Universidad Norbert

Wiener
Escuela Acadmico Profesional
de Tecnologa Mdica

Facultad de
Laboratorio Clnico y
TCNICAS
MICOLGICAS
PARA
EL
DIAGNSTICO MICOLGICO DE LAS
MICOSIS SUPERFICIAL Y CUTNEA QUE
AFECTAN AL HOMBRE, EMPLEANDO
PROCEDIMIENTOS
MICROBIOLGICOS
ESTANDARIZADOS CORRESPONDIENTES
PARA CADA CASO E INTERPRETANDO
ADECUADAMENTE
LOS
RESULTADOS
OBTENIDOS.

PRODUCTO N 1
Curso:
Integrantes:

Micologa

Docente: Lic. TM. Roberto Rojas

Len

Arias Guzman , Evelyn

Hurtado Quispe, Melina
Palpa Gomez , Jesica
Paz Alvares Miguel
Ramirez Martines Amparo
Tr u j i l l o M u c h a , M i l a g r o s
Ciclo: LC8N2

INDICE

2016-II

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FACULTAD DE LABORATORIO CLINICO ANAT. Y PATOLOGIA
ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA
Micologa

INTRODUCCION
4
OBJETIVO
5
MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTNEAS
1. Concepto
6
2. Clasificacin de micosis superficiales y cutneas
3. Procedimientos para obtencin, transporte y conservacin de muestras
7
3.1 Toma de mx estandarizada
7
3.2 Toma de muestra para diagnstico de micosis superficiales y
cutneas
8
a. Escamas
8
b. Pelos
9
b.1 En la piedra blanca o piedra negra
9
b.2 En las tias microspricas (M. canis)
9
b.3 Kerion de Celso
9
b.4 En las tias tricofticas antropoflicas
9
b.5 En la tia favosa
c. Uas
10
c.1Onicomicosis distal y lateral subungueal
10
c.2 Onicomicosis proximal subungueal
10
c.3 Onicomicosis blanca superficial
10
c.4 Onicomicosis distal y lateral con paroniquia crnica
10
c.5 Onicomicosis distrfica total
10

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Micologa

4 Procedimientos para el diagnstico micolgico

11
4.1

Examen

microscpico

12
4.1.1 Examen directo
a
Hidrxido
12
b

de

potasio

azul

12
c.

de

(KOH)
Albert

Tinta

china

12
d.

Fluorescencia

12
d.1Microscopa
13
d.2

con

Campo

Microscopa

de

Brillante
Fluorescencia

13
4.1.2.

Coloraciones

14
a.

Coloracin

14
b

PAS

Coloracin

14
c.

Giemsa

Coloracin

Gram

de

cultivo

14
4.2.

Medios

15
a.

Agar

Sabouraud

dextrosa

15
b. Agar Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol( mycosel)
15
c.

Agar

15
d.
16
e.

aceite

Agar
Agar

de

DTM
Dixon

oliva
(dermatofitos)

modificado

(Dxn)

17
5.

Cultivo

de

dermatofitos

18
6. Descripcion de colonias y microscopia de los diferentes dermatofitos
19

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7.

Identificacin

de

Malassezia

furfur

20
A. Objetivo
20
B. Consideraciones

generales

20
C. Identificacin

de

Malassezia

furfur

20
1)

Morfologa

20
2)

de

las

Examen

colonias
microscpico

20
2.1
21
2.2
21
2.3

Prueba
Asimilacin
Desarrollo

de
del

la

tween
a

20,

diferentes

40,

catalasa
60

80.

temperaturas.

21

INTRODUCCION
4

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Durante las ltimas dcadas, el aumento en la prevalencia de las

