LIGAMIENTO Y RECOMBINACIN

El principio de Mendel segn el cual los genes que controlan diferentes caracteres
son heredados de forma independiente uno de otro es cierto slo cuando los
genes existen en cromosomas diferentes. El genetista estadounidense Thomas
Hunt Morgan y sus colaboradores demostraron en una serie amplia de
experimentos con moscas de la fruta (que se reproducen con gran velocidad), que
los genes se disponen de forma lineal en los cromosomas y que cuando stos se
encuentran en el mismo cromosoma, se heredan como una unidad aislada
mientras que el cromosoma permanezca intacto. A los genes heredados de esta
manera se dice que estn ligados.
Sin embargo, Morgan y su grupo observaron tambin que este ligamiento rara vez
es completo. Las combinaciones de los alelos de cada progenitor pueden
reorganizarse. Durante la meiosis, una pareja de cromosomas homlogos puede
intercambiar material durante lo que se denomina recombinacin o
entrecruzamiento. El entrecruzamiento se produce generalmente al azar a lo largo
de los cromosomas, de modo que la frecuencia de recombinacin entre dos
genes depende de la distancia que los separe en el cromosoma. En consecuencia
los cientficos pueden trazar o dibujar mediante experimentos de reproduccin
apropiados, las posiciones relativas de los genes a lo largo del cromosoma o
mapa gnico.
Basndose en la teora cromosmica de la herencia enunciada por Sutton y
cuyos aspectos escenciales son:
Los genes estn ubicados en los cromosomas
La ordenacin de los mismos es lineal
Al fenmeno gentico de la recombinacin le corresponde un fenmeno
citolgico de intercambio de segmentos cromosmicos, Morgan propuso
que Existen parejas gnicas situadas sobre el mismo par de
cromosomas homlogos, llamando a este fenmeno ligamiento.
Cuando dos o ms genes estn localizados en el mismo cromosoma se dice que
estn ligados, y pueden estarlo en autosomas o cromosomas sexuales.
Los genes que se encuentran en distintos cromosomas se distribuyen en las
gameta independientemente uno del otro. Sin embargo, los genes que se
encuentran en el mismo cromosoma tienden a permanecer juntos; es decir, a no
sufrir separaciones ni combinaciones al azar durante la formacin de las gametas.
Al analizar los resultados de una cruza de prueba a individuos dihbridos se
observarn resultados diferentes, dependiendo de la ubicacin de los genes, es
decir: en el mismo o en distintos cromosomas.
GENES CON DISTRIBUCIN INDEPENDIENTE
Los genes que se encuentran en distintos cromosomas se distribuyen
independientemente, por lo tanto del apareamiento AaBb x aabb se obtendr una
proporcin esperada en la cruza de
prueba de 1:1:1:1.
Los productos de la meiosis ( gametos AB y ab) presentan los genes ligados o
unidos de la misma forma que se encuentran en el progenitor sometido a prueba.
Son el resultado de no haber sufrido

entrecruzamiento y se denominan gametos tipo progenitor o parental.

GENES PARCIALMENTE LIGADOS O LIGAMIENTO INCOMPLETO Y

RECOMBINACIN
Los genes ligados no siempre permanecen juntos, debido a que las
cromtides no hermanas de cromosomas homlogos pueden intercambiar
entre ellos segmentos de longitud variable durante la profase meitica
produciendo gametos de tipo recombinantes por virtud del
entrecruzamiento. Cabe aclarar que en las meiosis que ocurre
entrecruzamiento y recombinacin adems de los gametos de tipo
progenitor se obtienen los gametos tipo recombinantes que constituyen
nuevas combinaciones de los genes ligados en los progenitores.

Durante la meiosis cada cromosoma se duplica formando dos cromtides

hermanas idnticas, el par de cromosomas homlogos se aparea (sinapsis) y se
produce el entrecruzamiento entre cromtides no hermanas. Este ltimo proceso
requiere del rompimiento y la reunin de
slo dos de las cuatro bandas en cualquier punto del cromosoma.

