UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACUTICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGA
QUMICA

Profesor Patrocinante:

Directores de Memoria:

Lilian Elizabeth Abugoch James

Lilian Elizabeth Abugoch James

Departamento
Alimentos

de

Ciencia

Tecnologa

Universidad de Chile

de

los Departamento

Qumica, Alimentos

de

Ciencia

Tecnologa

de

los

Qumica,

Universidad de Chile
Nalda Marcela Romero Palacios
Departamento

de

Alimentos

Tecnologa

Ciencia

de

los

Qumica,

Universidad de Chile

OBTENCION, CARACTERIZACION
Y RELACION ESTRUCTURA - FUNCIONALIDAD
DE UN AISLADO PROTEICO DE QUINUA (Chenopodium quinoa) ORGANICA
PROVENIENTE DE LA VI REGION DE CHILE.
Memoria para optar al Ttulo Profesional de
Ingeniero en Alimentos

JORGE ANDRES SILVA MANZO

Santiago, 2006

La imaginacin es ms importante que el conocimiento

Albert Einstein

II

AGRADECIMIENTOS

A mi profesora patrocinante y directora de memoria Lilian Abugoch, por

su dedicacin, estimulo, apoyo personal y profesional en el desarrollo de
este trabajo, por confiar en mis capacidades y proyectarlas hacia mi
futuro.

A mi profesora Nalda Romero por su ayuda y contribucin a la

realizacin de mi tesis.

Al profesor Jorge Chvez por su disposicin y facilitar el equipo de

secado spray, y a Alejandra Olave por instruirme en el equipo.

A la profesora Mara Eugenia Letelier, por su ayuda, y facilitar la

centrfuga.

A los profesores Abel Guarda y Mara Jos Galotto del Departamento de

Ciencia y Tecnologa de los Alimentos de la Facultad de Tecnologa de
la Universidad de Santiago de Chile, por facilitar el equipo DSC para
llevar acabo los anlisis.

A todos mis profesores y personal de la Universidad por haber

contribuido en mi formacin acadmica y profesional.

A mi querida amiga Mnica Rivera por su compaa y ayuda a lo largo

de mi tesis.

A todos mis amigos y compaeros que encontr a lo largo de mi carrera.

A mis padres y hermanos por apoyarme incondicionalmente durante

toda mi carrera y mi vida.

III

INDICE
RESUMEN ....................................................................................................................VII
SUMMARY ...................................................................................................................VIII
I. INTRODUCCION ......................................................................................................... 1
1.1.- Antecedentes generales. ........................................................................................ 1
1.2.- Antecedentes de la Quinua ..................................................................................... 2
1.3.- Descripcin botnica ............................................................................................... 3
1.4.- Composicin qumica .............................................................................................. 4
1.5.- Saponinas ............................................................................................................... 6
1.6.- Usos de la Quinua................................................................................................... 6
1.7.- Mercado .................................................................................................................. 7
II. HIPOTESIS ................................................................................................................. 9
III. OBJETIVOS ............................................................................................................... 9
3.1.- Objetivo General ..................................................................................................... 9
3.2.- Objetivos Especficos .............................................................................................. 9
IV. MATERIALES Y EQUIPOS ..................................................................................... 10
4.1.- Materiales.............................................................................................................. 10
4.1.1.- Materia Prima ................................................................................................. 10
4.1.2.- Reactivos qumicos ........................................................................................ 10
4.1.3.- Insumos y utensilios ....................................................................................... 11
4.1.4.- Equipos e Instrumentos.................................................................................. 12
V. METODOS ................................................................................................................ 14
5.1.- Procedimiento de obtencin de harina.................................................................. 14
5.2.- Procedimiento de obtencin de un aislado proteico.............................................. 15
5.2.1.- Preparacin de la fraccin proteica................................................................ 15

IV

5.3.- Determinacin del contenido de protenas totales. ............................................... 17

5.4.- Anlisis Proximal. .................................................................................................. 17
5.5.- Tamizado .............................................................................................................. 17
5.6.- Perfil de aminocidos. ........................................................................................... 17
5.7.- Determinacin de Fitoestrgeno. .......................................................................... 18
5.8.- Anlisis y caracterizacin de polipptidos que integran los aislados de quinua
mediante Electroforesis (PAGE).................................................................................... 18
5.9.- Anlisis de las caractersticas conformacionales de las protenas en solucin. ... 19
5.9.1.- Espectroscopia UV......................................................................................... 19
5.9.2.- Fluorescencia. ................................................................................................ 19
5.9.3.- Calorimetra diferencial de barrido (DSC) ...................................................... 19
5.10.- Determinacin de las propiedades funcionales de Hidratacin .......................... 20
5.10.1.- Solubilidad.................................................................................................... 20
5.10.2.- Capacidad de retencin de agua ................................................................ 20
5.10.3.- Capacidad de absorcin de agua................................................................. 21
5.11.- Anlisis estadstico.............................................................................................. 21
VI. RESULTADOS Y DISCUSION ................................................................................ 22
6.1.- Composicin proximal ........................................................................................... 22
6.2.- Determinacin de fitoestrogenos........................................................................... 22
6.3.- Determinacin de Aminocidos............................................................................. 22
6.4.- Tamizado .............................................................................................................. 25
6.5.- Espectroscopia UV................................................................................................ 25
6.6.- Espectroscopia de Fluorescencia ......................................................................... 26
6.7.- Anlisis y caracterizacin de la composicin de polipptidos que integran el
aislado proteico de quinua A11 ..................................................................................... 29
6.7.1.- Electroforesis Nativa PAGE-nativo................................................................. 29
6.7.2.- Composicin polipeptdica a partir de electroforesis Desnaturante con y sin 2mercaptoetanol (2-Me) .............................................................................................. 30
6.8.- Calorimetra diferencial de barrido (DSC) ............................................................. 32
6.9.- Solubilidad............................................................................................................. 35

6.10.- Capacidad de Retencin de Agua (WHC)........................................................... 36

6.11.- Capacidad de Absorcin de Agua (WIC) ............................................................ 38
VII. CONCLUSIONES ................................................................................................... 40
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................... 42
ANEXO 1 ....................................................................................................................... 48
ANEXO 2 ....................................................................................................................... 49
Caracterizacin de los perfiles polipeptdicos del aislado proteico de quinua........... 49
Electroforesis PAGE.................................................................................................. 49
ANEXO 3 ....................................................................................................................... 54
Determinacin de Hidratos Carbono ....................................................................... 54
Mtodo Reaccin de ANTRONA ............................................................................... 54
ANEXO 4 ....................................................................................................................... 55
Determinacin de Solubilidad................................................................................... 55
ANEXO 5 ....................................................................................................................... 56
Capacidad de Retencin de Agua (WHC)................................................................. 56
ANEXO 6 ....................................................................................................................... 58
Capacidad de Absorcin de Agua (WIC)................................................................... 58
ANEXO 7 ....................................................................................................................... 59
Preparacin de Buffers.............................................................................................. 59
ANEXO 8 ....................................................................................................................... 60
Cuantificacin de Protenas Mtodo de BRADFORD ............................................ 60

VI

RESUMEN
El presente trabajo tuvo por objetivo la obtencin de un aislado proteico de
quinua orgnica a pH 11, con materia prima proveniente de la VI Regin. Se
caracteriz desde el punto de vista qumico, bioqumico y funcional. Los resultados se
analizaron estadsticamente mediante el uso de anlisis de varianza y test de Tukey y
Duncan al 95 % de confianza.
El aislado proteico se prepar mediante la extraccin a pH 11 y precipitacin a
pH 5. Contenido de protenas fue del 83,5% con una humedad del 6,8% valor bajo, lo
que le confiere estabilidad en el tiempo. La composicin de aminocidos coincidi con
lo descrito en la literatura, destacando su alto contenido de lisina y leucina
sobrepasando al patrn propuesto por la FAO. En espectroscopia UV y de
fluorescencia se tuvo como resultado que a pHs alcalinos se obtuvo mayor
absorbancia y mayor intensidad de fluorescencia. En la caracterizacin de polipptidos
por PAGE nativa y desnaturante se pudo determinar los perfiles de protenas de quinua
y se comprob que estn compuestas principalmente por dos tipos de polipptidos,
albminas del tipo 2S y globulinas 11S ambas estabilizadas por puentes disulfuro. La
calorimetra diferencial de barrido (DSC) dio como resultado que el aislado proteico de
quinua A11 posea poco grado de estructura cuando se analiza en medio acuoso y en
medio alcalino (pH 9), esto sugiere que las protenas quedan prcticamente
desestructuradas, ya al momento de ser extradas a pH 11. La solubilidad tendi a
aumentar a pH alcalino siendo mxima

a pH 11 con un 41,4%, por otro lado la

capacidad de retencin de agua (WHC) no fue afectada por el pH, registrndose una
retencin de agua entre 3,1 4,0 mL de agua por g de aislado proteico, esto lo hace
muy til en la elaboracin y desarrollo de nuevos productos de panificacin, embutidos
y bebidas enriquecidas. Con respecto a la capacidad de absorcin de agua (WIC) se
puede decir que este mostr una gran velocidad inicial de absorcin, con una
absorcin de agua mxima de 2,8 mL de agua/ g de aislado proteico. Por consiguiente
se concluye que el aislado proteico de quinua A11 tiene una alta capacidad para ser
utilizado como suplemento de otros alimentos como bebidas para deportista,
embutidos, salchichas, sopas y en productos deshidratados, como por ejemplo en el
desarrollo de alimentos funcionales altamente proteicos.

VII

SUMMARY
OBTAINING, CHARACTERIZATION AND RELATION STRUCTURE
FUNCTIONALITY OF A PROTEIN ISOLATE OF QUINUA (Chenopodium quinua)
ORGANIC ORIGINATING OF VI REGION OF CHILE.
The present work had by objective the obtention of a protein isolate at pH 11 of
organic precedence quinua, originated at the VI Region. It was characterized from the
chemical, biochemical and functional point of view. The results where statistically
analyzed by means of analysis of variance and test of Tukey and Duncan at 95 % of
confidence.
The protein isolate was prepared by means of extraction at pH 11 and
precipitation at pH 5. The protein content was 83.5 % with an humidity of 6.8% low
value, that it confers stability in time to the product. The amino acidic composition
correspond to the described in references, emphasizing the high content of lisine and
leucine exceeding the pattern proposed by the FAO. In UV and fluorescence
spectroscopy got as result a bigger fluorescence peak at alkaline pHs of the samples.
In the characterization of polypeptides by native and denaturing PAGE it was possible
to determine the protein profiles of quinua and it was verified that they are in mainly
composed two types of polypeptides, albumin 2S and globulins 11S both stabilized by
disulphur bridges. The differential scanning calorimetry (DSC) gave as result that
protein isolate of quinua A11 has little degree of structure when it is analyzed in the
middle watery and in the middle alkaline (pH 9), this suggests proteins are left
practically without structure, already at the time of being extracted at pH 11. The
solubility tended to increase at an alkaline range reaching peak values pH 11 with value
of 41.4%, for other side the water holding capacity (WHC) was not affected by pH,
registering a water retention between 3.1 - 4.0 mL of water by g of protein isolate , this
is useful in the elaboration and new developments in baking industry, inlays and
enriched drinks, with respect to the water imbibing capacity (WIC) can be said that this
it showed a great initial speed of absorption, with a maximum water absorption of 2.8
mL of water per g. of isolate. Therefore in conclusion the protein isolate of quinua A11
has a high capacity and can be used like supplement of foods like drinks for sportsman,
inlays, sausages, soups and in dehydrated products, like for example in highly protein
the

functional

food

development.