infecciones fngicas ha sido constante, relacionado fundamentalmente con
el incremento de pacientes inmunocomprometidos y con el uso generalizado
de antimicrobianos, la utilizacin de inmunosupresores, maniobras
diagnsticas invasoras y la implantacin de alimentacin parenteral. Junto a
estas micosis invasoras, que podramos llamar oportunistas, coexisten otras
micosis, que podramos considerar primarias, causadas por hongos muy
adaptados para la supervivencia en los tejidos infectados. Algunas de ellas
se comportan como micosis profundas, y se caracterizan porque se
distribuyen en determinadas zonas geogrficas, donde resultan endmicas.
Otras, ubicuas, se caracterizan por afectar a piel y mucosas: se trata de las
dermatomicosis y candidosis de las mucosas.
Con menos frecuencia, se encuentran las micosis subcutneas,
caracterizadas por la agresividad local y poca tendencia a la diseminacin a
distancia, y que suelen contar con antecedentes traumticos que justifican
la inoculacin del hongo.
El cultivo sigue siendo el gold standard del diagnstico microbiolgico, ya
que permite la identificacin del agente etiolgico y la realizacin del
estudio de sensibilidad. Sin embargo, no est exento de inconvenientes: la
necesidad de obtener muestras por mtodos invasores, la posible
contaminacin de la muestra, su dificultad para diferenciar fcilmente entre
infeccin y colonizacin, la baja sensibilidad que presenta y su lentitud para
el diagnstico.
En la ltima dcada se han desarrollado varios mtodos para realizar
pruebas de sensibilidad in vitro a los antifngicos. Estas tcnicas han
mostrado una buena reproducibilidad inter-laboratorio y cierta capacidad
para detectar la resistencia in vitro a estos frmacos, por lo que la mayora
de los expertos creen que las pruebas de sensibilidad a los antifngicos
tienen utilidad clnica. Existen varios mtodos de referencia para realizar
estas pruebas con levaduras y con hongos filamentosos. Los ms difundidos
son los del CLSI estadounidense (Clinical and Laboratory Standards Institute,
antiguo NCCLS), aunque otras sociedades e instituciones tambin han
desarrollado mtodos de referencia, como el EUCAST, European Committee
on Antibiotic Susceptibility Testing perteneciente a la Sociedad Europea de
Microbiologa Clnica y Enfermedades Infecciosas (ESCMID).
Las pruebas de sensibilidad a los antifngicos estn basadas en las tcnicas
de microdilucin en caldo, que se desarrollaron para conocer la actividad in
vitro de los antibacterianos. Estas tcnicas determinan la CMI
(concentracin mnima inhibitoria), que se obtiene calculando porcentajes
de inhibicin respecto a un control de crecimiento. Los estndares incluyen
recomendaciones para la conservacin, la preparacin y la interpretacin de
las pruebas, as como un sistema para controlar la calidad de los resultados.
La introduccin de estas tcnicas produjo un cambio cualitativo en los
estudios de sensibilidad a los antifngicos. Por primera vez se dispona de
mtodos reproducibles para detectar la resistencia in vitro a estos
antimicrobianos, por lo que se poda evaluar su utilidad clnica. La
aplicabilidad prctica de una tcnica de determinacin de sensibilidad
reside en la fiabilidad de sus resultados; si estos no son reproducibles no
pueden establecerse puntos de corte que guen las recomendaciones
teraputicas.

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Adems, la aparicin de estos estndares ha permitido disear y validar

varios mtodos de difusin en agar y tcnicas comerciales para realizar
pruebas de sensibilidad a los antifngicos, que pueden utilizarse para
detectar la resistencia a los azoles, particularmente la resistencia a
fluconazol en levaduras, que es el reto asistencial ms destacable en este
campo. En el presente documento tambin se describen los procedimientos
de referencia ms utilizados en la actualidad para realizar estas pruebas de
sensibilidad. Adems, se recogen las tcnicas comerciales que se podran
utilizar, dada su buena correlacin con los mtodos de referencia.

OBJETIVOS
Establecer los procedimientos de laboratorio para realizar el aislamiento e
identificacin de las principales micosis superficiales y cutanea desde la
obtencion de muestra hasta el aislamiento del agente causal. Los generos
de
la
especies
productoras
de
dermatofitosis
son:
epidermophyton,Microsporum, y trycophyton.

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MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTNEAS

1. CONCEPTO
Las micosis superficiales son infecciones muy prevalentes, en particular en
los trpicos. Las principales son las dermatofitosis o tineas o tias (capitis,
corporis, cruris, barbae y pedis, es decir, de la cabeza, del cuerpo, de la
pierna, de la barba y del pie, respectivamente), producidas por
Trichophyton, Epidermophyton y Microsporum, las candidiasis superficiales
(Candida albicans y tropicales), la pitiriasis versicolor (Malazessia furfur) y
las onicomicosis.

