Gilberto B.

Kerbauy
Instituto de Biocincia da
Universidade de So Paulo

A idia de cultivar clulas isoladas

de plantas surgiu no incio deste sculo
com Gottlieb Haberlandt, um ilustre botnico alemo, como uma estratgia capaz de materializar os conceitos embutidos na teoria celular proposta por
Schwann e Shleider por volta de 1839. O
que postulava esta teoria? Esta conceituava
a clula (vegetal e animal) como a menor
unidade biolgica, autnoma, e capaz,
em princpio, de originar um organismo
inteiro. Assim, ela afirmava que a clula
madura do corpo de um organismo
pluricelular (clula somtica) manteria
seu material gentico em condies de
originar um indivduo idntico matriz
doadora, comportando-se desta forma
como se fosse uma clula-ovo ou zigoto.
A questo, pois, era descobrir como
fazer uma clula madura e especializada
(diferenciada), programada para a realizao de funes especficas, voltar ao
estgio embrionrio. A tarefa no era
pequena para a poca de Haberlandt e
continua desafiadora e malcompreendida
para a cincia ainda hoje, quase s
vsperas da entrada da humanidade no
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Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

terceiro milnio.
Haberlandt, todavia, legou s geraes seguintes de pesquisadores algo
muito importante para o avano do conhecimento cientfico, ou seja, princpios bem fundamentados, e procedimentos tcnico-tericos a serem seguidos,
tendo alguns destes ltimos se mostrado
mais tarde quase que como verdadeiras
premonies.
A
primeira
demonstrao
inquestionvel na obteno de embries
de plantas a partir de clulas maduras
(embriognese somtica) viria a ocorrer
em 1958 pelo prof. F.C. Steward e colaboradores, cerca de quarenta anos mais
tarde, atravs do cultivo de clulas isoladas de raiz de cenoura. No obstante, o
significado cientfico e o imenso potencial prtico representado por esta descoberta parecem no ter sido suficientes
para despertar na mdia da poca o
mesmo frisson verificado com a divulgao dos resultados com a ovelha Dolly,
mesmo que neste caso no se possa falar
em clonagem, na verdadeira acepo
deste termo.
Antes da obteno de embries
somticos de cenoura, j haviam conseguido a formao in vitro de estruturas
complexas, como gemas vegetativas,
razes e plantas inteiras, utilizando-se
fragmentos (explantes) de tecidos isolados de caules, folhas e razes. Todavia,
um avano fantstico nos estudos da
cultura de clulas, embries e rgos de
plantas foi possibilitado com a desco-

berta das citocininas, um importantssimo hormnio vegetal, pelo grupo do

professor Folke Skoog da Universidade
de Wisconsin (USA). Paradoxalmente, a
descoberta deste novo fitormnio deuse graas ao emprego da prpria tcnica
da cultura de clulas vegetais. Esta descoberta levou constatao de que o
processo de formao de rgos nas
plantas dependia, na verdade, de um
balano das quantidades relativas de

uma citocinina e de uma auxina (outro

hormnio vegetal j conhecido), e no
da
presena
de
substncias
organognicas especficas, conforme se
postulava at ento (floregno, calinas,
rizocalinas).
Paralelamente a uma renovada e
indita perspectiva de compreenso dos
complexos mecanismos controladores
do desenvolvimento das plantas como
um todo, dava-se tambm com esta des-

Embries somticos de amor-perfeiro (Viola tricolor) em diferentes estgios de

desenvolvimento (estruturas verdes), formados sobre um calo (estrutura creme).

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

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coberta o incio da chamada

biotecnologia celular de plantas, aqui
entendida como a utilizao integrativa
de
processos
tecnolgicos
e
bioqumicos, empregando-se clulas,
tecidos e rgos de plantas superiores,
visando a gerao de produtos e servios.

das em biologia celular. Neste artigo,

procuraremos abordar apenas uma destas diferentes tcnicas, aquela mais visvel para o pblico em geral, ou seja, a
clonagem in vitro ou plantas de proveta.

1- Aplicaes da cultura de tecidos

Comparativamente s clulas animais, as clulas das plantas superiores

(produtoras de flores) podem ser consideradas menos diferenciadas, tendo sido
esta caracterstica interpretada como uma
importante estratgia de sobrevivncia
para organismos imveis.
Entretanto, isto no significa que possamos regenerar
uma planta inteira de qualquer tecido. Os potenciais
de regenerao dependem
do tipo de planta, do rgo
utilizado e do estgio de
desenvolvimento deste. rgos jovens so mais suscetveis clonagem do que
quando maduros, o que significa que, medida que a
especializao progride durante o desenvolvimento do
rgo ou da planta, a
desprogramao gnica
(desdiferenciao) torna-se
mais difcil.
Conforme mostrado no
esquema, verifica-se que as
culturas
podem
ser
estabelecidas a partir tanto
de fragmentos de tecidos
maduros (folhas, caules
etc.), quanto de tecidos
meristemticos, constitudos
por clulas em processo de
diviso e localizados, geralmente, nos pices dos caules e razes em crescimento.
O baixo grau de diferenciao de suas clulas, associado maior estabilidade
gentica destas, faz dos pices meristemticos uma das
principais fontes de explantes.
Aps a necessria desinfestao das
superfcies externas, os explantes so
transferidos para os meios de cultura,
uma mistura balanceada de macro e
micronutrientes (sais minerais),
aminocidos, vitaminas etc., e, obviamente, de uma auxina e uma citocinina
em propores adequadas s finalidades desejadas. A geleificao do meio
para efeito de sustentao das culturas
obtida atravs da adio de agar. Gemas
vegetativas e mesmo florais, razes e
embries somticos podero se formar
tanto diretamente do explante quanto
indiretamente (via proliferao celulares, os chamados calos). De um modo

