

-amanitina:
bloquea RNApol II>RNApol III
(eucariotas)
Enrique Castro, 2003

Transcripcin en procariotas:
ensamblaje de RNApol e iniciacin
Reconocimiento del promotor por

RNApol se une inespecficamente al DNA

(baja afinidad)
Recorre el dplex buscando el promotor
La subunidad reconoce el promotor
(unin a caja -35, alta afinidad)

Complejo promotor cerrado

(Unin RNApol/DNA enrollado, Kd = 10-6 -10-9 M )

RNApol se desplaza hacia la caja Pribnow.

Complejo promotor abierto

La actividad helicasa de
desenrollados 12-15 pb hasta +2.
burbuja de transcripcin.
Unin de muy alta afinidad, Kd = 10-14 M

Iniciacin
2 sitios de unin de NTPs en la RNApol
Sitio de iniciacin: preferentemente A,G
Sitio de elongacin: segundo nucletido
El 3'-OH del nucletido en el lugar de
iniciacin ataca y se une al -P del NTP en
el otro sitio
La RNApol transloca 1 pb y repite ciclo,
alargando la cadena naciente de RNA

Desalojo del promotor

Cuando el transcrito tiene 6-10
nucletidos la subunidad se disocia

Enrique Castro, 2003

Promotores procariticos
Regin de 40 pb 5 respecto al inicio
2 elementos conservados
Un elemento opcional ms hacia 5 (UP element)

Elemento UP
rico en AT
aumenta expresin

Elemento -35
unin de
Caja Pribnow (-10):
fusin del molde
(desenrollado por )

Inicio de
transcripcin
purina A(G)

Subunidades especficas reconocen

promotores diferentes
Caja -35

Caja -10

70 :

TTGACAT

TATAAT

general

32 :

TCTCNCCCTTGAA

CCCCATNTA

choque trmico (HSP)

28 :

CTAA

CCGATAT

Enrique Castro, 2003

funcin

movilidad y quimiotaxis

Mecanismo de la transcripcin:
elongacin
13-15 pb
17-19 pb

17-19 pb

8-9 pb
6-7 nt

Ncleo de RNA polimerasa (sin )

RNA pol es procesiva
Fidelidad media (10-4 errores)
(adecuado para transcritos de <10000 nt)
Velocidad 20-50 bases/segundo.
Ms lento en zonas ricas en G/C
Topoisomerasas preceden y siguen a la burbuja de
transcripcin (alivio de tensiones superhelicoidales)

Enrique Castro, 2003

Transcripcin en procariotas:
terminacin independiente de
Secuencia seal de terminacin:
Palndromo rico en GC: horquilla
Secuencia rica en T (U)

Parada de
la RNApol

Liberacin del
transcrito

Enrique Castro, 2003

Mecanismo ms
frecuente

Transcripcin en procariotas:
terminacin dependiente de
Seales de terminacin dependientes de
sin secuencia definida
se une a secuencias especficas
en el transcrito
Migra 53 hasta la burbuja transcripcional
Actividad DNA/RNA helicasa
(ATP-dependiente)

Mecanismo menos
frecuente

Enrique Castro, 2003

Transcripcin en eucariotas
Estructura del mRNA eucaritico:

Caperuza 5
5 UTR
Regin codificante
3UTR
Cola de poli-A 3'

(estabilizacin)
(regulacin)
(regulacin)
(estabilizacin)

Cola poli-A 3

Caperuza 5
5 UTR

Enrique Castro, 2003

3 UTR
Regin codificante

RNA polimerasas eucariticas

Tres polimerasas diferentes
RNApol I: pre-rRNA (nucleolo)
RNApol II: general (mRNA)
RNApol III: genes RNA
(tRNA, snRNA etc)

Sensibilidad a -amanitina

Pol II > polIII >> polI, RNApol bact

10 M

100M

2 subunidades grandes
RPB1, RPB2 (130-220KD)
homlogas a , de E. coli

Protenas grandes multimricas

12 subunidades (500-700 kD)
5 comunes
4-7 especficas

Estructura y funcin
conservadas
2 subunidades
homlogas a la
de E. coli
RPB3 (20-40 kD)