2. CLASIFICACION DE MICOSIS SUPERFICIALES Y

CUTNEAS
La clasificacin considera a las micosis superficiales y a las cutneas dentro
de un mismo grupo, tomando en cuenta que el agente causal sea parsito
de la queratina (Queratomicosis) o que forme ndulos duros, blancos o
negros sobre el pelo (Pilonodosis). Dentro de las micosis superficiales es
frecuente estudiar la candidosis mucocutnea crnica, causada por la
levadura Candida albicans. Esta levadura habita como comensal en el tubo
digestivo superior (boca, esfago, etc) del hombre y otros animales y bajo
ciertos factores predisponentes se hace patgena al invadir y colonizar los
epitelios pluriestratificados hmedos de la boca, vulvo-vagina, conducto
auditivo externo, pliegues cutneos etc, y tiende a diseminarse por todo el
organismo al hacerse oportunista

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3.

CLASIFICAC
ION DE
MICOSIS

SUPERFICIALE
S

ENFERMED
AD

AGENTE
ETIOLOGIC
O

Tia (pitiriasis
versicolor)

Malassezia sp.

Tronco, cuello,
cara, brazo.

Piedra negra
(tia capitis)

Piedraia
hortae

Cuero
cabelludo,cejas,
pestaas

M. canis

CUTANEAS

Micosis no
clasificables
Micosis
oportunistas

LOCALIZACION

Piedra blanca
(Tia barbae)

Trichosporon
beigelii

Barba, bigote

Tia negra
(tinea nigra)

Exophiala
werneckii

Palma de las
manos y planta de
los pies.

Dermatofitosis
( Tias
corporis)

Microsporum
sp.
Trichopyton
sp.
Epidemophyto
n Floccosum
T. rubrum

Queratomicosi
sy
onicomicosis
no
dermatoftica

Fusarium sp
Aspergillus sp

Candidiasis
mucocutaneas,
candidiasis
mucicutanea
crnica

Candida
albicans

P
R
O
C
E
D
I
M
I
E
N
T
O
S

Cabeza, Barba
cuerpo, manos,
pies, uas,ingle

Mucocutaneas

PARA OBTENCIN, TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE

MUESTRAS
Un adecuado proceso de obtencin de especmenes clnicos permitir el
establecimiento definitivo del diagnstico por parte del laboratorio al
recuperar e identificar al agente etiolgico. Todas las muestras deben de
transportarse en recipientes hermticos que impidan la contaminacin del
personal y medio ambiente en caso de derrame.

3.1. Toma de muestra estandarizado

Para optimizar la toma de muestras es necesario:

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Disponer de un protocolo de toma de muestra escrito, actualizado

peridicamente Tomar las muestras aspticamente, utilizando
contenedores estriles, remitirlas al laboratorio antes de las 2 horas y
sembrarlas lo antes posible
La muestra debe recogerse antes de iniciar el tratamiento y siempre
de la parte activa de la lesin cuando se sospechan dermatoficias.
Los hisopos deben ser evitados siempre que la lesin lo permita. Pero
hay muestras (conducto auditivo, boca, faringe, vagina crvix) que
no pueden ser recogidas de otra manera.
En el caso de heridas, drenajes o lesiones superficiales, debe
limpiarse la zona previamente para evitar contaminaciones.
Las muestras de lesiones cerradas y abscesos suelen ser de gran
rendimiento. Deben ser aspiradas con jeringa y aguja y transferidas a
un tubo o frasco estril, prestando atencin a la presencia de
grnulos, si los hubiere en la muestra.
En situaciones que requieran un estudio epidemiolgico, debe
establecerse la necesidad de toma de muestra ambiental, familiar o
en animales.

3.2 Toma de muestra para diagnstico de micosis superficiales

y cutaneas
Las micosis superficiales se limitan a la piel, el pelo y las uas. Otros
procesos que afectan a las capas ms superficiales de la piel son producidos
por bacterias como en el eritrasma
(Corynebacterium minutissimum)
que se estudia clsicamente dentro de la Micologa Mdica y requiere
habitualmente un diagnstico diferencial con las micosis superficiales.

