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LABORWELT

Nr. 5 / 2007 - Vol. 8

RNA-Integrität nimmt Einfluss auf quantitative real-time PCR

Expressionsanalyse von Genen ohne Amplifikation

PCR & DNA-Prep

Im Interview:

Arbeitsgruppe Life Science Research

Marktübersicht:

Thermocycler

Hochsensitive Detektion viraler Nukleinsäuren

Schnell und billig:

Nanoliter-PCR

Automatische DNA- Aufreinigung im mittleren Durchsatz

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Zum Thema

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Life Sciences-Firmen bitten um Input

„Wir wollen den Wissenschaftlern eine Möglichkeit bieten, ihre Bedürfnisse, ihre Wünsche an die Industrie zu formulieren und uns wirklich zu sagen, welche Tools fehlen, wo verbessert werden müsste, von Seiten der Industrie, um die Forschung dort schneller voranzubringen.“ Das sagt Dr. Ralf Hermann (Eppendorf AG) im Gespräch mit LABORWELT (vgl. Seite 24). Dass der erst Ende Juli frisch gewählte Vorsitzende der vor einem Jahr offiziell gestarteten ‚Arbeitsgruppe Life Science Research‘ (LSR AG, vgl. LABORWELT 5/06) innerhalb des VDGH es ernst meint, zeigen Planungen mit der Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung (DGPF) gemeinsam einen Workshop zu veranstalten, in dem es genau um diese Fragen gehen wird. Dass LABORWELT dies an dieser exponierten Stelle ankündigt, hat zwei Gründe:

Erstens, weil wir gerne in LABORWELT ein Forum schaffen würden, in dem Wissenschaftler und Unternehmen sich über die dringend benötigten Forschungswerkzeuge verständigen können. Denn der gegenseitige Nutzen scheint klar: Die Unternehmen wollen nicht am Markt vorbei entwickeln, und die Wissenschaftler brauchen

Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter www.biocom.de oder auf unserer Fax-Seite (S. 56). Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen, Name und Adresse angeben und faxen/mailen – Sie erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten.

effiziente Forschungswerkzeuge. Wenn Sie das auch interessant fin- den, bitten wir um Ihre Zuschriften (laborwelt@biocom.de). Denn nur durch Ihr Engagement kann die Chance zum Dialog auch genutzt werden. Zweitens freut sich die Redaktion LABORWELT, mit der LSR AG einen weiteren neuen Partner – diesmal aus der Anwendung – hin- zugewonnen zu haben, der schon 2008 deutlich mehr als 50% des Life Sciences-Forschungsmarktes in Deutschland repräsentieren und gemeinsam mit den Forschungsverbänden für mehr Transparenz bei der Forschungsförderung streiten will. Für die Wissenschaft gilt es, aus der neuen Partnerschaft Nut- zen zu ziehen. Nutzen Sie also die Möglichkeit, zu kommentieren, wünschenswerte Technologieentwicklungen zu formulieren und uns zu schreiben, welche Themenfelder Sie gerne in LABORWELT abgebildet sehen möchten. Übrigens: Wenn Sie die BIOTECHNICA in Hannover besuchen, freuen wir uns, wenn Sie an unserem Stand E12 in Halle 9 vorbei- schauen. Viel Lesevergnügen bei der aktuellen Themenausgabe PCR & DNA-Probenvorbereitung wünscht Ihnen

Thomas Gabrielczyk

DNA-Probenvorbereitung wünscht Ihnen Thomas Gabrielczyk Stilisierte Darstellung der PCR-Amplifikation Montage:
Stilisierte Darstellung der PCR-Amplifikation Montage: Heiko Fritz

Stilisierte Darstellung der PCR-Amplifikation

Montage: Heiko Fritz

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INHALT

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Einfluss der RNA-Integrität auf die quantitative real-time RT-PCR

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Dr. Michael Pfaffl und Dr. Simone Fleige, Technische Universität München

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Schnelle SNP-Diagnostik mit rapid-PCR und Fluoreszenz-Endpunktdetektion

10

Dr. Alexander Berka et al., Analytik Jena AG

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I S S E N S C H A F T

Hochempfindliche PCR-freie Genexpressionsanalyse einzelner cDNAs

13

Prof. Dr. Gerhard Schütz et al., Universität Linz

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L I T Z L I C H T

Einfache, robuste und flexible DNA-Aufreinigung

17

Dr. Tanja Lopez, Promega GmbH, Mannheim

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L I T Z L I C H T

Hochempfindliche Detektion viraler Nukleinsäuren

20

Dr. Herrmann Nieper, LUA Dresden; Dr. Andreas Ockhardt, InVi Tek, Berlin; Dr. Arha Lamberg, Thermo-Fisher Scientific, Vantaa, Finnland

I N T E R V I E W

„Als Verband wollen wir mit der Wissenschaft reden“

24

Dr. Ralf Hermann, Vorsitzender LSR AG; Dr. Thorsten Ebel, Sprecher LSR AG

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L I T Z L I C H T

Schnelle Zyklen und geringe Kosten:

 

Nanoliter-PCR

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Dr. Holger Eickhoff, Scienion AG, Berlin

I N T E R V I E W

„Appleras PCR-Motordeckel-Patent ist nichtig“

30

Dr. Christian Kilger, Vossius & Partner, München/Berlin

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E T Z W E R K

Die nächste Welle an Biotech-Wirkstoffen; Oligonukleotide

32

Dr. Joachim Klein, RiNA-Netzwerk, Berlin

B L I T Z L I C H T

Keine unvorhergesehenen Ereignisse mehr bei PCR und real-time qPCR

24

Dr. Marcus Neusser, Bio-Rad GmbH, München

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A R K T Ü B E R S I C H T

Thermocycler

39

Stellenmarkt

47

Verbände

52

Produktwelt

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Fax-Seite

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Termine/Impressum

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PCR

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Einfluss der RNA-Integrität auf die quantitative real-time RT-PCR

Simone Fleige und Michael W. Pfaffl Lehrstuhl für Physiologie, Zentralinstitut für Ernährungs- und Lebensmittelforschung, Technische Universität München,

Die mRNA-Quantifizierung via real-time RT-PCR (qRT-PCR) findet heute Anwendung in einer Vielzahl molekularbiologisch orientierter Labore. Die Methode birgt allerdings – gerade im Bereich der Prä-Analytik – zahlreiche Fehlerquellen. Vor allem die Messung der RNA-Qualität führt bis dato noch ein Schattendasein. Das führt häufig zu ungenauen Ergebnissen oder zu erheblichen Variationen in den Expressionsergebnissen. Die Op- timierung und Standardisierung der prä- und post-PCR stellen somit eine besondere Herausforderungen bei einer validen mRNA-Quantifizierung dar. Einmal mehr zeigt sich die Gesetzmäßigkeit, dass die Präzision der mRNA-Genexpressionsanalyse durch die Quantität und Qualität des Ausgangsmaterials, der total-RNA, signifikant beeinflusst wird. Die größte Verbesserung verspricht die Optimierung der Probenaufbereitung und die Bestimmung der RNA-Integrität sowie die verbesserte Verrechnung der erhaltenen real-time RT-PCR-Daten.

Die Existenz bestimmter mRNA-Sequenzen ist Ausdruck der Genexpressionsaktivität zugehöriger Gene. Allerdings handelt es sich bei der mRNA um ein relativ instabiles Molekül. In der Zelle wird mRNA ständig aufgebaut und mit Hilfe der Ribonukleasen nach der Translation wieder zerlegt. Dies macht eine besonders aufmerksame Quali-

tätskontrolle der RNA erforderlich. Da die Genexpressionsanalyse von der Extraktion bis hin zu post-qPCR-Applikationen sehr zeitaufwendig und laborintensiv ist, sind auch die Laborkosten ein nicht unbedeu- tender Faktor. Somit ist das Arbeiten mit einer hohen Probenqualität für alle mo- lekularbiologischen und diagnostischen

für alle mo- lekularbiologischen und diagnostischen Abb. 1: Box-Plot der durchschnittlichen

Abb. 1: Box-Plot der durchschnittlichen RNA-Integritätsnummer (RIN) boviner Gewebe und Zelllinien (= rechte fünf Gewebe). Analyse der RNA-Qualität mit dem Bionalyzer 2100.

Kennziffer 12 LW 05 · www.biocom.de

Anwendungen wünschenswert. Vor allem vor der Anwendung der quantitativen RT- PCR oder vor Array-Applikationen sollte die Integrität der RNA deshalb überprüft werden.

RNA-Analytik

Konventionelle Methoden der RNA- Analytik zeigen häufig das Problem der Sensitivität oder Spezifität gegenüber einzelsträngiger RNA. Zudem werden einige Methoden stark beeinflusst durch Kontaminationen oder Verunreinigungen des Probenmaterials 1 . Unterschiedlichste Methoden für die Qualitätsbestimmung stehen zur Verfügung: die klassische Mes- sung der optischen Dichte (OD), die mo- derne OD-Messung mittels Nanodrop, die altbekannte Agarose-Gel-Elektrophorese oder die innovative Lab-on-Chip-Techno- logie 2,3 . Um die Qualität und die Quantität der extrahierten RNA zu testen, empfiehlt es sich, die RNA-Integrität mittels Kapil- largelelektrophorese zu überprüfen. Die Kapillargelelektrophorese ist in den letzten Jahren auf ein immer größeres Interesse gestoßen, vor allem in Hinblick auf die Bedeutung der RNA-Integrität. Sowohl der Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) als auch der Experion (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA,) bieten die Möglichkeit einer schnellen und sensitiven RNA-Qualitätsbestimmung via Lab-on-Chip im pg-Bereich. Die sogenannte RNA-Integritätsnummer (RIN) stellt ein Qualitätslabel dar, das von Agilent Technologies und Quantiom Bio- informatics entwickelt wurde. Bei diesem System wird der RNA-Qualität ein Zahlen- wert, der RIN-Wert, zugeordnet. Auf Basis der ribosomalen Untereinheiten 28S- zu 18S-rRNA und deren Verhältnis sowie de- gradierten Abbauprodukten wird von der Software ein RIN-Wert auf einer Skala von 1 bis 10 ermittelt. Dabei entspricht 1 einer vollständig degradierten RNA und 10 einer völlig intakten RNA. Mit der RIN-Skala hat sich inzwischen ein weltweiter RNA-Quali- tätsstandard entwickelt.

Sorgfältige Probennahme und Aufbereitung – das A und O

Die Probennahme stellt in der medizinischen und veterinärmedizinischen Forschung fast immer ein Problem dar. Oft werden Proben von Menschen oder Tieren mittels Biop- sie entnommen, oder die Gewebeproben stammen von inhomogenen Tieren vom Schlachthof. Zudem ist die Integrität der Probe sehr stark vom beprobten Gewebe abhängig 3 . Bessere RNA-Integritätswerte

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 B L I T Z L I C H T Abb. 2: Regression der Genexpressionsdaten

Abb. 2: Regression der Genexpressionsdaten (Ct) aus einer bovinen Corpus luteum-Zellkultur versus RIN. Alle vier Gene wurden durch die RNA-Integrität signifikant beeinflusst (P<0.001).

(RIN 8-10) werden im Gegensatz zu den endogenen Geweben bei Leukozyten (WBC) oder diversen Zelllinien erreicht (siehe Abb. 1). Probennahme, Zellaufschluss und RNA-Extraktion sind bei Zellkulturen und Blutproben schneller und einfacher zu be- werkstelligen 3 . Gewebe mit einem höheren Anteil an Bindegewebe und/oder Fettgewebe, einer erhöhten Enzymaktivität oder durch er- schwerte Bedingungen bei der Probennahme können eine hohe Variabilität der RIN-Werte erklären. Die recht schnelle Degradation der RNA durch den Abbau post mortem oder durch inadäquate Probenbearbeitung und Lagerung ist bei der Probennahme und bei allen weiteren Applikationsschritten zu berücksichtigen 4 . Wegen der Notwendig- keit eines Waschvorgangs, zum Beispiel bei Darmproben in physiologischer NaCl- Lösung, spielt auch der Zeitfaktor eine bedeutende Rolle. Auch ist die schnelle La- gerung in flüssigem Stickstoff oder in RNA- stabilisierenden Agenzien ist nicht immer optimal gewährleistet. Des Weiteren haben die RNA-Lagerung sowie die Extraktionen aus Formalin-fixierten Geweben einen mas- siven Einfluss auf die RNA-Quantität und -Qualität und somit auch auf die folgende quantitative mRNA-Analytik. In der Praxis ergeben sich zudem große Schwankungen in der RNA-Quantität und Integrität bei der Anwendung unterschiedlicher Extraktions- methoden. Meistens finden flüssig-flüssig- Extraktionen oder auf Säulen basierende RNA-Extraktionssysteme Anwendung, die sich aber in Effizienz und Qualität der RNA

von Labor zu Labor unterscheiden. Um Fehl- interpretationen zu vermeiden, kommt es bei klinischen Untersuchungen mit begrenzter Menge an Probenmaterial entscheidend auf die genaue Qualitätsanalyse des RNA-Aus- gangsmaterials an 5 .

Einfluss der RNA-Integrität auf die qRT-PCR

Die fluoreszenzbasierte real-time PCR ist ein wichtiges Werkzeug in der Wis- senschaft, der molekularen Medizin und Pharmakologie sowie der Biotechnologie. Die Verfahren sind, einmal etabliert, ein- fach durchzuführen. Ebenso erlauben alle Formate einen hohen Probendurchsatz. Die real-time PCR kombiniert eine hohe Sen- sitivität mit einer verlässlichen Spezifität und Reproduzierbarkeit 6,7 . Die Entwicklung vieler neuer Anwendungen hat aber auch neue Probleme offengelegt, die bei der Etablierung und Durchführung der PCR sowie der anschließenden Auswertung und Interpretation der Ergebnisse besondere Aufmerksamkeit verlangen. Unter anderem zählt dazu die Effizienz der PCR innerhalb eines Zyklus und deren genauen Messung. Als Störfaktoren bekannt sind viele endo- gene Bestandteile der Probe sowie exogene Kontaminanten. Unter anderem inhibieren und beeinflussen diese Kontaminationen die Reverse Transkription und auch die PCR selbst. Inhibitoren sind vor allem Hämoglobin, Fett, Glykogen, Zelltrümmer, Ca 2+ , erhöhte Konzentration an genomi- scher DNA und DNA-Bindungsproteine 8 .

Nicht zu vergessen sind die gewebespezi- fischen Faktoren, die einen Einfluss auf die Kinetik der Amplifikation haben können, je- doch kann dieser Effekt durch eine adäquate Primerwahl behoben werden 9 . Bisher wurden jedoch nur wenige Studien durchgeführt, die den Einfluss der RNA-Qualität auf die PCR- Ergebnisse untersucht haben. Die Tatsache, dass die RNA-Qualität einen Einfluss auf den ermittelten Ct-Wert (Cycle threshold) ausübt, ist offensichtlich. Die große Frage ist jedoch, ab welchem RNA-Degradationsgrad eine Probe nicht mehr zu verwenden ist. Um hier eine Antwort zu finden, wurde der Einfluss der RNA-Integrität boviner Gewebe und Zelllinien auf die qRT-PCR- Ergebnisse untersucht. Die RNA-Qualität einer Probe wurde mittels einer ubiquitär vorkommenden Ribonuklease auf unter- schiedliche RNA-Qualiätsstufen eingestellt. Im Mittel wurden 12 Degradierungsstufen einer RNA-Probe, also mit dem gleichen Transkriptom, hergestellt. Die Qualität wurde mit dreimaliger Wiederholung auf einem Nano-Lab-Chip-Kit 6000 (Agilent Technologies) analysiert und anschließend mittels der qRT-PCR das Expressionsniveau von vier Genen (18S-rRNA, 28S-rRNA, β-Actin und IL-1β) in einem Rotor-Gene 6000-Thermocycler gemessen. Der Einfluss unterschiedlicher RIN-Werte auf die qRT- PCR wurde mit Hilfe der Regressionsana- lyse (Korrelation der RIN mit dem Ct-Wert) analysiert. Die verwendeten Gene zeichneten sich durch ihre unterschiedliche Expressions- niveaus aus: stark exprimierte Gene wie 18S- und 28S-rRNA, intermediär expri- miert wurden Gene wie das β-Actin und gering exprimiert wurden Gene wie das für IL-1β. Die Abbildung 2 verdeutlicht die Bedeutung einer großem RNA-Integrität. Eine hohe RNA-Qualität (hoher RIN) zeigt deutlich niedrigere Ct-Werte als stark de- gradierte RNA-Proben (niedriger RIN). Für alle untersuchten Gewebe und Zelllinien (n=10) konnte eine signifikante Korrelation nachgewiesen werden 3 . Es konnte kein Ein- fluss des RIN-Wertes auf die PCR-Effizienz festgestellt werden 2,3 .

Kann degradierte RNA verwendet werden?

Die entscheidende Frage lautet, „Kann ich auch partiell degradierte RNA in der real time qRT-PCR einsetzen?“ Die Lö- sung scheint in der Wahl der richtigen post-PCR- Datenverrechnung zu liegen. Als häufigste Methode der Datenauswer- tung wird die relative oder vergleichende Genexpressionsanalyse angewandt. Bei der relativen Quantifizierung wird die

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© 2007 General Electric Company – All rights reserved. First published May 2007 GE Healthcare Bio-Sciences AB, Björkgatan 30, 751 84 Uppsala, Sweden

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SNP-Diagnostik

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Schnelle SNP-Diagnostik mit rapid-PCR und Fluoreszenz- Endpunktdetektion

Melanie Trenkmann, Elmara Graser, Timo Hillebrand, Alexander Berka Analytik Jena AG, Business Unit ‘Bio Solutions’

Die Ansprüche an ein PCR-System und die benötigten Geräte steigen, wenn mehrere Fragmente innerhalb eines Reaktionsraumes amplifiziert werden sollen. Auch ist eine elektrophoretische Auswertung der PCR-Produkte nur dann möglich, wenn diese sich in der Größe unterscheiden. Bei der Diagnostik von Single Nukleotid-Polymor- phismen (SNPs), wie dem SNP309 in der Promotorregion des Mdm2-Gens (vgl. Abb. 3), der mit der Entwicklung von Tumoren in Verbindung gebracht wird, scheitert die Elektrophorese. Um dennoch spezifische Ergebnisse in kürzester Zeit zu generieren, können PCR-Produkte über Fluoreszenzsignale ausgewertet werden. Rapid-PCR und die anschließende Endpunktdetektion ermöglichen die parallele Analyse des Wildtyp- und des mutanten (SNP309) Allels im Mdm2-Gen innerhalb nur einer Stunde.