Vrias tm sido hoje as aplicaes

das tcnicas de biotecnologia celular de
plantas, a comear pela clonagem, seu
lado mais visvel, seguido pela cultura de

Protocormides formados diretamente de pices de razes de Catasetum fimbriatum

(Orquidceas).

clulas (suspenses celulares em meio

lquido), tecidos e rgos para fins prticos, a obteno de plantas haplides a
partir da cultura de anteras, a produo
de metablitos secundrios em
biorreatores, a gerao de variantes
somacionais, a microenxertia, a
tecnologia dos protoplastos (clulas nuas
com capacidade de se fundir) etc. Alm
disto, no seria demais mencionar ainda
que um dos esteios bsicos da chamada
biologia molecular de plantas (engenharia gentica) depende em grande
extenso de estratgias e tcnicas utiliza32

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2 - Estabelecimento das culturas

Flor e botes florais formados a partir de

tecido epidrmico, isolado de flores maduras
de tabaco.

geral, os balanos hormonais mais favorveis s auxinas promovem a formao

de embries e primrdios de razes e,
quando favorveis s citocininas, induzem a formao de gemas. Quando apenas gemas so formadas, torna-se necessria a transferncia destas para meios
indutores de razes, obtendo-se ento
uma planta inteira e em condies de ser
transferida para a casa de vegetao. Os
calos, por serem massas celulares
indiferenciadas, permitem tambm a regenerao in vitro com relativa facilidade. Todos os procedimentos necessrios
ao manuseio das culturas so realizados
sob condies asspticas, fornecidas por
equipamentos especiais.
3 - Clonagem de plantas in vitro
O termo clonagem, hoje j incorporado ao cotidiano das pessoas, significa a formao de indivduos
geneticamante idnticos a partir de clulas ou fragmentos de uma determinada
matriz. Clone deriva etmologicamente
do grego kln, que quer dizer broto e
pressupe, portanto, a existncia de um
indivduo gerador, e a ocorrncia de
reproduo assexuada.
A tcnica da clonagem in vitro de
plantas, tambm conhecida por
micropropagao, devido ao emprego
de pores de tecidos bastante pequenas, tem-se mostrado de enorme importncia prtica e potencial nas reas agrcola, florestal, horticultural, bem como
na pesquisa bsica em geral.
A necessidade de colocao rpida
no mercado de plantas de ciclo de vida
longo, geralmente arbreas e arbustivas,
selecionadas aps prolongados perodos de melhoramento gentico, faz da
clonagem uma alternativa muito importante e indispensvel nos dias atuais. Em
orqudeas, por exemplo, embora sejam

plantas herbceas, uma boa muda (diviso) no se obtm em menos de dois

anos, enquanto que neste mesmo perodo, atravs da cultura in vitro de pices
meristemticos, centenas ou milhares de
clones podem ser produzidos. Alm disto, so indiscutveis as vantagens representadas pela manuteno de quantidades considerveis destas plantas por
metro quadrado, dentro de frascos em
laboratrios, protegidos do ataque de
pragas, doenas e intempries.
Particularmente na rea de plantas
ornamentais, onde predominam plantas
hbridas (gerbera, cravo, tulipa, orqudea etc.), a clonagem in vitro de matrizes
selecionadas tem permitido a
compatibilizao de demandas especficas do mercado interno e externo, com
atributos importantes como poca de
florao, colorao, tamanho e forma
das flores, nmero de flores/planta, comprimento e resistncia das hastes florais,
tamanho e vigor das plantas etc. A multiplicao in vitro em larga escala de
plantas de importncia econmica tem
resultado na instalao de verdadeiras
biofbricas comerciais, baseadas no princpio da linha de produo.
4 - Eliminao de patgenos
Plantas propagadas vegetativamente
por meio de tcnicas convencionais,
como estaquia, enxertia, etc., uma vez
infectadas por vrus, micoplasmas, bactrias e fungos endgenos, transmitem
inescapavelmente estes patgenos s

geraes subseqentes, provocando uma

diminuio progressiva no rendimento
das culturas. O cultivo de espcies com
retornos abaixo do potencial gentico
produtivo, selecionado previamente,
inaceitvel num
mundo com populao crescente e carente de alimentos. Avaliaes comparativas realizadas com
plantas de um
mesmo cultivar de
moranguinho,
infectadas com vrus, mostraram
que aquelas livres
destes patgenos,
via cultura de pic
e
s
meristemticos,
eram duas vezes
mais produtivas. O
fato de uma planta ter sido limpa
de vrus, ou de
outro patgeno
em laboratrio,
no confere a ela
nenhuma imunidade a novas infeces. De fato,
a substituio das
populaes de
plantas, aps alguns anos de cultivo a campo, por

novas matrizes produzidas

em laboratrio torna-se condio sine qua non. Laboratrios comerciais de mdio e
grande portes tm sido os
responsveis pela produo
contnua de plantas livres de
patgenos.
Por sorte, conforme se
descobriu tempos atrs, a
distribuio de vrus e outros patgenos dentro das
plantas no uniforme, sendo os tecidos meristemticos
apicais praticamente livres
destes microrganismos. Infelizmente, a cincia no sabe
ao certo a(s) causa(s) desta
capacidade protetora dos
tecidos meristemticos.
De qualquer forma, o
isolamento cuidadoso de
pequenas pores de regies meristemticas (0,1 a
0,5mm) e a cultura destas em
meios de cultura apropriados permitem a obteno em
escala econmica de plantas
clonadas livres de muitos
patgenos. muito provvel, sem que o leitor o saiba, que a
batatinha, banana, moranguinho, abacaxi que saboreou nesta ltima semana
tenham sido produzidos por plantas
clonadas in vitro.

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