Abstracto

Enlafotosntesisribulosa1,5bisfosfatocarboxilasa/oxigenasa(Rubisco)catalizala
frecuenciaquelimitalavelocidaddeCO2fixationpasoenelciclodeCalvin.Estohaceque
laRubiscotantoelguardindelaentradadecarbonoenlabiosferayunobjetivoparala
mejorafuncionalparamejorarlafotosntesisyelcrecimientodelasplantas.Gravarel
rendimientocatalticodeRubiscoessumuyconservadasqumicacataltica,compleja.En
consecuencia,losesfuerzostradicionalesparamejorarlacatlisisRubiscoelusode"ensayo
yerror"prolongadaenfoquesdeingenieradeprotenashantenidounxitolimitado.Aqu
sedemuestralaversatilidaddealtorendimientodirigido(laboratorio)laevolucinde
protenasparamejorarlaspropiedadesdecarboxilacindeunRubisconofotosintticade
lasarqueasMethanococcoidesBurtonii.Elusodelatransformacindecloroplastosenla
plantamodelodeNicotianatabacum(tabaco)confirmamoslasformasmejoradas
deM.BurtoniiRubiscoaumentlafotosntesisyelcrecimientoenrelacinconlos
controlesdeproduccindetabacodetiposilvestreM.BurtoniiRubisco.Nuestroshallazgos
indicancontinuaronevolucindirigidadearqueasRubiscoofrecenuevasposibilidadespara
mejorarlafotosntesisdelahojaycrecimientodelasplantas.

Introduccin
MejorarelrendimientodelasemisionesdeCO2delaenzimaRubiscoFijacintieneel
potencialdemejorarsignificativamentelaeficienciafotosintticayproducir1.Las
estrategiasparalograresteobjetivosuponenilamodificacindelabioqumicayla
ultraestructuradeloscloroplastosdelashojasdeconcentrarCO2alrededordeRubisco,o
mejorardirectamentelacatlisisensRubiscomediantecruzamientogenticoo
modificacintransgnica2.Aunqueambosenfoquesseenfrentanadesafostcnicos
significativos,lassugerenciasdequeRubiscoenplantasyaestoperandoaocercade
ptimafisiolgicaplanteaincertidumbreencuantoalniveldemejoraposible3,4.Algopasa
poraltoenestospequeosconjuntodedatosdeanlisisesquelaplantaRubisconoesel
pinculodelaevolucincomoelRubiscosuperioresdealgunasalgasrojastienenel
potencialparabeneficiaraC3productividadPlantahastaenun30%2.Pordesgracia,en
sustitucindelaplantaRubiscoconalgasrojasRubiscopareceinsostenibledebidoala
chaperonaincompatibilidadesqueimpidenelmontajedealgasRubiscogrande(L)y
pequea(S)subunidadesfuncionalesenL8S8complejoshexadecamerenloscloroplastos
delashojas5.Enlosltimosaossehanproducidoavancessignificativosenla
comprensindelaschaperonasauxiliarescomplejasyespecializadasparalabiognesisde
lascianobacteriasylaplantaL8S8Rubisco6,7,8,9,sinembargohomlogosparamuchas
deestaschaperonasenalgasrojasnosonfcilmenteidentificables.
Apesardecincodcadasdeinvestigacin,unaamplificacindramticaenlapotenciade
clculoymsde25estructurasderayosXparadiferentesisoformasRubisco10seguimos
siendoincapacesdemejorarlaRubiscocatlisispordiseoracional11,12,13.Esta
limitacinhaconducidoaldesarrollodelasindicaciones(invitrodelaprotenaevolucino
laboratorio)EnfoquesadaptadosparaseleccionarmutantesRubiscoconmejoradela
funcin12.Engeneral,laevolucindeprotenasdirigidaimplicalaidentificacinde

protenasconpropiedadesdeseadasapartirdeunabibliotecademutantesquecomprende
unadiversidadgenticasuficiente14.Losavancesenlastecnologasdelaevolucinde
protenasdirigidashanestimuladosuxitoenlaidentificacindemutacionesquemejorano
alteran,lacatlisisy/olasolubilidaddeunagranvariedaddeenzimas14,15,16.Un
beneficioclavedelaevolucindirigidaesquepuederevelarnuevassolucionesde
acondicionamientofsicoqueseraprobablequedeotramanerapasaransinexplorar
durantelaevolucinnaturalde14,17.
LaevolucindirigidadeRubiscohautilizadoprincipalmentesistemasdebajorendimiento
fotosintticodeseleccin(porejemplocapsulatusRhodobacter)odealtorendimiento
dependeRubiscoE.colisistemasdeseleccin(RDE)quevarandramticamenteen
eficiencia12,18,19.ComnalossistemasdeseleccinRDEeslaexpresinectpicade
fosforribuloquinasa(PRK)cuyoproducto,elsustrato5carbonodeRubiscoribulosa1,5
bisphospahte(RuBP),esfortuitamentetxicosparalasbacterias.UnMM1
refinadaPRKseleccinRDEsehaadaptadogenticamenteparautilizarun'PRKRubisco
shunt'paracerrarunabrechaArupturaintroducidaenlagluclisis(figura1a.