Interaccin con promotores

A travs de RPB4
Requiere factores adicionales
especficos de promotor
RNApol III reconoce seales 3

Enrique Castro, 2003

Factores de
Transcripcin

RNA polimerasa II
Transcripcin de genes de protenas
Reconoce variedad de promotores
Ampliamente regulable
Requiere al menos 7 factores de transcipcin generales
Dominio carboxi-terminal (CTD) fosforilable
2 subunidades grandes
RPB1 (220 kD), RPB2 (150 kD)
homlogas a de E. coli

Dominio CTD de RPB1

52 repeticiones de

YSPTSPS

Hasta 50 nm

RPB1: unin a NTPs

(cataltica)
RPB2: unin a DNA

Regulacin por
fosforilacin mltiple

Funciones de CTD: Regulacin

Unin al promotor: desfosforilado

Iniciacin: fosforilado
Unin de protenas accesorias

Enrique Castro, 2003

Procesamiento
del pre-mRNA

Promotores eucariticos:
promotor proximal (core promoter)
Estructura de un gen de mamfero:
Elementos potenciadores
-200
-10 / -50 kb

Exones
intrones y UTRs
+10 / +50 kb

-30

Promotor
proximal

Caja TATA
Iniciador
Caja GC

start
Enrique Castro, 2003

Elementos reguladores Cis (secuencias promotoras)

y
Elementos reguladores trans
(factores de transcripcin)
Tanto los elementos reguladores Cis (basales, proximales y
distales), como los elementos reguladores trans (factores de
transcripcin) se caracterizaron usando
una combinacin de tcnicas de DNA-footprinting y
Cromatografa de afinidad.

Promotor
basal

Promotor Proximal

INR
-3 a +5
NYYANT/AYY
l

Enrique Castro, 2003

Factores de transcripcin
asociados a RNApol II

Enrique Castro, 2003

Pasos clave en la transcripcin

del DNA por RNApol II
Construccin secuencial y ordenada
del complejo de iniciacin

Ensamblaje:
Reconocimiento del promotor

Unin de RNApolII (CTD desfosforilado)

Hasta el complejo de
preiniciacin

Desenrollado del molde y activacin

de la polimerizacin

Iniciacin:
Apertura del complejo

Actividad de
TFIIH

Activacin de la RNApol
Fosforilacin del CTD
Hasta el desalojo
del promotor

Crecimiento del transcrito por

polimerizacin de NTPs sobre
el molde

Elongacin:
Disociacin de factores generales

Reclutamiento de factores de elongacin

Reclutamiento por CTD de RNPs para procesado
(capping, splicing)

Mientras no termine

Terminacin:

Acoplamiento de corte y poliadenilacin

con terminacin

Reclutamiento del complejo de poliadenilacin

(reconocimiento de la seal AUAAA)

Corte y liberacin del transcrito: desactivacin de RNApol

Poliadenilacin 3

Enrique Castro, 2003

Ensamblaje de RNApol II
sobre el promotor
1. Reconocimiento de promotor
unin de TBP
unin de TFIID

( y/o TFIIA)

3. Reclutamiento de
RNApol II

TFIID=
TBP o similar
11 TAFs

unida a TFIIF
CTD desfosforilado

2. Unin de TFIIB
Recluta RNApol

TFIIF inhibe
la unin no
especfica a
sitios no
promotores
9 subunidades
Se une a TFIIB

Complejo de
iniciacin
cerrado
5. Apertura

4. Formacin del
complejo cerrado

Actividad helicasa de
TFIIE y TFIIH

Complejo de
iniciacin
abierto
Enrique Castro, 2003

unin de TFIIE
unin de TFIIH

Complejo de
pre-iniciacin
(PIC)

Inicio de la transcripcin
por RNApol II

reutilizacin

Helicasa de
TFIIH

pTEFb
Factores
generales
disociados

Seal de
terminacin

Elongacin

Liberacin de
TFIIE/H

Quinasa deTFIIH:

Fosforilacin mltiple en CTD

Activacin de RNApol II
Disociacin de TFIID/TBP-TFIIB

Enrique Castro, 2003

Procesamiento del mRNA

eucaritico
Simultneo a la elongacin
Factores reclutados por P-CTD
PIC

Reclutamiento de la
capping enzyme
Caperuza formada en la
la transicin iniciacin-elongacin
(mRNA naciente 20-40 Nts)
Requiere desfosforilacin en Ser-5

Reclutamiento de la
maquinaria de splicing
(RNPs)
Requiere fosforilacin en Ser-2
por pTEF2b(quinasa)

Reclutamiento de la
maquinaria de corte
y poliadenilacin
mRNA/RNPs

Enrique Castro, 2003

capping
enzyme

maquinaria de
splicing
(RNPs)

Procesamiento del mRNA:

Formacin de la caperuza 5
Funciones de la caperuza:

Proteccin de 5exonucleasas
Exportacin del ncleo
Reconocimiento por ribosomas

Sntesis:

Durante iniciacin-elongacin (25-30 nts)

Enzima ligada a CTD-P de RNApol II

Capping
enzyme

Enrique Castro, 2003

Procesamiento del mRNA:

poliadenilacin 3
Seal de terminacin en DNA/transcrito:
Reclutamiento de endonucleasa
Corte del transcrito termina la accin de RNApolII
Catalizado por componentes RNP

AAUAAA

muy conservada
G/U

Rica en G/U

muy degenerada

G/U
10-30 nts

20-40 nts

cleavage
site

Funciones:

Estabilizacin 3
Reconocimiento por RNPs

80-250 nts

Enrique Castro, 2003

Procesamiento del mRNA:

poliadenilacin 3
CPSF forma complejo
inestable con
AAUAAA
CStF se une a G/U

Previene
terminacin
por RNApol II

Unin de CFI y CFII

complejo estable unido a
seales de terminacin

Se recluta poli-A
polimerasa
Unin de PAP activa endonucleasa:
corte 3 de AAUAAA

Corte seala
terminacin a
RNApol II
Liberacin de
factores

Poliadenilacin lenta

Reclutamiento de
PABII

PABII estimula a PAP

Enrique Castro, 2003

Poliadenilacin rpida

Intrones eucariticos: gen y

mRNA de la ovoalbmina de pollo
Intrones: bucles extra
(no codificante)

mRNA
maduro

DNA genmico

DNA genmico del gen de ovoalbmina

hibridado a su mRNA

Intrones:

Seales de control
Variabilidad/
combinatoria

100-20.000 nts
3UTR

5UTR

Exones:

Elemento funcional
Dominio estructural
Variabilidad/combinatoria
30-100 aa

Enrique Castro, 2003

1158 nts
386 aa

Estructura de los intrones

Seales identificadoras
Lmite 5: GU
Punto de ramificacin (A),
a 20-50 pb de 3

Regin rica en pirimidinas (15 pb)

Lmite 3: AG

Intrn

Punto de
ramificacin

Exn 5
A/C A G
70 60 80
Frecuencia de
aparicin, %

GU A/G A G U

U A/G A C/U

C AG

100

90 80 100 80

80 100

60

95 70 80 45

100
20000 pb

Seal GU:
Sitio de
empalme 5

Corte y empalme:

A partir de bordes 5GU y AG3

Punto de ramificacin es esencial
Exclusivamente en el ncleo
El sustrato de splicing es
transcrito+caperuza+poli-A
Catalizado por partculas snRNP
(espliceosoma)
snRNAP reclutadas por CTD-P de
RNApol II

Enrique Castro, 2003

Exn 3

20-50 pb

Zona rica
en Pir

Seal AG:
Sitio de
empalme 3

Splicing: Corte y empalme

de intrones
2 reacciones de trans-esterificacin sucesivas
Exn 1 (5')