VIII

I. INTRODUCCION
1.1.- Antecedentes generales.
Las protenas representan uno de los componentes principales de los
alimentos, tanto desde un punto de vista funcional como nutricional. Por ejemplo,
determinan las propiedades fsicas y organolpticas de muchos alimentos. As, la
consistencia y textura de la carne, queso o pan, dependen en gran medida de la
naturaleza de las protenas que los constituyen. Pero tambin, en alimentos elaborados
con una presencia menor de protenas, pueden jugar un papel muy importante,
influyendo en caractersticas funcionales, como la formacin de emulsiones, geles,
espumas y la absorcin de agua o aceite. Adems las protenas tambin constituyen
un aporte nutricional importante, representando una fuente de energa, nitrgeno y
aminocidos esenciales (Vioque y Milln, 2006).
Las protenas son macronutrientes esenciales para la nutricin humana y
animal que habitualmente forman parte de los propios alimentos en su forma natural.
Adems de su papel bsico en la nutricin, las protenas poseen propiedades fsicoqumicas que otorgan unas propiedades funcionales muy especficas al ser
adicionadas a ciertos alimentos. Por esta razn el desarrollo tecnolgico de la industria
alimentara ha recurrido en forma habitual a la utilizacin de productos proteicos con
fines funcionales-tecnolgicos, encaminados a dotar de propiedades fsico-qumicas y
organolpticas a los alimentos donde son incorporadas. Este hecho ha llevado a las
protenas, ms all de su actividad como macronutriente a ser un producto necesario
como ingrediente en la produccin tecnolgica de alimentos. A partir de esta
necesidad, se desarrollaron los procesos necesarios para aislar o extraer las protenas
de sus fuentes orgnicas originales. Se obtienen as los denominados concentrados
proteicos y aislados proteicos, que constituyen un purificado proteico a partir del
alimento o fuente orgnica inicial (Curare, 2006).
Un concentrado proteico es considerado aquel cuyo contenido en protena es
menor del 65%. El aislado proteico se considera aquel con un contenido proteico
mayor que 70%. Las protenas constituyentes de ambos productos deben ser
exactamente las que se encontraban en la fuente orgnica inicial, sin haber sufrido

procesos de degradacin o hidrlisis no deseables. La idea es obtener un

macronutriente purificado con papel tecnolgico y nutricional (Curare, 2006).
Las protenas son agregadas a los alimentos por varias razones, ya que son un
importante suplemento nutricional, las protenas tambin cumplen roles funcionales en
los alimentos. Las propiedades funcionales de las protenas son solubilidad, absorcin
de agua y aceite, comportamiento reolgico, capacidad emulsificante y espumante. La
protenas se usan como aditivos en suplementos nutricionales para mejorar el perfil de
aminocidos e incrementar el contenido de protenas, tambin conlleva beneficios
funcionales como emulsificacin y estabilizacin e incremento de viscosidad, mejora
apariencia, gusto, textura y absorcin de agua o aceite. Los beneficios nutricionales
incluyen un bajo contenido calrico de los alimentos. Los aislados proteicos pueden ser
utilizados en pastelera, en la elaboracin de bebidas para deportistas, en la
elaboracin de embutidos. (Giese, 1994).
1.2.- Antecedentes de la Quinua
La quinua (Chenopodium quinua willd.) es un nutritivo pseudocereal que se
cultiv en forma tradicional en el rea andina desde la poca incsica. Fue
ampliamente usada en la alimentacin de los pueblos antiguos de Sudamrica como
uno de los alimentos bsicos. El cultivo de la quinua en el altiplano disminuy despus
de la conquista espaola, cediendo el paso a cereales introducidos como el trigo y la
cebada. En la actualidad la quinua se cultiva en Argentina, Chile, Colombia y Ecuador
a nivel de pequeo agricultor y para autoconsumo. En Bolivia y Per el cultivo est
difundido en zonas marginales donde no hay otras alternativas agrcolas (Wahli, 1990).
Se distribuye en todo el cordn andino, en una extensin aproximada de 12.000
kilmetros desde Venezuela hasta Chile, desde la latitud norte 6 hasta la latitud sur
47. Esta diversidad geogrfica ha alentado una gran dispersin gentica, que se
traduce en la existencia de unas 3.000 variedades conservadas en los bancos de
germoplasma naturales existentes en la Cordillera de los Andes.
Recientemente se ha despertado el inters en la quinua por el reconocimiento
de su potencial agrcola y de su potencial nutritivo. Aunque la quinua supera a los
cereales ms importantes en algunos nutrientes, es ms notable en el contenido y
calidad de sus protenas (respecto al contenido de aminocidos esenciales). El

verdadero valor de la quinua no es como un reemplazo de algunos alimentos sino ms

bien como un complemento de ellos para que alcance un valor nutritivo alto (Wahli,
1990).
Es considerada por la FAO y la OMS como un alimento nico por su altsimo
valor nutricional. Como un alimento libre de gluten puede consumirla la gran parte de la
poblacin, incluyendo las personas celacas (alrgicas al gluten). La quinua mantiene
sus cualidades nutritivas incluso en procesos industriales, y es capaz de sustituir
notablemente a las protenas de origen animal (CCBOLgroup, 2006).
1.3.- Descripcin botnica
El nombre botnico de la quinua es Chenopodium quinua willdnow, cuya familia
es Chenopodiaceae. Nombres comunes: Quechua: kiuna, quinua, parca; Aymar:
supha, jopa, jupha; Mapuche: quinhua; Espaol: qunua, qunoa; Ingls: quinua,
quinua, kinoa, sweet quinua, white quinua, peruvian rice, Inca rice (Nacional research
council, 1989).
La quinua es una planta herbcea. La raz es pivotante con muchas
ramificaciones y alcanza una profundidad hasta los 60 cm. La altura de la planta vara
entre los 100 cm. y los 230 cm. (Fig. 1). El tallo es cilndrico a la altura del cuello y
angular a partir de las ramificaciones. El nmero de ramificaciones depende del tipo de
entrada y puede variar mucho. El fruto es pequeo, aproximadamente de 2 mm de
dimetro y 1 mm de espesor, el color de la semilla puede ser amarillo, caf, crema,
blanco o translcido. Como se muestra en la figura 1 la planta puede tener diferentes
colores desde amarillo a naranja, rojo vivo, rojo oscuro y verde (Wahli, 1990).

Figura 1: Planta de Quinua (Chenopodium quinoa willd)

Las hojas son alternas, simples, los bordes son dentados pudiendo ser
pronunciados o leves segn las variedades lmina polimorfa hojas inferiores
romboidales, o triangulares, hojas superiores lanceoladas o triangulares, planas u
onduladas, algo carnosas, hojas jvenes cubiertas de papilas esferoidales o globosas
de 1.4 mm de dimetro, blancas prpuras o rojas, a veces las hojas son brillantes y
carentes de papilas, de bordes ms o menos profundamente dentados, 3 a 20 dientes,
en el ltimo caso hojas aserradas, pecolos largos, finos, acanalados en el lado
superior, la coloracin en general vara de verde claro a verde oscuro, las que a su vez
se van transformando en amarillas, rojas o prpuras segn su estado de maduracin.
Posee una inflorescencia denominada pancula, de forma glomerulada, y pueden tener
un aspecto laxo y compacto, forman una panoja que contiene los frutos (granos)
esfricos de 0.8 a 2.3 mm de dimetro, de colores variados desde blanco hasta gris y
negro, pasando por todas las tonalidades de amarillo, rosado, rojo, prpura y morado,
incluyendo vistosas mezclas de varios colores en una sola panoja. El ciclo vegetativo
de la planta tiene una duracin de 8 meses con la siembra en septiembre, alcanzando
su fase de maduracin en abril, para efectuar la cosecha y trilla en los meses de Mayo
y Junio. La variedad "Real" es cultivada generalmente con fines comerciales y de
exportacin. Adems existe la "Blanca" que tiene un dimetro comprendido entre 2.4 y
2.8 milmetros y otra gama de semillas que son cultivadas con fines especficos de
consumo (CIED, 2006).
1.4.- Composicin qumica
La semilla de quinua tiene un alto valor nutritivo, tanto por su composicin
qumica, como por la cantidad y calidad de sus protenas, que flucta entre un 12 y 22
%. Es as como, la calidad de las protenas de quinua es considerada tan buena o
mejor que la casena, esto, debido al buen balance de los aminocidos esenciales,
sobresaliendo el triptfano, la cisteina y la metionina. Sin embargo, la mayor
importancia radica en su alto contenido de lisina, un aminocido deficitario en la
mayora de los vegetales, especialmente en el trigo (Albarran, 1993).
Por otro lado, la semilla de quinua presenta un alto contenido de vitaminas del
complejo B, C y E. Pero tambin, es importante su composicin de sales minerales
tales como: hierro, fsforo, potasio y calcio. Este ltimo se encuentra en la misma

concentracin que en la leche descremada, mientras que el fsforo es cuatro veces

ms concentrado que el de sta (Albarran, 1993).
Como se muestra en la Tabla 1 la harina de quinua tiene un alto contenido de
protenas con un buen balance de aminocidos como se muestra en la Tabla 2 en
donde se puede ver que tiene 16 aminocidos de los cuales 10 son aminocidos
esenciales (Araneda, 2004). La harina de quinua contiene 11,2 % de humedad, 13,5 %
de protenas, 9,5 % de fibra, 58,3 % de carbohidratos y 1,2 % de minerales
(Ogungbenle, 2003).
Tabla 1: Anlisis proximal harina de Quinua
%
Grasa

5,2 0,09

Humedad

11,7 0,06

Cenizas

1,4 0,03

Protenas

14,7 0,5

Carbohidratos totales

64,2

Fuente: Araneda, 2004.

Tabla 2: Contenido de aminocidos en la harina de Quinua.
Aminocidos
Ac. Asprtico
Ac. Glutmico
Serina
Histidina*
Glicina
Treonina*
Arginina*
Alanina
Tirosina
Valina*
Metionina*
Cistina
Isoleucina*
Leucina*
Fenilalanina*
Lisina*

%
1,3
3
0,7
0,4
1,2
0,8
1,6
0,7
0,6
0,9
0,4
0,1
0,8
1,2
0,8
1

* Aminocidos esenciales.

Fuente: Araneda, 2004.

1.5.- Saponinas
El contenido de la saponina en la quinua es de entre 0-6% dependiendo de la
variedad. Se ha observado que la semilla de quinua es de sabor amargo y posee un
cierto grado de toxicidad, que se debe a la presencia de saponinas (glucsido
triterpenoide) en el pericarpio, se elimina, sin embargo por lavado y friccin. Antes de
consumir la quinua es necesario desaponificarla (eliminar las sustancias amargas,
saponinas). Esto se hace frotando los granos de quinua con las manos en agua
corriente hasta que no se forme ms espuma. Se puede usar tambin una piedra para
facilitar la eliminacin de las primeras capas. (Albarran, 1993; Vilche y col., 2003;
Ruales y Nair, 1992; Comai y col., 2006).
En el organismo, las saponinas ocasionan dolor estomacal, nauseas, ligera
diarrea y problemas en la digestin, puesto que la fase jabonosa producida al
mezclarse con el agua y al ser agitada por los movimientos peristlticos de las
vsceras, hace que se rompan las fuerzas de tensin superficial de las fases lquidas
que intervienen en el proceso de digestin. Por esta razn, es necesario eliminar estos
compuestos, previo al consumo, pues no la hacen atractiva como alimento.
Aparentemente, ste ha sido el principal problema para expandir su consumo y cultivo
(Fontrbel, 2003).
1.6.- Usos de la quinua
Se consume como el arroz, en grano; sus hojas tiernas se comen guisadas
como las acelgas y espinacas; su tallo y hojas verdes se aprovechan como ensalada;
se hacan adems sopas o mazamorras; con su harina se elaboran panecillos y
galletas. Igualmente se pueden utilizar sus races. (CCBOLgroup, 2006).
La harina de quinua es utilizada para enriquecer harinas de panificacin en la
elaboracin de: galletas, barritas, tartas, batidos, pasteles, spaghettis, aportando un
alto valor nutritivo. Se utiliza igualmente en la elaboracin de alimentos rebozados,
enriquecindolos, conservando su humedad y aportando un sabor muy agradable as
como una textura fina y especial. As se consigue elaborar alimentos altamente
energticos, muy agradables, 100 % naturales sin colesterol y libres de gluten.

Pastas de quinua: un buen alimento sano y nutritivo estas pastas estn hechas con
una mezcla de smola de trigo candeal y smola de Quinua Real Orgnica y con
resultados extraordinarios, obteniendo textura y gusto muy delicado.
Harina de quinua: Para repostera, incrementa el valor nutritivo de cualquier alimento;
en pastas, panes, galletas. Adems es una de las pocas harinas para celiacos que
tiene un gran valor nutritivo.
Harina tostada de quinua: Quinua cocida finamente molida, para mezclar con agua
fra y azcar para refrescos o con agua hervida, leche y azcar; tambin para
acompaar una rica Sanda.
Hojuelas de quinua: Quinua procesada tipo avena, para sopas, en el desayuno con
leche, para postres se puede cocer con frutas. (CCBOLgroup, 2006).
1.7.- Mercado
Bolivia domin la produccin mundial de quinua entre 1982 y 1998, ao en el
que fue rebasada por el Per. Desde 1990, Bolivia controla ms del 90% de las
exportaciones mundiales de este grano, esencialmente constituido de variedades del
ecotipo denominado real. Este tipo de quinua, apetecido por su mejor aspecto,
cualidades agroindustriales y nivel nutritivo, crece nicamente en las riberas del Salar
de Uyuni, Altiplano Sur, regin que contribuye con ms del 57% de la produccin
boliviana de quinua desde 1989. La mayora de la quinua real producida es
convencional, siendo primordialmente consumida en Bolivia y secundariamente
comercializada de manera no registrada al Per desde fines de la dcada de los aos
1960, pas que constituye el principal mercado externo de la quinua boliviana y
principal consumidor mundial de quinua. Desde el ao 2000, el 20% de la produccin
de quinua real es biolgica, de la cual se exportan 1.800 toneladas en direccin de los
pases del norte, con mercados inestables y de dbil crecimiento, los cuales han sido
creados y en gran parte se desarrollan por accin de empresas privadas: Quinua
Corporation para los Estados Unidos y Euronat-Primal para Europa occidental (Lagos,
2006)
El consumo en Chile es bajo, comparado con otros alimentos ricos en
carbohidratos como: trigo, arroz y maz. Esto se debe a que no se conocen las ventajas

nutritivas de la quinua y a que existe una oferta irregular del producto (Seplveda y
col., 2004).
Los cultivos se han extendido hasta 35.700 hectreas, principalmente en el
altiplano norte, central y sur, y la produccin alcanza a un promedio de 23.200
toneladas mtricas, de las que un 65 por ciento es para el autoconsumo y el 35 por
ciento se destina al mercado boliviano. Los productores de quinua exportaron 2.800
toneladas por un valor de ms de tres millones de dlares a Europa y Estados Unidos
(Azcui, 2005).