Los productos de la meiosis (gametos AB y ab), presentan los genes ligados de la

misma forma que se encuentran en los progenitores, resultan de las cromtides
que no sufrieron entrecruzamiento y se denominan gametos tipo progenitor o
parental.
Los otros dos productos meitico (gametos Ab y aB), resultantes del
entrecruzamiento, constituyen nuevas combinaciones de los genes ligados
originalmente en los progenitores y se denominan gametos tipo
recombinantes.
AB/AB FASE DE ACOPLAMIENTO
En los dihbridos o dobles heterocigotas, para dos loci ligados, puede ocurrir que
los dos alelos dominantes o tipo comn estn en un cromosoma y los dos
recesivos o mutantes en el otro. En este caso se dice que las relacines de enlace
es de acoplamiento o cis.
AB/AB FASE DE REPULSIN
Cuando el alelo dominante de un locus y el recesivo del otro ocupan el mismo
cromosoma la relacin es de repulsin o trans. Los gametos recombinantes y
progenitores sern diferentes en cada caso.

La recombinacin, definida en relacin a la meiosis, es el proceso que genera un

producto haploide cuyo genotipo difiere de los dos genotipos progenitores
(haploides) que formaron la clula (2n) que inici la meiosis. El producto as
generado se denomina recombinante.
Hay dos tipos de recombinacin, las que producen recombinantes por mtodo
absolutamente diferentes:
a) intercromosmica
b) intracromosmica
a) Recombinacin intercromosmica.
Es la que se produce mediante la distribucin independiente de Mendel. Las dos
clases recombinantes o nuevos fenotipos constituyen el 50% de los
descendientes, 25% de cada tipo. Si encontramos esta frecuencia podemos inferir
que las parejas gnicas segregan independientemente.
b) Recombinacin intracromosmica.
Se produce por entrecruzamiento. Esto ocurre entre cualquiera de dos cromtides
no hermanas. Esto no sucede en todas las meiosis, pero cuando lo hace, la mitad
de esos productos son recombinantes y la otra mitad sern gametos tipo
progenitor.
Las meiosis sin entrecruzamiento entre dos loci producirn slo genotipos
parentales para esas parejas gnicas.
La recombinacin intracromosmica se pone de manifiesto en la aparicin de una
frecuencia de recombinacin menor al 50%. El ligamiento fsico entre las
combinaciones gnicas parentales impide la libre distribucin de los genes
(distribucin independiente), la que genera una frecuencia de recombinacin del
50%.

