TEMA 7

PRODUCCION INDUSTRIAL DE METABOLITOS

PRIMARIOS

I. METABOLITOS PRIMARIOS DE INTERES INDUSTRIAL

Los metabolitos primarios son molculas de bajo peso molecular que intervienen, bien como productos finales o
intermediarios, en las distintas rutas anablicas y catablicas. Los ms importantes desde el punto de vista industrial
son los aminocidos, nucletidos, vitaminas, cidos orgnicos y alcoholes.
Alcoholes: etanol
Aminocidos: cido glutmico, lisina, treonina
Nucletidos: cido 5' guanlico, cido 5' inosnico
Acidos orgnicos: cido actico, cido propinico, cido succnico, cido fumrico, cido lctico,
cido mlico, cido tartrico, cido ctrico, cido glucnico
Polioles: glicerol, manitol
Polisacridos: xantano
Azcares: fructosa, sorbosa
Vitaminas: riboflavina (B2), cianocobalamina (B12)
Como ya hemos dicho, la superproduccin de metabolitos primarios es evitada por la mayora de los
microorganismos, puesto que son procesos que consumen gran cantidad de energa, lo cual hace que sean menos
competitivos en los ambientes naturales. Sin embargo, existen en la Naturaleza microorganismos que tienen alterados
sus sistemas regulatorios y stos son precisamente los que a lo largo del proceso de bsqueda son seleccionados para
su utilizacin en microbiologa industrial. Estos cultivos posteriormente se someten a un profundo estudio mediante
el cual, alterando las condiciones del medio y/o por modificaciones genticas, incrementamos la superproduccin del
producto que nos interesa.
Mediante estas alteraciones se ha conseguido, por ejemplo, que la bacteria Pseudomonas denitrificans produzca
50.000 veces ms vitamina B12. Las manipulaciones ms frecuentes son la alteracin de la regulacin por
retroalimentacin y la alteracin de la permeabilidad.

II. ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION

La regulacin por retroalimentacin es el control que utilizan los microorganismos para evitar la superproduccin
de aminocidos y nucletidos. Para eliminar este control se han empleado dos tipos de manipulaciones: alteracin de
la acumulacin de productos finales y obtencin de mutantes resistentes a la regulacin por retroalimentacin.

1.- Alteracin de la acumulacin de productos finales

A. Evitar la acumulacin de productos finales
En una ruta metablica sencilla (no ramificada) la limitacin de la capacidad de la clula para acumular
intracelularmente productos finales inhibidores o represores, se utiliza generalmente para la superproduccin de
algn intermediario de esta ruta metablica. En el siguiente esquema se representa este principio:
Si nosotros deseamos obtener una superproduccin del producto intermediario C en una ruta metablica sencilla
donde el producto final E por retroalimentacin inhibe al enzima a y reprime a los enzimas a y b.
Lo primero que se hace es obtener un mutante auxtrofo que le falte el enzima c.
Al no poder sintetizar el producto E, este mutante requiere para su crecimiento que se aada en el medio E.
Si se aaden bajos niveles de E, los necesarios para que el microorganismo crezca, ste microorganismo no
podr acumular concentraciones de E que inhiban o repriman a los enzimas a y b con lo que ser posible
obtener una gran acumulacin de C.
Mediante este tipo de manipulacin se ha conseguido por ejemplo, que un mutante de Corynebacterium glutamicum
auxtrofo en Arginina produzca 26 gramos/litro de L-Ornitina

B. Acumulacin de productos finales

Se utiliza en rutas metablicas ramificadas. Consideremos una ruta metablica ramificada que conduce a dos
productos finales, A y B. Con frecuencia, si conseguimos disminuir la concentracin de B, el producto A se
acumulara.
El ejemplo ms importante, con inters comercial, de la utilizacin de esta estrategia es la superproduccin de lisina.
Este aminocido se utiliza como aditivo nutritivo, puesto que la mayora de las protenas de cereales son deficientes
en este aminocido. Pertenece a la familia del aspartato y se produce en la mayora de las bacterias en una ruta
metablica ramificada que produce adems metionina, treonina e isoleucina.
En Escherichia coli, el primer paso de esta ruta est regido por tres aspartato quinasas, cada una de las cuales est
regulada por un producto final diferente y, adems, cada producto final regula el primer enzima despus de cada
ramificacin.
Sin embargo, en los microorganismos utilizados en la fermentacin para la produccin de lisina (Corynebacterium
glutamicum) existe una nica aspartato quinasa regulada por un mecanismo concertado de retroalimentacin por la
treonina y lisina. As mismo, tampoco poseen regulacin en la ramificacin.
Mediante la eliminacin gentica del enzima homoserina deshidrogenasa, se obtiene un mutante que no puede crecer
salvo que se aada en el medio metionina y treonina. Mientras que los niveles de treonina que se aadan sean bajos,
pero suficientes para el crecimiento del microorganismo, no se producir una inhibicin por retroalimentacin de la
aspartato quinasa, con lo que estos microorganismos son capaces de producir 50 gramos de L-lisina por litro.