II. HIPOTESIS
El estudio de fuentes alternativas de protenas como la quinua, permite generar
conocimiento e informacin para proponer nuevos alimentos enriquecidos en protenas
tecnolgicamente funcionales. La quinua es un pseudocereal, con alto contenido
proteico y excelentes caractersticas nutricionales. La obtencin de un aislado proteico
funcional que pueda ser incorporado a un alimento, es posible a travs del estudio de
los cambios estructurales modificando las condiciones de procesamiento fsicas y/o
qumicas al medio que se expone la protena, relacionando cambios estructurales con
modificaciones en sus propiedades funcionales.
III. OBJETIVOS
3.1.- Objetivo General
Estudiar aislados proteicos de harina desgrasada de quinua orgnica desde el
punto de vista estructural y funcional para poder obtener conocimientos e informacin
que permitan incorporar estas protenas de alto valor nutricional en alimentos
destinados al consumo humano.
3.2.- Objetivos Especficos
Obtener un aislado proteico a pH 11.

Obtener

conocimiento

sobre

las

caractersticas

estructurales

fisicoqumicas del aislado proteico.

Determinar las propiedades funcionales que exhiben las protenas

integrantes del aislado proteico obtenido a pH 11. Se estudiarn
propiedades de hidratacin, como solubilidad, capacidad de retencin
de agua y capacidad de absorcin de agua.

Analizar las relaciones existentes entre las caractersticas estructurales

que exhiben las protenas y sus propiedades funcionales.

Estudio de cambios conformacionales de los aislados proteicos

mediante el estudio de tcnicas espectroforomtricas y electroforticas.

Determinar el perfil aminocidico y el contenido de fitoestrogenos.

Determinacin centesimal.

IV. MATERIALES Y EQUIPOS

4.1.- Materiales
4.1.1.- Materia Prima
Quinua orgnica pelada en seco proveniente de la localidad de La Plaza en la
comuna de Pichilemu, del agricultor Crispulo Leiva, ubicadas en la VI Regin de Chile
4.1.2.- Reactivos qumicos

Acetato de sodio (CH3COONa) Panreac, Barcelona, Espaa

Acetonitrilo (CH3CN) Panreac. Barcelona, Espaa

cido actico glacial (CH3COOH) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

cido ctrico monohidratado Sigma. USA

cido brico (H3BO3) Panreac, Barcelona, Espaa

cido clorhidrico fumante 37 % (HCl) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

cido orto-fosfrico 85% (H3PO4) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

cido perclrico 70-72% p.a Merck. Darmstadt, Alemania

cido sulfrico (H2SO4) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Antrona p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Alcohol etlico (Etanol) (C2H60) p.a Winkler. Mxico

Alcohol etlico (Etanol) (C2H60) 99,5 % absoluto, tcnico, comercializadora

tecnolgica limitada.

Achrilamida (C3H5NO) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Azul brillante de coomasie G-250 (C47H50N3NaO7S2) Baker.USA

Azul de bromofenol (C19H10Br4O5S) Sigma. USA

Bicarbonato de sodio (NaHCO3)

Bis-acrilamida (C7H10N2O2) Sigma. USA

-mercapto etanol (C2H6OS) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Cloruro de sodio (NaCl) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Coomassie blue R (C45H44N3O7S2Na) Sigma. USA

Dietil etoximetilenmalonato. Fluka. Buchs, Suiza

Dodecil sulfato de sodio (SDS) (C12H25NaO4S) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Estndar para electroforesis Bio-Rad Presicion plus protein Catalog 161-0373.

10

Estndar interno para aminocidos DL-2 aminobutyric acid for syntesis, Merck
Shuchardt

Estndar para fitoestrgenos Daizenine Genist 2g/mL.Sigma USA.

Estndar: seroalbmina de bovino (BSA). Sigma. USA

Fosfato de potasio dihidrogeno (KH2PO4) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Glicerol (C3H8O3) Sigma. USA

Glicina (C2H5NO2) Sigma. USA

Glucosa monohidratada p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Hidrxido de sodio (NaOH) W&Z

Hidrxido de sodio (NaOH) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Indicador fenoftaleina (C20H14O4) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Indicador rojo de metilo (C15H15N3O2) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Persulfato de amonio (PSA) ((NH4)2S2O8) Sigma. USA

Sacarosa (C12H22O11) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Sodio fosfato bibsico anhidro (Na2HPO4) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4*5H2O) p.a Merck. Darmstadt, Alemania

Sulfato de potasio (K2SO4) p.a Purom

TEMED (N,N,N`,N`-Tetramethiletilendiamina) Sigma. USA

Tetraborato de sodio

Tris (C4H11NO3) p.a j.t.Baker. USA

4.1.3.- Insumos y utensilios

Agua destilada, bandejas de acero galvanizado de 30 mallas de 44 cm x 24 cm,
cpsulas de aluminio, cpsulas DSC, cubeta para electroforesis, cubetas de cuarzo y
de plstico, esptula, gradilla, guantes, hielo, material de vidrio de laboratorio,
micropipetas, papel absorbente, papel Whatman n1, parafilm, pinzas, plumavit, potes
de plstico, soporte para electroforesis, tubos Ependorf, tubos kjeldahl, tubos para
centrifugas, utensilios de cocina, vidrios para polimerizacin y peineta (plstico
dentado).

11

4.1.4.- Equipos e Instrumentos

Agitador elctrico vortex Thermolyne, tipo 37600 Mixer, model N M37610-26,

serie N 871570819103

Agitador magntico Magnetic Stirrer HI 190M Hanna Instruments, serie

S229370

Agitador Cenco N 34525-200

Balanza analtica Precisa 125 A Swiss Quality

Balanza analtica Mettler Toledo, AG135, snr 1121140784, hecho en Suiza

Balanza granataria AND, model EK 120-A

Bao de agua termoregulado HAAKE, tipo FK N 751117, Alemania

Calormetro diferencial de barrido (DSC) Mettler Toledo 822e snr 5122145369,

hecho en Suiza.

Cmara de refrigeracin FroLux

Campana de extraccin

Centrifuga Heraeus Sepatech Suprafuge 22, Alemania

Conjunto para electroforesis Bio-Rad, con kit para preparacin de geles, cuba
de corrida y fuente de poder.

Desecador

Digestor Bchi 426 N 1270878, type B-426RC, hecho en Suiza

Espectrofotmetro de fluorescencia perkin Elmer, model LS50B, serie N 32938

N L225-0105

Espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 11 NBC11

Espectrofotmetro UNICAM UV/Vis, type UV3-200, N UV 3022809, hecho en

230V, serie NR30031

Inglaterra

Estufa Heraeus Instruments D-63450 Hnau, type UT 6200, hecho en Alemania

Estufa Heraeus, type TU 60/60, N 2760-02, Alemania

Estufa WTB binder, tipo 1924090000200, N 940107

Freezer medical Freezer Sanyo, model MDF-U332, N606033941, hecho en

Japn

Microcentrifuga HermLe Z160 Herteller Spintron, Alemania

Mini secador spray B-191 Bchi, Suiza.

12

Molino de impacto Retsh Muhle GmbH West-Germany, type SR-2 N73454

Mufla , Wild Barfiel, tipo M254 N c2441557, hecho en Inglaterra

Placa calefactora, Gerhardt, tipo H52 N 443792

PHmetro microprocesador pH 537 WTW, hecho en Alemania

Refrigerador Mademsa

Sistema HPLC Merck Hitachi bomba ternaria L6200 con inyector Rheodyne
7725;loop de 20 l, Detector espectrofotomtrico UV-Visible modelo 484 a 280
nm, Integrador D-2500; Columna Nova Pack RP18 (3,9 x 300 mm y un tamao
de partcula de 4 m) Waters, con software Clarity Chromatography Station
para Windows.

Termmetro

Unidad destiladora Bchi 323N1258804, tipo B-323, hecho en Suiza

13

V. METODOS
5.1.- Procedimiento de obtencin de harina
El proceso de obtencin de harina sigue las siguientes etapas (Pearson, 1976):

Recepcin de semillas: Se recibieron semillas de quinua envasada en sacos de

papel doble. Una vez determinada la humedad, estas fueron almacenadas a
temperatura ambiente y en lugar seco.

Limpieza: Se limpi la quinua en forma manual retirando impurezas, tales como,

ramas, palos, piedras y restos de insectos.

Lavado: Esta operacin se realiz en forma manual retirando el total de las

saponinas presente en el grano. Se hizo tantos lavados con agua fra como fue
necesario para no obtener ms espuma proveniente de las saponinas.

Ajuste de humedad: Se ajust el contenido de humedad hasta un 15 +/- 1%

mediante secado en estufa a 50C en regillas de acero galvanizado.

Determinacin de humedad: segn mtodo oficial de anlisis de AOAC

Internacional, 935.29, mtodo gravimtrico.

Molienda: Esta operacin se efectu en molino de martillo-cuchillo,

Tamizado: Este se realiz mediante un tamiz de 60 mesh (Fig. 4).

Almacenamiento: Se almacena en papel kraf en un lugar a temperatura

ambiente y seco.

Figura 2: Secado de semillas de quinua en regilla de acero galvanizado

14

5.2.- Procedimiento de obtencin de un aislado proteico

Este procedimiento comienza con el desgrasado de la harina de quinua, este
consiste en mantener una suspensin al 10 % p/v de harina de quinua con hexano en
continua agitacin, en una cmara de refrigeracin durante 24 horas (Fig. 5).
5.2.1.- Preparacin de la fraccin proteica
El proceso de preparacin de las fracciones proteica sigue las siguientes etapas
(Martnez y An, 1996):

Suspender la harina desgrasada en agua (10 % p/v).

Ajustar a pH 11 con NaOH 2N para solubilizar las protenas.

Agitar la suspensin por 30 min. A temperatura ambiente.(Fig. 3)

Centrifugar a 3400 rpm por 60 minutos a 15 C (anexo 1, Fig. 17 y 18)

Ajustar el pH del sobrenadante a 5 con HCl 2N para precipitar las protenas.

Luego centrifugar a 3400 rpm por 60 min. y se mantiene a 4 C.

El precipitado se resuspende en agua.

Neutralizacin con NaOH 0,1 N

Secado spray (ver anexo 1, Fig. 21).

Figura 3: Solubilizacin de protenas

de quinua

Figura 4: Grano, harina y aislado proteico

de quinua

15

Recepcin materia prima

Limpieza manual

Determinacin de humedad

Lavado con agua fra

Eliminacin Saponinas
Secado a 50 C

Obtencin de harina

Control de humedad hasta 15 +/- 1%

Molienda
Almacenamiento
Desgrasado en hexano al 10 % a 4 5 C por 24 h.

Filtrado al vaco y secado a t ambiente

Suspendido en agua y ajuste a pH 11 con agitacin por 30 min.

Centrifugado a 3400 rpm por 60 min. a 15 C.

Ajustado a pH 5 con agitacin del sobrenadante

Centrifugado a 3400 rpm por 60 min. a 4C

Resuspensin en agua del precipitado

Neutralizacin con NaOH 0,1 N

Secado spray

Anlisis

Figura 5: Obtencin de Aislado Proteico de Quinua A11

16

5.3.- Determinacin del contenido de protenas totales.