20,21).La
bajafrecuenciadefalsospositivosobtenidosutilizandoelMM1PRKsistemaRDE
contrastaconlaineficienciasorprendentedeotrossistemasRDE22,23.Comoresultado,la
MM1PRKsistemaRDEhaidentificadomutacionesqueinfluyennegativamenteenel
CO2/O2especificidad(SC/O)deLbacteriana2RubiscodeRhodospirillumrubrum,as
comomutacionesquemejoransignificativamenteelconjunto(solubilidad)deL
cianobacterias8S8Rubiscoy,enuncaso,marginalmentemejoradatodoslosparmetros
catalticos12,24.Msrecientemente,elMM1PRKRDEidentific
unSynechocystisPCC6803L8S8Rubiscomutanteconmejorasde3vecesenlaeficiencia
decarboxilacinquemejoraronlastasasdefotosntesisde>50%cuandosevuelvea
integrarseenlaaltaconcentracindeCO2compartimentocarboxisomadentrodela
cianobacteria11.Porelcontrario,espocoprobablequeestasmejoraspodranserde
beneficioenhojasdeplantascomolaaltaconcentracindeCO2nivelesnecesariospara
explicarlabajadeCO2deafinidadylamalaSC/SdelascianobacteriasRubisconose
cumplenporloscloroplastos25.
Figura1:SeleccindemejorasenlacatlisisMBRusandoRubisco
dependienteE.coli(RDE).

( Un ) esquemtico simplificado del sistema de seleccin RDE que utiliza un

gluclisis / gluconeognesis interrumpi gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa
eliminacin ( brechaA ) cepa de E. coli (MM1). La expresin ectpica de
phosphoribulokinase (PRK) y la Rubisco en MM1 acta como una derivacin de
derivacin para la gluclisis para permitir el flujo de carbono de carbono hexosa al
ciclo TCA para la energa y el crecimiento. PRK cataliza la conversin de la
ribulosa-5-fosfato (rib-5-P), producido por la va de la pentosa fosfato (PPP) para
RuBP, que es txico para el crecimiento celular. Toxicidad RuBP puede ser aliviado
por carboxilacin catalizada Rubisco seguido de la utilizacin del producto 3PGA en
la gluclisis. La expresin de la PRK y Rubisco es cuidadosamente regulada
mediante la variacin de los agentes inductores de arabinosa y IPTG,
respectivamente 20 . La primera divisin celular se facilita mediante la adicin de
niveles de trazas de glicerol (0,4% v / v; aguas arriba C-fuente), malato 30 mM y
-

0,5% w / v cas amino-cidos (C- aguas abajo y fuentes N-). ( B ) el crecimiento

comparativo de MM1- PRK clulas que expresan "mejorada" de tipo mutante y
salvaje IBM, establecidas en el aumento de los niveles de arabinosa expresin
inducida PRK. (-) Sin crecimiento; (+ A ++++) aumento relativo de tamao de las
colonias. Ver Tabla 1 complementario para la pantalla del crecimiento RDE integral
y la secuencia de todos los mutantes MBR primarias seleccionadas. ( C ) Un
resumen de crecimiento de colonias calificaciones de las siete mejores mutantes
MBR ms activos en el aumento de la expresin inducida PRK arabinosa.
imagen a tamao completo
ElpapelnofotosintticadelosantiguosL2/Lde10isoformasRubiscoenarqueasimplica
queprobablementehansidosometidosalaspresionesdeseleccinalternativosparaRubisco
fotosintticadurantelaevolucin.Porejemplo,Rubiscodearqueastieneunaaltaafinidad
porRuBPyaltatermoestabilidadperobajastasasdecarboxilacin(kgatoC)ySC/
,
,
O26 27 28.EstedistintivocatalticasurgedelpapelbiolgicoalternativodearqueasRubisco
enlavadelaspentosasbisfosfatoenelquefuncionaparametabolizarlaRuBPproducido
duranteelmetabolismonuclesido29.Apesardesufuncinnofotosinttica,arqueas
Rubiscotodavapuedeapoyarlafotosntesisyelcrecimientodelasplantas.Porejemplo,
elMethanococcoidesBurtoniiL10Rubisco(MBR)esaltamenteexpresadoenlos
cloroplastosdelashojasysemuestraparaapoyarelcrecimientohastalamadurezfrtilde
tabacobajolaaltaconcentracindeCO2nivelesnecesariosparadarcabidaalabajakgatoCy
SC/SdeMBR26.
Laspropiedadescarboxilasasignificativamentemspobresyfuncinalternativadela
Rubiscoenarqueassugierenqueestaformadelaenzimasehaadaptadoalaspresiones
evolutivasalternativasencomparacinconlaRubiscoenlosorganismosfotosintticos.Esta
preguntasilaspropiedadesdecarboxilacindelarqueasL10Rubiscopodranserms
susceptiblesdemejorahacialosrequeridosparaelpotencialfotosintticomejorada.Para
abordarestacuestinseutilizelMM1PRKsistemaRDE(Fig.1a)paraseleccionar
mutantesMBRevolucionadoconmejorasenlaspropiedadescatalticasqueserequieren
paramejorarC3fotosntesisPlanta5,30.EstaspropiedadesincluyenelaumentodekcatC,la
eficienciadecarboxilacin(kgatoCdivididoporKC21%deO2,laKmparaelCO2enambientes,
O2)ySC/S.Usandogenomadelcloroplasto(plastoma)transformacin
introducimosMBRgeneseneltabacoparademostrarxitodelatraduccindepropiedades
mejoradasMBRseleccionadosenE.colialoscloroplastosdelashojas.Lafotosntesis
mejoradayelcrecimientodelasplantastransformadasproduciendomutantesmejorados
MBRenrelacinconelcontroldelneasdeproduccinnomutadaMBRproporciona
nuevospruebadeconceptoenlautilidaddelamejoradeRubiscocatlisisporevolucin
dirigidaenE.coliparamejorarelCO2tasaassimilationenhojas.