LIGAMIENTO Y MAPAS CROMOSMICOS

Ligamiento
Como se ha visto, la transmisin independiente de dos pares de genes, cada uno
de ellos con dominancia completa y afectando a caracteres distintos, dara una
proporcin de 9:3:3:1 entre los descendientes de cruzamientos dihbridos. El
primer caso de una desviacin de esta proporcin lo encontraron Bateson y
Punnett en los cruzamientos de distintas variedades del guisante de olor: al cruzar
plantas con distinto color de la flor y distinta forma del fruto, los resultados que
obtuvieron constituan una desviacin sorprendente de las proporciones
esperadas para cruces dihbridos, de forma que la descendencia presentaba
demasiados individuos con los genotipos paternos originales y pocos individuos
con combinaciones de estos genotipos. Para explicarlo Bateson y Punnett
propusieron la hiptesis de que en estos casos ciertos gametos se multiplicaban
preferentemente despus de la meiosis.
Morgan y colaboradores encontraron numerosas caractersticas hereditarias en D.
melanogaster asociadas en cuatro grupos de ligamiento. En estos casos las
combinaciones gnicas aportadas por los parentales a la F1 constituan las clases
mayoritarias en la F2. Morgan sugiri que las dos parejas de genes que
participaban estaban situadas sobre el mismo par de cromosomas homlogos, lo
que explicara que las combinaciones genticas parentales permanecieran juntas
y fuesen las que aparecan siempre en mayor proporcin. En dicho organismo
cada grupo de ligamiento corresponda a cada uno de los cuatro pares de
cromosomas. Posteriormente esta relacin entre el nmero de grupos de
ligamiento y el nmero haploide de cromosomas ha quedado patente en otros
muchos organismos (en el maz se conocen 10 grupos de ligamiento que
corresponden a los 10 pares de cromosomas, 7 en Pisum sativum, etc.) y en
ningn caso el nmero de grupos de ligamiento es superior al nmero haploide de
cromosomas.
Para explicar la existencia de combinaciones gnicas distintas a las
parentales, Morgan sugiri que durante el emparejamiento de cromosomas
homlogos en la meiosis deba producirse un intercambio fsico entre fragmentos
de estos cromosomas al que denomin entrecruzamiento.
Se denomina ligamiento a la situacin general en la que dos parejas gnicas
residen en el mismo cromosoma. Los caracteres que estos genes codifican
tienden a heredarse juntos en lugar de hacerlo independientemente, por lo que las
proporciones de la descendencia se desvan de las proporciones de dihibridismo
(9:3:3:1) esperadas para genes independientes.
Los alelos dobles heterocigotos en los dos loci unidos se pueden presentar en
cualquiera de las dos posiciones relativas una respecto a la otra. Si los dos alelos
dominantes (o de tipo natural) se encuentran en un cromosoma homlogo y los
dos alelos recesivos (o mutantes) se encuentran en el otro la relacin entre los
enlaces se denomina fase de acoplamiento (AB/ab) y significa ligamiento entre
dos alelos dominantes o dos alelos recesivos. Cuando el alelo dominante de un
locus y el alelo recesivo del otro locus se encuentran sobre el mismo cromosoma

homlogo, la relacin se denomina fase de repulsin (Ab/aB) y significa ligamiento

entre un alelo dominante (de un gen) y un alelo recesivo (del otro gen).
Las combinaciones gnicas aportadas por los parentales y que constituyen las
clases mayoritarias en la F2 se denominan clases parentales o paternas y se
construyen a partir de cromtidas que no han sufrido entrecruzamiento. Las
combinaciones nuevas, y que son las que aparecen en menor proporcin en la F2,
se forman a partir de cromtidas no homlogas que han sufrido entrecruzamiento
dando lugar a las clases no parentales o recombinantes de la descendencia.
Cuando los genes estn tan ntimamente asociados que siempre se transmiten
juntos si proceden del mismo progenitor, se considera que el ligamiento entre ellos
es completo. Esta ausencia total de segregacin es una peculiaridad de los
machos de D. melanogaster y del sexo heterogamtico de algunas otras especies
como las hembras del gusano de seda cuyas meiosis son aquiasmticas por lo
que no existe entrecruzamiento ni recombinacin gnica. El ligamiento completo
es excepcional en las especies con reproduccin sexual. Como regla general el
ligamiento entre los genes es incompleto y los pares de genes de la mayora de
los grupos de ligamiento se transmiten con independencia unos de otros debido al
entrecruzamiento.
Mapas cromosmicos
Morgan analiz las progenies de cruzamientos con distintos genes ligados y
observ que la proporcin de descendientes recombinantes variaba de forma
considerable dependiendo de qu parejas gnicas estudiara. Al parecer el nmero
de entrecruzamientos entre parejas de genes no era constante y no exista razn
para suponer que los entrecruzamientos entre distintos genes ligados deban
ocurrir con la misma frecuencia, por lo que pens que esta variacin en la
frecuencia podra reflejar de algn modo la distancia real que separaba unos
genes de otros en el cromosoma.
Su discpulo Sturtevant sugiri que la proporcin de recombinantes de la F2 de un
cruzamiento prueba poda utilizarse como un indicador cuantitativo de la distancia
entre dos genes y reflejarla en un mapa gentico o mapa de ligamiento. En efecto,
dado que los entrecruzamientos suceden al azar, entre dos parejas gnicas
alejadas en el cromosoma la probabilidad de que se den entrecruzamientos entre
ellas ser mayor mientras que entre dos parejas gnicas cercanas la probabilidad
o frecuencia de entrecruzamientos ser menor. Cuanto mayor es la distancia entre
dos genes ligados mayor es la probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento en
la regin situada entre los dos, mientras que cuanto menor es la distancia entre los
genes ligados menor es la probabilidad de que ocurran entrecruzamientos en la
regin situada entre los dos. Por lo tanto mediante la medida de la frecuencia de
recombinantes se puede obtener una medida de la distancia de mapa que hay
entre las parejas gnicas implicadas.
Para medir la distancia entre parejas gnicas en el mapa de ligamiento se utiliza la
unidad de mapa gentico (u.m.). Una unidad de mapa gentico (1 u.m.) es la
distancia entre parejas gnicas para las que 1 de cada 100 productos meiticos
resulta ser recombinante. Una u.m. equivale a 1 centimorgan (cM, tambin
representado por la letra delta) y 100 u.m. a 1 Morgan.

