PRCTICA 5

TINCIN DE GRAM Y DE MANEVAL

I.

Introduccin

TINCIN DE GRAM
El mtodo de tincin diferencial ms importante usado en bacteriologa es la tincin
de Gram, llamada as en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este mtodo divide las
bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas. Esto es
esencial para la clasificacin y diferenciacin de microorganismos. La reaccin a la
tincin de Gram est basada en la diferencia en la composicin qumica de la pared
celular bacteriana.
Las bacterias Grampositivas tienen una gruesa capa de
peptidoglicano o murena, mientras que esta capa es ms fina en las Gramnegativas y est rodeada por una bicapa lipdica externa. El Peptidoglicano es un
polisacrido formado por dos subunidades qumicas, N-acetilglucosamina y acido
Nacetilmurmico. (Asca, Aldea, Arru & Valverde, 2012)

Figure 3: Microfotografa de pared

celular de bacteria Gram-negativa

Figure 1 Microfotografa de una pared

celular
De bacteria Gram-Positiva
1

Murray (2006) seala que la tincin

diferencial requiere el uso de al menos 3
reactivos qumicos que se aplican en
secuencia a un frotis fijado por calor. El
primer reactivo es llamado tincin primaria
o colorante primario. Su funcin es impartir
color a todas las clulas. Con el objetivo de
establecer un contraste de color, el segundo
reactivo usado es un agente decolorante, el
cual puede decolorar la clula completa o
solo parte de ella.
El reactivo final, el
Figure
3:
Estructura
de
la 4:
Pared
Figure
Estructura
colorante de contraste, le da a las clulas decoloradas un color que
contrasta
con de
el la Pared
Celular no
de puede
bacteria
Gram-positiva
Celular
de bacteria
Gram-negativa
del colorante primario. El colorante de contraste
ser
absorbido
por clulas
que no han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos de clulas o sus
estructuras se pueden distinguir unas de otras en funcin del colorante que es
absorbido.
Fundamento de la tincin: Tincin Primaria, Se utiliza Cristal Violeta, que tie todas
las clulas moradas. Luego se utiliza un Mordiente que puede ser Yodo o lugol. Segn
Bergey (1994) El lugol es un compuesto formado por I 2 (yodo) en equilibrio con KI
(yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el
yodo. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del colorante
primario con la clula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal
violeta-yodo sirve para intensificar el color del tenido. Luego de eso se agrega el
Agente decolorante. Comnmente se utiliza alcohol etlico al 95% o acetona. El
etanol tiene doble funcin como deshidratante de protenas y solvente de lpidos. El
alcohol disuelve los lpidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa,
haciendo la pared ms porosa. De esta manera, el complejo Cristal violeta-yodo es
removido de la capa de mureina ms fina de las bacterias Gramnegativas, mientras
que la pared ms gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en su interior,
colorendose de color morado o violeta. La ultima reaccin es la Tincin de
Contraste con Safranina, un colorante bsico. Este tinte se utiliza para teir de
rojo las clulas previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas. (Madigan,
Martinko & Parker, 2004)

Fuente: Asca, Aldea, Arru & Valverde (2012). Bacterias Grampositivas y

Gramnegativas [figura]. Recuperado de

TINCIN DE MANEVAL
En 1982, Lpez, A. J. Barajas, R. sealaron que Muchas bacterias estn

rodeadas por compuestos qumicos superficiales que se ties con mucha dificultad y
que ha sido denominada cpsula. La mayora de las cpsulas bacterianas estn
constituidas qumicamente por polisacridos, aunque en el gnero Bacillus consiste
en un polipptido del cido D-Glutmico.
La cpsula desempea un papel
importante en la virulencia de algunas bacterias patgenas, ya que les confiere
propiedades antifagocticas que interfieren con los mecanismos de defensa del
organismo. El grosor de la cpsula vara no solo de una especie de microorganismos
a otra, sino que tambin entre las diferentes cepas de la misma especie y
dependiendo de la fase de la curva de crecimiento en que se encuentra el cultivo. El
dimetro de la cpsula puede ser varias veces mayor al dimetro del cuerpo celular,
como en el caso de Streptococcus pneumoniae y Klebsiella pneumoniae. Las
bacterias con cpsula, en los medios de cultivo, forman colonias lisas y mucoides
mientras que las bacterias no capsuladas producen colonias rugosas.
Las cpsulas bacterianas no pueden observarse en frotis teidos con las tcnicas
usuales porque son incapaces de retener el colorante y porque los procesos de
fijacin al calor y lavado las disuelven. Por lo tanto, el mejor mtodo para
observarlas es el de las tinciones negativas. Los colorantes usados son: Maneval A
(Rojo Congo), sirve, sobretodo, como indicador del pH, es decir, de indicador de
la acidez de un medio. En su forma bsica el rojo congo es rojo. Cuando el pH est
comprendido entre 3.0 y 5.2 se vuelve rosa y el colorante Maneval B (Fucsina
cida). El objetivo de esta prctica es conocer los fundamentos moleculares de la
coloracin de Gram y Maneval, asi como la observacin de bacterias Grampositivas y

Gramnegativas. Tambin la observacin de cpsula bacteriana en Klebsiella

pneumoniae. Miranda, M. (1994).