resultados
LaevolucindirigidadeM.BurtoniiRubisco(MBR)
enE.coli

ElnativoMBIILgenquecodificaM.BurtoniiRubiscosetraduceeficientemente
enE.coliyseensamblaenabundantementeexpresado(>6%(w/w)delaprotenasoluble
declulas)comofuncionalL2Rubisco(MBR)26.EnpresenciadeRuBPsustrato(oligando
fosfatodeazcarestructuralmentecomparable)elL2unidadesseensamblanenunL
estable10complejoMBR.LasmutacionesalazarseintrodujeronenMBIILusandoPCR
propensaerror(conunpromediode2mutacionesporkb)ylosgenesmutantesseligen
unlacdelvectorinduciblepTrcHisB20.
TresMBIILbibliotecas(comprendiendocadauno~180kvariantes)setransformaronen
MM1PRKclulas(Fig.1a)ysecultivarona23Ccomosehadescrito20.Laseleccin
inicialsellevacabobajoaltaRubiscoinducir(0,5mMdeIPTG)ybajocondicionesde
induccindePRK(0.05%(w/v)dearabinosa)enelairesuplementadasconCO2,5%(v/
v)2.Despusde916das80coloniasquemuestranelcrecimientomejoradoenrelacin
conMM1PRKseidentificaronproduccindetiposalvajeMBR(quecomplementael
cuadro1).ElplsmidoquecontienelaRubiscodecadacoloniasesecuencisustituciones
reveladorasen78delos474aminocidos(Tabla1complementario).CadaMBIILmutante
seclondenuevoenpTrcHisByvolveratransformarseenMM1PRKclulasRDEypor
separadocultivabajomayorseleccinactividadRubisco(esdecir,enmediosquecontienen
0,1%(w/v)dearabinosaparaelevarlaexpresindePRK;laFig.1b).Elcrecimientode
coloniassepuntuenrelacinconMM1PRKclulasqueexpresandetiposalvajeMBR
quenopodancrecerenunmedioquecontiene0,1%(w/v)dearabinosa(Fig.
1b).SieteMBIIseencontrarongenesmutantesLparatransmitirunaventajaselectiva
distintaaMM1PRKE.colicrecimiento(Fig.1c).
LossietedetiposalvajeymutantepTrcMBIILgenesseexpresanenXL1Blue
deE.coliysincoexpresindePRK.EstodiocomoresultadosloenL2seforman
oligmerosMBRcomolasclulasnohicieronningnRuBPqueserequiereparala
formacindeL10MBRcomplejos26.Elcontenidocelularylaspropiedadescatalticasde
cadaL2semidienzimaMBR(Fig.2a).LastasasmximasdeCO2fixation(kgatoC)a25
Csedeterminaronenambientes,O2niveles(~252MO2)yconunpHde7,2,debidoal
bajopHfavorecidoporcatlisisMBR26.EnestascondicionesMBRmutanteasla#1
(MBRK332E),#10A(MBRE138V)y#63(MBRT421A)mostraronsignificativas40%a
90%mejorasenlakcatCy10%a25%deincrementoenloscorrespondientesSOC/(Fig.
2a).LacuantificacindelaexpresindeMBRenE.colipor14CCABPdeuninyla
confirmacinmedianteSDSPAGE(Fig.2b)mostrquelamayoradelasmutaciones
tuvieronpocoefectosobreelniveldeexpresinMBR.ElmutanteMBRT421A(#63)
mostrunmodesto,perosignificativo,aumentoenlaexpresin,mientrasquelas
mutacionesenelMBRmutantes#14,#23y#45laproduccindeMBRobstaculizadade
formasignificativa(Fig.2b).
Figura2:AnlisisdemutantesdeMBRconlamejoradelacatlisis.

( Un ) propiedades catalticas (mxima tasa de RuBP-carboxilacin, k

;
especificidad para el CO sobre S , S ) de tipo salvaje y mutante MBR a 25 C,
pH 7,2, y su nivel de expresin relativa en bruto E . coli lisado soluble. Los valores
mostrados son la media ( DE) de los ensayos realizados en tres preparaciones de
clulas o, por S , cuatro repeticiones tcnica de preparaciones de enzimas
purificadas duplicados. nm, no se mide. Importancia variacin relativa al tipo salvaje
MBR (* p <0,01, ** p <0,001), determinado por la prueba t. (B ) anlisis de SDS e
inmuno-blot deteccin de contenido MBR en el E. coli protena soluble (7 g / carril)
usado para medir k
y el contenido MBR. pTrcHisB, control de vectores de slo, *
una protena de 50 kDa ~ abundante hizo en E. coli que es de un tamao similar a
la Rubisco L-subunidad 21 .
gato

C/S

C/S

gato

imagen a tamao completo

LaexpresindelamejoradeMBRenloscloroplastosde
tabaco
ElgenotipodeltabacocmtrLsehaadaptadogenticamenteparalaingenieradeRubisco
mediantelatransformacindecloroplastos31.EnelplastomadecmcloroplastosTRLeltipo

salvajerbcLgenhasidoreemplazadoconunsinttico,codnversinmodificadade
laR.rubrumbacterianarbcgenH(cmrbcM)quecodificaparalaFormaIIL2Rubiscoen
lugardetabacoL8S8Rubisco(Fig.3a).ElaumentodeO2sensibilidad
deR.rubrumL2RubiscoreducetantoSC/Oylaeficienciadecarboxilacinenambientes,
O2(kgatoC/KC21%O2)por~7vecesenrelacinconeltabacoL8S8Rubisco(Tabla1).Estas
propiedadescatalticasmspobrescomoresultadolacmgenotipotrLquerequierealta
concentracindeCO2paraelcrecimientoenelsuelo31.ComosemuestraporAlonsoet
al.,(2009)laspropiedadescatalticasdeMBR(tantoenL2yL10complejos)sonanms
impedidoqueR.rubrumL2Rubisco,especialmenteconelaumentodepHalcalino.Apesar
deestaalteracin,sustitucintransplastmicasdelcmrbcgenMencmtrLconladetipo
salvajeMBIIgenLgenerlaL10genotipotabacoMBRproducirTobMBIILquepodran
sobrevivirbajoniveleselevadosdeCO2(2,5%v/v)enelsuelo26.LosTobMBIILlneas
tomaronmsde300dasparaalcanzarlamadurezfrtilencomparacincon~30daspara
eltabacodetiposalvajey~32dasparacmtrLenlasmismascondicionesdecrecimiento.
Figura3:TransformacinyexpresindelaMBRmutadoenzimasenlashojasde
tabaco.