Das Verfahren der PCR (engl. Polymerase Chain Reaction) ist eine der wichtigsten molekularbiologischen Methoden überhaupt und wird für ständig neue Anwendungen herangezogen. Da jedoch die Zusammen- hänge zwischen Temperatur und Wech- selwirkung der Einzelkomponenten sehr komplex sind, gestaltet sich die Entwick-

lung von Experimenten zum Teil immer noch schwierig und vor allem langwierig. Mit der Entwicklung der rapid-PCR und entsprechender Thermocycler, wie dem SpeedCycler (Abb. 2) kann die Gesamtlauf- zeit einer PCR erheblich reduziert werden. Der Endpunktdetektor SpeedScan (Abb. 2), dessen Funktionalität in der Aufnahme und

(Abb. 2), dessen Funktionalität in der Aufnahme und Abb. 1: Die schematische Darstellung des p53-Signalweges als

Abb. 1: Die schematische Darstellung des p53-Signalweges als Stressantwort zeigt die Regula- tion von p53 über Mdm2 als negative Rückkopplung und die Funktion des Tumorsuppressors in der Zellentwicklung 2,5,7 .

Analyse von Fluoreszenzsignalen liegt, er- möglicht anschließend über ein Analysentool zur Gerätesoftware ASpectFA eine einfache und schnelle SNP-Diagnostik. Der Single Nukleotid-Polymorphismus SNP309 im Mdm2-Promotor wird direkt der beschleunigten Tumorentstehung erblich

wird direkt der beschleunigten Tumorentstehung erblich Abb. 2: Die Rapid-PCR mit dem SpeedCycler erlaubt sehr

Abb. 2: Die Rapid-PCR mit dem SpeedCycler erlaubt sehr schnelle PCR-Amplifikationen in Anlehnung an die erheblich verkürzten Hal- tezeiten bei gleichzeitiger Reduktion der Pro- benvolumina. Durch die Endpunktdetektion der amplifizierten PCR-Produkte über Fluoreszenz mittels SpeedScan entfällt die Notwendigkeit zeitintensiver und zum Teil gesundheitsschäd- licher Elektrophoresen vollständig.

bedingter und sporadisch auftretender Krebs- arten zugeordnet. Das Mdm2-Protein nimmt hierbei eine zentrale Stellung im Signalweg des Tumorsuppressors p53 (Abb. 1) ein und fungiert als direkter Negativregulator von p53 1 . Anhand der spezifischen SNP309-Diagno- stik wird nachfolgend die hohe Präzision der genannten Analysengeräte und die enorme Reduktion des Zeitaufwandes verdeutlicht. Bei zellulärem Stress, wie DNA-Schäden oder Anomalien im Zellzyklus, wird der Tu- morsuppressor p53 aktiviert. Dieser initiiert Transkriptionsprozesse, die zur Reparatur schadhafter DNA, zum Wachstumsarrest von Zellen und zum Teil zur Apoptose führen. In Folge dessen kann die Vermehrung anomaler DNA und somit die Tumorentstehung verhin- dert werden 1-4 . In intakten Zellen ist die Konzentration an p53 gering und muss streng kontrolliert wer- den, um einen beschleunigtenAlterungsprozess aufgrund übermäßiger Apoptose zu hemmen 2 . Der p53-Hauptregulator ist Mdm2, ein Pro- tein, das zum einen als E3-Ubiquitin-Ligase und zum anderen als Inhibitor der p53-Tran- skriptionsaktivität fungiert. Darüber hinaus regelt p53 die Expression des Mdm2-Proteins und somit die eigene Konzentration über eine negative Rückkopplung 1-6 . Als Antwort auf DNA-Schäden wird zunächst eine Proteinkinase aktiviert, die p53 phosphoryliert und zur Disso- ziation des p53-Mdm2-Komplexes führt. Unmittelbar nachdem die zelluläre und genetische Stabilität wieder erreicht ist, erfolgt die Deaktivierung der Proteinki-

Kennziffer 15 LW 05 · www.biocom.de

mRNA-Expression des Zielgens mit der eines Referenzgens normalisiert, auch als delta-Ct (ΔCt)-Methode bekannt 10,11 . Der Vorteil der Normalisierung mit einem in- ternen Standard liegt in der Reduzierung der Varianz der Expressionsergebnisse. Gewebe- und Matrixeffekte, unterschiedli- che RNA-Extraktionseffizienzen und Fehler bei der reversen Transkription innerhalb einer experimentellen Probe werden normalisiert, da sie gleichermaßen beide Gene – das Referenz und auch das Zielgen – betreffen. Inwieweit sich auch der Ein- fluss der RNA-Integrität durch die relative Quantifizierung, sprich durch Normalisie- rung, herausrechnet, zeigt Abbildung 3. Der signifikante Einfluss der RNA-Integrität auf die Genexpressionsdaten konnte hier auf ein Minimum reduziert werden. Die normalisierten Werte der untersuch- ten Gene zeigen auch nach der Normali- sierung eine unterschiedliche Reaktion auf die RNA-Integrität. Die stark exprimierten Gene für 18S- und 28S-rRNA unterliegen auch nach der Normalisierung einer Be- einflussung durch die RNA-Integrität. Die normalisierten Daten des niedrig exprimierten Gens IL-1β werden nach der Normalisierung nicht mehr durch die Qualität der RNA beeinflusst. Vor allem RIN-Werte kleiner als fünf zeigen einen stärkeren Einfluss auf die Ct-Werte und auf die ΔCt-Werte. RIN-Werte über fünf sind somit unab- dingbar für eine erfolgreiche Genexpres- sionsanalyse. Proben mit einer Integrität kleiner als RIN 5 eignen sich auch nach einer Normalisierung nur sehr bedingt zur Genexpressionsanalyse. Zudem spielen auch hier die Gewebe- und Matrixeffekte eine bedeutende Rolle 2,3 . Zu beachten ist weiterhin, dass nur mit einem Referenzgen (β-Actin) normalisiert wurde. Die oft übliche Praxis, die Daten gegen ein einziges Referenzgen abzuglei- chen, ist wegen der Fehleranfälligkeit nur mäßig geeignet. Die Normalisierung gegen mehrere Referenzgene, in der Regel zwei bis drei, ist unabdingbar für eine korrekte Behandlung von Expressionsdaten und deshalb in der Regel ein entscheidender Schritt bei der Erstellung valider qRT-PCR- Expressionsprofile 12 . Die relative Quantifizierung lässt sich weiter optimieren, indem die unterschied- lichen qPCR-Effizienzen der untersuchten Gene in die Analyse miteinbezogen werden. Die Effizienz-korrigierte relative Quantifi- zierung mittels real-time qRT-PCR stellt bis dato die eleganteste Form der Quantifizie- rung dar 10 . Diese Quantifizierungsstrategie ist gerade im Hinblick auf den geringen Einfluss der RNA-Integrität auf die PCR- Effizienz von wichtiger Bedeutung 2,3 . Aus diesem Grund kann das Modell auch bei ge- ringfügig verschiedener RNA-Qualität an-

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verschiedener RNA-Qualität an- B L I T Z L I C H T Abb. 3: Normalisierte

Abb. 3: Normalisierte Daten des bovinen Corpus luteum. Der signifikante Einfluss der RNA- Integrität konnte auf ein Minimum reduziert werden.

gewandt werden, da eine Normalisierung bei diesem Modell vorausgesetzt wird.

Fazit

Die Studie hat damit gezeigt, wie wichtig die Qualitätskontrolle der RNA vor der Genexpressionsanalyse ist. Eine RNA kann mit einer Qualität von einem RIN > 5 für die qRT-PCR verwendet werden. Optimal sind RIN-Werte von 8 bis 10. Zwar muss auch hier- bei Gewebe- und Matrixeffekten und dem zu untersuchendem Gen große Aufmerksamkeit geschenkt werden. Da wir uns erst am Beginn der Entwicklung der Prä-qRT-PCR-Datenanalyse befinden, er- scheint es notwendig, bei zukünftigeren Da- tenanalysemethoden die Integrität der RNA mit einzubeziehen. Auf diese Weise können Fehlinterpretationen der Daten vermieden und Kosten reduziert werden. Weitere Infor- mationen und Publikationen auf: http://RNA- integrity.Gene-Quantification.info

Literatur

[1]

Imbeaud S, Graudens E, Boulanger V, Barlet X, Zaborski P, Eveno E,

[2]

Mueller O, Schroeder A, Auffray C (2005) Toward standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapil- lary. Electrophoresis traces. Nucleic Acids Res 33(6):e56. Fleige S, Pfaffl MW (2006) RNA integrity and the effect on the real-time

[3]

qRT-CR performance. Mol Asp Med 27:126–139. Fleige S, Walf V, Huch S, Prgomet C, Sehm J, Pfaffl MW (2006) Comparison of relative mRNA quantification models and the impact of RNA integrity in quantitative real-time RT-PCR. Biotechnol Lett

28:1601–1613.

[4]

Perez-Novo CA, Claeys C, Speleman F, Cauwenberge PV, Bachert C,

e36.

[5]

Vandesompele J (2005) Impact of RNA quality on reference gene expression stability. Biotechniques 39:52–56. Bustin SA, Nolan T (2004) Pitfalls of Quantitative Real-Time Reverse-

[6]

Transcription Polymerase Chain Reaction. J Biomol Tech 15:155–166. Bar T, Sta˚hlberg A, Muszta A, Kubista M (2003) Kinetic outlier detection

[7]

(KOD) in real-time PCR. Nucleic Acids Research 31 (17), e105. Wang T, Brown MJ (1999) mRNA quantification by real time TaqMan

[8]

polymerase chain reaction: validation and comparison with RNase protection [In Process Citation]. Analytical Biochemistry 269:198–201. Wilson IG (1997) Inhibition and facilitation of nucleic acid amplificati-

[9]

on. Appl Environ Microbiol 63:3741–3751. Tichopad A, Dilger M, Schwarz G, Pfaffl MW (2003) Standardized

[10]

determination of real-time PCR efficiency from a single reaction setup. Nucleic Acids Res 31(20):e122. Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L (2002) Relative expression software

tool (REST_) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res 30(9):

[11]

Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression

[12]

data using real-time quantitative PCR and the 2[-Delta Delta C(t)] method. Methods 25:402–408. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F (2002) Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology 3: research 0034.1–0034.11 (http://genomebiology.

com/2002/3/7/research/0034.1)

Korrespondenzadresse

PD Dr. Michael W. Pfaffl Lehrstuhl für Physiologie Technische Universität München

Zentralinstitut für Ernährungs- und Lebensmittelforschung

Weihenstephaner Berg 3, D-85354 Freising eMail: michael.pfaffl@wzw.tum.de www.gene-quantification.info

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B L I T Z L I C H T Abb. 3: Der SNP309 ist im

Abb. 3: Der SNP309 ist im ersten Intron an Position 309 des Mdm2-Gens lokalisiert und verstärkt die Bindungsaffinität des Transkrip- tionsaktivators Sp1 an den Mdm2-Promotor 4,5 .

nase, und p53 wird dephosphoryliert 1-4 . Die E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität von Mdm2 zielt auf beide Proteine ab und veranlasst die Ubiquitinierung von p53 und Mdm2 selbst für den Abbau durch Proteasome. Dement- sprechend ist auch die Expression von Mdm2 aufgrund des degradierten p53 gehemmt, womit beide Proteine im Gleichgewicht in der Zelle vorliegen (Abb. 1) 5 . Eine Überexpression des Mdm2-Proteins kann somit onkogen wirken. Der natürlich vorkommende Single Nukleotid Polymor- phismus SNP309 (Abb. 3), bei welchem ein Nukleotidaustausch von T nach G an Position 309 im ersten Intron des Mdm2- Promotors stattgefunden hat, erhöht die Affinität für die Bindung des zellulären Sp1- Transkriptionsfaktors. Daraus resultierend ergibt sich ein zellulär erhöhtes Niveau des Mdm2-Proteins, wodurch wiederum der p53-Signalweg abgeschwächt wird. Die über- mäßige Mdm2-Expression verhindert die Dissoziation des p53-Mdm2-Komplexes. Das notwendige Transkriptionsprogramm zur DNA-Reparatur kann somit nicht gestartet werden, schadhafte DNA wird unkontrol- liert vermehrt und kann zur Tumorbildung führen 1, 4-6 .

Experimentdesign zum

SNP309-Nachweis

Die für den PCR-Ansatz benötigte DNA wurde durch die neuartige DC-Technologie

aus verschiedenen Patientenproben isoliert. Diese verbindet einen sehr schnellen und hocheffizienten Lyseschritt mit einer extrem effizienten Bindung der Nukleinsäure an einer festen Phase. Die DNA-Aufreinigung ist in ca. 30 Minuten abgeschlossen. Die Vervielfältigung des Wildtyp- und des mutanten Mdm2-Allels erfolgte anschlie- ßend unter Anwendung der rapid-PCR im SpeedCycler. Hierbei wurde die Diffe- renzierung der parallelen Amplifikation aufgrund sequenzspezifischer Sonden mit unterschiedlicher Farbstoffmarkierung realisiert. Nach einer Laufzeit von ca. 25 Mi- nuten konnte die vollständige Reaktion mit 40 Zyklen abgeschlossen werden. Auf chemische und oft auch limitierende Additive konnte bewusst verzichtet werden, da die Geschwindigkeit ausschließlich durch den apparativen Aufbau gewährlei- stet wird und nicht von den eingesetzten Reagenzien abhängig ist. Die darauffolgende Endpunktdetektion (Abb. 4 A) beider Flurophore im Endpunkt- detektor SpeedScan wurde in wenigen Mi- nuten durchgeführt. Da der SpeedScan vier verschiedene Filtereinheiten beinhaltet, ist die kompakte Messeinheit in der Lage, die Detektion eines breiten Spektrums PCR-ty- pischer Fluoreszenzfarbstoffe abzudecken. Die Analyse des SNP erfolgte nach der Definition des Plattenlayouts (Abb. 4 B) automatisch und wird in Kombination mit den Messergebnissen in einem separa- ten Fenster dargestellt (Abb. 4 C).

Auswertung der SNP-Diagnostik mit ASpectFA

Die Abbildungen 4 und 5 zeigen die klare Unterscheidung zwischen Wildtyp, hetero- zygoten und homozygot mutanten Proben, sowohl im SNP-Layout der Gerätesoftware als auch in der parallel dargestellten Grafik (Abb. 5). Basis für die Differenzierung der unterschiedlichen Proben ist eine neuartige und zum Patent angemeldete Methode. Durch den Vergleich beider Fluoreszenzsi-

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Methode. Durch den Vergleich beider Fluoreszenzsi- A B C Abb. 4: Neben den aufgenommen Messwerten, ermöglicht

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Methode. Durch den Vergleich beider Fluoreszenzsi- A B C Abb. 4: Neben den aufgenommen Messwerten, ermöglicht

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Methode. Durch den Vergleich beider Fluoreszenzsi- A B C Abb. 4: Neben den aufgenommen Messwerten, ermöglicht

Abb. 4: Neben den aufgenommen Messwerten, ermöglicht die SpeedScan-Software weitere hilf- reiche Varianten (A-C) der Ergebnisdarstellung, womit durchgeführte Analysen auf einen Blick erfasst werden können. A: Screening der gemessenen Proben (grün = Wildtyp-Allel; orange = mutantes Allel); B: Layout der 36-Well-Mikroplatte zur automatischen SNP-Diagnostik; C: Ergeb- nisdarstellung der Auswertesoftware ASpectFA-SNP

gnale kann eindeutig bestimmt werden, ob das Mdm2-Gen homozygot oder heterozy- got vorliegt. Die Gegenüberstellung beider Abbildungen veranschaulicht die enormen Vorteile der Schnelligkeit, Übersichtlichkeit und Funktionalität der Produktkombination aus SpeedCycler und SpeedScan mit zuge- höriger Analysensoftware. In nur einer Stunde kann somit eine voll- ständige SNP-Diagnostik einschließlich der DNA-Isolation realisiert werden. Zusätzlich ist das Kontaminationsrisiko im Anschluss

Zusätzlich ist das Kontaminationsrisiko im Anschluss Abb. 5: SNP-Diagnostik der gemessenen Fluoreszenzsignale des

Abb. 5: SNP-Diagnostik der gemessenen Fluoreszenzsignale des Wildtyps und des mu- tanten Allels verschiedener Patientenproben (1-9), 1-3 Wildtyp, 4-6 Heterozygot, 7-9 Homo- zygot mutant

an die PCR auf ein Minimum reduziert, da das Öffnen der Mikroplatte vollständig entfällt.

Literatur

[1]

G.L. Bond, W. Hu, E.E. Bond, H. Robions, S.G. Lutzker, N.C. Arva, J. Bargonetti, F. Bartel, H. Taubert, P. Wuerl, K. Onel, L. Yip, S.-J. Hwang, L.C. Strong, G. Lozana, A.J. Levine; A Single Nucleotid Polymorphism in the MDM2 Promotor Attenuates the p53 Tumor Supressor Pathway and Accelerates Tumor Formation in Humans; Cell, Vol. 119 [Nov. 2004]

591-602

[2]

www.web-books.com/MoBio/Free/Ch4Hp53.htm [09.07.2007]

26787

[3]

D. Alarcon-Vargas, Z. Ronai; p53-Mdm2-the affair that never ends;

[4]

Cacinogenesis, Vol. 23 No. 4 [2002] 541-547 G.L. Bond, W. Hu, A. Levine; A Single Nucleotide Polymorphism in the

[5]

MDM2 Gene: From a Molecular and Cellular Explanation to Clinical Effect; Cancer Res 65 [July 2005] 5481-5484 N.C. Arva, T.R. Gopen, K.E. Talbott, L.E. Campell, A. Chicas, D.E. White,

G.L. Bond, A.J. Levine, J. Bargonetti; A Chromatin-associated and Transcriptionally Inactive p53-Mdm2 Complex Occurs in mdm2 SNP309 Homozygous Cells; J Biol. Chem. Vol. 208 No. 29 [July 2005] 26776-

[6]

C. Menin, M.C. Scaini, G.L. De Salvo, M. Biscuola, M. Quaggio, G. Espo-

[7]

sito, C. Belluco, M. Montagna, S. Agata, E. D‘Andrea, D. Nitti, A. Amadori, R. Bertorelle; Association Between MDM2-SNP309 and Age at Colorectal Cancer Diagnosis According to p53 Mutation Status; J. Natl Cancer Inst. 98(4) [Feb. 2006] 582-288 http://en.wikipedia.org/wiki/Mdm2 [09.07.2007]

[8]

http://en.wikipedia.org/wiki/P53 [09.07.2007]

Korrespondenzadresse

Melanie Trenkmann Analytik Jena AG, Business Unit ‘bio solutions’ Konrad-Zuse-Straße 1 07745 Jena Tel.: +49-(0)-3641-77-9403 Fax.: +49-(0)-3641-77-76 77 76 eMail: m.trenkmann@analytik-jena.de

Einzelmolekül-Mikroskopie

Hochempfindliche PCR-freie Genexpressionsanalyse einzelner cDNAs

Gerhard J. Schütz, Institut für Biophysik, Johannes Kepler-Universität Linz; Jan Hesse, Zentrum für Biomedizinische Nanotechnologie, Upper Austrian Research GmbH, Linz, Austria

Die Analyse des globalen genetischen Transkriptionsmusters einer geringen Zellpopulation stellt eine der großen Herausforderungen in der gegenwärtigen medizinischen Diagnostik, aber auch in der Grundlagenforschung dar. Insbesondere die präzise Charakterisierung des wenigen Probenmaterials eines Patienten soll es ermöglichen, auch heterogene Gewebe oder Teile eines Tumors selektiv zu untersuchen. Um diese Fragestellungen adressieren zu können, entwickelten wir eine neuartige Microarray-Plattform, welche mRNA-Expressi- onsprofile aus geringsten Probenmengen erstellen kann, ohne dazu auf die zeitaufwendige und fehleranfällige Probenamplifikation durch PCR zurückgreifen zu müssen. Das Auslesen der Microarrays erfolgt mittels eines auf der ultra-sensitiven Fluoreszenzmikroskopie ba- sierenden, patentierten Chipreaders (PCT/AT99/00257, WO 00/25113), der es erlaubt, selbst einzelne, spezifisch am Biochip hybridisierte cDNA-Moleküle zu detektieren. Damit wird es möglich, Expressionsprofile von nur 10 4 Zellen zu erstellen, was einer hundertfachen Verbesserung der Sensitivität im verglichen mit konventionellen Produkten entspricht.