Se determin mediante el Mtodo AOAC (1995). La medicin se efectuar solo
una vez a la harina de quinua y al aislado proteico. El mtodo descrito es el de Kjeldahl
que es el mtodo oficial ms ampliamente usado para la determinacin del contenido
de protenas en los alimentos, la razn se debe a su grado de precisin y
reproducibilidad. Consiste en la digestin cida total de la protena y conversin
cuantitativa de nitrgeno a NH3 que se valora por retrotitulacin. El factor de conversin
de nitrgeno utilizado para obtener el contenido de protenas total fue de 5,77
(Schmitd-Hebbel, 1981) (anexo 1, Fig. 22).
5.4.- Anlisis Proximal.
5.4.1.- Cenizas, segn mtodo oficial de anlisis de AOAC Internacional, 923.03
mtodo directo.
5.4.2.- Humedad, segn mtodo oficial de anlisis de AOAC Internacional, 935.29,
mtodo gravimtrico.
5.4.3.- Carbohidratos, mtodo colorimtrico de reaccin de antrona, la muestra se
digiere con cido perclrico. Los almidones hidrolizados, junto con los azcares
solubles reaccionan con el reactivo de antrona originando un compuesto de color verde
azul, el cual se utiliza para la determinacin colorimtrica, mediante el
espectrofotmetro. Los resultados se expresan en glucosa (Osborne y Voogt, 1986)
(Ver anexo 3).
5.5.- Tamizado
Este se realizo mediante una batera de tamices con luces de malla de 0,500;
0,250 y 0,125 mm.
5.6.- Perfil de aminocidos.
Se sigui la metdica descrita por (Alaiz y col., 1992) en la cual la muestra se
hidroliza con 4 mL de HCl 6 N a 110 C por 24 horas. Posteriormente el hidrolizado de
aminocidos se lleva a sequedad y se disuelve con buffer borato de sodio pH 9,
aforando a un volumen de 25 mL, luego se derivatizan

5 mL con 0,8 l de

etoximetilenmalonato de dietilo a 50C por 50 minutos con agitacin vigorosa. Se

17

inyectan 20 l en el cromatgrafo HPLC. Se utiliz el equipo HPLC Merck Hitachi con

inyector Rheodyne 7725i, loop de 20 l y deteccin espectrofotomtrica UV-visible
modelo 484 a 280 nm, integrador D-2500, columna Nova Pack RP18 (3,9 x 300 mm y
un tamao de partcula de 4 m) Waters, con software Clarity Chromatography Station
para Windows La resolucin de los derivados de aminocidos se logr usando un
sistema de gradiente binario con flujo de 0,9 mL/min a temperatura ambiente
empleando como fase mvil buffer acetato de sodio pH 6 y acetonitrilo.
5.7.- Determinacin de Fitoestrgeno.
Se sigui la metdica descrita por (wang y col., 1990) en la cual a 1 g de
muestra se agreg 24 mL de HCl 1 M, luego se calent en bao de agua a 98 C por 2
horas, se deja enfriar y se agregaron 100 mL de acetonitrilo, despus se agit por 1
minuto y se diluy 1 mL del sobrenadante con 1 mL de agua luego se filtro. Por ltimo
este filtrado se analiz mediante HPLC. Se utiliz el mismo equipo sealado en la
seccin 5.6 y una fase mvil de metanol: agua en gradiente binario con flujo de 0,7
mL/min con longitud de onda de 254 nm.
5.8.- Anlisis y caracterizacin de polipptidos que integran los aislados de
quinua mediante Electroforesis (PAGE)
Se realiz de acuerdo al mtodo descrito por LaemmLi U. K. (1970). Este
mtodo describe la tcnica PAGE que se realiz en funcin del estado de las protenas
(nativo o desnaturalizado) a lo largo del proceso electrofortico.
En la electroforesis nativa (PAGE-nativa), se someti a las protenas a
migracin en un campo elctrico. En esta situacin las protenas migran en funcin de
su carga, de su tamao y de su forma. Para esto se utilizo un gel separador de
poliacrilamida al 5% en ausencia de SDS, para un gel de 1 mm de espesor.
En la electroforesis desnaturalizante (PAGE-SDS), las protenas son sometidas
a migracin en un campo elctrico en presencia de un detergente aninico (SDS),
asegurando la completa desnaturalizacin (prdida de la estructura tridimensional). En
esta situacin la migracin es proporcional al tamao molecular de la molcula pero no
a su carga. Para esto se utilizo un gel concentrador de poliacrilamida al 5% y un gel
separador de poliacrilamida al 12 %, para un gel de 1 mm de espesor.

18

Para la electroforesis desnaturante en condiciones reductoras se agreg a la

muestra 2-mercaptoetanol al 20% (Ver anexo 1, Fig. 20 y anexo 2).
Las masas moleculares de los polipptidos fueron calculadas usando los
siguientes estndares de protenas de 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 y 250 kDa,
Bio-Rad Presicion Plus Protein.
5.9.- Anlisis de las caractersticas conformacionales de las protenas en
solucin.
5.9.1.- Espectroscopia UV
Se prepararon dispersiones de aislado al 1% en buffer de pH 3, 5, 7, 9 y 11, los
cuales se agitaron mediante vortex por lapsos de 15 minutos durante 1 hora, luego se
centrifugaron por 30 minutos a 10000 rpm. Por ltimo se midi la absorcin de las
muestras mediante un barrido de 250 a 450 nm (Abugoch, 2006; Mathews y col. 2002).
5.9.2.- Fluorescencia.
Se prepararon dispersiones de aislado al 1% en buffer de pH 3, 5, 7, 9 y 11, los
cuales se agitaron mediante vortex por lapsos de 15 minutos durante 1 hora, luego se
centrifugaron por 30 minutos a 10000 rpm. Posteriormente Se estandariz el contenido
de protenas a 0,02 mg/mL, luego se procedi a la medicin excitando a 270 y 290 nm
y obteniendo el espectro de emisin en cada caso en el rango de 300 a 500 nm a una
velocidad de barrido de 300 nm/min (Abugoch, 2006; Mathews y col., 2002;
Permyakov, 1993).
5.9.3.- Calorimetra diferencial de barrido (DSC)
Esta tcnica permite medir la energa suministrada a una sustancia (muestra) y a
un material de referencia en funcin del tiempo o la temperatura, mientras que la
sustancia y el material de referencia son sometidos a un programa controlado de
calentamiento. Cabe sealar que la referencia debe estar constituida por un material
inerte el cual no sufre ningn cambio fsico o qumico en el rango de temperatura a
emplear (Aon y Jovanovich, 2000).
El mtodo consiste en tomar entre 15 20 mg de la suspensin al 20 % del
aislado proteico en agua y en buffer de pH 9 y colocarla en una cpsula previamente

19

pesada y tarada, posteriormente sellar y colocar la muestra en el equipo de

calorimetra diferencial de barrido (DSC), se trabaj con un rgimen de calentamiento
desde 10 a 120 C con un flujo de calor de 10C/ minuto, la cpsula de referencia
contena el aislado proteico de quinua con la protena previamente desnaturalizada
(Abugoch, 2006; Martnez y An, 1996).
5.10.- Determinacin de las propiedades funcionales de hidratacin
5.10.1.- Solubilidad
Se prepararon dispersiones proteicas al 1% p/v en buffer de pH 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10 y 11. Las muestras se sometieron cada 15 minutos a agitacin intensa y breve en
vortex

durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador mecnico.

Seguidamente los tubos se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos a 15C.

(Scilingo, 2000). La protena que queda en el sobrenadante se cuantificara mediante el
mtodo descrito por Bradford, M. M. (1976) (Ver anexo 1, Fig. 19 y anexo 4).
5.10.2.- Capacidad de retencin de agua
Se prepararon dispersiones proteicas al 1% p/v en buffer de pH 3, 4, 5, 7, 9 y
agua. Las muestras se sometieron cada 15 minutos a agitacin intensa y breve en
vortex durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador mecnico. Seguidamente
los tubos se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos a 15C y se determinar la
masa de precipitado obtenido (Scilingo, 2000). La cantidad de protena que puede
solubilizarse en las condiciones de ensayo se determino en el sobrenadante obtenido
luego de la centrifugacin, haciendo uso del mtodo de Bradford M. M. A (1976).
La capacidad de retencin de agua se calcula de acuerdo a la siguiente ecuacin:
Donde: WHC =

(M 2 (M 1 M 3))
M1 d

WHC: Capacidad de retencin de agua expresada en mL de agua por g de muestra.

M1: masa de muestra pesada en g.
M2: masa de precipitado obtenido en g.
M3: masa de la protena soluble en g.
D: densidad del agua a 25 C (Ver anexo 5)

20

5.10.3.- Capacidad de absorcin de agua

Este mtodo consiste en determinar la cantidad de agua que un polvo proteico
es capaz de absorber espontneamente a una temperatura dada, cuando se pone en
contacto con una cantidad limitada de agua.
El equipo consiste en una pipeta de pequeo volumen graduada, cuyo eje
longitudinal se encuentra al mismo nivel que la superficie de contacto entre el agua y el
polvo proteico. El polvo se coloca sobre un papel filtro que est apoyado en una
superficie plana y en un embudo. Ambos, la pipeta y el embudo se conectan a travs
de una manguera transparente (Fig. 6). Los resultado se expresan en cantidad de agua
absorbida por cantidad de aislado (mL de agua/ g aislado) en funcin del tiempo (An
y col, 2000) (Ver anexo 6).

Figura 6: Esquema del equipo utilizado para la determinacin de absorcin de agua del
aislado proteico de quinua A11.

5.11.- Anlisis estadstico.

Los resultados obtenidos fueron analizados utilizando la media aritmtica y la
desviacin estndar. Adems se realiz un anlisis de varianza con un nivel de
confianza del 95 % para ver si existen diferencias significativas entre los pH
estudiados. Para ello se utiliz el programa StatGraphics Plus 4.0 con el que se realiz
un ANOVA simple segn Tukey y Duncan usando como variable dependiente el
anlisis que corresponda y como variable independiente el pH.

21

VI. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1.- Composicin proximal
En la Tabla 3 se muestra la composicin proximal del aislado proteico de quinua
A11, en donde se puede apreciar que el contenido de protenas es bastante alto, pero
menor que para aislado proteico de soya (85,4% Tomotake y col., 2002) y tambin
menores a los obtenidos para aislado proteico de amaranto (90% Martnez y An,
1996). Otra investigacin obtuvo un aislado proteico de amaranto con similares
resultados con un contenido de protenas de 82,2% (Abugoch, 2006). El contenido de
humedad fue bajo, lo que le confiere estabilidad en el tiempo a las protenas.
Tabla 3: Composicin proximal del aislado proteico de quinua
Composicin del aislado A11
Protenas*
Humedad
Cenizas*
Hidratos de Carbono*
Aw (25 C)

%
83,5 0,2
6,8
3,5
11,9 0,2
0,32

*Expresado en base seca.

6.2.- Determinacin de fitoestrogenos

Se determin el contenido de fitoestrogenos y se encontr que tanto el aislado
proteico como su materia prima no presentaron fitoestrogenos. En tres ecotipos de
quinua estudiados anteriormente, tambin procedentes de la VI Regin, se encontr
fitoestrogenos del grupo isoflavonas, especficamente Genisteina y Daidzeina
(Araneda, 2004), por consiguiente, en estudios posteriores deber determinarse si
estos compuestos quedan en el aislado o se pierden en el proceso de extraccin de la
protenas.
6.3.- Determinacin de aminocidos
Se determin la composicin de aminocidos del aislado proteico de quinua
A11, los resultados expresados, se muestran en la Tabla 4, como g de aminocidos/
100 g de protena del aislado proteico de quinua A11.

22

Tabla 4: Composicin de aminocidos en g/100g de protena de quinua

Ac. Asprtico
Ac. Glutmico
Serina
Histidina*
Glicina
Treonina*
Arginina*
Alanina
Tirosina
Valina*
Metionina*
Cistina
Isoleucina*
Leucina*
Fenilalanina*
Lisina*

Aislado proteico de quinua

7,7 0,12
16,1 1,13
5,2 0,00
2,5 0,07
5,5 0,09
4,7 0,05
9,8 0,22
4,1 0,07
3,9 0,05
5,2 0,12
2,6 0,09
0,7 0,07
4,3 0,10
7,6 0,17
4,5 0,09
5,7 0,12

* Aminocidos esenciales.

La quinua contiene 16 aminocidos, de los cuales 10 son esenciales: histidina,

treonina, arginina, valina, metionina, isoleucina, leucina, fenilalanina, lisina y triptfano.
Los que no pueden ser sintetizados por el organismo y deben ser aportados por la
dieta o en caso contrario pueden producir trastornos en la salud.
La lisina, uno de los aminocidos ms escasos en los alimentos de origen
vegetal, se muestra en la quinua en una proporcin que al menos duplica la contenida
en los otros cereales. La importancia de la lisina se debe a que tiene funciones claves
en el desarrollo de las clulas del cerebro humano y en el crecimiento. De hecho, se la
asocia con el desarrollo de la inteligencia, la memoria y el aprendizaje.