Las variables mb R genes que codifican tipo salvaje y mutante MBR se integraron
en elRBC regin L del plastoma del tabaco mediante transformacin del
cloroplasto. ( Un ) Comparacin de la secuencia de plastoma y tipos de Rubisco
hecho en los genotipos de tabaco diferentes examinados. El mb R y marcador
seleccionable aad un gen en los plsmidos transformantes pLEVMbR, pLEVMbRE138V y pLEVMbR-K332E se transformaron en el plastoma del genotipo trL
tabaco para reemplazar el rbc M (que codifica R. rubrum L Rubisco 31 ) por
recombinacin homloga de la secuencia de plastoma de flanqueo (situado entre
las lneas de trazos, la numeracin correspondiente a la secuencia de Genbank
Z00044). P, 292-bp rbc L promotor / 5 'UTR; T, de 288 pb RBC L 3'UTR; T , 112 pb
del PSB Un 3'UTR; t, 147 pb rps 16 3'UTR. Posicin de alineacin de cebadores
LSD y LSE 32 y la sonda 5UTR 221 pb 8 se muestran. ( B ) anlisis de PAGE nativa
de la L S , L y L isoformas Rubisco producido, respectivamente, en las hojas
de tabaco, trL y los tres Tob genotipos. * protena no Rubisco. ( C ) C-CABP
cuantificacin de Rubisco contenido del sitio activo en las hojas jvenes dosel
superior comparables de cada genotipo durante la primera (~ 20 cm de altura,
barras de colores) y tarda (~ 60 cm de altura, barras negras) de crecimiento
exponencial.
cm

cm

cm

cm

cm

10

MBR

14

imagen a tamao completo

Tabla1:medicionesdecatlisisRubisco.
mesa de tamao completo
ParaprobarsilasenzimasMBRevolucionadotraducidasalamejoradelafotosntesis
tabacoyelcrecimiento,sintticosmbsehicierongenesRqueincorporaronelusode
codonesdelatabacorbcLgen(Fig.3a).Adems,lasecuenciadeMSLIYEDLVMBRN
terminalnativosereemplazconlasecuenciadeMSPQTETKASVGFdeltabacoL
subunidadquesesometeaunaseriedemodificacionesposttraduccionalesque
tentativamenteproporcionanproteccindelaproteolisis13.TresmbRgenesquecodifican
tiposalvajeMBR,MBRK332EyMBRE138Vfueronclonadosenelplsmidoplastoma
transformarpLEV4ytransformadoencmtrLdeja31.Laslneasdetabacotransplastmicas
queproducenL10MBRseidentificaronmediantePAGEnativo(Fig.3b).Almenosdos
lneasindependientesparacadaunodelosTobMBR,tobMbRE138VyTobMbRK332Egenotiposse
propagandeformacontinuaenunmedioquecontieneespectinomicinahastahomoplasmic
(esdecir,yanoproducirL2R.rubrumRubisco)antesdecultivarlaT0plantashastala
madurezenelsueloenairecomplementadocon2,5%[v/v]CO2.
SloL10MBRsedetectenhojas(Fig.3b),debidoalaproduccincontinuadeRuBP
bajoiluminacinylarelativaestabilidaddelcomplejodecamricos26.Mientrasqueel
T0TobMBRE138VyTobMBRK332EplantascrecieronsustancialmentemsrpidoquetobMBR,se
detectpocadiferenciaenelL10contenidoMBRenhojasdeldoselsuperiorcomparables
delmenor(~21cmdealto)T0plantas(Fig.3c).Cuandoenel~60cmdealtura,36
vecesmayoresnivelesdeL10MBRsemidieroneneldoselsuperiorderecienteaparicin
dejaconcantidadessignificativamentemayoresdetectadasenlosquecrecenmsrpido,de
aspectosaludable,tobMbRE138VytobMbRK332ET0plantas(Fig.3c).Enambasetapasde
desarrollo,losnivelesdehojaMBRfuerongeneralmente34vecesmsbajosquelosde

L2yL8S8contenidoenelRubiscocmtrLyloscontrolesdetabacodetiposalvajequecrece
junto.
LaslimitacionesenelestadoestacionariombnivelesdeARNmRencadagenotipo
contribuyeronaladeficienciaenelMBR(Fig.1complementario).Comoseindicaenla
figura.3a,tantounmonocistronicmbRyA(5070%menosabundantes)discistronicmbR
aadUnatranscripcinserealizaronencadaT0TobMBRgenotipo.Enlashojasjvenes
superioresdeT0plantasen~21cmdealturatotalmbabundanciadeARNmdeIera3070%
msbajaenlaabundanciadelosRBCnivelesdemRNAenLdetiposalvaje
(complementarioFig.1).Comosehavistoanteriormenteenlosgenotiposdetabaco
modificadasRubiscoconpotencialreducidafotosinttica8,26,30,32,estosnivelesde
mRNAreducidossecorrelacionanconlaviabilidaddelaalteracindelamsdelgada,de
tamaomspequeo,plidohojasverdesdecadagenotipotransplastmica(verabajo).

ElMBRevolucionadohanmejoradolaactividad
carboxilasa
LaspropiedadescatalticasdeladetiposalvajeymutantesL10isoformasMBRproducido
enlosT0progeniesemidieronapH8(elpHaproximadodelaestromadel
cloroplasto,Tabla1).MientrasqueelSc/ovalorescoincidanconlosmedidosparael
L2enzimasproducidasenE.coli(Fig.2b),loskgatoCtasasfueroninferioresalosmedidosa
pH7,2,debidoalamayoractividaddeMBRabajopH26.Sinembargo,inclusoapH8
tantokgatoCylaseficienciasdecarboxilacin(kgatoC/KC21%O2)delasenzimasMBRE138Vy
MBRK332Eeranentre2y3,4vecesmayorqueMBR,conunacompaante~aumentodel
15%enelSC/SparalaenzimaMBRE138V(Tabla1).Esimportantedestacarqueestas
mejorasenCO2deafinidad,especificidadyfijacinvelocidadllegaronsingastosalaalta
afinidadnaturaldeMBRparaRuBP(esdecir.UnabajaKmRuBP,Tabla1).