Pre-mRNA
1 trans-esterificacin.
2-OH de A ataca pGU 5

Lazo: blucle cerrado

covalentemente.
Enlace 5G-2A

2 transesterificacin.
3-OH de exn 1
ataca AGpX

Exones ligados
en orden
Degradado
rpidamente

Exn 1 (5')

Exn 2 (3')

Autocorte:

Tipo I algunos rRNA, rRNA

Tipo II (plantas, hongos)

No autocorte:

Genes estructurales
tRNAs

Enrique Castro, 2003

Requieren catalizador: snRNP

Procesamiento de intrones;
estructura y funcin de snRNPs
Partculas snRNP

U1, U2, U4, U5, U6 (U11,U12)

100-200 nts. muy conservados

Catalizan splicing
5 snRNAs
50 protenas

RNPn
generales y especficas
Motivos de unin a RNA

Ensamblaje requiere ATP

Reclutados por CTD-P de
RNApol II

(RBD, RGG, KH)

U2:

U1:

reconocimiento de 5GU
(o bien U11)

RNP1, RNP2

Funciones de Un snRNA

unin al punto de ramificacin

(o bien U12)

Hibridacin: reconocimiento de seales

Forman el lazo al reunir los extremos 5 y 3
Catlisis de transesterificacin: ribozimas

Funciones de RNPs

Previene degradacin snRNA

Previene plegamientos secundarios de RNA
Reconoce secuencias seales
Recluta otras protenas
Transporte nucleocitoplasmtico

Enrique Castro, 2003

Corte y empalme en el
espliceosoma
Funciones de snRNA:
U1: une a extremos 5 y 3
U2: une a ramificacin
(cataltico)
U4: mantiene inhibido U6
U5: se une a 5
U6: cataltico

Otros espliceosomas
usan U11 y U12

Reordenamiento interno
(rehidridacion)

U6 hibridado con U2 y
centro de empalme 5
simultneamente

Enrique Castro, 2003

reutilizacin

Procesamiento alternativo
de intrones

Enrique Castro, 2003

Transcripcin y procesamiento de
pre-rRNA en eucariotas: RNApol I
SL1:

Ensamblaje:

multimrico

UBF se une a UCE

se une SL1
Se une RNApol

Activacin e iniciacin
NO requiere ATP

TBP

RNApol I

UBF

rRNA promoter
-150 -100 pb

Exclusivamente
en el nucleolo

UCE

+1

+1

Core element

Terminacin por factor

especfico unido en 3

2OH ribose,
100 nucleotides

snoRNAs:

from genes & introns

Enrique Castro, 2003

snoRNPs
(snoRNAs)

Transcripcin por RNApolIII

+1

Transcripcin de:

tRNAs
rRNA 5S
RNAs pequeos (snRNAs, snoRNAs)

rRNA 5S

+1
C

TBP

tRNA
Elementos de
control internos

TFIIIB
RNApol III

rRNA 5S

TFIIIC

Ensamblaje
Unin TFIIIC a
A-box y B-box

TFIIIA

+1

TFIIIB

tRNAs
RNApol III

TBP

TFIIIC

Unin TFIIA
a C-box
Terminacin por
seal poli-U

+1

(no horquilla)

Procesamiento:

(en nucleoplasma)

ribozima

Enrique Castro, 2003

tRNA-nucleotidil transferasa.
molde interno: 3 sitios de unin

Intrn
No en espliceosoma
mecanismo especial

Exportacin de mRNAs al citosol

mRNP:

mRNA maduro
protenas RNP
protenas CBC

sin intrones
desligado del espliceosoma
(snRNPs no se exportan)

No exportado = degradado
(talasemias)
Sistema de vigilancia
exosoma
(3 exonucelasas)

Las protenas
son exportadas.
mRNA va ligado

Exportacin:

Secuencias NES
Unin a exportina
Requiere energa

NPC
transporta
activamente

hnRNP A1

(NLS hidrfoba)

Seales
NES y NLS

Unin al
ribosoma

Enrique Castro, 2003

Transporte ncleo-citoplasma:
protenas G pequeas (ran)
NES reconocida por transportador
Transportador = exportina
Unin a protena G ran

3 NES
conocidas

Unidireccional
acoplado a hidrlisis de GTP

GEF: intercambio
GDP/GTP

Exportina reconoce
NES rica en Leu

GAP: Hidrlisis
de GTP

Transporte
retrgrado
(seal ??)