Mediante la elaboracin de mapas genticos se puede deducir la ordenacin

relativa de los genes en el cromosoma y las distancias relativas entre ellos
expresadas en centimorgans. Los resultados pueden estar distorsionados por la
existencia de dobles entrecruzamientos. Para estimar la frecuencia de dobles
entrecruzamientos es imprescindible la presencia de un tercer gen marcador y
considerar el fenmeno de interferencia: la formacin de un quiasma en una
regin reduce la probabilidad de que se forme otro quiasma en la regin contigua
del cromosoma por incapacidad fsica de las cromtidas, dando como resultado la
observacin de un menor nmero de dobles recombinantes de los esperados. El
grado de interferencia se expresa por el Coeficiente de Coincidencia (C) que es el
cociente entre los dobles recombinantes observados y los dobles recombinantes
esperados. La coincidencia es el complemento de la interferencia (I) (Coincidencia
+ Interferencia =1), de forma que si la interferencia vale 1 (C=0) no se dan dobles
entrecruzamientos y si la coincidencia vale 1 (I=0) se dan todos los dobles
entrecruzamientos esperados.
Mapas Cromosmicos
Mientras que los mapas de ligamiento requieren de la realizacin de protocolos
con cruzas de animales, los mapas cromosmicos se logran usando tcnicas que
no incluyen la reproduccin sexual y, por lo tanto, asignan una localizacin segn
las regiones citogenticas (adems,estos mapas presentan la ventaja de no
requerir del uso de marcadores polimrficos). Esas tcnicas son: (i) hibridacin in
situ, (ii) hbridos de clulas somticas y (iii) hbridos de radiacin.
Hibridacin In Situ.
Cuando una secuencia de ADN, en este caso referida como una sonda de ADN
(en ingls, probe), es marcada con istopos radioactivos o fluorescencia, podemos
hibridarla con su secuencia complementaria en el ADN genmico de un
cromosoma especfico y observar la marca directamente sobre el extendido
cromosmico con un microscopio ptico. La hibridacin in situ fluorescente (FISH)
es una tcnica muy sensible siempre que se cuente con sondas lo suficientemente
grandes (y homlogas) y que se suprima la fluorescencia de fondo. La sensibilidad
de esta variante de la tcnica de hibridacin in situ permite localizar una secuencia
con una precisin de hasta 30 Mb y de detectar anormalidades cariotpicas en
cromosomas metafsicos tanto como interfsicos. Los fluorocromos ms
empleados son la fluorescena (FITC), la rodamina (XRITC) y el Texas Red.
Aunque se trata de una tcnica muy confiable, el FISH es poco utilizado en la
construccin de mapas en el ratn por varias razones: (i) en muchos casos es ms
fcil y prctico realizar esquemas reproductivos, (ii) la hibridacin in situ nos
provee de una posicin regional, no una localizacin precisa y (iii) los cromosomas
murinos, como ya se dijo, son muy difciles de distinguir entre s, en un preparado
citogentico. De todas maneras, la hibridacin in situ es la
tcnica de eleccin para la localizacin rpida de los transgenes
Es tambin muy til para evaluar si los grandes insertos en los cromosomas
artificiales de levadura (YACs) derivan todos del mismo cromosoma o, por el
contrario, son quimricos. Por ltimo, el pintado de cromosomas (del ingls
chromosome painting) es una variante del FISH que emplea una mezcla de
sondas de ADN derivada de un cromosoma entero o de una regin cromosmica