LamejoradelacatlisisMBRmejoralafotosntesisyel
crecimientodeltabaco
LamejoradelcrecimientoyfenotipomssaludabledelaTobMbRK332EyTobMbRE138Vgenotipos
enrelacinconlostobMBRlneasfueevidenteenelT1progenie.Enlosensayosde
germinacindecultivodetejidosdetodoelT1progeniesurgicomocotiledonesverdesen
losmediosdecomunicacinespectinomicinadespusde1semanaconfirmandotodoseran
transplastmicas(Fig.4).Despusde5semanas,eraevidentequeserequierelaadicinde
sacarosaalmediodecultivodetejidosparaelgerminadoTobMBRyTobMbRE138Vlneaspara
sobrevivirbajoelevada(v2,5%v/)CO2(Fig.4).Encontraste,lostobMbRK332Eplantas
sobrevivieronaaltaCO2sinsuplementacinsacarosaycrecieronmsrpidamenteentodas
lascondicionesdecultivodetejidosensayados.
Figura4:ElT1TobMBRE138VyTobMBRK332Eprogeniemostrunamejoraenelcrecimiento
encultivodetejidos.

Comparacin del crecimiento de cada Tob genotipo tras el crecimiento 1 y 5

semanas en medios que contienen medida relativa de predictibilidad 0,2 mg.mL
espectinomicina y los diversos niveles de sacarosa. Las plantas se cultivaron en
aire + 2% (v / v) de CO y 25 a 100 mu mol photons.m .s iluminacin.
MBR

-2

-1

imagen a tamao completo

ComosemuestraporAlonsoetal.,(2009),aireenriquecidocon(v/v)CO>2%2se
necesitabaparacadalneadetabacoproducirMBRgeneradoparacrecerhastalamadurez
frtilenelsuelo.EnconsonanciaconlacatlisismejoradadeltrasplantadoMBRE138Vy
enzimasMBRK332E(Tabla1),lostobMbRE138VyTobMbRK332Egenotiposapoyaronms
rpidoshojafotosintticadeCO2tasasdeasimilacinenrelacinconlostobMBRlneas

(Fig.5A).ParacompensarlosnivelesinferioresdelahojaMBRylaspropiedades
catalticasmspobresdelaL10MBRenrelacinconeltabacoL8S8Rubisco(Fig.
3cyTabla1),lasmedicionesdeCOfotosintticos2assimilationbajasentodoelMBR
transformaronhojasserealizaronen1%(v/v)O2.Inclusoenestasbajasconcentraciones
deO2presiones,lafotosntesissemantuvolimitadoporMBRactividadentodoelrangode
lahojaintercelulardeCO2presiones(Ci)aprueba(Fig.5a)conlamsaltatasade
asimilacinde2,4moldeCO2fixed.m2.s1medidoenTobMbRK332Edejabajoelintercambio
degasesdelahojaCmsaltaide2000barCO2(Fig.4b).Comoestatasaesmsde10
vecesmslentoqueel2630moldeCO2fixed.m2.s1tasasmedidasenaltaconcentracin
deCO2crecidotiposalvajedeja33TOBMbRK332Ecrecieron~5vecesmslentaqueladetipo
salvajebajoaltoCO2(Fig.5b,c).
Figura5:ElMBRmutadoamejorarlafotosntesisdelahojadetabacoycrecimiento
delasplantasenrelacinconlaproduccindetabacodetiposalvajeMBR.

( Un ) Comparacin de las tasas de fotosntesis de las plantas que crecen en

suelos cuantificadas por medidas de intercambio de gases de la hoja de CO assimilation tasas en 25 C a diferentes intercelular de CO presiones (C ). Que
se muestran son la media de 3 mediciones ( DE) realizadas en 1000 mol quanta
m s iluminacin de fondo de hojas del dosel superior comparables de T plantas
21 2 cm de altura. La L contenido de la Rubisco en las hojas analizadas fueron
cuantificados por C-CABP (el promedio sites.m cataltica mol de unin se
muestra entre corchetes) y confirmado por tincin Coomassie tras PAGE
nativa. ( B ) Una comparacin del crecimiento de los genotipos de tabaco
transplastmicas despus de 180 das en alta concentracin de CO destacando el
crecimiento ms rpido de la Tob
y Tob
plantas en relacin con los
Tob controles, aunque ms lenta que ( c ) el 40 da viejo del tabaco de tipo
salvaje. pce, despus de la aparicin de los cotiledones.
2

-2

-1

10

14

MBR-E138V

MBR-K332E

MBR

imagen a tamao completo

LasdiferenciasrelativasenlahojadeCO2tasasassimilationdecadagenotipo
transplastmica(Fig.5a)secorrelacionconsutasadecrecimiento(Fig.5b).Los
TobMbRK332Eplantascrecanmsrpidamenteyalcanzaronlamadurezfrtilantesdequelos
TobMbRE138Vlneas,mientrasqueelcrecimientodelostobMBRcontrolessedeterioraron
considerablemente(Fig.5b).ElcrecimientomsrpidodelosTobMbRK332Eplantascontrasta
conlasmejorespropiedadesdecarboxilacindelMBRE138VconrespectoalMBR
K332E(Tabla1).Estadiscrepanciapuedeseratribuidaalosnivelesde~50%msbajosde
MBRE138VproducidosenTobMbRE138VdejarelacinalosnivelesproducidosenMBRhojas
comparablestantodelaTobMBRyTobMbRK332Egenotipos(Fig.5A).Laidentificacindesila
mutacinE138Vimpidelatraduccin,labiognesisy/oestabilidaddeMBRpermanecea
ensayar.