Das Wissen über die genetische Veranlagung von Individuen hat in den letzten Jahren nicht nur die biomedizinische Forschung dramatisch verändert, auch scheinbar weit entfernte Gebiete wie die Forensik oder die Migrationsanalyse – in der die historische Ausbreitung von Populationen anhand geneti- scher Profile analysiert wird – profitierten von

2 µm
2 µm

Abb. 1: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einzelner Farbstoff-Moleküle. Auf dem 7x7µm großen Auschnitt sind sechs solcher Moleküle klar zu erkennen. Das Bild wurde mit einer Belichtungszeit von 10ms bei einer Pixelgröße von 200 nm aufgenommen.

LABORWELT

den neuen Methoden. Von der Kenntnis der exakten genetischen Disposition versprechen sich Biomediziner die Möglichkeit, künftig die Medikationsart und -dosis persönlich auf den einzelnen Patienten abstimmen zu können. In der Pharmakologie wird versucht, krankheits- auslösende Veränderungen des genetischen Profils für die zielgerichtete Suche nach neuen Medikamententargets zu verwenden. Insbe- sondere die Zusammensetzung der in einer Probe transkribierten Gensequenzen hat sich als charakteristisch für eine Vielzahl krankhaft veränderter Gewebe oder Zellen erwiesen. Das Expressionsprofil der mRNA wird gegenwär- tig nicht nur in der Grundlagen-, sondern vor allem in der klinischen Forschung und in den pharmazeutischen Firmen zur Entwicklung von Markern zur Feinklassifizierung, Progno- se und Vorhersage der Medikamentenrespon- se genutzt. Zum Beispiel wurde für Brustkrebs ein Set von 70 ausgewählten Markern auf mRNA-Niveau 1 klinisch getestet 2 . Die hohe Zahl von gleichzeitig analysierten Markern gibt der Methode mehr Aussagekraft, ist in der Anwendung aber anspruchsvoller als Proteintests, die darauf basierend entwickelt werden können. Eine rasche Bestimmung der Gensequen- zen, welche in einer RNA-Probe vorhanden sind, erfolgt über Microarrays. Das Mess- prinzip beruht auf der Hybridisierung einer Sequenz der Probe an ihr komplementäres

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Abb. 2. A. Illustration des Aufbaus. Ein Laser wird nach Anpassung des Strahlprofils in das Mi- kroskop eingekoppelt. Die Probe wird in Epi-Konfiguration über interne Totalreflexion beleuchtet und die emittierte Fluoreszenz durch dasselbe Objektiv gesammelt. Als Detektor haben wir eine hochsensitive, „backilluminierte“ CCD-Kamera verwendet. B. Schema des Auslesprozesses. Die Probe („Kaffekanne“) und deren Abbildung am Detektor („Kaffetasse“) werden synchron durch den belichteten Bereich verschoben. Dadurch gelangt Fluoreszenzlicht aus demselben Proben- bereich immer in denselben Bildbereich, und wird aufsummiert, bis das Ende des Kamerachips erreicht ist; dort erfolgt der Ladungstransfer in das Ausleseregister.

Gegenstück , welches an einen Chip gekop- pelt ist. Verwendung vieler verschiedener Sequenzen am Chip ermöglicht die groß- flächige vergleichende Analyse der Probe; derzeit werden bis zu 35.000 solcher Sequen- zen in einem charakteristischen Muster am Chip aufgebracht, weshalb sich der Name Microarray eingebürgert hat. Eine Sequenz nimmt eine Fläche von etwa 100x100 µm ein. Zum Nachweis der gebundenen Proben wird üblicherweise das Probenmaterial mit einem Farbstoff markiert, der dann fluoreszenzmi- kroskopisch detektiert wird. Aufgrund der sehr geringen Mengen an ge- netischem Material, das für die meistenAnaly- sen zur Verfügung steht, wird oft ein Amplifi- zierungsschritt vorgeschaltet – die Poly- merase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Dabei werden vor der Farb- markierung multiple identische Kopien der DNA angefertigt. Dieser für die Genomana- lyse kritische Schritt birgt allerdings auch die größten methodischen Probleme: während der Verstärkung kann es zu signifikanten Verzerrungen der relativen Anteile der

Sequenzen kommen 3 . So erwies es sich als besonders schwierig, die sehr häufigen GC- Inseln zu verstärken. Darüber hinaus ist die Durchführung der Amplifizierungsschritte zeitaufwendig.

Detektion einzelner Moleküle

Wir verfolgten einen alternativen Ansatz, der es uns ermöglichen sollte, eine nicht ver- zerrte genetische Analyse von geringen Pro- benmengen zu erhalten. Ziel unseres Projekt- verbundes aus Genetikern, Immunologen, Medizinern, Mathematikern, elektrischen Messtechnikern und Industriepartnern war es, die Sensitivität der verwendeten Nach- weisinstrumente bis zu den prinzipiellen Grenzen auszureizen, um somit auf eine Amplifizierung des genetischen Materials verzichten zu können. Wir konnten dazu auf Technologie-Entwicklungen der letzten Jahre aufbauen, die die Abbildung selbst einzelner Farbstoffmoleküle ermöglichten 4 . Abbildung 1 (Seite 13) zeigt solche Einzel- moleküle in Falschfarbendarstellung. Der

optische Abbildungsprozess lässt die Mo- leküle als durch die Lichtbeugungsgrenze limitierte Signalverteilungen erscheinen; deren Breite von ca. 200 nm ist durch die verwendete Lichtwellenlänge sowie die Abbildungseigenschaften des Mikroskops bestimmt. Die Höhe der Einzelmolekülsi- gnale übersteigt das Hintergrundrauschen deutlich (Signal-zu-Rauschverhältnis ~30), so dass im Wesentlichen alle sich an der Oberfläche befindenden Moleküle auch detektiert werden (>99%). Die für Einzelmolekül-Experimente von uns konstruierten Geräte basieren auf einem Fluoreszenzmikroskop in Kombination mit Lasern als Lichtquellen sowie einer „back- illuminierten“, mit flüssigem Stickstoff gekühlten CCD-Kamera als Detektor (Abb. 2). Besondere Sorgfalt in der Auswahl der Komponenten – insbesondere der optischen Filter – ermöglicht eine Detektionseffizienz des gesamten Gerätes von bis zu 10%. Der angeregte Zustand von typischen Farb- stoffen weist eine Lebensdauer von etwa 1 ns auf, das heißt, es können maximal 10 9 Photonen von einem solchen Molekül pro Sekunde emittiert werden. Die erreichbare Emissionsrate kann sich allerdings deutlich durch das Auftreten weiterer nichtstrah- lender Übergänge reduzieren; meist steht auch die benötigte Anregungsintensität von mehreren kW/cm 2 nicht zur Verfügung. Real kann man von rund 10 5 -10 6 emitierten bezie- hungsweise etwa 10 4 -10 5 detektierten Pho- tonen pro Sekunde und Molekül ausgehen. Wird also die Belichtungszeit auf wenige Millisekunden reduziert, ist noch ein Signal von einigen hundert Photonen zu erwarten, welches auf modernen, „backilluminierten“ Kameras eindeutig nachgewiesen werden kann. Die hohe Sensitivität des Gerätes erfordert die Verwendung hochwertiger Abbildungs- optiken. Eine optimale Detektion ist nur möglich, wenn an der Auflösungsgrenze von rund 200 Nanometern gearbeitet wird. Um- gekehrt haben Biochips typische Abmessun- gen von mehreren Zentimetern. Wenn nun pro Gensequenz eine Fläche von 100x100 µm am Microarray angenommen wird, ist mit typischerweise 10 Milliarden Bildpunk- ten pro Microarray zu rechnen. Diese Zahl übersteigt bei weitem die maximale Anzahl von Bildpunkten einer Digitalkamera. Wir entschieden uns daher, den Biochip in einem Rasterverfahren abzubilden. Dieses Abbil- dungsverfahren sollte allerdings zeitlich kompatibel zu herkömmlichen Geräten sein, welche für das Auslesen eines Biochips ca. 15 Minuten benötigen. Deshalb verwende- ten wir ein für solche Lesegeräte neuartiges Ausleseverfahren, welches für hochsensitive Aufnahmen in der Astrophysik entwickelt

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W I S S E N S C H A F T Abb. 3: Ein DNA-Microarray,

Abb. 3: Ein DNA-Microarray, auf Einzelmolekül-Ebene ausgelesen. Die einzelnen Spots entspre- chen verschiedenen Gen-Sequenzen. Eine Ausschnittvergrößerung des Bildes zeigt einzelne helle Signale, die den einzelnen fluoreszierenden cDNA-Molekülen entsprechen.

wurde. Dabei werden sowohl Probe als auch die am Detektor akkumulierten Ladungen synchron bewegt. Somit kann die Aufnahme selbst einer beliebig großen Chipoberfläche kontinuierlich erfolgen, ohne zeitaufwendi- ge Positionierungsschritte 5 .

Ultra-sensitives mRNA-Profiling

Die Anwendung des Gerätes auf Microar- rays erwies sich zunächst als nicht ganz einfach. Aufgrund der hohen Sensitivität des von uns entwickelten Detektors be- obachteten wir zunächst viele gebundene, fluoreszierende Biomoleküle, selbst auf unbehandelten Biochips. Offenbar waren alle kommerziell erhältlichen Trägermateri- alien den hohen Ansprüchen an die Reinheit nicht gewachsen. Wir entwickelten daher Biochips mit einer wesentlich verbesserten Reinheit 6 – im Mittel befinden sich nur etwa 25 unspezifisch adsorbierte Moleküle innerhalb der Fläche eines DNA-Spots von 100 µm Durchmesser 5,7 . Weiters stellten sich völlig neue Anforde- rungen an die Software zur Datenanalyse. Während marktübliche Microarrays ge- wöhnlich nur auf die Helligkeit der einzel-

nen Spots untersucht werden, können in unserem Fall die Moleküle gezählt werden, was sich als viel genaueres Verfahren erwies. Projektpartner vom Fuzzy Logic Laboratory der Universität Linz entwickelten dafür die vollautomatischen Analyseroutinen. Damit stand einer Anwendung – also der Charakterisierung einer typischen Probe, wie sie im Routinebetrieb eines Analysela- bors auftreten könnte – nichts mehr im Wege. Dieses Experiment wurde gemeinsam mit unseren Partnern vom Fachbereich für mo- lekulare Biologie der Universität Salzburg durchgeführt. Um die hohe Sensitivität der Plattform zu demonstrieren, wählten wir zur Untersuchung nur 200 ng totale RNA – also eine hundertfach geringere RNA- Ausgangsmenge als mit herkömmlichen Geräten gerade noch messbar wäre. Die Probe wurde auf einem Microarray aus 125 unterschiedlichen 67-70mer Oligonukleoti- den, welche in acht Replikaten gespottet wurden, hybridisiert und ausgelesen (Abb. 3). Wir fanden einerseits hochexprimierte Gensequenzen, welche eine homogene Signalverteilung über dem Spot bewirkten. Diese Gene wurden mit konventionellen Methoden ausgewertet. Für viele Gene war

jedoch die Konzentration so niedrig, dass nur mehr einige wenige cDNA-Moleküle binden konnten (siehe Inset); in diesem Fall wurden für eine quantitative Analyse die Moleküle gezählt. Die Auswertung lieferte exakt die gleichen Resultate wie eine Ver- gleichsmessung an hundertfach höheren Ausgangsmengen mit einem kommerziellen Gerät 7,8 .

Auch Proteindetektion möglich

Die Anwendung der hier vorgestellten Technologie ist nicht beschränkt auf gene- tische Fragestellungen. So ist die Kenntnis des menschlichen Erbgutes nur der erste Schritt zu einer vollständigen Entschlüsse- lung von Zellfunktionen. Den wesentlichen zweiten Schritt stellt die Charakterisierung des im Genom kodierten Proteoms – des Proteingehalts einer Zelle in bestimmten Stadien ihrer Entwicklung – dar. Für Pro- teine existiert keine der PCR vergleichbare Methode zur Probenamplifizierung. Gerade in diesem Bereich wird ein Chip-Lesegerät mit Einzelmolekül-Sensitivität Grundvor- aussetzung für viele diagnostische sowie grundlagenwissenschaftliche Fragestel- lungen sein.

Literatur

[1]

Van‘t Veer, L.J., Paik, S., Hayes, D.F. Gene Expression Profiling of Breast

[2]

Cancer: a new Tumor Marker, j. Clin. Oncol 23, 1631-1635 (2005) Bogaerts, J., Cardoso, F., Buyse M., Braga S., Loi, S., Harrison, J.A.,

[3]

Bines, J., Mook, S., Decker, N., Ravdin, P., Therasse, P., Rutgers, W. , Van‘t Veer, L.J., Piccart, M. on behalf of the TRANSBIG consortium. Gene Signature Evaluation as a Prognostic Tool: Challenges in the Design of the MINDACT trial. Nat. Clin., Proct. Oncol. 10, 540-551 (2006) Mutter, G.L., Bonyton, K.A. PCR Bias in Amplification of Androgen re-

[4]

ceptor Alleles, a Trinucleotide Repeat Marker Used in Clonality Studies. Nucleic Acids Res. 23, 1421-1428 (1995) Schmidt, T., Schütz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J. & Schindler, H.

[5]

Imaging of single molecule diffusion. Proc Natl Acad Sci USA 93, 2926- 9. (1996). Hesse, J., Sonnleitner, M., Sonnleitner, A., Freudenthaler, G., Jacak, J.,

[6]

Hoglinger, O., Schindler, H. & Schutz, G. J. Single-molecule reader for high-throughput bioanalysis. Anal Chem 76, 5960-4 (2004). Schlapak, R., Pammer, P., Armitage, D., Zhu, R., Hinterdorfer, P., Vaupel,

[7]

M., Fruhwirth, T. & Howorka, S. Glass surfaces grafted with high-density poly(ethylene glycol) as substrates for DNA oligonucleotide microarrays. Langmuir 22, 277-85 (2006). Hesse, J., Jacak, J., Kasper, M., Regl, G., Eichberger, T., Winklmayr, M.,

[8]

Aberger, F., Sonnleitner, M., Schlapak, R., Howorka, S., Muresan, L., Frischauf, A. M. & Schutz, G. J. RNA expression profiling at the single molecule level. Genome Res 16, 1041-5 (2006). Mir, K. U. Ultrasensitive RNA profiling: counting single molecules on microarrays. Genome Res 16, 1195-7 (2006).

Korrespondenzadresse

Dr. Gerhard J. Schütz Institut für Biophysik Johannes Kepler-Universität Linz Altenbergerstr. 69 A-4040 Linz

Dr. Jan Hesse Zentrum für Biomedizinische Nanotechnologie Upper Austrian Research GmbH Scharitzerstr. 6-8, A-4020 Linz, Austria

DNA-Extraktion

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Einfache, robuste und flexible DNA-Aufreinigung

Tanja Lopez, Promega GmbH, Mannheim

Das Maxwell™ 16-DNA-Aufreinigungssystem vereint eine kompakte Instrumentation, vor- gefüllte Reagenzien-Kartuschen und optimierte automatisierte Methoden, um die Effizienz und Flexibilität der DNA-Aufreinigung einerseits zu maximieren und zugleich die Arbeitszeit zu minimieren. Das Gerät ist darauf ausgelegt, bis zu 16 Proben pro 16-minütigem Lauf zu bearbeiten. Die aufgereinigte DNA ist ohne Probenvorbereitung gebrauchsfertig für Folgeanalysen, Zentrifugation, Ausfällung oder Rehydratation von DNA-Pellets. In diesem Beitrag stellen wir das Maxwell™ 16-System vor und belegen seinen Nutzen bei der Auf- reinigung genomischer DNA.

Die Aufreinigung genomischer DNA (gDNA) ist ein molekularbiologisches Stan- dardlaborverfahren. Die aufgereinigte DNA wird üblicherweise in Genotypisierungen, Kartierungen oder Genstrukturanalysen eingesetzt. Derzeit nutzen Wissenschaftler zahlrei- che verschiedene Methoden mit diversen

Probengrößen, -typen und -durchsätzen zur gDNA-Aufreinigung. Hochdurchsatz- Nutzer haben sich zunehmend der Auto- mation zugewandt, um die Produktivität zu verbessern. Nutzer von Methoden mit niedrigem bis mittlerem Durchsatz ver- bringen bis zu 25-30% ihrer Zeit mit der DNA-Aufreinigung und hatten bis dato

wenige, wenn überhaupt Möglichkeiten zur Automatisierung, ohne beachtliche fi- nanzielle Ressourcen aufwenden zu müssen oder in Ausbildung, Betrieb und Wartung zu investieren. In großen Labors wird we- niger teure Benchtop-Ausrüstung benötigt, die für bestimmte Zwecke, Bereiche des Labors oder geographisch vom Hauptlabor getrennte Orte an die benötigten Arbeitsab- läufe angepasst werden kann. Um die Arbeitszeit und den Einsatz von Arbeitskraft zu reduzieren und gleichzeitig DNA in hoher Ausbeute und Reinheit zu er- halten, hat Promega das bedienungsfreund- liche Maxwell™ 16-System entwickelt. Dieses System, das sich aus dem Maxwell™ 16-Instrument und Kits zusammensetzt, die vorgefüllte Reagenzien-Kartuschen beinhalten, wurde für Anwendungen im niedrigen bis moderaten Durchsatz ent- wickelt. Das Maxwell™ 16-Instrument ist ein platzsparendes und extrem einfach zu bedienendes System. Seine einzigartigen Reagenzkassetten vereinfachen die DNA- Aufreinigung bei einem breiten Spektrum an Probentypen. Künftige Kits werden einen großen Bereich an Aufreinigungsanwendun- gen des Maxwell™ 16-Systems bereitstellen, die Anpassungen an sich verändernde Be- dürfnisse gestatten.