2.- Mutantes resistentes a la regulacin por retroalimentacin

Una segunda va para eliminar la regulacin por retroalimentacin y as obtener una superproduccin de metabolitos
primarios es alterando la estructura del enzima sujeto a la inhibicin o modificando los genes reguladores de tal
manera que el sistema no sea reprimible.
El sistema ms sencillo para aislar estos mutantes es seleccionar las cepas resistentes a los efectos txicos que
produce un anlogo del compuesto que nos interesa. Para ello se someten a mutacin los microorganismos y,
posteriormente se siembran en placa en presencia del anlogo. Aquellas cepas que son capaces de crecer y formar
colonias son las que se seleccionan. Algunos de estos mutantes resistentes sern superproductores del metabolito que
nos interesa.
Represin
Gen a

Enzima a

D'

Inhibicin
b

A --------> B --------> C --------> D

Si el anlogo D' inhibe la sntesis de D, el microorganismo no puede producir este metabolito y muere. Por el
contrario, si D' no inhibe la sntesis de D, el microorganismo seguir produciendo D y sobrevivir. En este caso
puede haber ocurrido una alteracin en la estructura del enzima, con lo que obtenemos mutantes resistentes a la
inhibicin por retroalimentacin. O bien, puede haber ocurrido una alteracin en el sistema de sntesis del enzima,
con lo que obtenemos mutantes resistentes a la represin por retroalimentacin. En cualquier caso y debido a la
alteracin de estos controles, el microorganismo superproduce D.

III. ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD

El incremento de la permeabilidad de la membrana citoplasmtica es el responsable de la superproduccin de cido

glutmico, que es con diferencia el aminocido ms importante de los producidos por fermentacin. Se utiliza en
forma de glutamato monosdico como potenciador de aromas.
Todos los microorganismos superproductores de glutamato tienen dos caractersticas comunes:
(i) Una deficiencia en el enzima -cetoglutarato deshidrogenasa.
(ii) Requerimiento nutricional de biotina.

La deficiencia del enzima del ciclo de Krebs canaliza el metabolismo del carbono hacia glutamato; mientras que la
deficiencia en el bloque biosinttico de la biotina da lugar a una alteracin de la permeabilidad de la membrana lo
que permite la excrecin del glutamato producido.
La principal ruta en la produccin de glutamato a partir de glucosa es la ruta de Embden-Meyerhof y los primeros
pasos del ciclo de los cidos tricarboxlicos.

El -cetoglutarato, el cual normalmente se convierte en succinil CoA en el ciclo, es aminado por accin de la
glutamato deshidrogenasa y se transforma en glutamato debido a la deficiencia en la -cetoglutarato deshidrogenasa.
De esta manera se pueden llegar a conseguir 100 gramos por litro de glutamato.
Durante el crecimiento con glucosa, los microorganismos superproductores acumulan intracelularmente glutamato,
hasta que la clula es saturada (c.a. 50 mg/g de peso seco). Entonces, y por medio de la regulacin por
retroalimentacin, se bloquea la sntesis de glutamato salvo que se modifique la permeabilidad y as se facilite la
salida del aminocido al exterior de la clula.
Esta modificacin de la permeabilidad se consigue mediante una deficiencia en el bloque biosinttico de la biotina.
Una deficiencia en biotina origina cambios en la composicin lipdica de la membrana debido al papel que
desempea la biotina en la sntesis de cidos grasos. Los niveles de biotina que se deben aadir al medio son crticos
a la hora de obtener una buena produccin de glutamato. Las concentraciones que se usan estn entre 1 y 5 g/L de
biotina. Una concentracin de 15 g/L elimina la excrecin de glutamato, con lo que se acumulara en la clula.
Esta modificacin de la permeabilidad tambin se puede alterar aadiendo penicilina durante la fase logartmica de
crecimiento. Aunque la penicilina no inhibe la sntesis de fosfolpidos, su adicin resulta en una inmediata excrecin
de fosfolpidos. Otra forma de alterar la permeabilidad de la membrana es aadiendo detergentes.