LaubicacinestructuraldelaE138Vymutaciones
K332EenelMBR
ElanlisisfilogenticodeMBRrevelaquecompartehomologadesecuenciamsestrecha
conR.rubrumFormaIIRubiscoqueotrosRubiscoarqueas(SupplementalFig.
2)26.EstosalineamientosmostraronqueelE138yK332enelMBRsealineanconA134y
E331enR.rubrumRubiscoyR134yE324enelT.kodakorensisarqueasL10Rubisco(Fig.
6a).ComosemuestraenlaFig.

6b,A134enelR.rubrumL2estructuracristalinaes
solventeexpuestaysituadadistilalsitioactivo.EncontrasteR134enelT.kodakarensisL10
deestructuraesunodelosdiezaminocidosqueformanunaredaltamenteinicaentre
dmerosadyacentes(esdecir,encadaL2L2interfaz)27.
Figura6:AnlisisestructuraldelacatlisismejorademutacionesenelMBR.

( Un ) Alineacin de MBR, R. rubrum ( Rr ) y T. kodakorensis ( Tk secuencias de la

subunidad grande) Rubisco colindantes los sitios de mutacin E138 y K332 en
MBR. Slo se muestran los aminocidos que difieren de MBR. Estructura
secundaria de informacin es relativa a la de Tk L Rubisco 27 . ( B ) Localizacin
de los residuos mutados en R. rubrum L Rubisco (A134 y E321: AP 9RUB)
y Tk L Rubisco (R134 y E324: AP 3A12) se destacan en cian. Rr L-subunidades
estn sombreadas de color rojo y verde, sitio activo unido RuBP o CABP en
amarillo. En el Tk estructura R134 est situado en el L -L de interfaz
(diferencialmente de color rojo y azul). E321 y E324 se encuentran dentro de la
zona flexible bucle 6 en tanto Rr yTk Rubisco, respectivamente. Diagramas
construyen utilizando PyMOL.
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imagen a tamao completo

EntantoR.rubrumyT.kodakorensisRubisco,laE331yE324correspondienteresiduosse
encuentrancercadelabisagradelaestructuraconservadabucleflexible6delaCterminal
/barril(Fig.6b).Unglutamatoenestaposicinenelgiro6estaltamenteconservada
entrefotosintticaL8S8isoformasRubisco(porejemploE336enplantascomoeltabaco,el
E339enalgasrojascomoGriffithsiamonilis)yseencuentraenlascercanasdelacataltica
deresiduosK334estrictamenteconservada(tabaconumeracinRubisco)cuyainteraccin
conlaRuBPyelsustratogaseosodelacadenalateralsondeterminantescrticosdela
eficienciacataltica(esdecir,kgatoCySC/S)10.Latasaderotacincatalticaaumentodela
eficienciaylacarboxilacindeMBRK332E(Tabla1)implicanunglutamatoenesta
posicinenelgiro6sepuedenbeneficiardeRubiscolacatlisisenlosorganismos
fotosintticos,peronosuponenningnbeneficioparaelpapelnophotosynthticdearqueas
Rubisco.

Discusin
lnosdemuestrandeformanicaelpotencialdeevolucindirigidausandolaseleccin
RDEparaentregarconxitolasformasmseficientesdelano
fotosintticaM.BurtoniiarqueasRubisco(MBR).LasmejorasderivadasdeCO2fixation
velocidad,CO2affinityyespecificidadparaelCO2delasenzimasmutantesMBRE138V
yMBRK332EevolucionadotraducidosaapoyaratasasmsrpidasdeCO2asimilaciny
elcrecimientoeneltabacoenrelacinconlosTobdecontrolMBRproduccindetiposalvaje
genotipoMBR.Estehallazgoproporcionalaprimerapruebadeconceptoquedirigela
evolucindelanofotosintticaRubiscoenE.colipuedeentregarmutantesconmejorasen
todoslosparmetroscatalticosnecesariosparaestimularlafotosntesisenloscloroplastos
delashojas.Estocontrastaconelxitoanteriorenlaevolucindemutantesmejorados
catalticasdecianobacteriasRubiscoque,obienmostrarslomarginal(<5%)mejora
generaldelacatlisis24ounamejorasignificativa(>50%)enlaeficienciadecarboxilacin
quevinieronaexpensasdeunaumentoparalelonodeseadoseninhibidoradelaeficiencia
deoxigenacin11.UnretoadicionalconcianobacteriasL8S8Rubiscoessupotencial
biognesislimitadaenloscloroplastosdetabaco(~10%detiposalvaje34)encomparacin
conelMBRL10queseproduceen~2550%deltabacodetiposalvajeRubisco(Fig.
3c).LaaltasolubilidadyelxitoglobalconlaevolucindelacatlisisMBRinspira
esfuerzocontinuadoevolucionandoalolargodelastrayectoriasevolutivaspropiedadesque
mejorananmssupotencialfotosinttico.
ExploracindelespaciodesecuenciasRubiscohaciamutacionesquemejoransueficiencia
enlasplantasdecultivoesundesafopermanente13.Nuestracontinuaincapacidaddespus
de50aosdepredecirracionalmentequcambiosdesecuenciapuedenmejorarlafuncin
Rubiscodiriginuestraatencinhaciaelpotencialdeevolucindirigidaparaexplorar
Rubiscosecuenciaespacioparalamejoradelacatlisis.Unrequisitocomndelosestudios
deevolucindirigidadexitoeslaidentificacindeunpuntodepartidaadecuadoparael
sistemademutagnesisyseleccinapropiada14,17,35.Lafacilidadconlaquelas
actividadescarboxilasadeMBRsepodranmejorarporcambiosdeaminocidos