Transporte unidireccional:

Unin slo a GTP-ran

Distribucin asimtrica de GAP/GEF

Enrique Castro, 2003

Transporte activo
por poro nuclear

Transporte citoplasma-ncleo:
y protenas G pequeas (ran)
2 NLS conocidas

NLS reconocida por transportador

Transportador=importina (NLS bsica)
transportina (NLS hidrfoba)
Unin a protena G ran

(bsica, hidrofbica)

hnRNP A1

(NLS hidrfob

Unidireccional
acoplado a hidrlisis de GTP

Transporte unidireccional:

Unin slo a GTP-ran

Distribucin asimtrica de GAP/GEF

GEF:

intercambio
GDP/GTP

Complejo -importina/carga es
transportado activamente
(-NPC, ATP-dependiente)

GAP:

Hidrlisis
de GTP

Diferencias:

Ran-GTP une transportador vaco

Importacin es activa
Requiere factores adicionales
(NTF2)

Enrique Castro, 2003

transporte ncleo-citoplasma
Importacin de protenas RNPs
Protenas
RNP

Importacin de
factores citoplsmicos

snRNPs

Caperuza
adicional

Importacin
activa

snRNA

snRNPs

Exportacin de
partculas pre-ribosmicas
nucleolo

ncleo

5S RNA

Importacin
de protenas

18 S
Partculas
pre-ribosmicas

28 S RNA
5.8 S RNA
5 S RNA

Subunidades ribosmicas

Enrique Castro, 2003

Regulacin de la expresin
gnica: genoma y proteoma
Tipos de genes:
Constitutivos
Inducibles
Represibles

Control gnico:
Qu genes se expresan
En qu momento
Con qu pauta temporal

Programas de
diferenciacin celular
Esquema de diferenciacin tisular

Regulacin:40-50%

Funciones codificadas por genes humanos

Enrique Castro, 2003

Regulacin de la expresin gnica

Estado estacionario

biosntesis

degradacin

Expresin
gnica

Gen
Transcripcin
Transcrito primario

nucletidos

Procesamiento
post-transcripcional
mRNA maduro

Hidrlisis del
mRNA

Traduccin

Todos los
procesos son
regulados

Protena
(inactiva)
Modificaciones
post-traducionales
Protena
(activa)

Funciones
fisiolgicas
Enrique Castro, 2003

aminocidos

Proteolisis

Control de la expresin gnica en

procariotas: operones bacterianos
Nivel basal de transcripcin elevado

Protena unida:
transcripcin bloqueada

Regulacin por represin

Protenas de control simples

Disociacin:
alivio de la inhibicin

Organizacin gnica en operones:

Unidad de transcripcin policistrnica
Secuencias de control nicas
Control conjunto por represor

Acoplamiento Transcripcin/Traduccin:
Regulacin conjunta

Enrique Castro, 2003

Control gnico en eucariotas:

caractersticas generales
Nivel basal de transcripcin nulo
Cromatina muy condensada

Acceso al promotor restringido

Regulacin por activacin

Organizacin jerrqica

Mecanismo principal:
control de la estimulacin
de la iniciacin

Organizacin gnica dispersa

unidades de transcripcin monocistrnicas

Integracin
Control combinatorio
Control alternativo

Control individualizado de genes

Seales de control mltiples
Protenas reguladoras complejas

Procesamiento del transcrito

Variabilidad en splicing

proteoma>>genoma

Desacoplamiento transcripcin/traduccin
Transporte al citosol regulado
Regulacin de la tranduccin