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Limpieza del rea afectada: Antes de realizar la toma de muestra, la

piel, pelos o uas deben limpiarse con etanol (70%) para eliminar la
flora bacteriana o exudacin.
Recoleccin

A. Escamas
En las lesiones descamativas, deben recogerse las escamas de las zonas
afectadas, raspando su borde activo con una hoja de bistur o
sindesmtomo estril, ya que dicho borde es el que ms probablemente
contenga elementos fngicos viables. Cuando existen lesiones satlites
(candidiasis), el raspado se realiza de dichas lesiones por ser las ms
jvenes. El material obtenido se recoge entre dos portaobjetos estriles. El
uso de contenedores estriles de plstico puede tener el inconveniente de
que las escamas se adhieran a sus paredes dificultando su recuperacin.
Los dermatofitos en las muestras de piel, pueden permanecer viables
durante meses. En los intertrigos candidisicos, las lesiones no suelen ser
descamativas sino exudativas, en cuyo caso el material se toma con hisopo
estril seco o hmedo. Si el espcimen no va a ser procesado
inmediatamente, se prefiere el empleo de un hisopo con medio de

transporte (Ej. medio de Stuart) ya que las levaduras pierden rpidamente

la viabilidad en los hisopos secos.

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B. Pelos
Dependiendo del tipo de lesin observada, los pelos deben recogerse
mediante diversas tcnicas:
B.1 En la piedra blanca o piedra negra: Ambas
estn confinadas a la vaina del pelo, por lo que
debe cortarse la porcin suprafolicular de los pelos
afectados.
En las tias del cuero cabelludo o de la barba: es
importante
tomar
los
pelos
parasitados
arrancndolos con la raz intacta, ya que cortarlos
es menos eficaz. En muchas ocasiones los pelos
parasitados se reconocen porque estn rotos,
friables o se desprenden fcilmente con el raspado.
B.2 En las tias microspricas (M. canis): se
reconocen por presentar una placa escamosa
blanquecina con escasa o nula inflamacin, que puede alcanzar varios
centmetros de dimetro, y en el cual se observan pelos rotos a 5-10 mm de
la superficie cutnea, estos pelos parasitados son friables y se arrancan con
facilidad al raspar con el bistur.

B.3 Kerion de Celso: Son las formas supurativas de

tinea capitis, es comn en los nios. Se presentan
como lesiones elevadas, hemisfricas de consistencia
blanda, exhiben muchas pstulas foliculares y al ser
apretadas manan pus por mltiples puntos.
Los
agentes
ms
frecuentes
aislados
son:
Microsporum
canis,
Microsporum
gypseum,
Trichophyton mentagrophytes var mentagrophytes y
Trichophyton verrucosum.

B.4 En las tias tricofticas antropoflicas (T.

tonsurans y T. violaceum), forman pequeas placas
escamosas con pelos de poca longitud, en forma de W
o Z, situados en el espesor de la escama o bien rotos
al nivel de la superficie dando un aspecto de puntos
negros, casi siempre en ausencia de inflamacin.
Estos puntos negros son los que deben extraerse

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con la punta del bistur o mediante pinzas. Sin embargo cuando la infeccin
se debe a especies zooflicas (T. mentagrophytes var. mentagrophytes y T.
verrucosum) se observan placas escamosas de tamao variable, que se
inflaman y se elevan sobre la superficie cutnea, apareciendo numerosas
pstulas foliculares que originan un Kerion. En estos casos cuando las
lesiones son dolorosas en nios puede ser difcil la toma de muestra,
Entonces el uso de un hisopo humedecido sobre la zona afectada puede ser
el nico medio incruento de realizar la toma. Con esta tcnica es posible
obtener resultados positivos, pero resultados negativos no excluyen la
infeccin. Los pelos situados en la placa tienen una longitud variable
pudindose extraer con facilidad sin causar dolor al paciente.
B.5 En la tia favosa (T. schoenleinii) presenta costras amarillentas,
cncavas y centradas por un pelo, denominadas cazoletas fvicas. Estn
formadas por un conglomerado de hifas que originan una foliculitis y con el
tiempo, alopecia cicatricial por destruccin de la matriz. La muestra de
estas lesiones debe ser tomada con ansa.