individuales(Tabla1)probablementesederivadelmismoquetienelaespecializacin
sometidoaunpapelmetablicoalternativadurantesuevolucinnofotosinttica29.Esto
implicaquearqueasRubiscopuedeocuparunaposicinalternativaparafotosinttica
Rubiscodentrodelpanoramadelaevolucindeladiversidaddelespaciodesecuenciasen
relacinconlacatlisis.Enconsonanciaconesto,arqueascatlisisRubiscoesnormalmente
distintaconrespectoalocontemporneo(fotosntesis)Rubisco26.ArqueasRubiscopuede
sostenerfuncionalidadatemperaturasextremas,enlasquetermotolerantescrecerarqueas,y
muestranlaafinidadaumentadaparaRuBPnecesariaparametabolizarlosnivelesfinitos
realizadasduranteelmetabolismodenucletidos29.Lacompensacindeestas
caractersticasbeneficiosas,arqueasRubiscomuestranunabajakgatoCySC/S26.Mejorar
nuestracomprensinfundamentaldelascaractersticasestructuralesquedeterminanesta
cinticanoconvencionalesrequiereunestudiomsexhaustivodelaestructuradearqueas
Rubisco,cataltica,yladiversidaddesecuencias.
Losmritosdelaprotenaevolucindirigidaseilustranporlosmuchosejemplosdexito
alterarlasolubilidaddeprotenas,mejoradelacatlisis,inclusopermitiendopromiscua
funcincataltica12,14,15,17.Estosresultadossuelenrequerirmltiplesrondasde
mutagnesisygraduales.ParaMBR,sehizounintentoparaseleccionarmutantesde
segundageneracinconactividadmejoradautilizandounabibliotecacombinadadeepPCR
mutadombgenesquecodificanRMBR,MBRE138VyMBRK332E.Nohaymutantes
MBRsedetectaronquepermitilasupervivenciaRDEMM1PRKbajoaltainduccinPRK
(esdecir,0,2%w/varabinosa).Losobjetivosfuturossonexaminarlaviabilidaddela
capturadelaepistasisdelespectrodelaprimerageneracinMBIIgenesmutantesL(Tabla
Suplementaria1)utilizandounenfoquebarajadoparaidentificartrayectoriasadaptativas
quemejorananmsMBRcatlisis.Elxitosinembargodependedelpotencialepistatic
positivoparalaevolucindelaactividaddelacarboxilasadeMBRylacapacidaddeevitar
oeludirmutacionesbeneficiosasquepuedanproducirefectosdesestabilizadoressobrela
estructurayfuncin.Talesincertidumbressoncomunesalosestudiosdelaevolucinde
protenasdirigidas.Pronsticodelamedidaenquelasmutaciones(atravsdeinteracciones
decidoaminodistanciadirectaolarga)influyenenlastrayectoriasevolutivasartificiales
siguesiendoimpredecible36.
Unobstculoimportanteeslarelativamentebajafidelidaddelaseleccinylaproduccin
delMM1PRKsistemadeseleccin20.Lafrecuenciadexitoenaplicacionesdeevolucin
dirigidadependedelaseleccindelabibliotecarendimientoylasensibilidaddelsistemade
seleccinparadetectarunrasgodeseado14,15.Ladependenciayelrendimientodelas
cepasdeRDEexistentessufrendealtasfrecuenciasdefalsospositivosquesurgen
tpicamenteatravsdemutacionesdeescapePRKtransposnasociada11,12.Aunquees
relativamenteinmunealosfalsospositivos,laMM1PRKrendimientoseleccinRDEseve
impedidaporelrequisitodebajatemperaturadecrecimiento(25C),faltadeeficaciadela
transformacin,yredujolaviabilidadcelularcomoresultadode
ladiferenciaAmutacin20.LamejoradelafidelidaddelaseleccindelossistemasRDE
tanto,esfundamentalparalaevolucinulteriorMBR,yotrasisoformasRubisco,con
mejorespropiedadesfotosintticas.UnasolucinpodraserladeatarPRKconunaprotena
deresistenciaalosantibiticosenunacepadeRDEevitandoaslaseleccinde"PRK
silenciado"falsospositivosyaquetalesmutacionestambinrenuncienresistenciaalos
antibiticos.

LaevolucindeadaptacindearqueasRubiscoinvitrohaciaunoqueesmseficienteque
laplantadecultivoL8S8enzimasessindudaunretoalargoplazosignificativa,mucho
tiempo.AdiferenciadeL8S8Rubiscodelasplantasylasalgas,losrequisitosde
plegamientoyensamblajedearqueasRubisco,comoMBR,secumplenenE.coli(Fig.
1c)26,27,29.EstapropiedadrefuerzalaidoneidaddearchaealRubiscoparaidentificar
mutantesquemejoranlacatlisisutilizandocepasRDE,yaquerestringelaseleccinde
mutacionesquepotencianlasolubilidad,unresultadoquehadominadolosestudiosde
evolucindirigidaconcianobacteriasL8S8Rubisco11,12,22.Lasusceptibilidaddearqueas
RubiscoparalaspruebasdemutacinenE.coliyahademostradosertilparademostrar
cmolaincorporacindesecuenciadeRubiscoespinacasenT.kodakarensisL10Rubisco
puedemejorarkgatoC27.LamejoradelacatlisisdearqueasRubiscopordiseoracionalo
evolucindirigidaounacombinacindeambos,portanto,planteavasfuturoviablellevara
cabo,especialmenteteniendoencuentanuestraconclusindequeestosbeneficiosse
puedentraducirdirectamentealamejoradelafotosntesisdelashojas.
Comoseindicaenlafigura.