23

20,00
18,00
16,00

A11
A9

Contenido (g/100 g proteina)

harinas VI Regin
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00

Ac
.A
s
Ac p
. G rtic
o
lu
t
m
ic
o
Se
rin
a
H
is
tid
in
a
G
lic
in
tre a
on
in
Ar a
gi
ni
n
Al a
an
in
a
Ti
ro
si
na
Va
lin
m
a
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io
ni
na
ci
st
in
Is
a
ol
eu
ci
n
Le a
u
Fe
c
ni ina
la
la
ni
na
Li
si
na

0,00

Figura 7: Grafico comparativo de aminocidos entre el aislado proteico A11, un aislado

obtenido a pH 9 y un promedio de harinas de quinua de la VI regin

Los aminocidos en menor cantidad fueron histidina y metionina, similares

resultados se obtuvieron en harina de quinua (Ranhotra y col., 1993), en aislado
proteico de arveja (Rangel y col., 2003). Al comparar la composicin de aminocidos
de A11 con aislado proteico de salvado de arroz (Wang y col., 1999) se puede
observar que se obtuvieron resultados similares en todos los aminocidos siendo la
cistina el de menor cantidad.
En la Figura 7 se puede ver que comparando con un aislado de quinua obtenido
a pH 9 (Rivera, 2006) el contenido de aminocidos fue bastante similar no
destacndose el mayor contenido de algn aminocido. Comparando con harinas de
quinua de la VI Regin (Gajardo, 2006; Villarroel, 2006) se puede decir que sta tiene
un contenido de cido glutmico, glicina, treonina y alanina ms alto que el aislado
A11; est diferencia se puede deber a los distintos ecotipos utilizados en aquellos
estudios.

24

Comparado con el patrn de aminocidos propuesto por la FAO en la Tabla 5,

se puede decir que el contenido de aminocidos del aislado A11 supera al patrn e
igualando en el contenido de lisina, demostrndose el alto nivel nutricional del aislado.
Tabla 5: Comparacin entre el patrn FAO/OMS y el aislado A11
Aminocidos

Patrn FAO/OMS para

A11

nios de 2-5 aos g/

100 g de protenas
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina + Cistina
Fenilalanina + Tirosina
Treonina
Valina

1,9
2,8
6,6
5,8
2,5
6,3
3,4
3,5

2,5
4,3
7,6
5,7
3,3
8,4
4,7
5,2

6.4.- Tamizado
Los resultados arrojan que el tamao de partcula del aislado proteico de quinua
A11. Tiene 35,33 % entre 0,250 y 0,500 mm; 58,37 % entre 0,125 y 0,250 mm y 4,82 %
menor a 0,125 mm.
6.5.- Espectroscopia UV
En la Figura 8 se muestran los espectros UV de dispersiones al 1% del aislado
proteico de quinua en distintos pH. Se grafic el promedio de cada ensayo y su
duplicado. De donde se desprende que la estructura proteica es afectada por el pH,
observndose que hay un aumento de la absorbancia y de la longitud de onda a pH
alcalinos, encontrndose a pH 11 una absorbancia mxima a una longitud de onda de
376 nm.
Tambin se puede decir que los pH 9 y 11 tienen una marcada diferencia con
respecto a los pH cidos, probablemente debido a que los pH 3 y 5 estn cercanos al
punto isoelctrico, y por lo tanto habra menos concentracin de protenas,

25

obtenindose por consiguiente una absorbancia menor que a pH alcalinos, en donde

Absorbancia

las protenas se encuentran parcialmente desnaturalizadas (Abugoch, 2006).

2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
300

pH 3
pH 5
pH 7
pH 9
pH 11

320

340

360

380

400

420

440

460

Longitud de Onda (nm )

Figura 8: Espectros UV para aislado proteico de quinua a distintos pHs

La absorcin sucede cuando las transiciones de energa elevada entre estados
electrnicos de una molcula conducen a la absorcin en la regin visible o ultravioleta
del espectro. La absorcin proteica ms fuerte se encuentra en dos mrgenes de
longitud de onda dentro de las regiones ultravioleta, en la proximidad de 280 y 200 nm.
En el margen de 270-290 nm, vemos la absorcin por las cadenas laterales aromticas
de fenilalanina, tirosina y triptfano (Mathews y col., 2002).
6.6.- Espectroscopia de Fluorescencia
A continuacin en la Figura 9 se muestran los espectros de fluorescencia, de
dispersiones de concentracin 2 mg/mL del aislado proteico A11, en distintos buffers.
Se grafic el promedio de cada ensayo y su duplicado. En donde se puede observar
que la intensidad de fluorescencia es afectada por el pH, encontrndose un aumento a
pH alcalino acompaada de un corrimiento de las longitudes de onda mxima hacia
valores menores, observndose una intensidad mxima a pH 11 a una longitud de
onda de 346,5 nm.

26

Tabla 6: Longitud de onda e Intensidad de fluorescencia para el aislado

proteico de quinua (A11)
pH

Longitud de onda (nm)

Intensidad

361 0b

27,6 0,0a

349 0a

60,6 3,2b

346 3a

83,1 1,5c

344 1a

90,4 2,5cd

11

348 2a

91,1 0,8d

(*Letras distintas indican diferencias estadsticamente significativas)

En la Tabla 6 se presentan las longitudes de onda e intensidades promedio en

donde se observa que a pH 3 y 5 los espectros presentan mayores diferencias con
respecto al pH 7 que los espectros obtenidos a pH alcalinos. Estas variaciones se
pueden atribuir a cambios en el entorno del triptfano inducido en una misma protena
por efecto del pH o a la presencia de distintas especies proteicas con diferentes
contenidos de triptfano los que tendran entornos moleculares diferentes (Abugoch,
2006).
Al comparar con los resultados obtenidos de un aislado proteico solubilizado a
pH 9 (A9) (Rivera, 2006), se puede decir que el aislado proteico de quinua a pH 11
(A11) tiene una tendencia similar que el aislado proteico obtenido a pH 9 (A9), pero el
aislado proteico A11 tiene intensidades de fluorescencia menores que los obtenidos
por el aislado proteico A9, esto debido a que este aislado tiene mayor solubilidad que
el aislado proteico A11 y por ende hay una mayor cantidad de protenas en solucin y
tambin podra deberse a diferencias en la estructura de las protenas, dado que el
A11 present menor grado de estructura que el A9 (Rivera, 2006) debido al tratamiento
de obtencin de este aislado. Tambin se puede decir que ambos aislados proteico A9
y A11 podran tener una composicin similar pero con diferente grado de estructura.

27

Intensidad

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
310

pH 3
pH 5
pH 7
pH 9
pH 11

330

350

370

390

410

430

450

470

490

Longitud de Onda (nm)

Figura 9: Espectros de fluorescencia para aislado proteico A11 de quinua a distintos

pHs

La disminucin de la intensidad de fluorescencia acompaada del corrimiento

de la longitud de onda mxima hacia el rojo nos estara indicando la presencia de
residuos de triptfano ms expuestos al medio polar en las estructuras a pH cido y
por lo tanto un cambio en el grado de estructura (Abugoch, 2006).
El fenmeno de la fluorescencia se origina cuando las molculas pasan a un
estado electrnico excitado por la absorcin de energa radiante vuelve al estado basal
por una transferencia sin radiacin de la energa de excitacin a las molculas
circundantes, es decir la energa vuelve como calor, pero en ocasiones una molcula
perder solo una parte de su energa de excitacin por transferencia y volver a radiar
la parte mas grande. En las protenas la tirosina y el triptfano son los grupos
fluorescentes ms importantes (Mathews y col., 2002). El triptfano cuando es excitado
a 295 nm genera fluorescencia que es muy sensible a los cambios en el entorno vecino
a l (Royer, 1995). Este aminocido da un espectro de mayor intensidad, que
fenilalanina y tirosina, que son frecuentemente apagadas por l, siendo por lo tanto el
fluorfobo dominante (Abugoch, 2006). El entorno de estos residuos puede modificar
en gran medida la intensidad de su fluorescencia, por esto, esta tcnica es de gran
utilidad para observar los cambios de conformacin proteica (Mathews y col., 2002).

28

6.7.- Anlisis y caracterizacin de la composicin de polipptidos que integran

el aislado proteico de quinua A11
6.7.1.- Electroforesis Nativa PAGE-nativo
En la Figura 10 se presenta el gel obtenido en condiciones nativas para el
aislado proteico de quinua obtenido a pH 11 (A11),
Aqu se observaron principalmente 3 bandas proteicas, dos de las cuales
poseen baja movilidad, estas podran corresponder albminas y globulinas de acuerdo
a lo descrito por Martnez y An (1996). En condiciones nativas las protenas de
quinua estn compuestas principalmente por dos tipos de polipptidos, albminas del
tipo 2S y globulinas 11S ambas estabilizadas por puentes disulfuro con masas
moleculares de 3 - 4 kD y 7 - 9 kD (Brinegar y col., 1996; Brinegar y Goundan, 1993).
En comparacin con un aislado proteico de quinua a pH 9 (A9) (Rivera, 2006),
se puede decir que no se encontraron diferencias, ya que est present las mismas
bandas proteicas. Por otra parte, en contraste con resultados obtenidos para harina de
quinua (Villarroel, 2005; Gajardo, 2005) se puede decir que no concuerdan, ya que en
la electroforesis nativa para el aislado proteico de quinua (A11) se obtuvo una menor
movilidad de las protenas y mayor nmero de bandas que las presentara la harina.

Figura 10: PAGE Nativa de aislado proteico de quinua a pH 11 (A11) y pH 9 (A9)

29

6.7.2.- Composicin polipeptdica a partir de electroforesis Desnaturante con y

sin 2-mercaptoetanol (2-Me)
Cuando se investigan las subunidades de una protena mediante esta tcnica,
es aconsejable realizar dos experimentos: uno en presencia de un agente reductor de
enlaces disulfuro como el 2-mercaptoetanol y otro en su ausencia. De este modo, se
distinguir entre las subunidades que se mantienen juntas mediante puentes de
disulfuro y las que se mantienen juntas solo mediante fuerzas no covalentes (Mathews
y col., 2002). En la Figura 11 se puede apreciar en a la electroforesis desnaturante en
ausencia de 2-mercaptoetanol y en b la electroforesis en presencia de 2-Me para el
aislado proteico de quinua obtenido a pH 11 (A11).
Para la electroforesis desnaturante en ausencia de 2-Me (a) se observaron
bandas proteicas de variadas masas moleculares de las cuales las ms importantes
son 12,9; 14,5; 16,0; 17,1; 23,3; 27,6; 36,9 y 49,7 kDa, ya que son las bandas ms
intensas que tienen una mayor cantidad de esas protenas.

Figura 11: PAGE SDS de aislado proteico de quinua a pH 11 (A11): a) sin 2-Me y
b) con 2-Me

30

Tabla 7: Composicin de polipptidos del A11 con y sin 2-Me (kDa)

Con 2- Me
107,7
65,1
49,7
36,9
31,6
27,6
23,3
19,3
17,2
16,0
14,5
12,9
11,3

Sin 2-Me
56,4
40,4
34,1
17,1
15,4
13,2
12,9
10,8

Para la electroforesis desnaturante en presencia de 2-Me (b) se observan

bandas proteicas de 12,9; 15,4; 17,1 y 34,1 kDa siendo estas las ms intensas,
encontrndose una mayor intensidad de polipptidos entre 11,3 y 12,9 kD. Adems se
puede observar en la Tabla 7 que en comparacin con la electroforesis en ausencia de
2-Me la desaparicin de bandas, lo que da a entender la existencia de protena
mantenidas por puentes de disulfuro (-S - S-), que son protenas de mayor masa
molecular que al romperse sus enlaces disulfuro se convirtieron en protenas de menor
masa molecular, como la banda obtenida a 49,7 kDa en presencia de 2-Me que se
rompe dos bandas de 17,1 y 34,1 kDa bandas ms pequeas.
Por otro lado las bandas mayores de 100 kDa son aglomerados proteicos,
protenas que no se disolvieron.
Los resultados obtenido tanto para la electroforesis desnaturante en ausencia
de 2-Me como en presencia de 2-Me coinciden con los resultados obtenidos para un
aislado proteico de quinua obtenido a pH 9 (A9) (Rivera, 2006).
En estas condiciones, las estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias de
las protenas se descomponen todas. La cadena se despliega y se rodea de molculas
de SDS. Las numerosas cargas negativas transportadas por las muchas molculas de