de inters. Se utiliza para obtener patrones de regiones homlogas entre

diferentes especies y es una forma muy directa de evaluar la cantidad de
rearreglos que se produjeron entre dos especies en el curso de la evolucin.
Hbridos de Clulas Somticas
Para esta tcnica se utilizan clulas hbridas (viables) derivadas de la fusin in
vitro de clulas somticas de especies diferentes de mamferos. Aunque se
desconoce la razn, se observa que los cromosomas que se van perdiendo en las
clulas hbridas pertenecen exclusivamente a uno de los conjuntos parentales. Por
ejemplo, los hbridos humano/roedor tienden a perder (a travs de los sucesivos
cultivos y en forma preferencial) los cromosomas humanos y quedarse con una
mayora de cromosomas de roedor. Debido a esto, es posible derivar un panel de
clulas hbridas que representen cada cromosoma humano en forma nica, sobre
un conjunto de cromosomas de roedor. Por lo tanto, todos los genes de origen
roedor son retenidos (y se expresan normalmente), mientras que slo los genes
presentes en el nico cromosoma humano que qued retenido en ese hbrido
podrn ser localizados por medio del uso de sondas moleculares o el anlisis de
expresin. De esta manera, detectando patrones de presencia o ausencia de
marcadores (o expresin de genes) y correlacionando con los cromosomas
presentes en el hbrido, se puede asignar un gen humano a un cromosoma en
particular.
Los hbridos de clulas somticas humano/ ratn, con un complemento limitado de
cromosomas humanos (intactos), han sido muy usados para localizar genes
humanos en los ltimos 20 aos, a pesar de ser muy inestables. Tambin existen
hbridos similares segregando cromosomas de ratn, pero no han sido muy
utilizados porque es en general ms fcil y rpido usar el ADN derivado de cruzas
de animales. Adems, contrariamente a los cromosomas humanos, son raros los
hbridos de clulas somticas del ratn con deleciones o translocaciones, lo que
complica la asignacin sub-cromosmica de genes por este mtodo.
Hbridos de Radiacin (HR)
Otra tcnica desarrollada para obtener mapas de alta resolucin en humanos son
los paneles de hbridos de radiacin (Radiation Hybrid RH), enfoque descripto
por Goss y Harris en 1975. Las dos grandes ventajas de este sistema son que
pueden mapearse marcadores o genes no polimrficos (ya que se evala slo la
presencia o ausencia de un marcador) y que se logra una resolucin mayor que
con los mapas de ligamiento, constituyendo un puente entre stos y los mapas
fsicos. Estos paneles de clulas hbridas se construyen a partir de clulas
donantes (de la especie a ser mapeada) que han sido irradiadas letalmente (ya
sea con rayos g o X) para causar la fragmentacin de sus cromosomas (por
roturas de doble cadena). Las clulas as irradiadas son fusionadas con lneas
celulares receptoras deficientes para un marcador de seleccin, como ser la
timidina quinasa (TK) o la hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT). Usando
condiciones de seleccin con medios apropiados, sobrevivirn slo aquellas
clulas que contengan, por lo menos, algn fragmento cromosmico proveniente
de las clulas dadoras. Por ejemplo, para el mapeo de genes humanos se utiliz
siempre un fondo de clulas receptoras de roedor, en particular de ratn o hmster
chino (Cricetulus griseus)