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der Blutzellen erforderlich, was die „Hands- on“-Zeit erhöht und zu signifikanten DNA- Verlusten führen kann, wenn die Proben durch ungünstige Lagerbedingungen oder mehrfaches Einfrieren und Wiederauftauen beschädigt werden. Das Maxwell™ 16-Sy- stem reinigt DNA aus Blut auf, das bei 4° C –20° C oder Raumtemperatur gelagert wird. Das System erfasst effizient DNA verschie- denster Größe und maximiert die Ausbeute auch von beschädigten Proben.

Routineverfahren der Probenvorbereitung eingesetzen Zermahlen oder der Proteinase K-Behandlung. Nachdem die Probe zugege- ben wurde, werden die Reagenzkartuschen in das Maxwell™ 16-Gerät geladen und eine einfache Bildschirmauswahl gestattet die Auswahl des geeigneten opimierten Proto- kolls. Nach Beendigung des Durchlaufes ist die aufgereinigte DNA gebrauchsfertig für Folgeanalysen.

Das kompakte Design des Maxwell™ 16- Gerätes minimiert die Laborstellfläche auf 31,4 x 37,4 x 29,5cm (Abb. 1). Optimierte Protokolle werden in das unmittelbar ein- satzbereite Gerät geladen. Die Funktion von Maxwell™ 16 basiert auf der sequentiellen Bindung und Freisetzung paramagnetischer Partikeln (MagneSil ® , PMPs) in den Wells der Reagenzkartuschen, die mit vorgeladenen Reagenzien ausgeliefert werden. Das Gerät nutzt einen leistungsstarken Magneten und ein einzigartiges Stößeldesign, um Zielmate- rial, wie etwa genomische DNA zu lysieren, zu binden und zugleich Verunreinigungen auszuwaschen. Die Fähigkeit des Gerätes, die paramagnetischen Partikel selektiv einzu- fangen und zu bewegen, erspart den Einsatz komplexer Liquid-Handling-Prozesse und von Reagenzienflaschen, die verstopfen oder verunreinigt werden können. Die Reagenzi- enkartusche und der Stößel kommen nur in Kontakt mit einer einzigen Probe; nach jedem Lauf werden sie entfernt und verworfen. Die Einmal-Reagenzienkartusche stellt zu- dem sicher, das neue Reagenzien fehlerfrei abgegeben werden und so die Effizienz und Reproduzierbarkeit eines Durchlaufs ma- ximieren. 1 bis 16 Proben können mit dem Maxwell™ 16-Gerät in zirka 30 Minuten bearbeitet werden. Das einzigartige Design des Stößels erlaubt eine Aufreinigung der meisten Probenmaterialien, inklusive Tier- und Pflanzenzellen, ohne dass Vorbehand- lungen, etwa mit Proteinase K oder anderen Enzymen, durch mechanisches Zermahlen, die Fraktionierung von Blutzellen oder Zen- trifugation erforderlich wäre. Beispielsweise kann zur DNA-Aufreinigung bis zu 1,2 cm Mausschwanz oder 25–50mg Gewebe direkt in die Kartusche gegeben werden. Die Mög- lichkeit, Vorbehandlungen zu vermeiden, sichert Stunden, verglichen mit dem bei

in Suspension kultivierten Zellen sowie an Oberflächen angeheftete Zellen isoliert wer- den. Die Zellen werden dabei in Volumina von bis zu 400 Mikroliter gesammelt und bearbeitet, oder den Platten und zur Weiter- bearbeitung gesammelten Zelllysaten kann Lyse-Puffer zugegeben werden. Auch eine Auswahl an prokaryotischen Organismen wurde getestet. Gram-negati- ve Bakterien können ohne Vorbehandlung bearbeitet werden. Um optimale gDNA- Ausbeuten zu erzielen, empfiehlt sich bei Gram-positiven Bakterien eine einfache Vorbehandlung. Um die Flexibilität des Maxwell™ 16-Sy- stems zu überprüfen, wurde seine Leistungs- fähigkeit an unterschiedlichsten Probenma- terialien gestestet, wie etwa menschlicher Lunge, Pflanzenblättern und Drosophila. Die erhaltene DNA wurde durch Agarose- Gelelektrophorese visualisiert. Andere Pro- benmaterialien wie menschliches Haar und Mundschleimhautabstriche können ebenfalls Abb. 1: Maxwell™ 16-DNA-Aufreinigungssystem unter Einsatz des Maxwell™ 16 Tissue DNA

Das Maxwell™ 16-System verwendet drei verschiedene Kits mit vorgefüllten Reagenz- kartuschen zur Aufreinigung von gDNA aus einem breiten Spektrum verschiedener Probenmaterialien, darunter humane und tierische Ganzblutpräparate, Leukozytenfil- me, Tier- und Pflanzenzellen, eukaryotische und prokaryotische Zellen sowie ganze Organismen wie Drosophila. Tierblut und verschiedene Tiergewebe wurden ohne vorherige Bearbeitung und Homogenisie- rung mit Hilfe von Maxwell™ 16 bearbeitet. Gewebestückchen (bis 50 mg) können direkt in die mit dem Maxwell™ 16 Tissue DNA- Aufreinigungskit ausgestatteten Maxwell™ 16-Reagenzkartuschen appliziert werden. Die Eliminierung von Vorbereitungsschritten erlaubt es, die Produktivität zu steigern – Pro- bensammlung und Datenanalyse benötigen anstelle von zwei Tagen nur noch einen Tag. Die aus verschiedensten Ausgangsmateri- alien aufgereinigte DNA kann effektiv in Folgeanwendungen eingesetzt werden. DNA kann mit Hilfe von Reagenzkartuschen, die mit dem Maxwell™ 16 Cell DNA-Aufreini- gungskit ausgestattet sind, direkt aus Zellen aufgereinigt werden. gDNA kann dabei aus

Blut ist ein einfaches und oft genutztes Pro- benmaterial für die gDNA-Aufreinigung. Die mit dem Maxwell™ 16 Blut-DNA-Auf- reinigungs-Kit ausgelieferten Maxwell™ 16 Reagenzien-Kartuschen sind optimiert für die Prozessierung eines weiten Bereiches frischer oder gelagerter Human- und Tierblutproben. Bis zu 400 Milliliter Blut liefern etwa 8 bis 16 Mikrogramm gDNA, abhängig von der Leu- kozytenanzahl, bei exzellenter DNA-Reinheit und Effizienz in Folgeapplikationen wie etwa PCR-Analysen. Die Blutausgangsmenge kann ohne Verluste bei den PCR-Ergebnissen oder der Ausbeute an linearer DNA auf bis zu 10 Mikroliter verringert werden. DNA wurde mit ähnlicher Ausbeute und Reinheit und ohne Beeinträchtigung des Resultats ebenso aus Blut in Citrat, EDTA- oder Heparin-hal- tigen Röhrchen aufgereinigt. Auch PCR-Mul- tiplex-Analysen, die eine hohe DNA-Qualität erfordern, belegen die Qualität der mit dem Maxwell™ 16 aufgereinigten DNA. Bei der di- rekten Isolierung von DNA aus Blut mit dem Maxwell™ 16 Blood DNA-Aufreinigungskit wurden durch die Lagerungsbedingungen bedingte, negative Effekte, die bei der Auf- reinigung mit anderen Systemen auftreten, nicht beobachtet. Normalerweise ist vor der DNA-Isolierung zunächst die Aufreinigung

DNA-Folgeanalysen

Vorgefüllte Reagenzkartuschen für diverse Applikationen

DNA-Folgeanalysen Vorgefüllte Reagenzkartuschen für diverse Applikationen 18 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 LABOR WELT

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Kennziffer 19 LW 05 · Informationen ordern? · www.biocom.de

Purification-Kits bearbeitet werden. Die gDNA konnte effektiv in Folgeapplikationen eingesetzt werden und eine hohe Flexiblität des Systems nachgewiesen werden

Zusammenfassung

Das Maxwell™ 16-System wurde entwickelt, um Laborkosten zu sparen und eine einfache Aufreinigung von Biomolekülen im niedri- gen bis mittleren Durchsatz zu ermöglichen. Das System kombiniert

A B C
A
B
C

Abb. 2: A. Maße des Maxwellgerätes, B. Schema des Stößels in der Reagenzienkartusche, C. Überblick der vorgelegten Reagenzien in der Kartusche

ein kompaktes und einfaches Instrument, das wenig Routine und Wartung benötigt, mit vorgefüllten Reagenzkartuschen, die helfen, die Produktivität durch Minimierung des Bedienungsaufwandes zu steigern. Das Maxwell™ 16-System kann gDNA aus Ganzblut (10-400µl), Tier- und Pflanzengewebe sowie pro- und eukaryoti- schen Zellen in Kultur aufreinigen. Wir haben die durchgängig hohe Leistungsfähigkeit des Systems bei der Bearbeitung dieser Probentypen belegt und zugleich dessen Flexibilität durch den Ein- satz verschiedenster Probenmaterialien wie ganzer Gewebe, ganzer Organismen und von Mundschleimhautabstrichen gezeigt.

Korrespondenzadresse

Tanja Lopez Promega GmbH Schildkrötstr. 15, 68199 Mannheim Tel.: +49-(0)621-8501-110 Fax.: +49-(0)621-8501-222 www.promega.com

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Sind Ihre Platten wirklich rein?

Auch wenn alle weißen Mikrotestplatten den Eindruck erwecken, rein und einwandfrei zu sein, versteckt sich häufig ein unsichtbarer Makel. Oft bleiben Rückstände von Chemikalien, die verwendet werden, damit die Platten sich leicht aus den Gussformen lösen lassen, als auch von Weichmachern in nicht vertretbaren Größenordnungen im Polypropylen zurück. Die Genauigkeit eines Versuches und somit das Ergebnis können durch diese Rückstände erheblich negativ beeinflusst werden.

Porvair Mikrotestplatten sind speziell frei von allen extrahierbaren Komponenten, damit Sie sich sicher sein können, nur mit ultrareinem, hochwertigen Polypropylen zu arbeiten.

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PCR/Probenvorbereitung

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Hochempfindliche Detektion viraler Nukleinsäuren

Dr. Hermann Nieper, LUA Sachsen, Standort Leipzig: Dr. Andrea Ockhardt, Invitek GmbH, Berlin; Dr. Arja Lamberg, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finnland

Dieser Anwendungsbericht beschreibt die Isolierung und Detektion des Erregervirus der Bovinen Virusdiarrhoe mit Hilfe des InviMag Virus DNA/RNA Mini Kit/KFmL (Invitek) und des Magnet- partikelprozessors Thermo Scientific KingFisher mL (Thermo Fisher Scientific) in Kombination mit dem Echtzeit-RT-PCR-Detektionsverfahren. Für dieses Experiment wurden Probenpools aus Rinderblut von maximal 50 Tieren hergestellt. Bis zu 15 Proben wurden automatisch im KingFisher mL verarbeitet. Die Ergebnisse belegen, dass mit Hilfe dieses Verfahrens selbst ein geringes Vorkommen viraler RNA nachgewiesen werden kann.

Eine schnelle Detektion und Quantifizierung von Viren in der Veterinärmedizin kann zur effizienteren Bekämpfung von Seuchen wie der Vogelgrippe beitragen. Die hierfür einge- setzten Diagnoseverfahren müssen eine sehr hohe Effizienz und Sensitivität bei der Iso- lierung und Detektion von Nukleinsäuren in umfangreichen Individual- oder Probenpools aufweisen. Das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe/Mu- cosal Disease (BVD-MD) – auch als BVDV be- zeichnet – tritt sehr häufig bei Mastrindern auf und verursacht in dieser Branche große Verlu- ste.Aufgrund der komplexen Pathogenese und des schleichenden Fortschritts der BVDV-Infek- tion stellt die Laboranalyse einen wesentlichen Faktor bei der Entwicklung von Maßnahmen zur Kontrolle und Prävention von Infektionen dar. Akute Infektionen immunkompetenter Tiere können zu unterschiedlichen klinischen Symptomen führen, darunter Leistungsabfall, Diarrhoe (Diarrhoevirus), respiratorische und reproduktive Störungen (Fehlgeburten und Fehlbildungen) bis hin zum tödlich verlaufen- den Hämorrhagischen Syndrom. Des weiteren führt die mit der Infektion einhergehende Immunsuppression zu opportunistischen

Infektionen und genereller Immunschwäche. Das Virus verbreitet sich über Nasal- und Oralsekrete sowie über Kot, Urin und Sperma infizierter Tiere, doch erfolgt die Ansteckung zumeist über persistent infizierte (PI) Tiere. Zur persistenten Infektion kommt es im Falle einer intrauterinen Ansteckung während des ersten Drittels der Trächtigkeit, also vor der Entwicklung der Immunkompetenz. PI-Tiere sind während ihres gesamten Lebens infiziert und weisen hohe Viruskonzentrationen ohne jegliche Immunreaktion auf.

Prävention und Kosten

Die deutsche Bundesregierung schätzt den finanziellen Verlust pro Kuh auf ca. a160 (BMELF 1998). Laut Wolf (1997) kann sich der finanzielle Verlust einer tödlich verlau- fenden Infektion bei einem Bestand von 100 Tieren auf bis zu a12.000 belaufen. Seit November 2004 ist BVD in Deutschland eine anzeigepflichtige Tierkrankheit. Mit der für 2007 erwarteten Verabschiedung einer Bun- desverordnung zur BVD-Bekämpfung wird für jedes Tier eine tierärztliche Untersuchung vorgeschrieben werden, um die Ausbreitung

Tab. 1: Pipettierschema für KingFisher mL und InviMag Virus DNA/RNA Mini Kit/KFmL

Röhrchen

Inhalt

Proben-/ Reagenzienvolumen

A

Lysierte Probe MAP Solution A*

200

µl

20 µl

1Bindungslösung

400

µl

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Waschpuffer R1

800 µl

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Waschpuffer R2

800 µl

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Waschpuffer R2

800 µl

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Elutionspuffer R

120 µl

der Seuche einzudämmen. Das primäre Ziel der BVD-Bekämpfung ist die Erkennung und Vernichtung aller PI-Tiere, die ca. 0,1% bis 2,0% des gesamten Rinderbestandes aus- machen. Um dieses Ziel zu erreichen, ist ein wirtschaftliches, schnelles, sinnvolles und sicheres Detektionsverfahren nötig. Detekti- onsverfahren anhand von Viruskultivierung und Antigen-ELISAs haben den Nachteil, dass

und Antigen-ELISAs haben den Nachteil, dass Abb. 1: Der Thermo Scientific KingFisher mL-

Abb. 1: Der Thermo Scientific KingFisher mL- Magnetpartikelprozessor

sie bei großen Tierbeständen nicht einsetzbar oder aber sehr kostenintensiv sind. Mit RT- PCR-basierten Verfahren hingegen lassen sich Mischproben (Pools) von bis zu 50 Tieren untersuchen. Im Jahr 2002 wurde in Sachsen ein frei- williges Programm zur BVD-Bekämpfung anhand eines RT-PCR-Verfahrens eingeführt. 2004 wurde das Verfahren modernisiert und um eine semi-automatische Reinigung der Serumpools mit Hilfe des Thermo Scientific KingFisher mL in Kombination mit dem Invitek InviMag Virus DNA/RNA Mini Kit/KFmL ergänzt. Im Vergleich zum Ein- satz vollautomatischer Instrumente bietet dieses System einen wichtigen Schritt hin zur kostengünstigen Standardisierung der bislang sehr arbeitsaufwendigen Reinigung von Nukleinsäuren im Labor.

Isolierung viraler RNA

Die virale RNA des BVD-Virus wird innerhalb von 45 Minuten mit Hilfe des InviMag ® Virus DNA/RNA Mini Kit/KFmL aus Serum- und Plasmapools gereinigt. Die Serum- und Plas- mapools bestehen aus Rinderblutproben, die direkt beim tierhaltenden Betrieb entnommen werden. Die Qualität der verwendeten Proben kann je nach Alter und Gesundheitszustand des Tieres sowie entsprechend verschiedener Lager- und Transportbedingungen der Pro- ben stark schwanken. Zur Herstellung eines

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Endlich frei – mit dem einzigen wirklich flexiblen Probenaufreinigungssystem © 2007 Thermo Fisher Scientific Inc.
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© 2007 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved.
All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries.

Genießen Sie die Freiheit, die Ihnen die Thermo Scientific KingFisher ® Aufreinigungssysteme bieten. Wählen Sie Ihre Reagenzien völlig unabhängig vom Gerät und erreichen Sie so die bestmöglichen Ergebnisse für alle Protein-, Zell- und DNA/RNA-Reinigungsprozesse.

Unsere Magnetpartikelprozessoren sind Ihr flexibler Partner. Sie können jede Probe vom Protein bis zur Zelle aus nahezu allen Ausgangsmaterialien von Blut bis hin zu Bodenproben isolieren. Das Endprodukt besticht durch höchste Reinheit. Durch eine hohe Automatisierung der Verarbeitungsprozesse bleibt Ihnen viel mehr Zeit für andere Aufgaben.

