Acta Scientiae Veterinariae, 2014. 42: 1213.

RESEARCH ARTICLE

ISSN 1679-9216

Pub. 1213

Deteco de fraude em leite e queijo de coalho caprino por adio de leite bovino
Detection of Bovine Milk Contaminants in Adulterated Milk and Curd Goat Cheese
Maria Rociene Abrantes1, Adriene Rosceli Menezes de Oliveira1, Manuella de Oliveira Cabral Rocha1,
Gisele Oliveira de Souza2, Evelise Oliveira Telles2, Sidnei Miyoshi Sakamoto1 & Jean Berg Alves da Silva1

ABSTRACT

Background: Goat milk is quite useful as an alternative for feeding children and adults who are sensitive or allergic to
bovine milk because of its peculiar characteristics, and goat milk ensures the subsistence of small producers. Therefore,
ensuring the purity and satisfactory quality of dairy goat products is essential for consumer safety. Accordingly, the present study aimed to detect adulteration of goat milk and curd goat cheese with bovine milk contaminants using polymerase
chain reaction (PCR).
Materials, Methods & Results: For this purpose, the detection limit of the PCR assay was tested using bovine milk added
to goat milk at concentrations of 0.5%, 1.0%, 5.0%, 10.0%, 25.0%, 50.0%, and 100%. Subsequently, goat milk from 79
producers and 43 samples collected from community cooling tanks was tested. Curd goat cheese was subsequently manufactured in the laboratory according to technical recommendations. The quality of the curd cheese was assessed by adding
the aforementioned concentrations of bovine milk to goat milk, and PCR was performed to detect contaminants. Genomic
DNA was extracted from milk and curd cheese samples and subjected to amplification by PCR using specific primers.
After amplification, PCR products were analyzed in 1.5% agarose gel, stained with ethidium bromide, and visualized using a UV transilluminator. The quality of milk DNA was evaluated using a spectrophotometer, and it corresponded to an
average value of 1.76. With regard to the detection limit, bovine DNA was detected using the smallest concentration of
bovine milk (0.5%) added to goat milk. Using these same experimental conditions for the curd cheese samples, a detection
limit of 5.0% of bovine milk was established. When evaluating goat milk samples from producers and cooling tanks, the
bovine gene was detected in 82.27% and 97.67% samples, respectively.
Discussion: DNA quality was determined on the basis of the amount of DNA and protein. The value obtained was close to
the minimum limit of 1.8, probably because of the high protein concentration in the milk. The high rate of contamination
of goat milk with bovine milk is concerning, taking into consideration that this contamination can cause serious health
problems to consumers who are allergic to bovine milk. In addition, government regulations and ethical or cultural objections are compromised. Some factors may contribute to goat milk contamination, such as the lack of practice in routine
inspection and the lack of rigorous supervision. Another factor is the lack of technical support for milk producers because
inadequate cleaning of equipment at milk processing facilities may contribute to the high levels of contamination. In the
present study, the threshold for detection of bovine DNA in curd cheese was high, which can be explained by product
characteristics such as compact texture and semi-solid consistency. Therefore, an extraction protocol capable of efficiently
recovering the maximum amount of DNA from this type of sample is required. The protocol used in the present study can
be used to detect bovine milk contaminants during the preparation of goat curd cheese, because it enables the extraction
and detection of bovine DNA. This methodology pioneers the use of PCR to check the authenticity of milk products;
therefore, it can be efficiently used to identify this type of adulteration.
Keywords: fraud, goat milk, coalho cheese, PCR.
Descritores: fraude, leite de cabra, queijo de coalho, PCR.

Received: 5 May 2014

Accepted: 2 October 2014

Published: 24 October 2014

Laboratrio de Inspeo de Produtos de Origem Animal (LIPOA), Programa de Ps-graduao em Cincia Animal (PPGCA), Universidade Federal Rural
do Semi-rido (UFERSA), Mossor, RN, Brazil. 2Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Departamento de Medicina Veterinria Preventiva e
Sade Animal, Universidade de So Paulo (USP), So Paulo, SP, Brazil. CORRESPONDENCE: M.R. Abrantes [rocienevet3@hotmail.com - Tel.: +55
(84) 3317-8381]. DCAN, UFERSA. BR 110 - Km 47 - Presidente Costa e Silva. CEP 59625-900 Mossor, RN, Brazil.