Muchas de las lneas de clulas hbridas obtenidas por este mtodo retienen
cantidades detectables del ADN donante (normalmente entre 20 y 30% del
genoma). Por lo tanto, estas clulas hbridas, obtenidas por las tcnicas clsicas
de fusin celular, contienen slo un pequeo segmento del genoma donante
(irradiado) incorporado en los cromosomas de la especie receptora (no irradiada).
El concepto terico es que aquellos loci que se encuentran muy prximos unos de
otros sern retenidos en el mismo fragmento cromosmico despus de la
irradiacin.
En 1998 se puso a disponibilidad de la comunidad cientfica un panel HR del ratn,
el primero en su momento para un organismo modelo. Su nombre es T31 y fue
creado por Linda McCarthy y sus colaboradores usando fragmentos de
cromosomas de ratn (de una lnea de clulas embrionarias de la cepa 129)
retenidos en cromosomas de hmster chino (provenientes de una lnea de
fibroblastos TK), totalizando 104 lneas celulares. La informacin ms actualizada
sobre este panel y las secuencias que se encuentran localizadas se puede
obtener en The Jackson Laboratory T31 Mouse Radiation Hybrid Database .
Desde el ao 1999, la rata posee tambin su panel HR (T55), en el cuan se han
localizado ms de 5.000 marcadores genticos. Los paneles HR ratn/hmster y
rata/hmster se encuentran disponibles comercialmente a travs de la empresa
Research Genetics Inc.
Hbridos de radiacin.
Diagrama esquemtico mostrando la construccin de clones de hbridos de
radiacin (HR) a partir de clulas donantes con un nico cromosoma
humano (hbrido mono-cromosmico) y clulas receptoras de hmster
Chino. La seleccin de clulas donde hubo fusin se realiza por medio del
uso de genes de seleccin como la timidina kinasa. Cada clon (abajo)

Cuando se evala un
marcador (por Southern
blot, FISH o PCR), el
patrn de presencia (+)
o ausencia () a travs
del panel, define el emplazamiento del mismo: aquellos marcadores con el mismo

patrn de + y estarn localizados en el mismo bin o posicin. Estos estudios se

conocen como patrones de retencin de marcadores y nos ayudan a determinar
la ubicacin de un gen o marcador. En estos casos, la unidad utilizada para medir
la distancia en el mapa es el Ray o el centiRay (cR). Debido a que la dosis de
rayos X tiene gran influencia sobre esta medida, es necesario aclararlo de la
siguiente manera: un cR3000 indica una frecuencia de rotura del 1% entre dos loci
dados luego de una exposicin a
3.000 rads de radiacin X. Como esta distancia entre marcadores puede tener
poca significacin para un mapa gentico, ser necesario convertirla a distancias
de mapas fsicos (en kb o Mb). Por ejemplo, en el panel T55 de la rata un cR3000
es equivalente a una distancia fsica de 106 kb.
La evaluacin estadstica de los resultados debe hacerse con programas de
computacin especiales, como RHMAPPER
El mapa ms reciente del ratn basado en hbridos de radiacin (panel T31) fue
publicado en la revista Nature Genetics en el ao 2001. Este mapa contiene
11.109 genes (incluyendo genes expresados slo en embriones y neonatos) que
fueron emplazados con respecto a un mapa de referencia conteniendo alrededor
de 2000 marcadores genticos, e incluye 3.658 genes homlogos con secuencias
humanas (genes ortlogos). Uno de los aspectos ms notables que surge del
anlisis de este mapa es la distribucin irregular de genes a lo largo de los
cromosomas; por ejemplo, existe un exceso de genes en los cromosomas 11 y 19
y un dficit en los cromosomas 18 y X.