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– 11. Oktober 2007 in Hannover! Halle 9 / Stand-Nr. F34 KingFisher Probenaufreinigungssysteme MEHR Durchsatz für

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Diagnosepools von 5 ml werden nur 100 µl Serum oder Plasma pro Tier von maximal 50 Tieren verwendet. Aus jedem Pool wird ein Aliquot von 200 µl zur Isolierung viraler RNA verwendet. Hier- zu wird das Aliquot in das im Kit enthaltene Extraktionsröhrchen übertragen und vor- sichtig mit 200 µl ddH 2 O vermischt. Dieses Extraktionsröhrchen verfügt innen über eine Beschichtung aus einer vorbereiteten Mischung fester Lysereagenzien (nicht-chao- troper Lysepuffer und Proteinase K), Carrier- Nukleinsäuren und präzise abgemessener interner RNA/DNA-Extraktionskontrollen. Die internen Kontrollen wurden mit den Zielsequenzen zusammen aufgereinigt und ermöglichen die Beurteilung der Extrakti- onseffizienz beziehungsweise der PCR-Am- plifizierung. Hierdurch werden die Qualität der gereinigten Virus-RNA und/oder DNA sichergestellt und falsch-negative Ergebnisse ausgeschlossen. Nach dem Mischen werden sämtliche Proben für 15 Minuten bei 65 °C in einen Schüttelinkubator gegeben, um die Aktivität der Proteinase bei der Lyse des Viruskapsids und der Proteindigestion zu unterstützen. Zur Entfernung von Proteinresten von den Virusnukleinsäuren wird darüber hinaus eine Inkubation von 10 Minuten bei 95 °C empfohlen. Dieser Schritt ist insbesondere bei sehr stabilen Virusnukleinsäure-Protein- Komplexen notwendig. Während der Lyse ist für jede Probe ein KingFisher mL-Röhrchenstreifen in die Probenhalterung einzusetzen. Dann werden die Röhrchenstreifen B bis E gemäß Tabelle 1 mit den mitgelieferten Puffern befüllt. Nach Abschluss der Lyse werden die Proben in die KingFisher mL-Röhrchenstreifen über-

tragen (Röhrchen A), und es werden 400 µl Bindungslösung und 20 µl Magnetpartikel- lösung A hinzugefügt und mit jedem Lysat gemischt, um optimale Bindungsbedingun- gen herzustellen. Unter diesen Bedingungen wird die Vi- rus-RNA quantitativ an die Magnetpartikel gebunden. Anschließend werden die Ma- gnetpartikel in den Waschpuffer R1 und R2 übertragen, um sämtliche Verunreinigungen wie Proteine, Nukleasen, PCR-Inhibitoren etc. zu entfernen. Nach der Entfernung des Etha- nols von den Partikeln wird die Virus-RNA in Elutionspuffer R eluiert und ist bereit zur weiteren Verwendung. Nach dem Befüllen der Röhrchenstreifen wird das Tablett im Gerät plaziert und die Kammspitzen eingesetzt. Die Frontabdek- kung wird geschlossen und die Proben mit dem „InviMAG-Virus-KFmL“-Reinigungs- protokoll verarbeitet. Nach Abschluss des Programms werden die Eluate zur weiteren Verwendung gelagert.

BVDV-Detektion

Standardmäßig wird ein Aliquot von 5 µl von jedem Eluat (1/24) zur BVDV-Detektion bei Probenpools von 50 Tieren verwendet. Primer und Bedingungen der Echtzeit-One-Step-RT- PCR beschreiben Gaede et al. Dieses System ermöglicht eine zuverlässige Detektion selbst bei nur 10 Genomkopien pro Reaktion und entspricht den Sensitivitätsanforderungen der Bundesregierung. Dies entspricht einer Verdünnung von mindestens 1 zu 1.000 bei jeder PI-Probe (Abb. 1). Des Weiteren wurde ein quantitativer Assay durchgeführt, um sicherzustellen, dass auch bei verdünnten Pools eine ausreichende Vi-

Norm. Fluoro. 0,3 0,25 10 1 0,2 10 2 Genomkopien 0,15 10 3 0,1 10
Norm. Fluoro.
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Genomkopien
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Schwellenwert
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Zyklus
PI-Tier
1:10
1:100
1:1000

negativ

Abb. 1: Amplifizierung der Verdünnungsreihe einer Kontroll-Nukleinsäure (rot; von links nach rechts 10.000/1.000/100/10 Kopien in Serumproben) und parallele Verdünnungsreihe von zwei PI-Tieren (persistent infizierte Tiere, grün; unverdünnte Serumprobe/1:10/1:100/1:1000 verdünn- te Serumprobe), amplifiziert mittels Echtzeit-RT-PCR.

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Norm. Fluoro. Norm. Fluoro. positive Probe positive Probe 0,05 0,1 0,05 0 0 Schwellenwert Schwellenwert
Norm. Fluoro.
Norm. Fluoro.
positive
Probe
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Schwellenwert
Schwellenwert
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40
Zyklus
Zyklus
negative Probe
negative Probe

Abbildung 2: (A) BVDV-Detektion bei vier positiven (rot) Serumproben aus unterschiedlichen Se- rumpools und bei vier negativen (blau) Serumpools; alle positiven Proben weisen ein Viruspro- dukt auf. (B) Detektion der internen Kontroll-RNA in den Eluaten von vier positiven (rot) und vier negativen (blau) Serumpools; alle Proben weisen ein detektierbares Produkt der Kontroll-RNA auf, was ein Beleg für die erfolgreiche Extraktion und Amplifizierung ist.

rusdetektion gewährleistet ist. Hierzu wurde eine Detektion der internen Kontroll-RNA(der Beschichtung im Extraktionsröhrchen) anhand von 5 µl jedes Eluats in einer spezifischen Echt- zeit-RT-PCR-Analyse durchgeführt (Assay von AJ Roboscreen). Der Assay enthält alle Reak- tionskomponenten, Primer und internen Kon- trollen. Er erlaubt das Erkennen von Fehlern während der Extraktion der Virusnukleinsäure oder von Inhibitoren während der Amplifi- zierung (Abb. 2). Diese Kontrolle verhindert falsch-negative Ergebnisse und ermöglicht die Überwachung der Extraktion, Transkription und Amplifizierung. Somit ermöglicht dieser Assay eine zuverlässige BVDV-Detektion.

Ergebnisse

Das beschriebene Extraktionsverfahren bietet eine hocheffiziente Reinigung viraler RNA selbst bei geringer Kopienanzahl (siehe Abb. 1). Die Qualität der Extraktion wird durch ein in- ternes Kontrollsystem überwacht (sieheAbb. 2). Die extrahierte BVDV-RNAund die Kontrollen werden durch Echtzeit-RT-PCR quantifiziert. Im Serum zweier PI-Tiere konnte virale RNA bei Verdünnungen bis zu 1:1.000 nachgewiesen werden. Eine künstliche Nukleinsäure wurde als Standard zur Quantifizierung von Genom- kopien eingesetzt (Abb. 2). Acht Serumpools von bis zu 50 Tieren wurden zur BVDV-De- tektion verwendet, und sämtliche Pools mit positiven Proben wurden korrekt erkannt. Alle Extraktionen und Amplifizierungen wurden anhand eines Assays mit positiver Kontrolle überprüft. Alle Proben wiesen korrekte Extrak- tion und Amplifizierung auf (Abb. 3).

Schlussfolgerung

Das Kombi-System für Extraktion und De- tektion viraler RNA bewies seine Sensitivi-

LABORWELT

tät bei Virusverdünnungen bis mindestens 1 zu 1.000. Nach dem Gesetz müssen Systeme zukünftig in der Lage sein, 50 bis100 Kopi- en/ml per Echtzeit-RT-PCR festzustellen. Das beschriebene Verfahren entspricht die- sen Kriterien in Bezug auf die BVD-Schutz- verordnung zur Erkennung von PI-Tieren. Seit Inkrafttreten der Schutzverordnung wurden allein in Sachsen bereits knapp 200.000 Tiere mit dem hier beschriebenen Virusextraktions- und -detektionssystem untersucht. Das für hochsensitive Virusdetektion ausgelegte InviMag Virus DNA/RNA Mini Kit/KFmL bietet eine schnelle, kostengün- stige simultane Reinigung viraler DNA und RNA aus unterschiedlichen Quellen. In Kombination mit dem Thermo Scientific KingFisher mL wurde es im Labor ebenfalls bereits erfolgreich für andere RNA-Viren (Influenza A-Virus, Porcines Enterovirus, Aviäres Paramyxovirus 1) sowie für DNA- Viren (Porcines Circovirus 2) aus unter- schiedlichen Quellen eingesetzt, etwa von Abstrichen, homogenisierten Gewebepro- ben und Exkrementen.

Literatur

[1]

Gaede et al. (2005). Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 118, 113-120 Wolf (1997). ITB-Schriftreihe, Bd. 1, 87-98 BMELV (1998). Leitlinien für den Schutz von Rinderbeständen vorm Virus der BVD/MD

Korrespondenzadresse

Timo Trageser Thermo Fisher Scientific Robert-Bosch-Str. 1 63505 Langenselbold Tel.: +49-(0)-6184-90-6337 Fax: +49-(0)-6184-90-7337 eMail: timo.trageser@thermofisher.com

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8. Jahrgang | Nr. 5/2007 | 23

Interview

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„Als Verband wollen wir mit der Wissenschaft reden“

Dr. Ralf Hermann, Vorsitzender; Dr. Thorsten Ebel, Sprecher Arbeitsgruppe Life Science Research innerhalb des VDGH

Erst im vergangenen September hatten die acht global tätigen Unternehmen Becton Dickinson, Bio-Rad, Eppendorf, Perkin Elmer, Promega, Qiagen, Roche Diagnostics und Sigma-Aldrich Chemie die neue Interessenvertretung Life Science Research AG (LSR AG) aus der Taufe gehoben (vgl. LABORWELT 5/2006). Ein Jahr später hat die neue Unterneh- mensvertretung nicht nur Mitgliederzuwachs zu vermelden, sondern eine schlagkräftige Struktur und einen neuen Vorstand etabliert sowie in fünf Arbeitskreisen begonnen, ihre Ziele tatkräftig umzusetzen. Als Verband suchen die auf dem Markt in Konkurrenz zueinander stehenden Unternehmen das Gespräch mit der Wissenschaft, um ihre Entwicklungen mit den Bedürfnissen der Wissenschaftler abzugleichen. Doch auch die Politik, die Messege- sellschaften, Anbieter von eCommerce-Plattformen und andere im Life Science-Sektor tätige Verbände zählen zu den Gesprächspartnern, mit denen die LSR AG bereits in Kontakt steht. LABORWELT sprach mit Dr. Ralf Hermann, dem im Juli neu gewählten Vorsitzenden der Life Science Research AG und Vice President Global Marketing & Customer Support der Eppendorf AG, und Dr. Thorsten Ebel, dem Sprecher der Arbeitsgruppe und Sales & Marketing Manager Biotechnologie der Sigma-Aldrich Chemie GmbH, über die Entwicklung und Ziele des wachsenden Herstellerverbandes.

Laborwelt:

Im vergangenen September hat sich die Arbeitsgruppe Life Science Research inner- halb des VDGH als Interessensvertretung der Hersteller von Forschungswerkzeugen und -Instrumenten gegründet. Was war Ihre Ausgangslage und welche Meilensteine haben Sie bislang erreicht?

Hermann:

Wir hatten eine recht homogene Ausgangs- lage. Die Firmen, die sich in der Life Science Research AG zusammengefunden haben, sind alle im gleichen Marktsegment tätig und haben im Grunde die gleichen Interessen und Bedürfnisse. Die eigentliche Triebfeder für die Gründung der Life Science Research AG war, dass wir nirgendwo einen Verband gesehen haben, der das spezielle Segment, für das unsere Mitgliedsfirmen stehen, im Fokus hat und konsequent vertritt. Es galt also einen neuen Gesprächspartner und Interessensver- treter der Hersteller im Life Science Research- Bereich zu etablieren, um unsere gemeinsa- men Ziele sowohl auf wissenschaftlicher als auch auf wirtschaftlicher, politischer und Anwenderebene nach außen zu vertreten. Seit der Gründung im September 2006 haben wir versucht, fünf Arbeitskreise – Marktfor- schung, eCommerce/eProcurement, Messen, Öffentlichkeitsarbeit und Verbände – auf- zubauen und für diese einen regelmäßigen Arbeitsmodus zu etablieren. Gleichzeitig haben wir die ersten Gespräche mit Politik, Verbänden und Presse aufgenommen.

Laborwelt:

Sie sind mit acht Gründungsmitgliedern gestartet, die 30% des deutschen Life Sci- ence Research-Marktes repräsentieren. Ein erstes Ziel war es zu wachsen, um Ernst genommen zu werden und politische Ziele artikulieren zu können. Welchen Zwischen- stand gibt es hier?

Hermann:

Wir haben im Februar diesen Jahres die erste größere Veranstaltung zur Mitglieder- werbung gehabt und dort regen Zuspruch erfahren. Seitdem sind drei neue Firmen als Mitglieder dem Verband beziehungsweise der LSR AG beigetreten, Merck, Thermo- Fisher Scientific und PEQLAB. Außerdem haben wir ein knappes Dutzend Kandidaten, darunter auch zwei große Laboranbieter, die erst 2008 vorhaben beizutreten.

Ebel: … und die auch schon aktiv an Treffen der LSR AG teilgenommen haben und sich aktiv einbringen. Wenn die großen Laboranbieter, die wir an dieser Stelle noch nicht nennen wollen, beitreten, dann werden die Mitgliedsfirmen der LSR AG deutlich mehr als 50% des deutschen Life Science-Research-Marktes repräsentieren. Damit hätten wir unser erstes Ziel erreicht. Zudem hätten wir bereits die wesentlichen Marktführer in vielen Bereichen an Bord.

Laborwelt:

Sie hatten es bereits angesprochen. Sie woll- ten auch Kooperationsmöglichkeiten mit

Sie woll- ten auch Kooperationsmöglichkeiten mit Dr. Ralf Hermann ist der Vorsitzende der Ar- beitsgruppe

Dr. Ralf Hermann ist der Vorsitzende der Ar- beitsgruppe Life Science Research innerhalb des Verbandes der Diagnostica-Industrie (VDGH). Nach seiner Promotion im Fach Molekularbiologie an der Universität zu Köln begann der heute 46-jährige 1992 seine Karrierre als Produktmanager bei Qiagen und wechselte 1999 ins strategische Ma- nagement. Von 2001 bis 2003 baute Hermann als Vorstandvorsitzender die Vivascience AG auf. Seit 2004 ist er bei der Eppendorf AG als Vice President Global Marketing und Customer Support tätig.

Biotechnologie- und Forschungsverbänden ausloten. Wie ist da der Stand?

Hermann:

Wir haben mit der Forschung erste Kontakte. Mit der Deutschen Gesellschaft für Proteom- Forschung planen wir eine gemeinsame Veranstaltung. Zusätzlich haben wir mit sehr vielen Fachverbänden – ich glaube 10 Industrie- und Biotechnologieverbänden sowie sieben Forschungsgesellschaften – gesprochen und erste Kontakte geknüpft. Jetzt geht es im nächsten Schritt darum, gemeinsame Interessen zu definieren und zu vertreten.

Laborwelt:

Die LSR AG hat sich schon bei der Gründung eine intensive Zusammenarbeit auch mit der Forschung auf die Fahnen geschrieben. Was ist Ihnen hier besonders wichtig?

Hermann:

Unser Interesse liegt in erster Linie darin, wirklich ein kompetenter und neutraler An- sprechpartner für die Forschung zu sein, um gemeinsam an Lösungen für wissenschaft- liche Probleme zu arbeiten. Es ist immer wieder der Fall, dass den Wissenschaftlern die geeigneten Tools fehlen, um in ihrer Forschung weiter voranzukommen. An uns als Verband können sie viel neutraler eine Rückmeldung geben, welche Tools fehlen, in welcher Rich- tung die Firmen entwickeln sollten, als an eine

einzelne Firma, die naturgemäß einen sehr viel kommerzielleren Ansatz und Hintergrund hat. Wir wollen versuchen, diesbezüglich ein neutraler Ansprechpartner zu sein. Ein erster Schritt in diese Richtung ist der gemeinsame Workshop mit der Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung (DGPF). Hier wollen wir den Proteomforschern eine Möglichkeit bieten, ihre Bedürfnisse an die Industrie zu formulieren und uns zu mitzuteilen, welche Tools fehlen.

Laborwelt:

Was ist an dem Thema Messen so wichtig, dass die LSR AG diesem Thema einen eige- nen Arbeitskreis widmet?

Hermann:

Messen sind für uns eine der wesentlichen Kommunikationsplattformen. Die Firmen stecken einen erheblichen finanziellen und personellen Aufwand in Messen. Letztlich muss uns allen daran gelegen sein, dass so eine Plattform auch genutzt wird – von un- seren Kunden. Dazu muss man sich ansehen, wie man die Messen gestaltet und wie man es hinbekommt, dass die Messen mit der Zeit und mit den Ansprüchen des Kunden an so eine Veranstaltung tatsächlich mitwachsen. Deswegen ist es für uns ganz wesentlich, die

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Ausrichtung der Messegesellschaften, die Ge- staltung der für uns wesentlichen Messen mit zu beeinflussen. Es erscheint uns sehr sinnvoll, diese Anstrengungen zu bündeln und über den Verband glauben wir, dass wir deutlich größeren Einfluss auf die Messegesellschaf- ten ausüben können, diese Messen wirklich interessant für den Kunden zu gestalten und somit den Aufwand, den die Firmen dort hereinstecken, auch zu rechtfertigen. Ganz besonders wichtig sind uns an dieser Stelle die beiden Hauptmessen für unseren Bereich, die Analytica und die Biotechnica. Wir haben mit beiden Messegesellschaften schon mehrfach Gespräche geführt. Wir versuchen uns wesent- lich stärker in die Gestaltung der Messen ein- zubringen. Hier sehen wir bereits Fortschritte, unsere ersten Anregungen werden schon jetzt in der Umsetzung der Biotechnica sowie bei der Analytica im nächsten Jahr verwirklicht.

Ebel:

Der wichtigste Punkt ist, dass das Konzept der Messe viele Besucher anzieht. Da un- terscheidet sich das Konzept der beiden großen Messen im Augenblick. Wir versu- chen herauszufinden: Gibt es für die unter- schiedlichen Standorte Möglichkeiten, die Besucheranzahl und den Besucherstrom so zu lenken, dass sich für uns ein erfolgreicher

so zu lenken, dass sich für uns ein erfolgreicher Dr. Thorsten Ebel ist Sprecher der Arbeits-

Dr. Thorsten Ebel ist Sprecher der Arbeits- gruppe Life Science Research (LSR AG) innerhalb des Verbandes der Diagnostica- Industrie (VDGH). Nach seiner Promotion im Fach Molekulare Genetik an der Universität Freiburg (Breisgau) ist der 41-jährige im Vertrieb bei Life Technologies, später Invitrogen tätig gewesen. Im Jahr 2004 wechselte er zur Sigma-Aldrich Chemie GmbH in Taufkirchen, um den Verkauf zu führen, Seit 2005 hat Ebel die Leitung für Vertrieb (D, A) und Marketing (D, A, CH) für die Geschäftseinheit Biotechnologie inne.

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I N T E R V I E W Der neugewählte Vorstand der Life Science Research

Der neugewählte Vorstand der Life Science Research AG: Wolfgang Barthel, Country Sales Ma- nager Germany & Austria, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Dr. Ralf Hermann (Vorsitzender), Vice President Global Marketing & Customer Support, Eppendorf AG und Friedel Horneff, Group Ma- nager Life Science Central Europe, Bio-Rad Laboratories GmbH

Messeauftritt ergeben kann? Das beginnt bei dem Einzugsgebiet, geht weiter bei den begleitenden Veranstaltungen, über Mög- lichkeiten der Einladung oder des günstigen Zugangs für möglichst viele Besucher.