31

SDS unidas a la protena se hacen insignificantes. La cadena polipeptdica plegada se

transforma en un objeto alargado, cuya carga y longitud son proporcionales a la
longitud (y, por lo tanto al peso molecular) de la cadena (Mathews y col., 2002).
Las globulinas tipo 11S se caracterizan por tener dos grupos heterogneos de
polipptidos a 30 - 40 kD (subunidades cidas) y a 20 - 25 kD (subunidades bsicas)
las cuales son ligadas por puentes de disulfuro (Brinegar y Goundan, 1993). Por
consiguiente las bandas alrededor de 36,9 y 23,3 kD (en ausencia de 2-Me) seran
globulinas tipo 11S. Adems concuerdan, ya que estas desaparecen en condiciones
reductoras ratificando la condicin de estar ligadas por puentes de disulfuro.
Los polipptidos 2S poseen masas moleculares de entre 8 9 kD bajo
condiciones reductoras (Brinegar y col., 1996), por lo tanto se encuentran polipptidos
de este tipo a 10,8 kD en b.
6.8.- Calorimetra diferencial de barrido (DSC)
La calorimetra diferencial de barrido (DSC) es una tcnica termo-analtica que
se usa para monitorear los cambios en la energa trmica asociados con las
transformaciones fsicas y qumicas de los materiales como funcin de la temperatura.
En tecnologa de alimentos existen numerosos ejemplos en los cuales algunas
sustancias experimentan cambios fsicos y/o qumicos cuando se les suministra o
extrae calor como: cambios de fase en agua, grasas y lpidos, desnaturalizacin de
protenas y gelatinizacin de almidones (Rodrguez y col., 2001; Martnez y An,
1996).
Esta tcnica es relativamente sencilla. Mediante la DSC se mide la capacidad
calorfica relativa de un sistema determinado cuando sufre una transicin inducida por
un cambio trmico. En el experimento, las celdas con la muestra y la referencia se
calientan simultneamente a una misma velocidad predeterminada. Cuando se
calientan ambas celdas y se produce una transicin inducida por la temperatura, la
muestra absorbe parte del calor que se le est suministrando a la celda (Beldarran,
2001).
En la Figura 12, se muestra el termograma obtenido para el aislado proteico de
quinua a pH 11 (A11) en una suspensin al 20 % en agua, en donde se puede
observar una pequea endoterma con dos transiciones trmicas con una temperatura

32

de desnaturalizacin de al menos Td = 96,1 C, semejantes a las descritas para

globulinas vegetales del tipo 11S (Abugoch, 2006; Martnez y An, 1996) y una
entalpa H= 1,35 mJ lo que esta sealando que el aislado proteico de quinua A11
present poco grado de estructura, similar resultado se obtuvo para el aislado proteico
de amaranto extrado bajo las mismas condiciones que el de quinua (Abugoch, 2006)
Cuando el A11 es sometido a pH alcalino, zona de pH en la cual se ha descrito
para numerosas protenas vegetales que las globulinas presentan mayor grado de
estructura (Abugoch, 2006; Martnez y An, 1996; Castellani y col, 1998).
En la Figura 13, se muestra el termograma obtenido para el aislado proteico de
quinua a pH 11 (A11) en una suspensin al 20 % en buffer de pH 9, en esta condicin
de pH alcalino se encontr una endoterma con un poco mayor grado de estructura que
en agua donde se obtuvo dos transiciones trmicas a partir de Td = 99,2 y una entalpa
un poco mayor a la obtenida en agua, pero igualmente baja de 2,1 mJ/g lo que no s
sugiere que las molculas de las protenas del aislado proteico de quinua a pH 11
quedan prcticamente desestructuradas, ya al momento de ser extradas a ese pH.
Similar resultado se obtuvo de un aislado proteico de amaranto en buffer de pH 9
(Abugoch, 2006).

33

^ex o

A 11 en agu a 2

05.10.2006 12:10:39

mW

-1.5

A 1 1 e n a g u a 2 , 0 5 . 1 0 . 2 0 0 6 1 2 : 0 6: 1 1
A11 e n agua 2, 17.2500 mg

I n t eg r a l
- 1.35 mJ
Peak
9 6 .1 0 C
Left Li mit
9 1 .6 7 C
R i g ht L i m i t
1 1 0. 3 4 C
H e a ti n g R a te
1 0 .0 0 C m in ^ - 1

-1.6

-1.7

-1.8

-1.9

-2.0

-2.1

-2.2
70.0

75. 0

80 .0

8 5.0

90.0

95.0

100.0

6 .0

6.5

7.0

7.5

8. 0

8 .5

9.0

Univ er s idad de Santiago de Chile: Lab. Pr op. Fis ic as

105.0

110.0

1 1 5 .0

9.5

1 0.0

10.5

min

METTL ER T OLEDO S TA Re Sy s te m

Figura 12: Calorimetra diferencial de barrido del aislado proteico de quinua a pH 11

(A11) en una suspensin al 20 % en agua.
^ex o

A 11 pH 9 2

05.10.2006 13:25:10

mW

A11 pH 9 2, 05.10.2006 13:20:44

A11 pH 9 2, 15.5800 mg
-0.2

-0.3

Integral
-1.29 mJ
Peak
104.15 C
Left Limit
98.95 C
Right Limit
112.47 C
Heating Rate
10.00 Cmin^-1

Integral
-0.82 mJ
Peak
94.31 C
Left Limit
86.32 C
Right Limit
98.90 C
Heating Rate
10.00 Cmin^-1

-0.4

-0.5

-0.6

-0.7
60. 0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95 .0

100.0

105.0

110.0

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8 .0

8.5

9.0

9.5

10.0

Univ er s idad de Santiago de Chile: Lab. Pr op. Fis ic as

METTL ER T OLEDO

1 1 5 .0

10.5
m in
S TA Re Sy s te m

Figura 13: Calorimetra diferencial de barrido del aislado proteico de quinua a pH 11 (A11)
en una suspensin al 20 % en buffer de pH 9.

34

6.9.- Solubilidad
Los resultados de la solubilidad en funcin del pH del aislado proteico de quinua
A11 se muestran en la Figura 14. En donde se observa que a pH 11 se obtuvo la
mxima solubilidad del aislado y a pH 3 la mnima solubilidad, observndose asimismo
una tendencia significativamente (p<0,05) ascendente de la solubilidad con el pH.
Teniendo una mayor solubilidad entre los pHs 8 11 oscilando entre 31,9 41,4 %.
45
% Solubilidad

40
35
30
25
20
15

cd

10
5
2

10

11

12

pH

Figura 14: Solubilidad del aislado proteico de quinua a diferentes pHs

Las variaciones de solubilidad con el pH, tienen que ver con la modificacin de
la carga neta de las protenas y por lo tanto con su balance electrosttico; en la zona
cercana a su punto isoelctrico (pI) la carga neta de las protenas tiende a 0 y la
variacin de la solubilidad es mnima debido al aumento de la atraccin entre las
molculas. Del lado alcalino al pI las protenas tendrn una carga neta negativa y
probablemente mayor que la carga neta positiva que presenta en medio cido, de este
modo las fuerzas repulsivas a pHs alcalinos y cidos extremos sern ms importantes
que las fuerzas de atraccin aumentando la solubilidad (Abugoch, 2006). De acuerdo a
esto el punto isoelctrico de las protenas de quinua estara entre los pH 3 y 4, menor
que el punto isoelctrico reportado para harina de quinua, el cual es pH 6 (Oshodi,
1999; Ogungbenle, 2003)
Los resultados de solubilidad para el aislado proteico de quinua A11 (41,4%)
son menores a los resultados obtenidos para un aislado proteico de quinua obtenido a
pH 9 (A9) (94,6% a pH 11) (Rivera, 2006), pero concuerdan en que a pH alcalino se
obtiene la mayor solubilidad, de igual manera coinciden con los resultados reportados

35

para harina de quinua en donde se reporto una solubilidad mxima a pH 10 de 50% y

45% (Ogungbenle, 2003; Oshodi y col., 1999).
En comparacin con otros aislados proteicos como el de trigo negro (Tomotake
y col., 2002) que present, una tendencia a aumentar la solubilidad a pH alcalino
siendo esta mayor que la del A11 (55% a pH 10). Por otro lado en contraste con un
aislado proteico de mucuna (Adebowale y Lawal, 2003), se puede decir, que de igual
manera present una tendencia a aumentar su solubilidad a pH alcalino siendo est,
mucho mayor a la del aislado proteico de quinua A11 con un 96% a pH 12. Y al
comparar con la solubilidad de protenas de harina de amaranto (Mahajan y Dua,
2002), se puede decir que este tambin present una solubilidad mayor que para el
aislado A11 con una solubilidad mxima de 70% a pH 12, y en el caso de aislados
proteico de amaranto (Abugoch, 2006) tambin present una solubilidad mxima a pH
11 con un 90%. Tambin se puede incluir los datos reportados para un aislado proteico
de salvado de arroz (Wang y col., 1999) que arrojaron una solubilidad mxima de 82%
a pH 10 con una tendencia muy similar a la mostrada por el aislado proteico A11 a
partir del pH 6 a 12, ya que tambin mostr un lento aumento de la solubilidad. Todos
los aislados citados presentan un punto isoelctrico a pH 4 similar al del aislado
proteico de quinua A11 y en general tambin muestran una tendencia

similar

aumentando gradualmente la solubilidad a partir del pH 6-7 hacia la zona alcalina.

6.10.- Capacidad de Retencin de Agua (WHC)
La capacidad de retencin de agua de las protenas, WHC es un ndice
importante en la evaluacin del comportamiento de las mismas como ingrediente en
productos de panadera, carnes embutidas, salchichas y geles alimentarios. Esta
propiedad afecta no slo las condiciones del procesamiento sino tambin la calidad
final de los productos (Abugoch, 2006; Pilosof, 2000).
En la Figura 15 se muestran los resultados de retencin de agua para el aislado
proteico de quinua A11, en donde se aprecia que no existen diferencia significativas
(p>0,05) entre cada pH, obtenindose un mximo a pH 4 y un mnimo a pH 7. Adems
se puede decir que la retencin de agua oscila entre 3,1 4,0 mL de agua por g de
aislado proteico, tambin que el valor obtenido a pH 7 se asemeja al obtenido en agua
destilada (control).

36

WHC ml agua/g aislado

6,0

5,0

4,0

a
a

3,0
2,0
1,0
0,0
Agua
(Cont rol)

pH

Figura 15: Retencin de agua del aislado proteico a diferentes pH expresado en

mL de agua por g de aislado proteico
(*Letras distintas indican diferencias estadsticamente significativas)

Los valores de retencin de agua para el aislado proteico de quinua A11 fueron
un poco mayores (4,0 1,3a mL de agua/g aislado proteico) que los obtenidos para un
aislado proteico de quinua obtenido a pH 9 (A9) con un mximo de 3,0 0,6a mL de
agua/g aislado proteico (Rivera, 2006), esto se podra deber en un principio, al mayor
grado de desnaturalizacin que presentaron las protenas del aislado proteico A11,
pero el valor obtenido a pH 9 para este aislado es muy cercano al mximo, esto
sugiere que para que un aislado proteico presente una alta WHC, no basta solamente
con encontrarse desnaturalizado, sino que tambin es funcin de cmo se encuentran
las molculas proteicas en los agregados luego del tratamiento. Solamente aquellos
agregados en que las protenas tienen los grupos polares ms accesibles al agua
sern los que posean mayor WHC (Abugoch, 2006). Y tambin podra deberse a que el
aislado A9 tiene una mayor solubilidad, por lo tanto una menor fraccin insoluble que
retenga agua.
Por otra parte, la retencin de agua mxima se obtuvo al mismo pH donde se
registr la mnima solubilidad, lo cual coincide con lo reportado por Abugoch (2006).
Los resultados obtenidos en los pH 3, 5 y 9 son menores en comparacin con
los datos obtenidos para un aislado proteico de amaranto obtenido en las misma
condiciones (Abugoch, 2006), pero son similares a los obtenidos a pH 7 y en agua
destilada.

37

Los datos obtenido para un aislado proteico de trigo negro 3,32 g de agua /g de
aislado (Tomotake y col., 2002) son similares a los resultados del estudio. Pero estos
datos son bastante mayores que los reportados para harina de quinua (1,47 g de agua/
g de harina), harinas de mijo y sesamo (1,15 y 1,82 g de agua/ g harina
respectivamente) y harina de amaranto (1,8 g de agua/ g de harina) (ogungbenle,
2003; Oshodi y col., 1999 y mahajan y dua, 2002).
6.11.- Capacidad de Absorcin de Agua (WIC)
A continuacin en la Figura 16 se muestran, las curvas de capacidad de
absorcin de agua del aislado proteico de quinua A11, en donde se observa
inicialmente una rpida absorcin de agua. Despus se llega a la etapa de saturacin,
donde el aislado ya no es capaz de absorber agua, obtenindose un mximo. El tiempo
que le toma al aislado para llegar a este mximo se denomina tiempo de equilibrio.
Mediante las graficas se puede calcular la velocidad inicial (vi), el volumen mximo de
agua absorbido por gramo de aislado (WIC) y el tiempo de equilibrio (te). Estas son
caractersticas de cada muestra (Pilosof, 2000).