Histonas
rRNA

Transcripcin
(ncleo)

citoplasma

Enrique Castro, 2003

Mecanismos de regulacin
Dosis gnica

Metilacin del DNA

Condensacin de la cromatina
Control de la iniciacin
Regulacin de la elongacin/terminacin
Splicing alternativo
Edicin del mRNA
Transporte nucleocitoplasmtico
Estabilidad del mRNA
Regulacin de la sntesis de protenas

Silenciamiento gnico
(epigentico)

Estructura de la cromatina y
control de la transcripcin
Empaquetamiento DNA/Histonas:
promotores inaccesibles a factores
TAF, RNApol elementos reguladores

El empaquetamiento de los
cromosomas metafsicos
bloquea todo acceso al DNA

Para la transcripcin, el
DNA debe remodelarse sin
llegar a desorganizarse

Sensibilidad a la DNasa I

Cromatina activa:

(promotor: sitios hipersensibles)

Pobre en H1
Poco metilada (CpG)
Rica en HMGs
Histonas acetiladass

HAT

Cromatina condensada
No hay transcripcin
Enrique Castro, 2003

HDAC

Cromatina relajada
Si hay transcripcin

Complejos reorganizadores de
la cromatina
Cambio conformacional
ATP-dependiente

Actividades enzimticas

Reorganizacin del nucleosoma

Acetilacin de histonas

HATs
HDACs

Reclutados por

Trans-moduladores
Co-moduladores
Mediador

actividad oligmero
pCAF/SAGA HAT
>20
mSIN3
HDAC
>10
SWI/SNF
Remodelado
>11

Represin: Desacetilacin

HDAC

HDAC

mSIN3

Reclutado por
transactivadores/
mediador/co-mod

HAT

Ensamblaje: HATs B

pCAF
SWI

CAF1 (H3/H4)
NAP1 (H2A/H2B)

Enrique Castro, 2003

Subunidades compartidas
con Mediador/THIID

HAT Activacin:

Acetilacin

Amplificadores: Trans-activacin
-10 / -50 kb

Exones
intrones y UTRs

Elementos potenciadores
-200

PIC

Protenas reguladoras unidas a

elementos de control

+10 / +50 kb

-30

Complejo de
preiniciacin

Transactivadores
Co-activadores
Co-represores

Unin a
surco menor:
curva en
DNA dplex

GTFs + RNApol

TFIID:
Interaccin
activadora:
Mediador/TFIID

TBP
11 TAFs

Mediador:

>20 subunits
unido a CTD

cooperativas

Se unen al PIC
Reclutan transactivadores
Reclutan remodeladores

Accin a distancia:
Mecanismo de bucle
Enrique Castro, 2003

Amplificadores eucariticos:
elementos cis
Ncleo del promotor:
(core promoter)

Prximo a +1
Unin de RNApolII
TATA
GC-box
Inr

Elementos proximales:

Posicin cercana (hasta -200 pb)

Siempre 5
Orientacin fija
Afectan al promotor inmediato

Amplificadores:

Elementos distales (0.1-50 kb)

5, 3 y en intrones
Orientacin bidireccional
Controlan grupos de genes

Enrique Castro, 2003

elemento

s. consenso

factor

CAAT box
GC box
Octmero
B
ATF

GGCCAATCT
GGGCGG
ATTTGCAT
GGGACTTTCC
GTGACGT

C/EBP, CTF1
SP1
Oct-1
NF-B
ATF

Todos los anteriores +

Elementos de respuesta
a hormonas
choque trmico (HSTF)
HRE
CRE
TRE
SRF
GRE
RARE

sec. consenso

AGAACAN3TGTTCT
AGGTCAN5AGGTCA

factor
CREB
AP-1
SRF
GR
RAR/RXR

Elementos trans:
Factores de Transcripcin
Funcin:

Unin a elementos de control cis (DNA)

Regular iniciacin

Estructura:

reclutamiento
activacin
represin

Modulares

D. unin a DNA (DBD)

D. de activacin (AD)
Interaccin
protena-protena

Dimricos
Integracin
combinatoria

N
AD
AD

Dominios de unin a DNA (DBDs):