Laborwelt:

Gibt es Wunschprojekte von Ihrer Seite oder bereits Spruchreifes?

Hermann:

Bei der nächsten Analytica werden wir uns am Rahmenprogramm zum Thema Life Sciences beteiligen. Da haben wir aus unserer Sicht für die Messebesucher interessante Themen vorge- schlagen und werden, wenn sie angenommen werden, für attraktive Referenten sorgen. Wir werden zudem versuchen, unsere Pressearbeit mit der der Analytica zu koordinieren. Bei der Biotechnica sind wir dabei, das neu vorgelegte Konzept zu hinterfragen und darauf hinzu- wirken, dass man bei den Bestrebungen, die in Richtung europäische Leitmesse laufen, die sich ja auch in Turnusänderungen niederschlagen, die Interessen derAussteller mit berücksichtigt. Denn nur gemeinsam werden wir es schaffen, die Messen attraktiv zu machen.

Laborwelt:

Da scheint mit anzuklingen, dass Sie sich in- haltlich noch nicht so richtig wiederfinden?

Hermann:

Wir haben in der Vergangenheit, eigentlich bei allen Messegesellschaften beobachten müssen, dass Aspekte wie Technologietransfer oder Partnering ein immer größeres Schwergewicht bekommen. Dort sehen wir nicht den Schwer- punkt oder die Zukunft der Messen und auch nicht die Schwerpunktinteressen unserer Kunden. Das ist ein Thema, über das wir mit den Messegesellschaften diskutieren.

Laborwelt:

Müsste es mehr um Technologien gehen?

Hermann:

Richtig. Wir haben daher schon Ideen dis- kutiert, ob die Messegesellschaften nicht ein Interesse daran haben müssten, einen Tech- nologiebereich auf der Messe darzustellen, und zwar ohne kommerziellen Hintergrund, also ohne begleitende Herstellerstände, son- dern rein wissenschaftlich und neutral. Dort könnten Technologien vorgestellt werden, die auch die eine oder andere Firma in der Entwicklungspipeline hat, aber ohne dass die Firmen im Vordergrund stehen. Solche Dinge könnte ein Verband zwar koordinie- ren, aber vorangetrieben werden müssten sie von der Messegesellschaft.

Laborwelt:

Weltweite Technologietrends zu erfassen, ist eine Aufgabe der Marktforschung. Was sind die Ziele und derzeitigen Aktivitäten des Arbeitskreises Marktforschung der LSR AG?

Hermann:

Der Arbeitskreis Marktforschung versucht primär, Transparenz über den deutschen Markt zu gewinnen – und zwar im interna- tionalen Vergleich: Wo steht Deutschland tatsächlich in der Forschung, welcher Teil der Fördermittel fließt real in welche For- schungsprojekte, wo gibt es Doppelfinan- zierungen, wo werden Förderschwerpunkte gesetzt, und wie vergleichen sich die ver- schiedenen Branchen, in die investiert wird, zum Beispiel Biotechnologie versus Nano- technologie. Das primäre Ziel ist es, Trans- parenz zu schaffen, um sagen zu können, wo steht Deutschland, wo gibt es Defizite, wo müssten Schwerpunkte anders gesetzt werden? Alle Unternehmen betreiben indi- viduell für sich Marktforschung und haben darüber hinaus ihre eigenen Umsatz- und Absatzzahlen, Abschätzungen von Marktan- teilen etc. Wenn wir es schaffen, diese Daten neutral zu kombinieren, sollten wir ein sehr

klares Bild der Life Science-Landschaft in Deutschland erhalten – also Fördermittel, firmeneigene Daten, Publikationen.

Laborwelt:

Tritt nicht gerade bei der Marktforschung die Konkurrenzsituation der Firmen untereinan- der in Erscheinung?

Hermann:

Die Konkurrenzsituation ist in diesem Punkt sehr kritisch. Umso wichtiger ist es hier aber, dass wir im VDGH organisiert sind, der sehr viel Erfahrung hat, wie man diese Daten tat- sächlich neutral zusammenführt, so dass keine Rückschlüsse auf die einzelnen Firmendaten gezogen werden können. Da hat der VDGH jahrzehntelange Erfahrung im Diagnostica- Bereich und auf die können wir natürlich zurückgreifen. Die Daten werden letztlich von der Geschäftsstelle des VDGH anonymisiert und zusammengeführt, so dass eine Konkur- renzsituation ausgeschlossen ist.

Laborwelt:

Ihr Arbeitskreis Marktforschung führt derzeit schon entsprechende Befragungen durch. Was soll konkret an Daten abgebildet werden?

Hermann:

Wir fragen, weil wir neue Mitglieder gewon- nen haben, in einem ersten Schritt bei den Unternehmen Mitarbeiterzahlen, Umsätze in Deutschland verglichen mit dem Weltumsatz, Umsatzentwicklung in bestimmten For- schungssegmenten, Produktgruppen etc. ab. Es geht uns also aktuell darum, die Firmendaten zu erheben. Der Arbeitskreis selbst arbeitet aber auch schon an der Zusammenführung der Da- ten, die die einzelnen Firmen zum Beispiel über die Fördermittelvergabe haben. Das passiert aber nicht im Rahmen einer Umfrage, sondern die Daten aus den Unternehmen werden inner- halb der Arbeitsgruppe zusammengeführt.

Laborwelt:

Hat es diesbezüglich schon Gespräche mit den Fördermittelgebern gegeben, die ja eigene Datenbanken dazu vorhalten?

Hermann:

Es ist richtig, dass die Daten zum Teil vorhan- den sind. Sie werden aber nicht so herausgege- ben wie man das etwa aus den USA kennt. Die tatsächlichen Fördermittelflüsse beziehungs- weise die genaue Verwendung dieser Mittel wird bei uns in Deutschland nicht wirklich transparent gemacht. Das ist in den USA, wo es den Freedom of Information Act gibt, ganz anders. Da können Sie ganz genau reinschauen, wie und für welche Zwecke die Mittel, die eine Arbeitsgruppe oder Institut bekommen haben, tatsächlich eingesetzt worden sind. Das ist in Deutschland so nicht der Fall, und das ist auch nichts, was die Fördermittelgeber tatsächlich herausgeben. Das ist der Punkt, den wir

eigentlich angehen wollen, um zu versuchen anhand der Daten, die wir haben, verglichen mit dem, was offiziell berichtet wird, zu sehen, wie das denn zueinander passt. Wir wollen zuerst einmal die Datenlage auf unserer Seite so weit wie möglich absichern, bevor wir dann in die Gespräche mit den Mittelgebern gehen.

Laborwelt:

Wollen Sie die Daten auch veröffentlichen?

Hermann:

Wo es sinnvoll ist, werden wir die Daten auch öffentlich manchen. Wir werden aber sicher nicht unsere gesamten Datenpakete unkom- mentiert auf den Tisch legen.

Laborwelt:

Wie sieht denn die Zeitplanung für die Date- nerhebung aus?

Hermann:

Die Firmenbasisdaten werden wir im Herbst in einer präsentablen Form erhoben haben. Das komplexere Fördermittelthema braucht natürlich wesentlich länger. Bis zur Mitte nächsten Jahres sollten wir in der Lage sein, die ersten Punkte anzugehen.

Laborwelt:

Welche Ziele verfolgen Sie mit den Arbeitskrei- sen Öffentlichkeitsarbeit und eCommerce?

Ebel:

Eine Aufgabe der Öffentlichkeitsarbeit ist es, unsere Forderungen und Visionen an die Poli- tik zu kommunizieren. Die andere Gruppe, die wir erreichen wollen, sind die Nutzer unserer Produkte, also unsere Kunden. Hier suchen

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wir den Dialog mit der Wissenschaft. Der dritte wichtige Aspekt ist die Interaktion mit den anderen Verbänden in Deutschland.

Hermann:

In dem Arbeitskreis eCommerce geht es uns darum, Transparenz hinsichtlich aller sichtba- ren Plattformen, ihrer Leistungen und Kon- ditionen zu gewinnen und letztlich dafür zu sorgen, dass die Benutzeroberflächen solcher Plattformen möglichst einheitlich gestaltet werden. Darüber hinaus ist uns ganz wichtig, dass sich diese Plattformen nicht als Selbst- zweck verselbständigen. Sie müssen einen Nutzen schaffen – und zwar für den Kunden und den Hersteller. Es kann also nicht sein, dass es nur einen Nutzen für den Dienstleister gibt, der die Plattform anbietet.

Laborwelt:

Im Juli wurde ein neuer Vorstand gewählt. Was hat sich bei der LSR AG personell ver- ändert?

Ebel:

Die Neubesetzung war notwendig geworden, weil der bisherige Vorstand und sein Vertreter für ihre Firmen beruflich ins Ausland gegan- gen sind und deshalb ihre Tätigkeit nicht weiter wahrnehmen können.

Hermann:

Dr. Hans-Peter Fatscher (Qiagen), der bis- herige Vorstand, ist in die USA gegangen, Dr. Bhuwnesh Agrawal hat für Roche eine Aufgabe in Indien übernommen. Der neue Vorstand besteht jetzt aus Wolfgang Barthel von Sigma-Aldrich und Friedel Horneff von Bio-Rad als Stellvertreter. Ich bin der Vorsit- zende seit Juli.

Laborwelt:

Im Oktober wird die LSR AG auch poli- tisch erstmals sichtbar. Gemeinsam mit der VDGH werden Sie eine Veranstaltung zum Thema personalisierte Medizin durchfüh- ren…

Ebel:

Es handelt sich um den zweimal jährlich stattfindenden Lokaltermin des VDGH, an dessen Planung die LSR AG erstmals mitbeteiligt ist. Wir haben ein Thema gefun- den, das sowohl die Life Science Research- Firmen betrifft, als auch von besonderem Interesse für die diagnostischen Firmen ist. Hintergrund ist, dass es technologische Entwicklungen gibt, an denen auch einige unserer Unternehmen beteiligt sind, die es heute ermöglichen, Gewebebanken auf molekularer Ebene nachträglich zu analysie- ren. Auf Basis der entsprechenden Research Tools können diagnostische Tests entwickelt werden, die helfen zu verstehen, weshalb morphologisch-histologisch ähnliche Prä- parate auf verschiedene Therapieansätze nicht gleich reagieren. Das ist diagnostisch ein ganz neues Feld und auch von politischer Bedeutung, da es das Gesundheitssystem betrifft, dessen Finanzierung beansprucht und zahlreiche Fragen über den Umgang mit den Gewebeproben und erhaltenen Daten aufwirft.

Laborwelt:

Was sind die Ziele der LSR AG für 2008?

Ebel;

Wir wollen die selbstgestellten Aufgaben un- serer Arbeitskreise rasch umsetzen. Daneben wollen wir natürlich weiter wachsen.

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8. Jahrgang | Nr. 3/2007 | 27 Setting standards in

8. Jahrgang | Nr. 3/2007 | 27

Setting standards in analytical science

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Liquid Handling

Schnelle Zyklen und geringe Kosten: Nanoliter-PCR

Holger Eickhoff, SCIENION AG, Dortmund; Andreas Dahl, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin

Die Kombination hochpräziser Dispenser im Piko- und Nanolitervolumenbereich und stark miniaturisierter Mikrotiterplattenformate ermöglicht die Durchführung von PCR- Reaktionen in Nanolitervolumina. Die kleinen Volumina erlauben schnelle Heiz- und Kühlschritte und die Durchführung einer kompletten PCR in weniger als 10 Minuten. Dabei werden im Vergleich zu Standardsystemen typischerweise maximal 10% der sonst üblichen Reagenzienmengen eingesetzt, was insbesondere im Hochdurchsatzbetrieb zu massiven Kosteneinsparungen führt. Kombiniert mit einer Online-Detektion für Real-time- oder Endpunktbestimmung ermöglicht die hier vorgestellte Kombination einen sensitiven, kosteneffektiven und schnellen Nachweis von Nukleinsäuren.

Die Miniaturisierung von PCR-Reaktionen ist ein Forschungsfeld, welches in zwei generellen Ansätzen verfolgt wird. Neben Durchflusssystemen, bei denen sich ein kleiner Kanal durch mehrere Heiz- und Kühlzonen windet, werden in einem weiteren Ansatz auch miniaturisierte Mikroplatten- systeme für PCR im Submikroliterbereich verwendet. Dabei gilt in beiden Ansätzen, dass das Verhältnis von Reaktoroberfläche zu Reaktionsvolumen im Gegensatz zu konventionellen Ansätzen stark in Richtung einer großen Oberfläche verändert wird. Dies führt zu effizienterer Wärmeübertragung auf das Reaktionsgemisch und ermöglicht so die Durchführung einer kompletten PCR in nur wenigen Minuten.

Damit PCR-Reaktionen im Nanoliterbereich (nano-PCR) erfolgreich durchgeführt wer- den können, müssen sowohl die Präsenz von die Polymerasen inhibierenden Stoffen als auch die biochemischen Wechselwirkun- gen zu der vergrößerten Kontaktfläche mit dem Reaktionsgefäß minimiert werden. Während Durchflusssysteme und weiter integrierte Lab-On-A-Chip-Systeme große Skalierungseffekte durch die Verwendung von Siliziumtechnologie und der damit ver- bundenen günstigen Herstellung solcher Strukturen in der Zukunft versprechen, ist in den meisten Labors die Verwendung von PCR-Mikroplattensystemen Realität. Durchflusssysteme sind in der Regel ge- schlossene Systeme mit einem nicht standar-

in der Regel ge- schlossene Systeme mit einem nicht standar- Abb. 2: Online-Volumenbestimmung von dispensierten Tropfen.

Abb. 2: Online-Volumenbestimmung von dispensierten Tropfen. Mit einem Strobos- kopblitzlicht werden dispensierte Tropfen angeleuchtet und mit einer CCD-Kamera live aufgenommen. Die gezeigte Bildschirmauf- nahme ist ein Ausschnitt aus der sciFLEXAR- RAYER-Software, auf dem die Düseneinstel- lungen links oben (blau hinterlegt: Pulshöhe 88 Volt, Pulslänge 48 µs, Tropfenfrequenz 500 Hertz), das Livebild der CCD-Kamera mit dem automatisch identifizierten Tropfen rechts (Tropfenschwerpunkt im Fadenkreuz) und das dispensierte Volumen von 285 Pikolitern unten links angezeigt werden

disierten Interface für die Probenaufgabe, die spezifisch für einen bestimmten Assay gefertigt werden. Im Gegensatz dazu sind miniaturisierte Mikroplattensysteme offene Plattformen, die mit geeigneten Dispensern leicht und – wenn nötig – mehrfach befüllt werden können und so für eine Vielzahl von Assays nutzbar sind. Die Verwendung von offenen Kavitäten in PCR-kompatiblem Po- lypropylenmaterial erlaubt dabei eine freie Auswahl von einzelnen Reaktionsplätzen und die Adaptierbarbeit an verschiedene Assays und Detektionssysteme (Abb. 1). Diese im Vergleich zu geschlossenen Sy- stemen größere Flexibilität in der Applika-

Sy- stemen größere Flexibilität in der Applika- Abb. 1: Links: Parallele Bestückung der nano-PCR-Platten
Sy- stemen größere Flexibilität in der Applika- Abb. 1: Links: Parallele Bestückung der nano-PCR-Platten

Abb. 1: Links: Parallele Bestückung der nano-PCR-Platten mit vier Dispensern auf einem gekühlten sciFLEXARRAYER-Probenhalter zur Vermei- dung von Evaporation und Kondensation. Rechts: Detailaufnahme während der Abgabe von Probengemischen in einzelne Kavitäten. Abstand der Kavitäten: 1mm.

tionsentwicklung gab den Ausschlag für die Verwendung von miniaturisierten Testplatten für die hier dargestellten Ergebnisse.

Dispensing

In dem hier geschilderten Ansatz werden flexible, kontakt- und kontaminationsfrei arbeitende Dispensiersysteme für die Befül- lung der entsprechenden Reaktionskavitäten verwendet. Die dabei dispensierten Volumina liegen zwischen 100 Pikolitern und 200 nl (Abbildung 2). Die Abgabe dieses Volumens erfolgt als einzelner Tropfen oder als eine Summe von Tropfen in weniger als einer

Standardsystemen sehr viel kürzer. Dies ist im Wesentlichen auf kürzere Diffusionswe- ge und einen effizienteren Wärmetransfer zurückzuführen, der durch die relativ zum Volumen großen Oberflächen erzeugt wird. Gleichzeitig wird durch die Miniaturisierung auch der Energieverbrauch pro Reaktion stark verringert.

Schnelle PCR

Die hier vorgestellte Plattform befindet sich in der fortgeschrittenen Prototypenentwick- lung. Neben der weiteren Optimierung der verwendeten Werkstoffe, Materialien und

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Abb. 3: A. Real-time-Fluoreszenz-Monitoring: Amplifikationskurven für 200 nl real-time PCRs in einer Studie zur Untersuchung der gewebsspezifischen Genexpression in der Maus (Dahl et al., Biomol.Dev. 2007). B. Typischer Output eines TaqMan-basierten SNP-Genotypisierungsex- perimentes in 200 nl nach Endpunktbestimmung. Proben mit gleichen Genotypen bilden leicht identifizierbare Cluster.

Sekunde und weist dabei einen online gemes- senen Dispensierfehler von weniger als 2,5% auf. Neben dieser hohen Präzision sorgt die Geschwindigkeit der abgegebenen Tropfen – typischerweise etwa 2-3 m/s – dafür, dass eine effiziente Mischung der Reaktionspartner erfolgt, bevor der erste Schritt im PCR-Proto- koll gefahren wird. Die einzelnen experimentellen Schritte erfol- gen dabei ähnlich wie in manuellen oder kon- ventionellen Laborautomatisierungsystemen:

Reaktionsmixe, Primer und Templates werden mit dem sciFLEXARRAYER-Dispenser in den miniaturisierten Testplatten gemischt und diese Testplatten mit transparenten Folien ver- schlossen. Nach Überführung in eine integrier- te Temperatur- und Detektionseinheit kann die Intensität der Fluorophore in Echtzeit nach jedem Zyklus mit einer CCD-Kamera aufge- nommen oder nur eine Detektion im Rahmen einer Endpunktbestimmung durchgeführt werden. Die dabei erfassten Intensitätsdaten werden für die einzelnen Kavitäten integriert, mit Standards abgeglichen und in den hier gezeigten Experimenten mit Standard-Ta- bellenkalkulationsprogrammen ausgewertet (Abb. 3). Die Zykluszeiten der nano-PCR sind verglichen mit den benötigten Zeiten von

Protokolle ist aber schon jetzt eine leistungs- fähige Plattform entstanden, deren Kapazität und Durchsatz etwa 10-fach höher ist als bei konventionellen Systemen. Dabei werden die Kosten durch die Miniaturisierung massiv ge- senkt und betragen, abhängig vom Durchsatz, in der Regel nur noch etwa 10% der Kosten einer Standard-PCR-Reaktion. Zentrale Anwendungen der hier gezeig- ten Technologieplattform sind real-time PCR-basierte Genexpressionsanalysen und SNP-Genotypisierungen. Dabei können im miniaturisierten Format die Assaykompo- nenten für konventionelle PCR, qPCR oder sondenbasierte homogene Assays eingesetzt werden, so dass nach erfolgter Protokollanpas- sung schnell mit vergleichbaren Ergebnissen gerechnet werden kann.