WIC (ml de agua/ g aislado)

3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0

4
tiempo (min)

Figura 16: Capacidad de absorcin de agua del aislado proteico de quinua A11

38

Para el aislado A11 la velocidad inicial de absorcin fue de 3,5 0,35 mL de

agua/min. g aislado, llegando al equilibrio a los 0,8 minutos y con valor de WIC
alcanzado de 2,8 mL de agua/g aislado. La velocidad inicial (1,1 mL de agua/min. g
aislado) reportado para un aislado proteico de amaranto obtenido en las misma
condiciones (Abugoch, 2006), es menor que la del aislado A11, pero la WIC es similar
con 2,5 mL de agua/g aislado. La mayor capacidad de absorcin de agua es resultado
de una mayor desnaturalizacin de las protenas.
En comparacin con un aislado proteico de soya (Sorgentini y col., 1995). Este
aislado reporta una WIC de 4,5 mL/g de aislado considerablemente mayor a la WIC del
aislado A11 y comparando con una aislado proteico de quinua obtenido a pH 9 (Rivera,
2006), este obtuvo una menor velocidad de absorcin con 1,34 mL de agua/min. g
aislado y tambin menor WIC con 1,8 mL/g de aislado, por lo tanto mayor tiempo de
equilibrio con 3,9 min, todo esto es debido probablemente a que el aislado A11 se
encontrara con un mayor de desnaturalizacin que el aislado A9.
La WIC es un parmetro muy importante desde el punto de vista tecnolgico,
vinculado a la practica de rehidratacin que normalmente se realiza antes de la
utilizacin de cualquier ingrediente proteico (Pilosof, 2000).

39

VII. CONCLUSIONES

El contenido de protenas del aislado y su composicin de aminocidos fue

alto y contena 10 aminocidos esenciales: histidina, treonina, arginina,
valina, metionina, isoleucina, leucina, fenilalanina, lisina y triptfano. Siendo
el ms importante la lisina, con una proporcin que al menos duplic el
contenido en otros cereales, ratificando su alta calidad nutricional.

El contenido de aminocidos del aislado A11 super al patrn propuesto por

la FAO, lo cual demuestra su alta calidad nutricional.

No se encontr la presencia de fitoestrgenos en el aislado proteico, debido

a que la harina de quinua utilizada para su elaboracin no contena estos
compuestos. En posteriores estudios deber demostrarse si el proceso de
obtencin del aislado afecta a dichas sustancias.

En espectroscopia UV se puede concluir que es afectada por el pH,

aumentado la absorbancia a pH alcalinos debido a un aumento de la
solubilidad de las protenas.

En espectroscopia de fluorescencia se concluye que la estructura de las

protenas es afectada por el pH, encontrndose que aumenta la intensidad
de fluorescencia a pH alcalinos y a la presencia de distintas especies
proteicas con diferentes contenidos de triptfano.

De la electroforesis nativa y desnaturante (PAGE) se puede concluir que las

protenas de quinua estn compuestas principalmente por dos tipos de
polipptidos, albminas del tipo 2S y globulinas 11S ambas estabilizadas
por puentes disulfuro.

En la calorimetra diferencial de barrido (DSC) las molculas de las

protenas

del

aislado

de

quinua

presentaron

un

bajo

grado

de

estructuracin, debido probablemente a la alcalinidad, del medio aplicado

para la obtencin del aislado.

Con respecto a las propiedades funcionales de hidratacin, para solubilidad

se concluye que sta es mxima a pH 11 y mnima a pH 3, el cual sera su
punto isoelctrico, esto implica que el aislado A11 podra ser utilizado en
bebidas carbonatadas.

40

Con respecto a la capacidad de retencin de agua (WHC), se concluye que

el pH no tiene efecto sobre sta. El aislado A11 present una alta retencin
de agua obtenindose un producto ptimo para su aplicacin en embutidos,
salchichas y geles.

En la capacidad de absorcin de agua (WIC) se puede concluir que el

aislado tuvo una gran velocidad inicial de absorcin y tambin una WIC
bastante alta, tambin se puede concluir que aquellas protenas ms
desnaturalizadas presentan mayor capacidad de absorcin de agua. Lo que
lo hace aplicable en la prctica de hidratacin, sopas y tambin como por
ejemplo en el desarrollo de alimentos funcionales altamente proteicos.

De los resultados de solubilidad se puede suponer una alta capacidad

espumante en el aislado, debido a que ambas propiedades se relacionan.
Dicha capacidad se evidenci a travs del manejo del aislado, pero deber
ser evaluada en estudios posteriores.

Del estudio realizado se puede concluir que el aislado proteico de quinua

posee caractersticas nutricionales y funcionales excepcionalmente aptas
para su utilizacin a escala industrial, por lo tanto queda la ventana abierta
a estudios sobre su utilizacin en el desarrollo de productos que incorporen
el aislado proteico.

41

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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46

ANEXOS

47

ANEXO 1

Figura 17: Centrifuga Heraeus

Sepatech Suprafuge

Figura 19: Espectrofotmetro Perkin

Elmer Lambda

Figura 21: Mini Secador Spray

Figura 18: Rotor de Centrifuga

Figura 20: Equipo Bio-Rad para

Electroforesis

Figura 22: Unidad Destiladora

48

ANEXO 2
Caracterizacin de los perfiles polipeptdicos del aislado proteico de quinua
Electroforesis PAGE
Reactivos
1. Buffer del electrodo o de corrida (pH 8,3): disolver 3,0 g de Tris, 14,4 g de
glicina y 1,0 g de SDS en un litro de agua destilada. En la preparacin del buffer
nativo no incorporado SDS.
2. Buffer del gel de concentracin (pH 6,8): disolver 6,0 g de Tris y 0,4 g de SDS
en 40 mL de agua destilada. Ajustar el pH con HCl 4 N, y completar el volumen
a 100 mL. En la preparacin del buffer nativo no incorporar SDS.
3. Buffer del gel de separacin (pH 8,8): disolver 18,2 g Tris y 0,4 g de SDS en 40
mL de agua destilada. Ajustar con HCl 4 N, y completar el volumen a 100 mL.
En la preparacin del buffer nativo no incorporar SDS.
4. Solucin de persulfato de amonio: disolver 200 mg de persulfato de amonio en
2 mL de agua destilada, eliminar el gas de la solucin y congelar en pequeas
alcuotas. Esta solucin permanece estable por aproximadamente cuatro aos.
5. Solucin colorante: disolver 1,25 g de Coomassie Blue R en 227 mL de metanol
y 46 mL de cido actico glacial. Completar con agua destilada a 500 mL.
6. Solucin decolorante: mezclar 70 mL de cido actico glacial, 300 mL de etanol
y completar el volumen a 1 litro con agua destilada.
7. Solucin archilamida / Bis-acrilamida: disolver 30 g de archilamida y 0,8 g de
bis-acrilamida en 100 mL de agua destilada. Almacenar en frasco oscuro a 4
C.
8. Buffer de muestra desnaturante con -mercapto: mezclar 2,5 mL buffer de gel
de concentracin (pH 6,8) con sds, punta de esptula de azul de bromofenol, 4
mL de glicerol y 2 mL de -mercapto Completar a 10 mL.
9. Buffer de muestra desnaturante: mezclar 2,5 mL buffer de gel de concentracin
(pH 6,8) con sds, punta de esptula de azul de bromofenol y luego 4 mL de
glicerol. Completar a 10 mL.

49

10. Buffer de muestra nativa: mezclar 4 mL buffer de gel de concentracin (pH 6,8)
(nativo), punta de esptula de azul de bromofenol y 4 mL de glicerol. Completar
a 10 mL.
11. SDS 10%: disolver 10 g de sds en 50 mL de agua destilada y completar a 100
mL.
12. Gel concentrador al 5 %: Para 2 geles, 2,1 mL de agua destilada, 0,5 mL de
A/BA, 0,38 mL de tris-HCl pH 6,8 1 M (buffer gel de concentracin), 0,03 mL de
SDS 10%, 0,03 mL de PSA 10% y 0,003 mL de TEMED.
13. Gel separador al 12 %: para 2 geles, 2,182 mL de agua destilada, 4,008 mL de
A/BA, 2,6 mL de tris-HCl pH 8,8 1,5 M (buffer gel de separacin), 0,1 mL de
SDS 10%, 0,1 mL de PSA 10 % y 0,01 mL de TEMED.
14. TEMED
15. Agua destilada
16. Etanol
17. Estndar de peso molecular
Materiales

Esptula

Tubos ependorf

Micropipetas

Toalla nova

Matraces

Papel Kraft

Potes plsticos

Mechero

Regilla de asbesto

Trpode

Plumavit

Hielo

Guantes

50

Equipos

Balanza analtica

Agitador vortex

Congelador

Microcentrfuga

Refrigerador

Conjunto para electroforesis Bio-Rad, con kit para preparacin de geles,

cuba de corrida y fuente de poder.

Preparacin de las muestras para electroforesis PAGE

1. Pesar 5 mg de aislado en un tubo ependorf
2. Agregar 100 l de la solucin desnaturante con -mercapto, desnaturante o
nativa, segn corresponda.
3. Agitar breve e intensamente en vortex a intervalos de 5 minutos, durante 15
minutos.
4. Calentar las muestras durante 1 minuto en agua hirviendo (esto se hace
solo con las muestra desnaturantes), insertando los tubos en plumavit para
que floten.
5. Centrifugar a temperatura ambiente por 15 minutos a 14000 rpm.
6. Recolectar el sobrenadante en otro tubo ependorf. Almacenar los tubos en
congelador hasta llevar a cabo la electroforesis.
7. Cuando se desee ocupar, calentar las muestras durante 1 minuto en agua
hirviendo (esto se hace solo con las muestra desnaturantes), insertando los
tubos en plumavit para que floten.
Procedimiento para electroforesis nativa
1. Los geles se preparan entre dos placas de vidrio perfectamente limpias, es
por esto que antes de comenzar con la preparacin de los reactivos, es muy
importante lavar los vidrios con detergente liquido, enjuagar con abundante
agua destilada y por ltimo ponerles alcohol y secarlos con toalla nova.
2. Colocar los vidrios en el soporte del equipo Bio-Rad, procurando que
queden bien derechos y fijos al soporte.

51

3. Preparar gel al 5 %.
4. Colocar la mezcla en seguida entre las placas de vidrios, con la ayuda de
una micropipeta (hasta que resbale), usando guantes colocar el peine,
procurando que no queden burbujas.
5. Retirar los vidrios del soporte

y colocarlos en la cubeta de corrida del

equipo Bio-Rad, siempre con el peine hacia adentro.

6. Quitar el peine con cuidado y cargar las muestras cuidadosamente con
micropipeta.
7. Cargar el buffer del electrodo (pH 8,3) (nativo) el espacio entre los vidrios
sobrepasando la placa ms pequea. Posteriormente completar con buffer
del electrodo (por fuera) todos los espacios de la cuba de corrida (hasta
cubrir los electrodos).
8. Tapar la cuba de corrida y conectarla a la fuente de poder (cable rojo con
rojo y negro con negro). Programada 200 voltios por aproximadamente 40
minutos, o hasta que la muestra haya alcanzado el borde inferior del gel.
9. Apagar el equipo y remover los vidrios de la cuba de corrida.
10. Retirar el gel cuidadosamente con la ayuda de una esptula o con las
manos, usando guantes, y colocarlo estirado en un recipiente que contenga
solucin colorante, dejar reposar por tres o cuatro horas a temperatura
ambiente, si se desea se pude acelerar esta etapa a 60 C por 10 minutos.
11. Retirar la solucin colorante y adicionar decolorante, esta etapa tambin
puede ser acelerada a 60 C, cambiar la solucin a medida que se vaya
tornando azulada. La solucin decolorante puede ser reaprovechada
adicionndole carbn activado y filtrndola.
Procedimiento para electroforesis desnaturante
1. Los geles se preparan entre dos placas de vidrio perfectamente limpias,
es por esto que antes de comenzar con la preparacin de los reactivos,
es muy importante lavar los vidrios con detergente liquido, enjuagar con
abundante agua destilada y por ltimo ponerles alcohol y secarlos con
toalla nova.

52

2. Colocar los vidrios en el soporte del equipo Bio-Rad, procurando que

queden bien derechos y fijos al soporte.
3. Preparar gel separador al 12 %.
4. Colocar en seguida 3,5 mL de la mezcla (gel separador) entre los vidrios
con la ayuda de una micropipeta. Cubrir la superficie con alcohol, la que
debe ser adicionada lentamente.
5. Sacar los vidrios del soporte y retirar la capa de alcohol que cubre el gel
separador, lavando con abundante agua destilada.
6. Secar entre los vidrios con papel absorbente.
7. Preparar gel de concentracin al 5 %.
8. Colocar en seguida 1,5 mL (o hasta que rebalse) de la mezcla (gel
concentrador) entre los vidrios, sobre el gel separador, con la ayuda de
una micropipeta. Usando guantes colocar el peine, procurando que no
queden burbujas.
9. Retirar los vidrios del soporte y colocarlos en la cubeta de corrida del
equipo Bio-Rad, siempre con el peine hacia adentro.
10. Quitar el peine con cuidado y cargar las muestras cuidadosamente con
micropipeta.
11. Cargar el buffer del electrodo (pH 8,3) el espacio entre los vidrios
sobrepasando la placa ms pequea. Posteriormente completar con
buffer del electrodo (por fuera) todos los espacios de la cuba de corrida
(hasta cubrir los electrodos).
12. Tapar la cuba de corrida y conectarla a la fuente de poder (cable rojo
con

rojo

negro

con

negro).