-hlice protrusiva
Contactos con surco mayor
Unin a secuencias especficas
Sin desaparear bases

DBD

DBD

Muy conservados
80% en tres categoras
HTH
Dedos de Zn
bZIP
surco mayor

Enrique Castro, 2003

surco menor

SP1

LBD

GR

AD

Gal4

-hlice 1.2 nm
Surco 1.2 x 0.6-0.8 nm

(sin desenrollar)

No existe un cdigo constante

Imposible predecir secuencias

DBD

Estructuras de dominios DBD

hlice-giro-hlice
(HTH)
Dedos de Zn
20 aa

C2 H2
30 aa

SP1

60 aa

Homeodominio

Cx
60 aa

bZIP:
Cremalleras de leucina bsicas

NR

Interaccin
protena-protena

60 aa

Enrique Castro, 2003

Dominios de transactivacin:
mdulos independientes
Dominios de transactivacin:

Diversidad estructural
Cambio conformacional por unin a DNA
Interaccin con co-activadores
(reclutamiento)

Tipos de dominios
Acdico
Rico en Q
Rico en P
Rico en S y T
Hidrofbicos
Bsicos

Ovillo -hlice anfiptica

muy potente
promiscuo (todo tipo de genes)

Represin

Se pueden intercambiar
mdulos en protenas
quimricas

Un dominio AD rico en P
transactiva
desde un elemento GC
Enrique Castro, 2003

Regulacin de los factores de

transcripcin
Regulacin de la unin al DNA por:

La expresin gnica
es controlada por
seales celulares

Expresin diferencial (induccin)

Fosforilacin/desfosforilacin
Unin de ligandos
Localizacin/secuestro

Unin de ligandos
inactivo

Sntesis
proteica

activo
fos
jun

NR

(ER,TR.RAR)

Fosforilacin/
desfosforilacin

Localizacin/
secuestro

ATP
ADP

P
P

CREB
SRF

E2F/Rb

inactivo
P

citosol

ncleo

proteolisis

citosol
ncleo

activo
NF-B
Enrique Castro, 2003

NF-AT

Notch

Regulacin gnica:
organizacin jerrquica
Seal

Organizacin jerrquica:
Cascadas de reguladores

(y otras
acciones)

Unin
al DNA

Activacin del
regulador

Expresin de un
nuevo regulador

que controla varios genes

Regulacin alternativa:

Varias rutas para cada gen

Activacin/represin
coordinadas

Expresin de
reguladores
secundarios

Trans-activacin

Protenas activas

Trans-represin

Respuesta
fisiolgica
celular
Enrique Castro, 2003

No transcripcin
Supresin de protenas activas

Mediadores del Mediador:

co-activadores y co-represores

Los transactivadores
NO se unen a PIC:
Protenas de intermediacin
Red compleja de interacciones
protena-protena

Co-moduladores:

Papel
Central

Centros de interaccin
(construccin del complejo proteco)
Reclutamiento de otros factores
(Remodelamiento/HAT)

CBP/
p300

Co-activadores:N-CoA, CBP/p300
Co-represores: N-CoR
Remodelacin?

TFIID/TAFs:

Unin a Histona-Ac
Similar a histonas
Subunidades compartidas
(cromatina activa)
Bromodominios
entre complejos
Interacciones protena-protena
TFIID/ Mediator/ pCAF
Reconocimiento de promotor
(SAGA) etc
Estabilizacin
Construccin de PIC
Reclutamiento
Unin a trans-moduladores
Unin a Inr etc
promotores sin TATA
TAFs

Mediador:

Multimrico (20 p)
Interacciones protena-protena
Reclutado sobre PIC-CTD

Enrique Castro, 2003

CAF
Med

Regulacin gnica:
Integracin cooperativa de seales
Trans-moduladores

Mediator
RNApol II
PIC

remodelacin
co-moduladores

Compleja red de
interacciones

TFIID
Puntos de inicio alternativos
Construccin por reclutamineto
Construccin cooperativa