C. Uas
C.1. Onicomicosis distal y lateral subungueal: La lesin comienza por
el borde libre de la ua y va extendindose hacia la matriz, la sustancia de
la ua se sustituye por un material amarillento y friable, mientras que la
lmina exterior puede estar infectada o destruida. Esta lesin puede
deberse a dermatofitos, Scopulariosis spp o Scytalidium spp. En estos casos,
aparecen uas hiperqueratsicas siendo los alicates especiales para recoger
el material subungueal y cortar trozos de la parte proximal de la ua, ya que
aunque sea la menos accesible, es la que menos se contamina y presenta
elementos fngicos ms jvenes y viables.
C.2 Onicomicosis proximal subungueal: causada por Candida spp,
Fusarium spp o por recidivas de una tinea unguium tratada. Se observa, de
forma caracterstica en pacientes con SIDA. En estos casos, se debe recoger
el material blanquecino de la porcin ms profunda de la tabla ungueal
C.3 Onicomicosis blanca superficial: se manifiesta como una mancha
blanca lechosa en un punto cualquiera de la superficie de la ua que se va
extendiendo progresivamente. Es debida a dermatofitos (T. mentagrophytes,
T. rubrum) u otros hongos miceliares (Acremonium spp., Fusarium spp.,
Aspergillus spp.) Slo en este caso, se raspa la ua en la superficie
afectada.
C.4 Onicomicosis distal y lateral con paroniquia crnica: comienza
con una inflamacin del borde periungueal y termina con la afectacin
lateral de la lmina que aparece plisada. Aunque casi siempre est causada
por Candida spp. en ocasiones excepcionales algn hongo no dermatofito
tambin puede ser el responsable. En estos casos, se recoge el material
ungueal ms cercano a la cutcula, raspando con el bistur en la profundidad
del surco periungueal. Con hisopo o ansa estril se obtiene el pus de la

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paroniquia acompaante tras incisin con lanceta o compresin de la

porcin lateral del dedo.
C.5 Onicomicosis distrfica total: corresponde al estadio final de
cualquier onicomicosis. En estos casos, se debe raspar preferentemente el
material subungueal.

4.

PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICO MICOLGICO

Estas micosis incluyen infecciones muy frecuentes que afectan al estrato
crneo de la piel, a la epidermis y a los anejos cutneos: pelo y uas. Son
infecciones que constituyen una parte importante de las consultas
dermatolgicas y cuyo diagnstico de eleccin sigue siendo el examen
directo y el cultivo de las muestras de piel y anejos cutneos, stas deben
de procesarse de inmediato mediante su inoculacin sobre medios de
cultivo.

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4.1 EXAMEN MICROSCOPICO

Este procedimiento no sustituye al cultivo. Brinda informacin preliminar o
presuntiva al ser una tcnica rpida que puede ser til al clnico y en
algunos casos llegar a ser diagnstica.
Es as, que la presencia de hifas cenocticas en pacientes con cetoacidosis
diabtica puede ser de gran valor para iniciar tratamiento contra posible
mucormicosis. entre los principales exmenes directos tenemos:

4.1.1 EXAMEN DIRECTO

a. Hidrxido de potasio (KOH)
Disuelve rpidamente las clulas permitiendo digerir material proteico,
observando con mayor nitidez los elementos fngicos, su efecto de clarificar
puede incrementarse al calentar a la llama ligeramente la preparacin.

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Adicionalmente, se puede emplear colorantes para pigmentar la pared de

los hongos y mejorar la visualizacin.
La observacin de hifas, permite sugerir la presencia de invasin mictica.
b. Azul de Albert y azul de Parker al 10% en koh al 10%
Son reactivos utiles para observar las estructuras parasitarias de Malassezia
spp., en los casos de pitiriasis versicolor y dermatitis seborreica asociada a
estas levaduras. Las escamas obtenidas en la piel se procesan de manera
similar a las que se someten con KOH.

c. Tinta china
Es un mtodo de contraste. Permite
visualizar la cpsula de polisacrido
de
Cryptococcus
neoformans,
mediante la presencia de un halo
claro y ntido alrededor de la
levadura.
Existen
artefactos
(hemates,
burbujas
de
aire,
leucocitos, gotas de grasa y partculas
de talco) que pueden interferir y
confundir al analista.
La sensibilidad de la tcnica es de 50% en pacientes sin VIH y se puede
incrementar hasta 88% en pacientes VIH con meningitis criptococsica.

d. Fluorescencia
Las tcnicas instrumentales ms
utilizadas son la microscopa de campo
brillante y la de fluorescencia.

d.1 Microscopa con Campo Brillante

El microscopio de campo brillante es
el equipo disponible en la generalidad
de los laboratorios de microbiologa.
La mayora de los hialohifomicetos
(no dematiceos) tiene un bajo ndice
de refraccin por lo que el uso del
contraste de fases ayuda de forma
muy notable en la deteccin de las
estructuras fngicas cuando no se
utilizan colorantes.