Programada

200

voltios

por

aproximadamente 40 minutos, o hasta que la muestra haya alcanzado el

borde inferior del gel.
13. Apagar el equipo y remover los vidrios de la cuba de corrida.
14. Retirar el gel cuidadosamente con la ayuda de una esptula o con las
manos, usando guantes, y colocarlo estirado en un recipiente que
contenga solucin colorante, dejar reposar por tres o cuatro horas a
temperatura ambiente, si se desea se pude acelerar esta etapa a 60 C
por 10 minutos.

53

15. Retirar la solucin colorante y adicionar decolorante, esta etapa tambin

puede ser acelerada a 60 C, cambiar la solucin a medida que se vaya
tornando azulada. La solucin decolorante puede ser reaprovechada
adicionndole carbn activado y filtrndola.
ANEXO 3
Determinacin de Hidratos Carbono
Mtodo Reaccin de ANTRONA
Reactivos

cido perclrico al 52%

cido sulfrico al 76%

Agua destilada

Solucin de antrona

Solucin patrn de glucosa 0,05 mg/mL

Solucin patrn de glucosa 0,1 mg/mL

Materiales

4 Tubos de ensayo con tapa

Bao de agua (a ebullicin)

Bao de agua fra (con hielo)

Embudo analtico

Matraz aforado de 100 mL

Matraz aforado de 250 mL

Matraz erlenmeyer con tapa

Papel filtro

Varilla de vidrio

Equipos
Espectrofotmetro
Procedimiento
1. Pesar 1 g de muestra seco 2 g de muestra hmeda en un matraz erlenmayer con
tapa.
2. Agregar 10 mL de agua destilada.

54

3. Agitar con una varilla de vidrio hasta completa homogeneizacin.

4. Agregar 15 mL de cido perclrico al 52%.
5. Agitar y tapar.
6. Dejar por 12 horas para que hidrolice la muestra.
7. Agregar agua al matraz hasta completar 100 mL aproximadamente.
8. Filtrar la solucin con embudo analtico y papel filtro. Recibir el filtrado en un matraz
aforado de 250 mL.
9. Lavar el precipitado, el matraz y el papel filtro con agua destilada (recibiendo la
solucin en el matraz de 250 mL).
10. Tomar una alcuota de 10 mL y aforar con agua destilada.
11. Tomar una alcuota de 1 mL de dicha solucin y colocarla en un tuvo de ensayo
con tapa.
12. Agregar 5 mL de solucin de antrona y agitar.
13. Llevar a bao de agua a ebullicin por exactamente 12 min.
14. Enfriar inmediatamente con agua fra.
15. Leer en un espectrofotmetro a una longitud de onda de 630 nm
16. La misma reaccin se realiza a 1 mL de glucosa (1 mg/mL) y a 1 mL de glucosa (5
mg/mL).
ANEXO 4
Determinacin de Solubilidad
Reactivos

Bicarbonato de sodio

Fosfato dihidrgeno de potasio

Tetraborato de sodio

cido clorhdrico fumante 37 %

Hidrxido de sodio

Cloruro de sodio

cido ctrico monohidratado

Materiales

Cronmetro

55

Esptula

Micropipeta

Toalla nova

Tubos ependorf

Equipos

Agitador vortex

Balanza analtica

Microcentrfuga

PHmetro

Procedimiento
1. Se prepararan dispersiones proteicas al 1% p/v en buffers de pH 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, y 11:
2. Pesar 10 mg del aislado proteico en tubos ependorf.
3. Agregar a cada tubo 1,0 mL de buffer.
4. Agitar la muestra cada 15 minutos de manera intensa y breve en vortex durante
1 hora a temperatura ambiente.
5. Centrifugar los tubos a 10.000 rpm, durante 30 minutos, a 15C.
6. Cuantificar la protena que queda en el sobrenadante mediante el mtodo
descrito por Bradford, M. M. (1976).
ANEXO 5
Capacidad de Retencin de Agua (WHC)
Reactivos

Solucin estndar de albmina (BSA) ( 1 mg/mL)

Agua destilada

Reactivo de Bradford (Disolver 100 mg de azul brillante de Cromassie G-250 en

50 mL de etanol al 95%, agregar 100 mL de cido fosfrico al 85%. Llevar a un
litro con agua destilada. Agitar al menos por 2 horas, protegido de la luz directa.
Filtrar con papel Whatman N 1. Almacenar en botella de vidrio. Conservar a 4
C.

56

Materiales

Cronmetro

Cubetas de acrlico para espectrofotmetro

Cubetas de cuarzo para espectrofotmetro

Esptulas

Micropipetas

Toalla de papel

Tubos ependorf

Equipos

Agitador vortex

Balanza analtica

Espectrofotmetro Unicam UV/Vis UV 3

Microcentrfuga

Procedimiento
1. Se prepararn dispersiones proteicas al 1% p/v en buffer de pH 3, 4, 5, 7, 9 y
agua.
2. Pesar los tubos ependorf, y luego en cada uno de ellos pesar una cantidad de
muestra equivalente a 10 mg de harina.
3. Agregar a cada tubo 1,0 mL de agua destilada.
4. Las muestras se sometern cada 15 minutos a agitacin intensa y breve en
vortex durante 1 hora, a temperatura ambiente.
5. Acto seguido, los tubos se centrifugarn a 10.000 rpm durante 30 minutos a
15C y se determinar la masa de precipitado obtenido.
6. Separar el sobrenadante.
7. Con el fin de estandarizar las condiciones de la determinacin, invertir los tubos
ependorf con el precipitado obtenido y se dejar reposando sobre papel
absorbente durante 10 min, antes de pesarlos.

57

8. Pesar los tubos con el precipitado, para obtener por diferencia la masa de
precipitado obtenido.
9. La cantidad de protena que puede solubilizarse en las condiciones de ensayo
se determinar en el sobrenadante obtenido luego de la centrifugacin,
haciendo uso del mtodo de Bradford M. M. A (1976).
10. La capacidad de retencin de agua se calcula de acuerdo a la siguiente
ecuacin:
WHC = (m2 (m1-m3))/m1 d
Donde:
WHC: Capacidad de retencin de agua expresada en mL de agua por g de muestra.
M1: masa de muestra pesada en g.
M2: masa de precipitado obtenido en g.
M3: masa de la protena soluble en g.
D: densidad del agua a 25 C.
ANEXO 6
Capacidad de Absorcin de Agua (WIC)
Materiales

Filtro bacteriolgico Millipore de 4 cm de dimetro o filtro Buchner con papel de

filtro tipo Whatman.

Pipeta graduada de 1mL.

Manguera flexible para conectar el filtro con la pipeta.

Cronmetro

Procedimiento
1. El equipo mantenido a temperatura constante se llena con agua, evitando la
incorporacin de burbujas y se coloca el papel de filtro dejando que embeba
agua aproximadamente 5 min.
2. Con un papel absorbente se elimina el exceso de agua sobre el papel de filtro
hasta lograr enrasar en cero la columna de agua en la pipeta.
3. Se deja 5-10 min para verificar la nivelacin del equipo (en este tiempo no debe
variar la posicin del menisco de agua).

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4. Se pesa 50 a 100 0,1 mg de muestra.

5. Se esparce la muestra rpidamente formando una monocapa uniforme sobre el
papel de filtro mojado mientras se dispara un cronmetro.
6. Se registra el retroceso de la columna de agua en la pipeta en funcin del
tiempo hasta que sta no vare ms.
7. El tiempo para llegar al valor de equilibrio puede variar entre 5 min y 2 horas,
dependiendo del tipo de protena y granulometra de la muestra.
Curvas de Absorcin de Agua
La cantidad de agua absorbida (q) a cada tiempo se expresa como mL de agua/g masa
seca (MS) y se grafica en funcin del tiempo.
ANEXO 7
Preparacin de Buffers
Buffer pH 3: mezclar 4,2028 g de cido ctrico monohidratado, 0,4 g de NaOH y 2,34 g
de NaCl, disolver en 40 mL de agua destilada, ajustar pH y aforar a 100 mL.
Buffer pH 4: mezclar 4,2028 g de cido ctrico monohidratado, 0,92 g de NaOH y 1,4 g
de NaCl, disolver en 40 mL de agua destilada, ajustar pH y aforar a 100 mL.
Buffer pH 5: mezclar 4,2028 g de cido ctrico monohidratado, 1,3 g de NaOH y 0,29 g
de NaCl, disolver en 40 mL de agua destilada, ajustar pH y aforar a 100 mL.
Buffer pH 6: mezclar 50 mL de fosfato dihidrgeno de potasio 0,1 M, 5,6 mL de NaOH
0,1 M y 1,3 g de NaCl y ajustar pH.
Buffer pH 7: mezclar 50 mL de fosfato dihidrgeno de potasio 0,1 M, 29,1 mL de NaOH
0,1 M y 1,85 g de NaCl y ajustar pH.
Buffer pH 8: mezclar 50 mL de fosfato dihidrgeno de potasio 0,1 M, 46,7 mL de NaOH
0,1 M y 2,26 g de NaCl y ajustar pH.
Buffer pH 9: mezclar 50 mL de tetraborato de sodio 0,025 M, 4,6 mL de HCl 0,1 M y
1,35 g de NaCl y ajustar pH.
Buffer pH 10: mezclar 50 mL de bicarbonato de sodio 0,05 M, 10,7 mL de NaOH 0,1 M
y 1,57 g de NaCl y ajustar pH.
Buffer pH 11: mezclar 50 mL de bicarbonato de sodio 0,05 M, 22,7 mL de NaOH 0,1 M
y 1,85 g de NaCl y ajustar pH.

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Buffer acetato de sodio pH 6: disolver 2,05075 g en 800 mL de agua ajustar pH con

HCl y aforar a 1 lt.
Buffer borato de sodio 1 M pH 9: disolver 17,78 g de c. Brico y 11,79 g de NaOH en
300 mL de agua ajustar pH y aforar a 500 mL.
ANEXO 8
Cuantificacin de Protenas Mtodo de BRADFORD
Reactivos

Solucin estndar de albmina (BSA) ( 1 mg/mL)

Agua destilada

Reactivo de Bradford

Materiales

Cubetas de acrlico para espectrofotmetro

Cubetas de cuarzo para espectrofotmetro

Micropipetas

Toalla de papel

Tubos ependorf

Equipos

Agitador vortex

Espectrofotmetro Unicam UV/Vis UV 3

Procedimiento
Preparacin del Estndar de protena
Pesar en balanza analtica 10 mg exactos de albmina de bovino, completar con 990
ul de agua destilada y disolver suavemente. Una vez disuelto, diluir en tubos de 1,5
mL la solucin concentrada de 10 mg/mL de BSA tomando 100 ul de esta solucin y
completando a 1 mL con 900 ul de agua destilada, agitar en vortex etiquetar y
congelar hasta el momento de su utilizacin.
Cada vez que se realice una curva de calibracin, se debe comprobar la concentracin
del estndar, leyendo a 280 nm, usando como blanco agua destilada. El valor obtenido
se divide por 0,63 y este resultado da la concentracin exacta del estndar en mg/mL.

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Curva de Calibracin
Tubo

Estndar BSA (l)

10

20

30

40

50

40

20

20

10

Agua (l)

Agitar con vortex los tubos ependorf cerrados.

Reposar 5 minutos y agregar, tener cuidado de cada vez que se agrega este reactivo
agitar cada tubo cerrado con el vortex.
Bradford (l)

1500

1500

1500

1500

1500

Dejar reposar 10 minutos y leer a 595 nm

Medicin de Protenas de las Muestras
Los pptidos presentes en el sobrenadante de las muestras, se determinan de acuerdo
al mtodo descrito por Bradford, la sensibilidad de este mtodo oscila de 1 a 40 ul de
protenas, por lo que hay que estimar el porcentaje de protenas aproximado que se
espera en la muestra para caer en el rango de la curva.
El mtodo a seguir es el siguiente:
Tomar entre muestra y agua destilada 50 ul, agitar despus de agregar el solvente,
dejar reposar 5 minutos y despus agregar 1500 ul de reactivo de Bradford.
Dejar reposar 10 minutos y leer las muestras en el espectrofotmetro a una longitud de
onda de 595 nm.
Dibujar la curva de calibracin: cantidad de BSA (eje de las abscisas) contra
absorbancia obtenida a una longitud de onda de 595 nm (eje de las ordenadas).
La absorbancia resultante de las muestras, se interpola a la curva de calibracin y se
extrapola de esta al eje de las X, para conocer la cantidad de protena contenida en la
muestra. La curva de calibracin debe hacerse en paralelo con la medicin de la
muestra.

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