La cromatografa

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de mezclas

complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia; Es un conjunto de
tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los
distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades
de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de los
compuestos dan como resultado una retencin diferencial sobre la fase estacionaria y, por
tanto, una separacin efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente
de la mezcla.
La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que puedan

ser usados posteriormente (etapa final de muchas sntesis).

Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad analtica). En este

caso, las cantidades de material empleadas suelen ser muy pequeas.
ndice

Historia
La cromatografa, como indica su nombre (proviene del griego chrma y
grph, que significan respectivamente "color" y "escribir, registrar", literalmente
"escritura de color", o mejor "registro de color") , fue empleada originalmente con
sustancias coloreadas.
Ya en 1850, Runge describi la formacin de zonas coloreadas cuando se depositaban
gotas de sustancias colorantes sobre papel secante, pero el desarrollo ms importante
vino con los experimentos de Mijal Tsvet1 (1872-1919), que emple por primera vez en
1906 el trmino "cromatografa". A comienzos del ao 1903, Mijal Tsvet, botnico ruso,
logr separar una mezcla de pigmentos de plantas (clorofilas) en una columna de
carbonato de calcio. Ms tarde, en 1910, cromatografi un extracto de yema de huevo en
una columna de inulina. Sus investigaciones, sin embargo, no fueron utilizadas por otros
investigadores hasta 1931. Esta demora quiz se debi al hecho de que los trabajos de
Tsvet fueron publicados en ruso y en una revista que no tena amplia circulacin.
El rpido desarrollo de la cromatografa como herramienta analtica sensible no ocurri
hasta 1931, cuando Kuhn, con Lederer y con Winterstein, emple la tcnica para el
anlisis de pigmentos de plantas, confirmando los primeros trabajos de Tsvet y su
prediccin de que el caroteno no era una sola sustancia, sino una mezcla de varios
homlogos estrechamente relacionados. Al mismo tiempo, el tamao de las columnas
empleadas fue aumentando para poder recuperar los componentes separados. La tcnica,
por lo tanto, no era solo analtica sino preparatoria.
La cromatografa en columna por estos tiempo tena aplicaciones limitadas, dado que los
componentes que se podan separar eran invariablemente lpidos. Pasaron 10 aos antes
de que Martin y Synge desarrollaran una tcnica mediante la cual se pudieran separar
compuestos acuosos o hidroflicos. Esto marc un nuevo inters en la tcnica y en 1944
Consden, Gordon y Martin lograron separar mezclas complejas de aminocidos en papel y
fueron premiados con el Premio Nobel por sus trabajos. Al poco tiempo, en 1947,
en Estados Unidos de Norteamrica, la Comisin de Energa Atmica dio a conocer
informacin sobre el uso de la cromatografa de intercambio inico para la separacin de
productos de fisin nuclear.
El desarrollo ms reciente en el campo de la cromatografa se deriva de los trabajos de
Stahl, quien en 1956 present una tcnica prctica mediante la cual una capa
delgada slice gel, celulosa o almina era diseminada sobre una placa de vidrio. Esta

tcnica, llamada cromatografa de capa fina, result en un anlisis ms rpido y ms

sensible para el examen de mezclas complejas y, en muchos casos, ha sustituido a otros
mtodos similares ms antiguos de cromatografa en papel toche.
En 1959, Porath y Flodin introdujeron una nueva tcnica llamada cromatografa de
filtracin de gel. Esta se ha convertido en una poderosa y nueva herramienta para la
separacin de sustancias de alto peso molecular, particularmente las protenas, y ha
encontrado muchas aplicaciones en los campos de la bioqumica, la medicina, la
fisiologa y la biologa. La mayora de las tcnicas de filtracin en gel utilizan columnas y
recientemente se han hecho trabajos con una combinacin de filtracin en gel y materiales
de intercambio inico, logrando que las separaciones complejas sean extremadamente
rpidas y eficientes.
Los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en el mercado a mediados
del siglo XX. A su vez, la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC High Performance
Liquid Chromatography, en ingls) comenz a desarrollarse en los aos 1960,
aumentando su importancia en las dcadas siguientes, hasta convertirse en la tcnica
cromatogrfica ms empleada. Sin embargo esto se ir modificando con el paso de los
aos.

Clasificacin de los mtodos de separacin en

cromatografa
Las distintas tcnicas cromatogrficas2 se pueden dividir segn cmo est dispuesta
la fase estacionaria:

Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre
un papel. Las principales tcnicas son:

Cromatografa en papel

Cromatografa en capa fina

Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna.

Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen:

Cromatografa de lquidos

Cromatografa de gases

Cromatografa de fluidos supercrticos

La cromatografa de gases se aplica a numerosos compuestos orgnicos. En el caso de

compuestos no voltiles, se recurre a procesos denominados de "derivatizacin", a fin de
convertirlos en otros compuestos que se volatilicen en las condiciones de anlisis.
Dentro de la cromatografa lquida, destaca la cromatografa lquida de alta resolucin
(HPLC, del ingls High Performance Liquid Chromatography), que es la tcnica
cromatogrfica ms empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase
reversa, en la que la fase estacionaria tiene carcter no polar, y la fase mvil posee
carcter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporcin de la misma o de
otros disolvente polares, como por ejemplo, metanol). El nombre de "reversa" viene dado
porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de slice o almina, de
carcter polar, y por tanto la fase mvil era un disolvente orgnico poco polar. Una serie

eluotrpica es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actan como fase

mvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase estacionaria.

Separacin de clorofilas mediante cromatografa en papel

Tipos

Fase
mvil

Fase estacionaria

Cromatografa en
papel

Lquido

Papel de celulosa.

Cromatografa en
capa fina

Lquido

Gel de slice o almina.

Cromatografa de
gases

Gas

Columnas capilares de slice fundida, con recubrimientos

internos de varios tipos de siloxanos enlazados, columnas
empaquetadas con tierras diatomeas hechas de tubos de
vidrio o metal.

Cromatografa
lquida
en fase reversa

Lquido
(polar)

Relleno de siloxano de octilo o siloxano de octadecilo.

Cromatografa
lquida
en fase normal

Lquido
(menos
polar)

Relleno de slice, almina o un soporte al que se unen

qumicamente grupos polares (ciano, amino, etc).

Cromatografa
lquida
de intercambio
inico

Lquido
(polar)

Resinas de intercambio inico.

Cromatografa
lquida
de exclusin

Lquido

Relleno de pequeas partculas de slice o polmeros con

red de poros uniforme.

Cromatografa

Lquido

Partculas finamente divididas de slice o de almina.

lquida
de adsorcin
Cromatografa de
fluidos
supercrticos

Lquido

Columnas abiertas de slice fundida con recubrimientos

internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de
enlaces cruzados.

Trminos empleados en cromatografa

Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografa.

Fase mvil es la fase que se mueve en una direccin definida. Puede ser un
lquido (cromatografa de lquidos o CEC). un gas (cromatografa de gases) o un fluido
supercrtico (cromatografa de fluidos supercrticos). La muestra que se est
separando/analizando (formada de analito/s y el disolvente) se inyecta en la fase mvil
que se mueve a travs de la columna. En el caso de la cromatografa lquida de alta
resolucin, HPLC, la fase mvil es un disolvente no polar como el hexano (fase
normal) o bien algn disolvente polar (cromatografa de fase reversa).

Fase estacionaria es la sustancia que est fija en una posicin durante la

cromatografa. Un ejemplo es la capa de gel de slice en la cromatografa en capa fina.

Cromatografa analtica se emplea para determinar la existencia y posiblemente

tambin la concentracin de un analito en una muestra.

Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las
partculas de soporte o a las paredes internas de la columa.

Cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de

separacin ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden
a los componentes de la mezcla separada.

En el eje X se representa el tiempo de retencin, y en el eje Y una seal (obtenida,

por ejemplo, a partir de un espectrofotmetro, un espectrmetro de masas o
cualquier otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada
por los diferentes analitos existentes en la muestra. En el caso de un sistema
ptimo, la seal es proporcional a la concentracin del analito especfico separado.

Cromatgrafo es el equipo que permite una separacin sofisticada. Por

ejemplo, un cromatgrafo de gases o un cromatgrafo de lquidos.

Cromatografa es el mtodo fsico de separacin en el cual los componentes

que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es
estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra (la fase mvil) se mueve en
una direccin definida.

Eluyente es la fase mvil que atraviesa la columna.

Serie eluotrpica es una lista de disolventes clasificados segn su poder de

dilucin.

Fase inmovilizada es una fase estacionaria que est inmovilizada sobre

partculas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.

Cromatograma correspondiente a una cromatografa lquida en fase reversa para

compuestos fenlicos

Cromatografa preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de

sustancia para un uso posterior, ms que para anlisis.

Tiempo de retencin es el tiempo caracterstico que tarda un analito

particular en pasar a travs del sistema (desde la columna de entrada hasta el
detector) bajo las condiciones fijadas. Vase tambin:ndice de retencin de
Kovats

Muestra es la materia que va a ser analizada en la cromatografa. Puede

consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla
es tratada en el curso del anlisis, la fase o fases que contienen los analitos
de inters es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias
cuya separacin no resulta de inters es llamada residuo.

Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.

Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la

fase mvil lquida en cromatografa de lquidos.

Capacidad de carga Es la cantidad mxima de muestra que puede ser

separada en una sola carga.

Capacidad de fraccionamiento Es el nmero mximo de componentes que

pueden ser separados en una sola operacin.

Selectividad Es la capacidad de poder discriminar y distinguir entre dos

componentes.