6,lassecuenciasprimariasdearqueasRubiscosonmuy
diversosysusestructurasdeoligmeroscomoL2oL10aparecevariable.Sibienelanlisis
deespectrometrademasasinfiereunamaduraL10estructuracuaternariadeMBR26nose
sabesiformaunaestructuratoroidalcomparableaT.kodakarensisarqueasRubisco(PDB:
1GEH),enparticular,yaqueslocompartenel36%dehomologadeaminocidosyMBR
contieneunanoveladeinsercinde11aminocidosensudominioC26.Losesfuerzosen
cursosecentranenlaresolucindelasestructurascristalinastantoparaL2yL10MBRpara
entendermejorladiversidadestructuralentrearqueasRubisco,ascomoayudarainterpretar
cmolasmutaciones,comoE138VyK332E,funcionalmenteimpartencambiosenla
catlisis.

Materialesymtodos
Laevolucin,expresinypurificacindeMBRenE.coli
ElMBIILgendePhuembiiL26seclonenpTrcHisBusandoNcoI/HindIIIyelplsmido
resultantepTrcMbRutilizcomomoldeparamutaraleatoriamenteelMBIILporPCR
propensaaerrores(epPCR)comosedescribe20.LosproductosdePCRseclonaronen
pTrcHisByladiversidaddelaMBIIbibliotecaLmutantecalculadoutilizandopedel
AA37.LabibliotecasetransformenlaRubiscodependienteE.coli(RDE)cepa
MM1PRKycrecidobajodiferentescondicionesselectivasdeacuerdoconla20.Los
mutantesMBIILgenesdelascoloniasdecrecimientomsrpidoseclonaronenel
plsmidodeexpresindelaubiquitinamarcadacon6xhistidinePhueycadaMBRafinidad
isoformapurificadaporcromatografadeafinidaddemetalinmovilizado(IMAC)comose
describe26.

transformacindeplastomadeltabacoyelcrecimiento
Ungensinttico,mbR,quecodificalaM.BurtoniiRubiscoconysinmutacionesde
codificacinE138VosustitucionesK332EfuesintetizadoporGenScript.Elusode
codonesdembRsecorrespondaconeltabacorbcgenLysesustituyelasecuencianativa

Nterminaldecodificacin(MSLIYEDLV)conladelRubiscogrande(L)subunidadtabaco
nativo(MSPQTETKASVGF).Los1.418pbmbfragmentosdegenesRseclonaronenNheI
/SalcortpLEV432paraproducirlatransformacindeplsmidosplastomapLEVmbR,
pLEVmbRK332EypLEVmbRE138VytransformadosendiezcmTRLhojaspor
bombardeobiolstico31.Independentlneastransformadaspositivamentelaproduccinde
L10MBRseidentificaronporPAGEnodesnaturalizante(PAGEnativa)26ydoslneas
independientesparacadagenotipoMBRsehicieroncrecerhastalamadurezenelsueloen
unacmaradecrecimientoconelairesuplementadocon2,5%(v/v)CO230.Lasfloresde
lasfrtilesT0plantasfueronfertilizadasconpolendetiposalvajeylasemillagerminadaen
cultivodetejidosenmediosdemedidarelativadepredictibilidadsuplementadascon0%a
3%(w/v)desacarosa30.ElgerminadoT1progeniesetransfiricuidadosamentealsueloy
elintercambiodegasdelahojaylabioqumicacelulardecercadehojastotalmente
expandidasenposicionescomparableseneldoselsuperioranalizadacuandolasplantaseran
de2025cmdealtura.

LosanlisisdeADN,protenasyPAGE
ADNgenmicodelahojatotalfueaisladoutilizandoelDNeasyKitycebadoresPlant
MiniLSHyLSE(Fig.3a)utilizadosparaamplificarporPCRylasecuenciadelaregin
deplastomatransformadoencadagenotipodetabacocomosedescribe32.Serealizla
preparacin,lacuantificacin(contraBSA)deprotenadehojasolubleyanlisisporSDS
PAGE,PAGEnativayanlisisdeinmunotransferenciacomosehadescrito38.

contenidodeRubiscoycatlisis
LastasasdeRubisco14CO2defijacinserealizaronutilizandoextractosdeprotenas
solublesaisladosdebacteriasodeprotenadelahojaen50mMHEPESNaOH(pH7,2o
8,0)quecontienetampndeextraccincomosehadescrito30.Seutilizextractode
protena(20l)parainiciarlaactividaden0,5mldeensayosrealizadosen7mlvialesde
centelleodeseptotope38.Cadamuestrasemidiporduplicadoendiversas
concentracionesdeNaH14CO3(067mM)yO2(0,2,y5%(v/v))paracalcularlatasa
mximadecarboxilacin(VC)ylaconstantesdeMichaelis(Km)paraelCO2(KC)y
O2(KS)38.Latasaderotacincarboxilacin(kgatoC)secalculdividiendoVCporlos
sitiosactivosdecontenidoRubiscocuantificadospor[14C]2CABPunin30.Rubisco
CO2/O2especificidad(SC/S)ylaKmparaRuBPsecuantificaroncomoseha
descrito38utilizandoMBRpurificapartirdeE.coliporcromatografadeafinidadcon
metalinmovilizado26olashojasdetabacomedianteintercambioinico30.

Anlisisdelcrecimientoylafotosntesis
Todaslasplantassecultivarona25Cenunacmaradecrecimientotalcomose
describe30envirtudde20050molquanta.m2.s1enairequecontiene2,5%(v/v)
CO2.Unavezaproximadamente21cmdealturalastasasdefotosntesisdelahoja(A)en
la5hojadecubiertasuperiorsemidieronusandoun6400LIsistemadeintercambiode
gasesXT(LICOR)adiferentesatmosfricasdeCO2presionesparciales(Cuna;502000
ppm)aunahojatempladaconstantede25Cy1,000molquanta.m2.s1.El"ACi"

mediciones(Ci,dehojaintercelulardeCO2niveles)serealizaronaconcentracionesbajas
deO2presionesparciales(1%(v/v)deO2enN2)paraobtenermedidasadecuadasdeA.