Korrespondemzadresse

Dr. Holger Eickhoff SCIENION AG Otto-Hahn-Str. 15 44227 Dortmund eMail: eickhoff@scienion.com

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eMail: eickhoff@scienion.com Kennziffer 23 LW 05 · www.biocom.de LABOR WELT 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 |
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Interview

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„Appleras PCR-Motordeckel- Patent ist nichtig!“

Dr. Christian Kilger, VOSSIUS & PARTNER, Berlin

Streitigkeiten um PCR-Patente sind wegen der großen Bedeutung des Verfahrens in der Moleku- larbiologie und der damit verbundenen Marktbedeutung seit langem an der Tagesordnung. Anfang August traf die Technische Beschwerdekammer des Europäischen Patentamtes in München eine Entscheidung, die den exklusiven Marktanspruch einer Firma auf die in den neunziger Jahren entwickelten Thermocycler mit Motordeckel bricht. Weil das Patentierungskriterium der Neuheit zum Zeitpunkt der Patentanmeldung nicht gegeben war, erklärte die Beschwerdekammer das Patent für nichtig und ermöglicht es so den Firmen, die gegen den damit verbunden Anspruch Einspruch erhoben hatten, ihre PCR-Maschinen mit Motordeckel wieder in Europa zu vertreiben. LABORWELT sprach kurz nach der Entscheidung mit Dr. Christian Kilger, Leiter des Berliner Büros der Kanzlei Vossius & Partner, die die protestierenden deutschen Firmen vertrat.

Laborwelt:

Herr Dr. Kilger, Anfang August haben Vossius & Partner bekanntgegeben, dass die Techni- sche Beschwerdekammer des Europäischen Patentamtes eine Entscheidung im Konflikt um das so genante PCR-Motordeckelpatent getroffen hat, die den Wettbewerb unter verschiedenen Thermocycler-Anbietern wie- derzubeleben verspricht. Was sind überhaupt diese Motordeckel, und was macht sie so in- teressant für Firmen, dass vor Gericht darum gestritten wird?

Kilger:

Zunächst will ich festhalten, dass schutz- würdige Patente den Wettbewerb per Saldo nicht behindern. Ein Patent ist in aller Regel ein „Incentive“, um Innovation zu schaffen. Wir sind dem rechtsbeständigen Patentschutz verpflichtet, um so den Wettbewerb durch Belohnung schutzwürdiger Erfindungen anzuregen. Im Motordeckel-Fall hat die Patentinhaberin allerdings aus einem aus unserer Sicht offensichtlich schutzunfähigen Patent mehrere Wettbewerber mit Patent- verletzungsklagen überzogen; dem sind wir erfolgreich entgegengetreten. In den späten Achtzigern und frühen neunziger Jahren haben verschiedene Kon- sortien versucht, als erste das menschliche Erbgut und andere Genome zu sequenzieren. Angesichts des zur Gensequenzierung erfor- derlichen gewaltigen technischen Aufwands wurde eine Automatisierung vieler moleku- larbiologischer Verfahren notwendig. Hierzu wurden die PCR-Geräte in Pipettierroboter integriert und die Motordeckel für die PCR- Maschinen entwickelt. Heute sollen die motorbetriebenen Heizdek- kel in erster Linie dazu dienen, verschiedene PCR-Gefäße sicher mit einem einstellbaren und reproduzierbaren Druck automatisch

zu verschließen. Dies ist vor allem bei 96er Thermoplatten mit Gummimattensystemen oder bei 384er-Thermoplattensystemen sehr wichtig. Mittlerweile gibt es viele Hersteller, die fast nur noch über Cycler verfügen, die diese Motorfunktion beinhalten. Ein manuelles Einstellen ist bei diesen Instrumenten nicht mehr vorgesehen. Wie bei jeder Technolo- gie ist auch bei Thermocyclern so, dass ein Kunde bei einem Hersteller alle Varianten im Programm erwartet, also auch einen Motordeckel. Bin ich als Hersteller aus Patentgründen nicht in der Lage, einen bestimmten Markt zu bedienen, dann habe ich ein Problem. Unter Umständen geht dann das gesamte PCR-Geschäft an einen Wettbewerber.

Laborwelt:

Zurück zur jetzt getroffenen Entscheidung. Wie sieht sie aus, was war ihre faktische Basis, und was macht sie so besonders?

Kilger:

Das Europäische Patent „Thermocyclervor- richtung“ mit der Nummer EP 1 013 342 B1 wurde am 7. August 2007 um zirka 20.00 Uhr von der Technischen Beschwerdekammer 3.3.05 des Europäischen Patentamtes wider- rufen. Kurzum – das Patent ist weg. Das Patent wurde aufgrund mangelnder Neuheit widerrufen. Gemeinsam mit meinem Kollegen, Dr. Dieter Heunemann, und der Ein- sprechenden Eppendorf AG haben wir geltend gemacht, dass der „Power Bonnet“ der PTC 200-Maschine der Firma MJ Research schon vorher alle Merkmale des Patentanspruchs offenbart hatte. Aus unserer Sicht hatte auch Roche bereits zuvor einen automatischen PCR-Deckel der Art entwickelt, wie Applera versucht hat, ihn in vielen Patentverletzungs-

wie Applera versucht hat, ihn in vielen Patentverletzungs- Dr. Christian Kilger ist in den USA geboren

Dr. Christian Kilger ist in den USA geboren und wuchs sowohl in Deutschland als auch in den USA auf. Nach seinem Biologiestudium mit Schwerpunkt Genetik und Biochemie hat er im Labor von Svante Pääbo seine Doktorarbeit über Techniken der Nukle- insäure-Sequenzierung geschrieben. Als Post-Doc am MPI für Evolutionäre Genetik hat Dr. Kilger häufig auch am EMBL doziert. Im Jahre 1997 nahm Dr. Kilger eine Stelle bei der LION bioscience AG an, wo er für alle Schutzrechtsangelegenheiten verantwortlich war. Dr. Kilger wurde 2003 als Europäischer Patentanwalt zugelassen und 2006 als deut- scher Patentanwalt zugelassen. Nach seiner Zeit bei LION war Herr Kilger Geschäftsfüh- rer der ipal GmbH in Berlin bevor er in die Kanzlei Boehmert & Boehmert eintrat. Seit Januar 2007 leitet Christian Kilger das Büro von VOSSIUS & PARTNER in Berlin. Schwer- punkt seiner Tätigkeit sind Bio/Pharma Patenterteilungsverfahren, Nichtigkeits- und Einspruchsverfahren sowie Patentverlet- zungsverfahren.

klagen zu monopolisieren. Wie häufig bei diesen Verfahren, die bisweilen einige Jahre zurückreichen, hängt ein Teil der Erfolgschan- cen neben der Arbeit des Patentanwalts an ei- ner guten Recherche. Es war unseren Parteien PEQLAB, Clemens und Sensoquest gelungen, die Gebrauchsanweisung des Power Bonnet aufzuspüren. Eppendorf hat es gar geschafft, ein altes Gerät zur Verhandlung mitzubringen, welches dann aber nicht benötigt wurde. Ich denke, dass das Patent wegen mangelnder Neuheit widerrufen wurde, ist aus unserer Sicht erfreulich. So war es nicht mehr nötig, über die erfinderische Tätigkeit zu diskutie- ren, und damit haben wir uns den zweiten Verhandlungstag gespart.

Laborwelt:

Wie sah die rechtliche Situation davor aus und wie kam sie zustande?

Kilger:

Das Patent wurde im Jahre 1999 von der MWG Biotech AG angemeldet. Im Rahmen

Ausgangsmaterialien:

kultur,

Buffy

Abstriche,

Bakterien,

Coat,

Mundschleimhaut,

Vollblut,

Viren,

Zecken,

Pflanzen,

RNA,

Gewebe,

Pilze,

HisTag-Proteine

Haare,

Mausschwanz,

HOPE-Gewebe,

Zell- LGAs,

Knochen,

und

weitere

einer außergerichtlichen Einigung in einer Patentverletzungssache zwischen Applera und MWG, hat MWG das Motordeckelpatent im Jahre 2005 auf Applera übertragen. Bei dieser Patentverletzungssache ging es um ein weiteres Applera-Patent, das Heizdeckelpatent. Der Beschwerdesache T 868/06 war ein Einspruch der Firma Eppendorf gegen das Motordeckelpatent vorausgegangen. In diesem Einspruch- verfahren wurde das Patent jedoch in Gänze aufrechterhalten. Dage- gen hat Eppendorf Beschwerde eingelegt. In der Folge hat Applera eine Vielzahl von Firmen in Deutschland aus dem Motordeckelpatent wegen Patentverletzung verklagt – und zwar ohne Berechtigungs- anfrage und Abmahnung – die Firmen wurden also mit der Klage überfallen. Wir haben eine ganze Reihe von Parteien vertreten. Die Firmen PEQLAB, Clemens und Sensoquest sind auf unseren Rat hin dem Beschwerdeverfahren am EPA beigetreten. Dadurch dass das Patent widerrufen wurde, konnten wir zeigen, dass die Klage unbe- gründet war. Andere Parteien haben sich aber wohl aus verschiedenen Gründen im Vorfeld mit Applera geeinigt. Eine Partei hat sogar in der Nacht vor der mündlichen Verhandlung am EPA ihren Beitritt zurückgezogen. Ich gehe davon aus, dass es auch hier eine Einigung gegeben hat.

Laborwelt:

Wer profitiert von der neuen Rechtslage? Gibt es nun ein neues Schlüs- selpatent und eine damit verbundene Monopolstellung eines einzelnen Unternehmens?

Kilger:

Von der Rechtslage profitieren zunächst die von uns vertretenen Firmen und Eppendorf. Grundsätzlich kann nun aber jeder einen Thermocycler mit Motordeckel herstellen, soweit es das jetzt widerrufene EP 1 013 342 B1-Patent betrifft. Ob jene Parteien von der Entscheidung profitieren, die sich im Vorfeld geeinigt haben, kann ich nicht sagen. Mir ist nur bedingt bekannt, wie die Einigungsverträge zwischen Applera und diesen Parteien gestaltet sind.

Laborwelt:

Ist die Entscheidung endgültig und die Rechtslage klar, oder ist nach Ihrer Einschätzung mit weiteren Verfahren zu rechnen?

Kilger:

Nein, die Entscheidung ist endgültig – das Patent wurde widerrufen.

Laborwelt:

Sind ähnliche Verfahren auch außerhalb Europas anhängig und wie ist deren Stand?

Kilger:

Das kann ich Ihnen leider nicht sagen.

Laborwelt:

Was bedeutet die Entscheidung für Nutzer entsprechend ausgestatteter Thermocycler in Europa?

Kilger:

Wären die von uns vertretenen Parteien unterlegen, so wäre Applera berechtigt gewesen, den Vertrieb und den Besitz von PCR-Maschinen, welche mit einem Motordeckel ausgerüstet sind, zu untersagen. Des Weiteren könnten sie Auskunft darüber zu verlangen, wer einen Motordeckel geliefert bekommen hat. Sie können sich vorstellen, wie unangenehm die Preisgabe von Kundeninformationen sein kann. Ins- besondere, weil auch der Nutzer solcher Maschinen ein potentieller Patentverletzer gewesen wäre. Auch die Vernichtung des Patent-ver- letzenden Gegenstandes wäre eine Option gewesen.

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8. Jahrgang | Nr. 5/2007 | 31

Quelle: Fritz Eckstein, MPI für experimentelle Medizin, Göttingen

Meeting

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Die nächste Welle an Biotech- Wirkstoffen: Oligonukleotide

Dr. Joachim Klein, RiNA Netzwerk RNA-Technologien GmbH, Berlin

Führende internationale Experten aus Pharma- und Biotech-Unternehmen sowie der Wis- senschaft geben Anfang Oktober in Berlin einen Überblick über eines der derzeit wissen- schaftlich wie wirtschaftlich dynamischsten Forschungsfelder: Oligonukleotid-Wirkstoffe. Was die Organisatoren um Tom Tuschl (New York) und Gunther Hartmann (Bonn) an Sprechern nach Berlin zum 3. Treffen der Oligonukleotide Therapeutic Society (OTS, 4.–6. Oktober 2007) gebracht haben, verspricht einen exzellenten Blick in die Unternehmenspipelines und auf den aktuellen Forschungsstand.

Die fortgeschrittenstenArzneimittelkandidaten der bekanntesten Wirkstoffklasse, die siRNAs, die sich bereits in Phase-III-Studien der klini-

schen Entwicklung befinden, sind unlängst auf den Radarschirm großer Pharmaunternehmen geraten. Dies scheinen die Akquisitionen von

Tab. 1: Oligonukleotid-Wirkstoffe in klinischer Prüfung

SIRNA durch Merck & Co. (Volumen 1,1 Mrd US-$) oder Alnylam Europe durch F. Hoff- mann-LaRoche (Gesamtvolumen 800 Mio. US-$) zu belegen. Die Firmenentwicklung bei den RNA-Interfeerenzspezialisten ist derzeit durch den Aufbau eines möglichst guten Pa- tentportfolios gekennzeichnet. So haben der Antisense-Spezialist Isis Pharmaceuticals und der RNA-Interferenz-Pionier Alnylam Inc. un- längst ein Joint-Venture namens Regulus Thera- peutics LLC. gebildet um Wirkstoffe, gegen die körpereigenenen micro-RNA-Regulatoren der Genexpression zu entwickeln. Neben neuesten Entwicklungen aus dem Gebiet der siRNA- und miRNA-Wirkstoffe werden sich zahlreiche Unternehmenspräsentationen um Antisense- Wirkstoffe, Ribozym-, und Aptamerwirkstoffe drehen. Daneben bildet die Immunstimula- tion durch RNAs wie CpG-Oligonukleotide, immunstimulatorische isRNAs, RNA-Im- munstimulatoren, die an sogenannte Toll-like Rezeptoren (TLRs) binden, und 5‘Triphosphat- RNAs (3PRAs) einen zweiten Schwerpunkt der wissenschaftlichen Tagung.

Kategorie

Firma

Wirkstoff

Phase

Target/Krankheit

Antisense (RNase H aktiv)

ISIS ISIS ISIS ISIS (with Antis.Therap.) ISIS (with OncoGenex) ISIS (with ATL) ISIS (with Lilly) ISIS (with Lilly) Geron

Vitravene

zugelassen

CMV Retinitis/CMV Hoh. Cholesterin/ApoB-100 Diabetes/PTB-TB Multiple Sklerose/VLA-4 Krebs/Clusterin Psoriasis Krebs/Survivin

301012

Phase 2

113715

Phase 2

ATL 1102

Phase 2

OGX-011

Phase 2

ATL 1101

LY2181308

Phase 1

LY2275796

Phase 1

Krebs/eIF4E

GRN163L

Lymphocyt.

Leukäm.(Telomerase)

Genta

Genasense

Phase 3

Fortgeschrittenes Melanom Asthma AML/Ribonucleotid-Reduktase malignes Gliom/TGF-B2 Lymphocyt. Leukemie/Bcl-2 Myastenia Gravis/AChE

Topigen

ASM8

Phase 2

Lorus Therapeutics

GTI-2040

Phase 2

Antisense Pharma

AP 12009

Phase 2

Santaris

SPC 2996

Phase 1

Ester Neuroscience

Monarsen (1)

Phase 1

Morpholinos (Translationsarrest)

AVI Biopharma

Resten-MP (AVI-4126)

Phase 2

Cardiov. Restenose/c-myc Drug Metabl./Cytochrome P450 HCV

AVI Biopharma

AVI-4557

Phase 1

AVI Biopharma

AVI-4065

Phase 1

Ribozyme

SiRNA

ANGIOZYME

Phase 2

Krebs/VEGF-Rezeptor/FLT1

siRNAe

Alnylam OpkoCorp. (Acuity Pharma)

RSV01

Phase 2

RSV/Nucleocapsid (N) protein AMD (VEGF)

Bevasiranib

Phase 3

Aptamere

EyeTech/Pfizer

Macugen

zugelassen

AMD (VEGF) Coagulation/factor IXa Coagulation/Antidote to RB006

Regardo Biosciences

RB006

Phase 1

Regardo Biosciences

RB007

Phase 1

TLR9-Agonisten (CpG, immunstimulator.)

Coley Coley (with Pfizer) Coley (for Sanofi-Aventis) Dynavax Idera

CPG 7909

Phase 2

Melanom/TLR 9 Cancer (not appr. by FDA)/TLR9

PF-3512676

Phase 2

AVE 7279

Phase 1

Asthma/TLR9

1018

Phase 3

Asthma

HYB 2055

Phase 2

Krebs

Decoys

Avontec

AVT-01 (3)

Phase 2

Asthma/STAT-1

Antisoma

AS1411

Phase 2

Krebs/Nucleolin

Anesiva

Avrina

Phase 1

Ekzem/NF-κB

Die ersten durch die US Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen RNA- Wirkstoffe scheinen zu belegen, dass nach der Welle monoklonaler Antikörper eine zweite Generation zulassungsfähiger Biomoleküle heranreift (vgl. Tabelle). Die Hauptentwick- lungsrichtungen in Forschung und Industrie sind dabei derzeit die RNA-Interferenz und die Immunerkennung von Nukleinsäuren.

Vielfalt der Technologieplattformen

„Die Entdeckung der Genregulation durch kleine RNAs und ihre Anwendung zur Ent- wicklung von Wirkstoffen ist derzeit eine der spannendsten Gebiete der biomedizinischen Forschung“, erklärt der Alnylam-Mitgründer und Co-Organisator der OTS-Tagung Tom Tuschl (Rockefeller University). „Neue Ent- deckungen im Feld der Immunerkennung von Nukleinsäuren markieren einen Durch- bruch im Verständnis viraler Infektionen und werden zu neuen antiviralen und Krebs-The- rapien führen“, erkärt Gunther Hartmann (Universität Bonn), Co-Chair der OTS-Tagung. Antivirale Strategien, die die TLR-Bindung nutzen, befinden sich derzeit in der klinischen Phase III-Testung. Leitende Wissenschaftler von Elli Lilly, Merck & Co., Santaris Pharma, Archemix,

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Freude beim Börsengang der im vergangenen Jahr von Merck & Co übernommenen SIRNA

Sirna Therapeutics, Isis Pharmaceuticals, OncoGenex, Antisense Pharma und Topi- gen Pharma geben auf der Tagung einen Einblick in ihre klinische Entwicklung und dikutieren Themen wie Qualitätskontrolle von siRNA-Wirkstoffen, Herstellung und Zielsteuerung/Verabreichung. Internationale Spitzenforscher präsentieren wissenschaftlich heiße Eisen, wie neue Technologien für das Aptamer-Screening, lichtprogrammierbare Oligonukleotide oder RNAs als Krebs-Dia- gnostika und -Therapeutika.