Regulacin del gen de la

transtiretina en hepatocitos

GTFs

Generales
+
especficos
de tejido

Complejo multiproteico:
Enhanceosome
Potenciosoma?
Enrique Castro, 2003

Integracin combinatoria
de seales
Aumento factorial de las opciones de regulacin
Homo/Heterodimerizacin
Reconocimiento de seales cis

AP-1: combinaciones
de fos/jun/otros
repeticiones
simetra

Interacciones protena-protena

El orden
puede ser
significativo

Puede
combinarse
con represores

Enrique Castro, 2003

Trans-represin
Inverso funcional de la trans-activacin
Esencial para una red de control

Construccin del complejo

de amplificacin impedida
No hay transcripcin

Mecanismos de represin:
Competicin por unin al DNA
Bloqueo de dominios AD
Bloqueo del reclutamiento de
Co-activadores
TFIID/Mediador
GTFs
Reclutamiento de remodeladores
compactacin/desacetilacin

Enrique Castro, 2003

Ejemplo: tumores de Wilms

Represor
WT-1

AP-1
SRF

Elementos de control
-1 kb

Gen EGR-1
Esencial en el desarrollo
Tumores posteriormente

Controles de largo alcance

Controles de grupos gnicos

Afectan a grupos de genes coordinados

Remodelado de la cromatina

Cada gen tiene

controles individuales
LCR: compactacin
de la cromatina

: saco vitelino
:hgado fetal
,:mdula sea
adulta

Slo activado en
clulas eritroides
Delecin causa talasemia

Aisladores (elementos frontera)

Limitan accin de amplificadores
Previenen efecto de posicin

Enrique Castro, 2003

Actan por unin de

protenas

Regulacin de la expresin gnica:

Edicin del mRNA maduro
Edicin:

Cambiar la secuencia del mRNA maduro

Muy frecuente en mitocondrias y cloroplastos

Mecanismo de edicin:

Modificacin de bases in situ

Reconocimiento de secuencia por RNA

Desaminacin:
CU
AI

Apo-B100 (500 kD): hepatocitos

Apo-B48 (240 kD): intestino

Apolipoprotena B

hgado

intestino

conversin en
codn stop

Se une a LDL-R
Cede colesterol a
tejidos perifricos

Dominio de unin
a LDL-R

Receptores de glutamato tipo AMPA:

No se une a LDL-R
No cede colesterol

Permeabiliadad al Ca2+
(plasticidad sinptica: memoria)

Enrique Castro, 2003

Metabolismo citoslico del

mRNA
Recambio: via principal

Degradacin lenta
progresiva de cola ppli-A

Acelerada por seales

de AUUUA en 3UTR

Recambio: via adicional

Reclutamiento de
endonucleasa especfica
Seales codificadas en
5UTR y 3UTR

Enrique Castro, 2003

Estabilidad del mRNA:

opciones de regulacin
Recambio constitutivo:

mRNAs son muy estables en eucariotas

Degradacin por sistema enzimtico especfico
3 UTR

5cap

mRNA

Estable

Lbil

Degradacin regulada:

Aumento de degradacin: seal 3UTR

Aumento de estabilidad
sistema caseina/prolactina
sistema TfR/Hierro (IREs )

Regulacion de la estabilidad
del mRNA de TfR por Fe

Unin especfica a
secuencias de
bucle IRE

Enrique Castro, 2003

3 Poli-A

Secuencias AUUUA
repetidas en 3UTR
Reconocimiento por nucleasas
Citoquinas
genes inmediatos tempranos

Seal de degradacin rpida

IRE-BP activa (no Fe)

protege de la degradacin

Los elementos IRE tambin

regulan la traduccin del mRNA

Elementos IRE
en 5 UTR
No modifican
degradacin

Unin de IRE-BP
previene iniciacin de
traduccin

Enrique Castro, 2003

Fe secuestrado
por ferritina

Fe disponible para
Fe-enzimas

Enrique Castro, 2003