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Es una tcnica sencilla que permite la observacin inmediata de la muestra

clnica. En el caso de sospecha de meningitis criptoccica, tomar una gota
de LCR, colocarla entre porta y cubre y examinarla a x400 en un
microscopio de campo brillante. La observacin de levaduras redondas,
algunas de las cuales presentan yemas, es caracterstica de C. neoformans.
Pueden, asimismo, observarse formas capsuladas, hecho que se hace ms
evidente al emplear contraste de fases. Los problemas que presenta la
interpretacin de la visualizacin microscpica directa tienen que ver, sobre
todo con la experiencia del observador, dado que otras formas redondas
que pueden verse en los LCR, como las gotas de grasa o los hemates (ms
habituales en punciones traumticas), pueden confundir a observadores
inexpertos.

d.2 Microscopa de Fluorescencia

Fueron Margarot y Deveze quienes, en 1925, demostraron la utilidad

diagnstica de la luz UV, al comprobar la fluorescencia de los pelos
infectados en casos de Tinea capitis producidas por Microsporum spp. Con la
aparicin de los microscopios de fluorescencia y sus continuas mejoras se
abri una gran puerta al diagnstico y la investigacin biomdica.
Fluorescencia
primaria
o
natural: La capacidad de
determinados
hongos
en
muestras clnicas para emitir
radiacin en el visible tras ser
irradiados
con
luz
UV
(autofluorescencia)
es
conocida desde hace aos,
pero la debilidad de esta
fluorescencia natural la hacen
intil desde el punto de vista
del diagnstico prctico. Sin
embargo,
se
ha
podido
demostrar
una
autofluorescencia importante
en algunos hongos incluidos
en parafina y teidos con
hematoxilina-eosina y de P.
jiroveci
en
preparaciones
teidas con Papanicolaou.
Fluorescencia secundaria: Se basan en la visualizacin de objetos no
fluorescentes tras marcado con molculas fluorescentes. Los
sucesivos desarrollos en equipos, fuentes de iluminacin y la
aparicin de diferentes fluorocromos con dianas diferentes, ha
cambiado radicalmente el escenario de su implicacin en el
diagnstico micolgico. Estos fluorocromos son herramientas de
cribado ideales, puesto que permiten una visualizacin inmediata de

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las dianas fluorescentes, contra un fondo oscuro, an en manos

inexpertas. Hay que distinguir la fluorescencia inespecfica o
quimiofluorescencia, que marca de modo general las estructuras
fngicas (naranja de acridina, rojo Congo y agentes blanqueantes), de
la especfica o inmunofluorescencia que permite la identificacin
especfica de ciertos hongos al conjugar un anticuerpo especfico (poli
o monoclonal) con un fluorocromo (isocianato).

4.1.2 COLORACIONES
a. Coloracin PAS
La tincion PAS es uno de los mtodos
qumicos
mas
empleados
en
histologa.
En la tincin PAS se trata el material
con acido peryodico, que oxida los 1,
2glicoles
formndose
grupos
aldehdo en los glucano y mananos
de las paredes celulares de los
hongos.
Con el reactivo de Schiff, los
aldehdos reaccionan dando un color
rojo luminoso.

Candidiasis

Los fialmentos fngicos, conidias y esporas aparecen rojos o rosas intensos.

El citolplasma que es verde en general adquiere un tinte rosa. Permite la
detecion de hongos en muestras de tejido.

b. Coloracin Giemsa
Esta coloracin se utiliza cuando la
muestra es sangre o puncion de
medula roja de los huesos.
Es de utilidad para el diagnstico de
histoplasmosis,
neumocistosis
y
otras micosis. Permite visualizar
blastoconidias
intracelulares
al
polimorfonuclear, como la fase
tisular del H. capsulatum

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c. Coloracin Gram

Es til para observar blastoconidias y pseudomicelios de las especies del

gnero Candida, Malassezia y Cryptococcus, las cuales son Gram positivas
con variaciones en la intensidad de la coloracin.

4.2 MEDIOS DE CULTIVO

a.