Spezielle Veranstaltungsthemen fokussieren auf die Mechanismen des Gene Silcencing und das Ansprechen von Nukleotidsequenzen auf Wirkstoffe, auf Tiermodelle und die präklini- sche Entwicklung. Das von Volker Erdmann initiierte RiNARNA-Netzwerk ist verantwort- lich für die Organisation der Veranstaltung.

Korrespondenzadresse

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8. Jahrgang | Nr. 5/2007 | 33

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PCR

 

Keine unvorhergesehenen Ereignisse mehr bei PCR und quantitativer real-time PCR

Dr. Marcus Neusser, Bio-Rad Laboratories, München

Seit der Erfindung der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 1,2 -Methode durch Kary Mullis 1985, für die dieser 1993 den Nobelpreis für Chemie erhielt, wurde diese Methode zu einem der be- deutendsten Handwerkszeuge der modernen Molekularbiologie. Die PCR dient der spezifischen Amplifikation von RNA/DNA-Sequenzen, zu deren Nachweis und neuerdings auch zu deren exakter Quantifizierung mittels quantitativer real-time PCR und Fluoreszenzmarkierung. Neueste technologische Entwicklungen dienen dem quantitativen Nachweis seltener Proteine mit Immuno-PCR 3,4 und dem schnellen Nachweis von Einzelbasenaustauschen 5 , sogenannten SNPs. Die SNPs sind unter anderem Indikatoren spezifischer Krankheitsbilder und haben prognostische Bedeutung dafür, ob und wie hoch das individuelle Erkrankungsrisiko ist. Viele Anwender der PCR-Methode sind bereits einmal den „Geistern“ in der PCR begegnet. Gemeint sind damit „unerklärliche“ Ergebnisse wie falsch-positive Nachweise oder die Amplifikation unerwünschter PCR-Produkte, die eine Konkurrenz zu den eigentlichen spezifischen PCR- Produkten darstellen. Auch das Ausbleiben jeglicher Amplifikationsprodukte unterliegt dem Einfluss dieser vermeintlichen „PCR-Geister“. Dieser Beitrag soll helfen, unerwünschte PCR-

Resultate zu vermeiden. Zugleich ist er Anleitung, effektive Maßnahmen zu ergreifen, um den

unerklärlichen Phänomenen auf den Grund zu gehen.

Anwender, für die die PCR eine neue Metho-

dik darstellt, unterschätzen häufig die hohe

Nachweisempfindlichkeit und das damit

einhergehende Risiko falsch-positiver und

artifizieller PCR-Ergebnisse. Bereits bei der Probenisolierung sollten bestimmte Richtlini-

en eingehalten werden, um Frustration und Verwirrung in den nachfolgenden Schritten zu vermeiden. Der Laborbereich, in dem die Probenaufarbeitung (DNA-/RNA-Isolierung) durchgeführt wird, ist räumlich strikt von den

übrigen Laborbereichen, in denen die Ampli- fikation und der Nachweis der PCR-Produkte erfolgt, zu trennen. Es werden in allen Berei- chen ausschließlich gestopfte Pipettenspitzen und nicht gepuderte Handschuhe verwendet; PCR-Wasser sollte kommerziell bezogen und in kleinen Mengen zum Einmalgebrauch ge- lagert werden. Laborbekleidung und Pipetten verbleiben im jeweiligen Laborbereich, um ein Verschleppen von PCR-Endprodukten in den Bereich der Probenisolierung und

von PCR-Endprodukten in den Bereich der Probenisolierung und Abb.1: SmartSpec T M Plus Spectrophotometer (Bio-Rad

Abb.1: SmartSpec TM Plus Spectrophotometer (Bio-Rad Laboratories GmbH)

LABORWELT

PCR-Vorbereitung zu vermeiden. Der Grund:

PCR-Produkte lassen sich sehr einfach, etwa über einen Luftstrom, übertragen.

Isolierung der DNA/RNA

Es werden im wesentlichen zwei Methoden verwendet. Die klassische Phenol/Chloro- form-Extraktion ist sehr gut geeignet, um große Mengen an DNA/RNA und auch um aus sehr fetthaltigem Material (z.B. Hirnge- webe) DNA zu isolieren. Der Nachteil dieser Methode ist der Umgang mit den toxischen Substanzen Chloroform und Phenol, die zu- sätzlich eine kostenaufwendige Entsorgung beanspruchen. Ein weiterer Nachteil – in der PCR können Phenolreste eine Inhibition der Reaktion verursachen. Die auf Kieselsäure basieren- de Extraktion mittels Säulchen stellt eine moderne, sehr zeiteffiziente und saubere Aufarbeitungsmethode dar, die auch für Kleinstmengen geeignet ist sowie die par- allele Aufarbeitung einer großen Anzahl von Proben ermöglicht (high throughput analysis). Die Aufarbeitung kann unter Ver- wendung einer Vakuumstation vereinfacht werden, indem die Waschschritte für alle Proben (bis zu 96 in der Aurum Vacuum-

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Station) gleichzeitig erfolgen. RNA-Proben werden während der Isolierungsschritte mit DNAse behandelt, damit kontaminierende DNA nicht als Konkurrenz zur eigentlichen RNA beziehungsweise cDNA in der anschlie- ßenden PCR co-amplifiziert wird und damit zu falschen Ergebnissen führt. Es ist kein Um- gang mit toxischen Substanzen erforderlich, und Inhibitoren (z.B. Häm aus Blutproben) werden effizient beseitigt.

DNA/RNA-Qualitätskontrolle

Bevor die isolierte DNA/RNA im PCR-Pro- zess verwendet wird, sollte immer eine Qua- litätskontrolle erfolgen. Spektralphotometer wie das SmartSpec TM Plus (Bio-Rad Laborato- ries GmbH) geben Auskunft über die Menge und Reinheit der isolierten DNA, und die Resultate können zur Datendokumentation direkt ausgedruckt werden (Abb. 1) oder auf einen Rechner übertragen werden. Für eine Qualitätskontrolle der RNA kann bei ausreichender Menge (minimal 100ng) die klassische Gelelektrophorese verwendet wer- den. Das Verhältnis der ribosomalen 28S- und 18S-RNA-Banden sollte 2 zu 1 betragen. Ein RNA-Hintergrund durch Abbaufragmente sollte nicht sichtbar sein, da dies die Degra-

dation des wertvollen Materials anzeigt und somit die Wahrscheinlichkeit einer effizienten Amplifikation reduziert ist. Stehen nur geringste Mengen der wertvol- len RNA zur Verfügung, so resultiert daraus die Notwendigkeit, die Qualitätskontrolle mit Kleinstmengen durchzuführen, um nicht zu viel Material für die anschließenden Expe- rimente zu verlieren. In diesem Fall erfolgt die Analyse in einem Microfluidic-System, das auf einem Microchip alle Laborbereiche der konventionellen Gelanalyse vereint. Nur geringste Mengen (0,1-500ng) der kostbaren DNA/RNA werden in die gelbefüllten Mi- krokanäle des Chips injiziert und durchlaufen in wenigen Sekunden eine Elektrophorese- auftrennung mit gleichzeitiger Färbung und Fluoreszenzdetektion in Form eines Elek- tropherogramms. Die gemessenen Mengen sowie die Reinheit und Unversehrtheit der RNA-Probe werden durch das charakteristi- sche Profil der Mengen an 28S- und 18S-RNA angezeigt und zusätzlich optisch in Form eines simulierten Gelbildes anschaulich prä- sentiert (Abb.2). Eine RNA-Degradation lässt sich auf diese Weise einfach detektieren, und die Proben werden bei schlechter Qualität von weiteren Untersuchungen ausgeschlos- sen. Dadurch werden Material und Zeit

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3 rd ANNUAL MEETING OF THE OLIGONUCLEOTIDE THERAPEUTIC SOCIETY Tom Tuschl, Rockefeller University, and Gunther
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Abb. 2: CT-Shift in degradierten RNA-Proben, Qualitätskontrolle mit dem Experion TM Microfluidic system (Bio-Rad Laboratories GmbH) und an- schließende Amplifikation mit dem iQ5 TM Real-Time-PCR-System 6 .

eingespart, und es werden keine unnützen oder irreführenden Daten erhoben.

PCR-Setup

Der Bereich, in dem die PCR-Vorbereitung erfolgt, also Mastermix und DNA/RNA-Pro- ben zusammengeführt werden, ist strikt vom Detektionsbereich zu trennen. Im übrigen gelten hier die gleichen Richtlinien wie für den Probenisolierungsbereich genannt. In der modernen PCR-Methodik ist ein Pipettieren der Proben auf Eis bei 4 °C nicht mehr erforderlich, denn es werden sogenannte HotStart-Taq-Polymerasen verwendet. Diese

Enzyme sind initial inaktiv und werden erst durch einen einleitenden Hitzedenaturie- rungsschritt bei 95° C bis 98° C unmittelbar vor der PCR-Reaktion aktiviert. Je nachdem, ob antikörperassoziierte oder chemisch modi- fizierte Taq-Polymerasen verwendet werden, dauert die initiale Aktivierung von 15 Sekun- den bis zu 15 Minuten. Durch den HotStart ist gewährleistet, dass beim ersten Anbinden der genspezifischen Startermoleküle (Primer) an die Ziel-DNA/cDNA unmittelbar die gewünschte Neustrangsynthese durch die Taq-Polymerase erfolgt. Wenn es darum geht, möglichst uniforme und gut reproduzierbare Ergebnisse zu erzie-

len, ist die Verwendung von Fertigreagenzien zu empfehlen. Diese unterliegen strengen Qualitätskontrollen und verwenden hoch- wertige Einzelkomponenten und optimierte Puffer, die eine maximale Produktausbeute garantieren. Primer-Stammlösungen sollten in TE-Puf- fer gelagert werden, und ein wiederholtes Auftauen und Einfrieren ist zu vermeiden. Idealerweise wird eine solche Primer-Stamm- lösung einmalig in kleinere Einheiten abge- füllt, bei –20° C gelagert und die Portionen nur einmalig aufgetaut. Die als Gebrauchs- lösung verdünnten Primer werden für einen begrenzten Zeitraum von weniger als 10 Tagen

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36 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007

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bei 4° C gelagert und im PCR-Prozess verwendet. Gleichermaßen wird mit DNA-Standards und positivem und negativem Kontrollmaterial verfahren. Um Konzentrationsverluste der titrierten DNA-Standards zu vermeiden, kann mit einer Hintergrund-DNA oder -RNA gearbeitet werden. Diese stammt aus einer anderen Spezies und hat keinerlei Homologie zu den zu amplifizierenden Zielgenen der spezifischen DNA oder RNA. Schließlich soll hier auch noch die Temperaturgra- dientenfunktion genannt werden, über die viele Thermocycler verfü- gen. Der Temperaturgradient hilft dabei zu überprüfen, bei welcher Annealingtemperatur die spezifischen Primermoleküle ihre maximale Bindung zur Zielstrang-DNA und damit ihre höchstmögliche Ampli- fikationseffizienz erzielen.

Fast-PCR

Um eine möglichst schnelle und sichere PCR zu erzielen, lassen sich Standard-PCR-Applikationen auf einfache Weise beschleunigen, ohne dass die Verwendung von speziellen Verbrauchsmaterialien, Reagen- zien oder PCR-Geräten erforderlich ist. Die hohen Heiz-/Kühlraten der modernen PCR-Geräte spielen dabei eine untergeordnete Rolle. Eine große Bedeutung haben jedoch die speziell für die Fast-PCR konstruierten Primer, deren Design es ermöglicht, dass sie bereits bei einer hohen Temperatur um 70° C, also im Temperaturoptimum der Taq-Polymerase, an die gewünschten Zielsequenzen binden. Die Amplifikationsprodukte sollten klein sein (80-150bp), um eine vollständige Neusynthese aller Komplementär- stränge zu erreichen. Aus einer klassischen 3-Schritt-PCR: (HotStart: 95° C x 3 min, Dena- turierung: 95° C x 15 s, Annealing: 62° C x 30s x 35 Wiederholungen, Neustrangsynthese: 72° C x 30 s) lässt sich sehr einfach eine schnelle 2-Schritt-PCR entwickeln (HotStart: 98° C x 30s, Denaturierung:

92° C x 1s, Annealing/Neustrangsynthese: 70° C x 5s x 35 Wiederholun- gen). Während die klassische Polymerase-Kettenreaktion eine Laufzeit von 90 Minuten hat, reduziert sich dieser Zeitraum in der beschriebenen Fast-PCR auf unter 30 Minuten. Als Kary Mullis die PCR-Methode erfand, wurden die PCR-Produkte ausschließlich mit klassischer Gelelektrophorese und Ethidiumbromid- färbung nachgewiesen.

PCR-Detektion und quantitative real-time PCR

Die modernen PCR-Systeme bieten die Möglichkeit des gelfreien Nachweises der PCR-Produkte mit dem wenig toxischen SYBR-Green oder fluoreszierenden Hybridisierungssonden mittels quantitativer real-time PCR. Die dazu verwendeten real-time PCR-Systeme verwenden Halogen- oder LED-Licht und Fluoreszenzfilter, um die PCR-Produkte in jedem Zyklus der PCR zu messen. Es wird dadurch ein großer dynamischer Detektionsbereich für Proben unterschiedlichster DNA-Mengen erzielt. Im Vergleich mit DNA-Standards bekannter Quantität lassen sich unbekannte Proben absolut quantifizieren, das heißt, ihnen kann mit hoher Genauigkeit eine DNA-Ausgangsmenge im Vergleich mit den bekannten Standards zugewiesen werden. Im Bereich der Genexpression ist es üblich, die zu untersuchen- den Gene (Kandidatengene) mit sogenannten Referenzgenen (Gene, die bekanntermaßen keiner Regulation unterliegen) zu vergleichen und anhand von Rechenalgorithmen die n-fache Regulation dieser Kandidatengene zu berechnen. Die hierzu entwickelten Software- programme bieten zur Auswertung Algorithmen nach Livak 7 , Pfaffl 8 oder Vandesompele 9 an. Die Unterschiede bestehen darin, ob nur

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 38 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 Abb. 3: iQ5 T M High End real-Time

38 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007

 38 | 8. Jahrgang | Nr. 5/2007 Abb. 3: iQ5 T M High End real-Time

Abb. 3: iQ5 TM High End real-Time PCR-System zur absoluten und relativen Quantifizierung und Verwendung von einem oder mehreren Referenzgenen. Selbst große Genstudien mit bis zu 5.000 Proben lassen sich innerhalb der Software nach Algorithmen von Livak, Pfaffl oder Vandesompele verarbeiten.

eines oder mehrere Referenzgene in die Berechnung einfließen und ob unterschiedliche Produktbildungseffizienzen der PCR-Produkte mitberechnet werden. All diese Algorithmen führen zu sehr exakten und miteinander ver- gleichbaren Resultaten, sofern die erforderliche Umsicht bei der Wahl der nichtregulierten Referenzgene gewährt wird. High end-Systeme wie das iQ5 TM - oder MyiQ TM -System können innerhalb der real-time PCR-Software sogar Genstudien mit bis zu 5.000 Proben auswerten. Bei Berücksichtigung aller genannten Maßnahmen im Rahmen einer „Good Laboratory Practice“ (GLP) ist man hervorragend gegen die „Geister der PCR“ geschützt. Sollte aber dennoch einmal einer in Erscheinung treten, dann rufen Sie einen unserer „Ghost Buster“-PCR- Spezialisten an.

Literatur

[1]

Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Ehrlich H.A., Arnheim N.: Enzymatic amplification of β3-globin

[2]

genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230 (1985), 1350-1354 Mullis K.: Dancing Naked in the Mind Field. Pantheon Books, New York, 1998

[3]

Sano et al: Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science 258

[4]

(1992), 120-122 Lind, K. and Kubista, M.: Technical Note 2805 BioRadiations 109 (2002), 32-33

[5]

Wittwer, Carl T., Reed, Gudrun H., Gundry, Cameron N., Vandersteen, Joshua G. and Pryor, Robert J.: High-Resolution

[6]

Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen, Clinical Chemistry 49 (2003), 853-860 Strong, William and Rubio, Theresa: Using the ExperionTM Automated Electrophoresis System to assess RNA Quality and

[7]

Quantity in siRNA-induced Gene Silencing Experiments, Bio-Rad Technical Note 5315 Livak K.J., Schmittgen T.D.: Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta

[8]

Delta C(T)) Method. Methods 25 (2001), 402-8. Pfaffl M.W.: A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29 (2001), :e45.

[9]

Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A., Speleman F.: Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 3 (2002) RESEARCH0034.1-RESEARCH0034.11

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Marktübersicht: Thermocycler

Ob in der Forschung oder zunehmend auch in der medizinischen Diagnostik - die Polymerase-Kettenreaktion ist in gut 20 Jahren zum mole- kularbiologischen Arbeitspferd molekularbiologisch arbeitender Labors aufgestiegen. Damit verbundenen war eine ständige Optimierung des zeitraubenden Amplifikationsprozesses. Einen Überblick über die aktuellen Instrumente der Hersteller, die sich an unserer Geräteumfrage beteiligt haben, gibt die vorliegende Marktübersicht.

Biometra GmbH Dr. Stefanie Navabi Rudolf-Wissell-Straße 30 37079 Göttingen Tel.: +49-(0)551-50 686-0 Fax: +49-(0)551-50686-66 info@biometra.de www.biometra.de

T1 / TGradient Thermocycler

PCR, Cycle Sequencing

Thermocycler

Temperaturzyklen mit schnellen Heiz- und Kühlraten

Anzahl der Heizblöcke: 1 Material der Heizblöcke: Silber Probenkapazitäten der erhältlichen Blöcke:

48 x 0,5ml, 96 x 0,2ml oder MTP, 384well MTP, 4 Objektträger (in situ) Art des Kühl/Heizsystems: Peltier Programmspeicherplätze: ca. 250 Schritte pro Programm: 99 Deckelheizung: 30 °C – 99 °C Heizrate: 4.0°C/sek. Kühlrate: 3.0°C/sek. Temperaturbereich: 3 bis 99°C Regelgenauigkeit: ± 0,1°C Temperaturverteilung bei 95°C: ± 0,5°C Geräteabmessung: 25 x 15 x 34 (B x H x T) Gewicht: 8,8 kg