II.

Material y Mtodos

Materiales

Equipos

Laminillas cubreobjetos
03 Microscopios
Laminas portaobjetos
Mechero de Bunsen
Aceite de inmersin
Colorantes para la tincin de
Maneval
10 Isopos de madera
Colorantes para la tincin de
Gram.
05 estudiantes (muestra)
Rejilla de soporte o de tincin
Goteros

Metodologa
Coloracin de Gram
Realizar un frotis de sarro dentario en una lmina portaobjetos. Permita que los frotis
se sequen al aire y luego fjelos con calor. Teir con cristal violeta agregando
suficiente colorante e inundar suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y dejar
actuar durante dos minutos. Lavar suavemente con agua. Decolorar con alcohol
etlico al 95%. Nota: No sobredecolorar, agregue el alcohol gota a gota hasta que
este salga casi claro, solo ligeramente azul. Lavar suavemente con agua. Agregar la
safranina para la tincin de contraste, y dejar actuar durante dos minutos. Lavar
suavemente con agua. Secar la preparacin. Por ltimo, examinar al microscopio con
el objetivo 100X de inmersin con aceite de cedro.
Coloracin de Maneval
Colocar una gota de Maneval A (Rojo Congo) en una laminilla sobre el frotis ya fijado,
haciendo movimientos giratorios con el asa. Extender la suspensin de manera que
quede una pelcula delgada. Dejar secar la preparacin a temperatura ambiente. NO
FIJAR EL FROTIS AL CALOR. Cubrir la preparacin con Maneval B (Fucsina cida) y
4

dejar que acte durante dos minutos. Lavar suavemente con agua corriente de la
llave y seca el frotis mediante un ligero contacto con una toalla de papel. Observar al
microscopio Con el objetivo de inmersin. Las cpsulas se observan como halos
incoloros. El espacio intercelular se observa de un color oscuro y las clulas
bacterianas de color rojo.

III.

Resultados

IV.

Comentario
5

V.

Referencias Bibliogrficas

Asca,A.; Aldea,A.; Arru,K. & Valverde,K. (2012). Bacterias Grampositivas y

Gramnegativas. Disponible en: http://biologiamedica.blogspot.pe/bacterias-grampositivas-y-gram-negativas.

Bergey, David H.; Holt, John G.; Krieg, Noel R.; Sneath, Peter H. A.
(1994). Bergey's manual of determinative bacteriology. 9 edicin. Lippincott
Williams & Wilkins.

Lpez, A. J. Barajas, R. (1982). Manual de Laboratorio para Bacteriologa y

Micologa. Departamento de Bacteriologa. FMVZ-UNAM.

Madigan, M. T; Martinko J., Parker J. (2004). Biologa de los Microorganismos. 10

edicin. Madrid, Espaa. PEARSON Prentice Hill.

Miranda, M. (1994). Material didctico para Laboratorio de Bacteriologa Y

Micologa. Departamento de Bacteriologa. FMVZ_ UNAM.

Murray, P. (2006). Microbiologa Mdica. 5ta edicin. Madrid, Espaa. Editorial

Elsevier Mosby.

VI.

Anexos

Anexo 1: Preparacin de la coloracin de Gram

Teir suavemente
con violeta de
cristal por 2

Lavar suavemente
con agua

Teir suavemente
con safranina por
dos minutos

Lavar suavemente
con agua

Aplicar acetona gota

a gota

Lavar suavemente
con agua

Aplicar lugol
suavemente hasta
cubrir la muestra

Lavar suavemente
con agua

Secar al aire libre

Fuente: Bergey, David H.; Holt, John G.; Krieg, Noel R.; Sneath, Peter H. A.
Anexo
2: Preparacin
del colorante
Maneval Lippincott
(1994): Bergey's
manual
of determinative
bacteriology.[Figura].
Williams & Wilkins,

Fuente: Lpez, A. J. Barajas, R. (1982). Manual de Laboratorio para

Bacteriologa y Micologa. [figura]. Departamento de Bacteriologa. FMVZUNAM.

ANEXO 3: Algunos pasos de la coloracin Gram

4: Bacterias
Y Gram+) coloreadas con
UNIVERSIDAD ANEXO
NACIONAL
DE(GramTRUJILLO
mtodo Gram

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

ESCUELA ACADMICA DE CIENCIAS BIOLGICAS

ALUMNO:

 PROFESORES:

MESA:

CURSO:

2016