AGAR
DEXTROSA

SABOURAUD

Se le emplea para el aislamiento

primario,
identificacin
y
mantenimiento de la mayora de los
hongos patgenos.
Para mejorar la inhibicin bacteriana
se puede adicionar cloramfenicol 0,5
g/L.
Pesar:

Peptona 10 g
Glucosa 20 g
Agar 20 g
Agua destilada 1000 Ml

Disolver los ingredientes en el agua destilada.

Controlar el pH a 5,6. Esterilizar a 121 C por 15 minutos.
Verter en tubos o placas.

b.

AGAR SABOURAUD CON

CICLOHEXIMIDA
Y
CLORANFENICOL( MYCOSEL)

Es
un medio selectivo utilizado
para el aislamiento de hongos
patgenos a partir de muestras
muy contaminadas con hongos
saprofitos y bacterias. Se utiliza
fundamentalmente
en
el
aislamiento de dermatofitos y
hongos dimrficos. Inhibe algunas

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especies de hongos de inters mdico (Candida no albicans, Aspergillus,

zigomicetos, C. neoformans, etc.).

Control de Calidad
Aspecto: Agar firme, amarillento, transparente.
Trichophyton mentagrophytes: Crece
Aspergillus flavus: Inhibicin parcial o completa
Staphylococcus epidermidis: inhibicin parcial o total

c. AGAR ACEITE DE OLIVA

Pesar:

Agar Sabouraud dextrosa 6,5 g

Tween 80 2 mL
Aceite de oliva 2 mL
Vitamina A 10 gotas Cloramfenicol 0,5 g
Agua destilada 100 mL

Disolver el agar Sabouraud dextrosa en agua destilada.

Agregar los dems ingredientes.
Esterilizar a 121 C por 15 minutos.
Almacenar a 4 C.

d. AGAR

DTM

(DERMATOFITOS)

Medio
utilizado
para
el
aislamiento de dermatofitos en
muestras
muy
contaminadas,
proporcionando una identificacin
presuntiva.
Los
dermatofitos
producen alcalinizacin, virando el
medio de amarillo a rojo. Algunas
bacterias
y
algunos
hongos

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tambin pueden producir alcalinizacin. Debido a que se trata de un medio

coloreado, no es un medio til para la carac-terizacin de los pigmentos
producidos por los dermatofitos. La cicloheximida inhibe muchos de los
hongos saprofitos.

Pesar

Peptona 10 g
Dextrose 10 g
Agar 20 g
Rojo Fenol 40 ml
Cl 0.8 M 6 ml
Cicloheximida 0.5 g ( 500mg. disueltos en 2 ml de acetona)
Sulfato de gentamicina 0.1g ( 100 mg disueltos en 2ml de agua
destilada)
Cloramfenicol 250 mg (disueltos en 10 ml de etanol)
Agua destilada 1000 ml

Disolver la peptona, la dextrosa y el agar en agua. Calentar a BM. Agregar el

rojo fenol agitando. Ajustar el pH con HCl, agitndola agregar la
Gentamicina (Streptomicina), agitando. Fraccionar en frascos de 200 ml.
Autoclavar a 121 C durante 10 minutos. Enfriar a 50 C y agregar el
cloramfenicol. (para 200 ml de medio, 5ml de antibitico). El pH final debe
ser 5.5 0.1.Distribuir a razn de 7 ml por tubo, en tubos de ensayo
estriles. Enfriar en bisel y guardar, listos para su uso, en la heladera.
Solucin Rojo Fenol
Rojo fenol 0.5g
HONa 0.1 N 15 ml.
Agua destilada 100ml.
Solucin HCl 0.8 M
HCl 1N 8 ml.
Agua destilada 2 ml

e. AGAR

DIXON

Modificado

(DXN)
Utilizado
en
el
cultivo
de
Malassezia spp. Puede modificarse
aadiendo cloranfenicol o bien
cloranfenicol y cicloheximida.
Pesar

Extracto de malta 36 g
Peptona 6 g
Oxgall, desecada 20g
Tween 40 10 ml

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Glicerol 2 ml
cido oleico 2 ml
Agar 12 g
Agua deionizada 1000 ml

Calentar bien, disolver todos los componentes, esterilizar a 121 C durante

15 min., distribuir en placas de Petri
Control de Calidad
Aspecto: Blanco amarillento, no muy slido
PH final: 6.0
Malassezia restricta: Crece
En el medio inhibidor
Malassezia restricta: Crece
Aspergillus flavus: Inhibicin parcial o completa
Staphylococcus epidermidis: Inhibicin parcial o completo