M.R. Abrantes, A.R.M. Oliveira, M.O.C. Rocha, et al. 2014. Deteco de fraude em leite e queijo de coalho caprino por
adio de leite bovino.
Acta Scientiae Veterinariae. 42: 1213.
INTRODUO

Extrao de DNA

O DNA genmico foi extrado das amostras

de leite e queijos de coalho de acordo com Guido [6],
com modificaes.
As amostras de leite foram centrifugadas a
14000 g com um volume de 500 L adicionado com
50 L de Tween 20% a 24C por 10 min. Em seguida
descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 500 L
de TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 e 1 mM EDTA, pH
8,0) centrifugando novamente a 14000 g por 10 min a
mesma temperatura. O processo foi repetido at o pellet
apresentar-se translcido. Aps a lavagem foi adicionado
a soluo de lise (4 L Tris-HCl, pH 8,0 a 1M; 20 L
EDTA 0,5 M, 8 L de Nacl 5 M; 40 L SDS 10%; 10 L
de proteinase K a 20 mg/mL; 418 L de gua ultra pura),
incubando a mistura por 18 h a 37C em um termobloco
com agitao. Utilizou-se fenol: clorofrmio (1:1) na
desnaturao das protenas tornando-as insolveis
fase aquosa, onde se encontram os cidos nucleicos e o
DNA precipitado com adio de propanol, mantendo-o
a -20C por duas h. Em seguida centrifugou-se a 14000
g a 24C por 20 min, desprezando o sobrenadante e
adicionando 500 L de etanol a 70C, centrifugando
novamente e desprezando o sobrenadante. O pellet de
DNA foi secado a 56C por 10 min e adicionado 30 L
de TE. Posteriormente incubou-se a mistura a 56C por
30 min, armazenando o produto extrado (DNA) a -20C
at o momento da amplificao.
Aps a extrao, todas as alquotas da soluo de DNA das amostras de leite foram submetidas
leitura espectrofotomtrica1 nos comprimentos de
onda 260 nm (DO260) e 280 nm (DO280), para estimar
a qualidade do DNA.
Na extrao do DNA dos queijos de coalho,
as amostras foram homogeneizadas com TE (10mM
de Tris-HCL, pH 8 e 1mM de EDTA, pH 8,0) no stomacher. Logo aps 500 L do homogeneizado foram
transferido para um microtubo e realizado o mtodo
descrito anteriormente para extrao do DNA.

A globalizao e o aumento da demanda dos

consumidores por alimentos seguros tm levado a grandes
investimentos em pesquisas e implementao da garantia
de qualidade para aumentar a competitividade no mercado, a confiabilidade e a segurana dos alimentos [12].
A identificao das espcies em produtos
lcteos tem uma grande importncia devido a reaes
adversas em humanos s protenas do leite ou da possibilidade de deteco de procedimentos fraudulentos,
como a substituio de um tipo de leite por outro [3].
O leite bovino relatado como o principal
produto lcteo responsvel por reaes adversas em
humanos [11], na maioria dos casos esse produto pode
ser substitudo por leite de outras espcies como o de
cabra, sem causar sintomas alrgicos [8].
Para evitar a possvel substituio fraudulenta
de leite de cabra pelo de vaca, que mais disponvel
e barato, necessrio desenvolver procedimentos
analticos capazes de detectar fraudes e proteger os
consumidores de rotulagem enganosa. Neste sentido
a tcnica da Reao em Cadeia pela Polimerase (PCR)
tem sido bem sucedida, detectando a presena de clulas somticas de mamferos em produtos lcteos [1].
Apesar da utilizao de tcnicas moleculares na
verificao de autenticidade em produtos lcteos, no
existem estudos utilizando a PCR na identificao de
leite bovino em queijo de coalho caprino, um produto
tradicional, geralmente com alto valor econmico e
sem nenhuma garantia ao consumidor em relao a
sua autenticidade. Dessa forma, objetivou-se detectar,
atravs de PCR, a presena de leite de vaca em amostras
de leite e queijo de coalho de cabra.
MATERIAIS E MTODOS

Delineamento experimental

Inicialmente foi determinado o limite de deteco do ensaio de PCR utilizando leite de cabra SRD
(Sem Raa Definida) misturado nas concentraes de 0;
0,5; 1; 5; 10; 25; 50 e 100% com leite de vaca mestias
(girolanda), obtidas de rebanhos leiteiros da regio,
avaliando-se em seguida amostras de leite de cabras
de produtores e tanques de resfriamento comunitrios.
Posteriormente foram elaborados queijos de coalho
utilizando leite de cabra misturado com leite de vaca de
mesma procedncia e concentraes j citadas, sendo
utilizado o mtodo de PCR na deteco de fraude.