CULTIVO DE DERMATOFITOS
El medio utilizado universalmente es el agar de Sabouraud, cuya
composicin es la peptona, la glucosa, el agar y el agua, con un pH cido de
5,5, aproximadamente. Como las muestras suelen estar contaminadas con
bacterias de la flora normal, el medio incluye un antibitico antibacteriano,
el cloramfenicol, y a veces la gentamicina. Para muestras en que se
pretende aislar un dermatfito tambin se agrega cicloheximida, un
antifngico inhibidor de numerosos hongos contaminantes, aunque tambin
puede inhibir especies de levaduras y mohos oportunistas.
Se han descrito otros medios de aislamiento, algunos de los cuales son
diferenciales porque llevan un indicador cromognico ms o menos
especfico. Entre los que se utilizan corrientemente se encuentran el
Dermatophytes test medium (DTM), descrito por Taplin , til para observar
el desarrollo de la mayora de dermatfitos que, al crecer, alcalinizan el
medio y ocasionan un viraje de color amarillo a rojo . Este viraje ha de
valorarse en condiciones concretas, es decir antes de los 7 das de la
siembra, descartando contaminacin por bacterias. Siempre es conveniente
asegurar la identificacin por medio de una observacin microscpica de la
colonia desarrollada. Fuera de estas condiciones, el viraje puede estar
ocasionado por otros microorganismos contaminantes. En las levaduras se
han descrito varios medios diferenciales en los que algunas especies
(Candida albicans y, segn el medio, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei)
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originan colonias que adquieren un color diferente del blanco o el

amarillento, comn a todas ellas . En los cultivos hay que tener presente
que, si bien las levaduras crecen rpidamente en 24-48 h y tambin lo
hacen algunos mohos (Aspergillus, Penicillium, etc.), los dermatfitos tienen
un desarrollo lento y raramente se observan colonias antes de los 4-5 das,
por lo que hay que esperar hasta 3-4 semanas para algunas especies como
T. verrucosum o T. violaceum. Es necesario recordar que la esporulacin y la
pigmentacin que ayudan a identificar las especies de dermatfitos no se
obtienen, en general, hasta transcurrida 1 semana o 10 das de la siembra
(fig. 5).

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DESCRIPCION DE COLONIAS Y MICROSCOPIA DE LOS DIFERENTES

DERMATOFITOS

IDENTIFICACIN DE Malassezia furfur

A. Objetivo
Describir los procedimientos para la identificacin de cepaas de
mMalassezia furfur.
B. Consideraciones generales
Las levaduras de Malassezia furfur por ser lipoflicas, se desarrollan
en medios de cultivo que contengan en su composicin aceites
naturales u otras sustancias grasas, siendo el mtodo ms comn el
cultivo en ASD que contiene cicloheximide o actidione y aceite de
oliva, sin embargo existen medios de cultivo alternativos como el
agar de Dixn que en su formulacin incluye al glicerol mono oleato
que estimula el crecimiento in vitro de la levadura. La identificacin
se basa en comparar caractersticas morfolgicas y fisiolgicas.
C. Identificacin
furfur.

de

Malassezia

1) Morfologa de las colonias

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Se caracterizan por ser redondas de consistencia cremosa y de color

blanco amarillento.

2) Examen microscpico

Se utiliza hidrxido de potasio.

Se observa clulas globosas, elipsoidales a cilndricas que se
reproducen por gemacin.

2.1 Prueba de la catalasa

Consiste en determinar la presencia de la enzima catalasa.
Colocar una gota de perxido de hidrgeno (agua oxigenada)
10 vol. en una lmina portaobjeto y agregar una suspensin de
la levadura.
Positivo: presencia de burbujas.
Negativo: ausencia de burbujas.
2.2 Asimilacin del tween 20, 40, 60 y 80.

Preparar soluciones de 0,1; 0,5; 1; 5 y 10% de tween 20, 40, 60

y 80 en agar peptona glucosa.
(1 y 2%) e incubar a 32 C por siete das.
El inculo se prepara a una suspensin de 107 mL-1 en agua
destilada estril.

2.3 Desarrollo a diferentes temperaturas.

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Se siembra la cepa en el agar de Dixn y se incuba a 32, 37 y

40 C durante siete das.

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