Amplificao por PCR

Foi realizado a PCR em um volume de 25

L contendo, 12,625 L de gua ultra pura, 4 L de
dNTPs, 2,5 L de tampo 10x PCR Buffer (KCl 50
mM; Tris-HCl 10 nM pH 9), 0,75 L MgCl2, 1,25 L
de cada primer e 0,125 L de Taq DNA polimerase
patinum 5U/L. Os primers bovino [3], e caprino [2],
pertencente ao gene 12s e 16s da rRNA mitocondrial
(Tabela 1).

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adio de leite bovino.
Acta Scientiae Veterinariae. 42: 1213.

Em um termociclador realizou-se a amplificao pela PCR utilizando os primers nas seguintes

condies: desnaturao inicial de anelamento de 95C
por 3 min, seguida por 39 ciclos de desnaturao a
94C por 30 s, 60C por 30 s, extenso a 72C por 45
s e extenso final a 72C por 10 min (para o primer
bovino); desnaturao inicial de anelamento de 94C
por 5 min, seguida por 35 ciclos de desnaturao a 94C
por 30 s, extenso a 55C por 1 min, 72C por 1 min e
extenso final 72C por 5 min (para o primer caprino).
Aps a amplificao dos produtos, os mesmos
foram analisados em gel de agarose 1,5%, corados
com brometo de etdio a 0,5 g/mL e posteriormente
visualizados em um transluminador ultravioleta (UV).

vaca. Os queijos foram preparados de acordo com as

recomendaes do regulamento tcnico de identidade
e qualidade de queijo de coalho [4].
Foi fabricado um queijo de coalho com leite de
vaca puro, um queijo de coalho com leite de cabra puro
e ainda seis queijos de coalho de mistura de leite com
as seguintes porcentagens de leite de vaca: 0,5; 1; 5;
10; 25; e 50%. Foram aliquotadas amostras de queijos
de coalho das diferentes concentraes e congelado a
-20C at o momento da extrao.
RESULTADOS

A qualidade do DNA extrado do leite obteve valor mdio de 1,76. O limite de deteco alcanado neste
trabalho, utilizando o mtodo PCR, foi considerado a
menor porcentagem de mistura de leite bovino (0,5%)
[Figura 1] em leite caprino. Ao avaliar as amostras de
leite de cabra foi diagnosticada presena do gene bovino
em 82,27 (65) [Figura 2] e 97,67% (42) [Figura 3] do leite de produtores individuais e de tanques de resfriamento
comunitrios, respectivamente. Foi observado que em
87,7% (107) das amostras de leite de cabra analisadas
foi detectado fragmentos de DNA bovino.
J em relao as amostras de queijos de coalho elaborados a partir de misturas de leite, o teste foi
sensvel na deteco de 5% do leite bovino em leite
caprino (Figura 4).

Amostras de leite de cabra

Foi avaliada quanto originalidade, amostras

de leite de cabra de 79 produtores e de 43 amostras
de tanques de resfriamento comunitrios, das regies
central e oeste do estado do Rio grande do Norte, totalizando 122 amostras. As coletas foram realizadas em
recipientes estreis e em seguida enviadas, devidamente
acondicionadas, ao laboratrio onde foram aliquotadas
e congeladas a -20C at o momento da anlise.
Queijo de coalho

Foram preparados queijos de coalho, no laboratrio, utilizando mistura de leite de cabra e de

Tabela 1. Oligonucleotdeos utilizados como primers na PCR de leite e queijos de coalho.

Espcie
Bos taurus e Bos indicus
J01394a
Capra hircus M55541a
a

Sequncia 5 3
Senso 14814-GGCTTATATTACGGGTCTTACACT
Antisenso15092-GGCAATTGCTATGATGATAAATGGA
Senso 144-CGCCCTCCAAATCAATAAG
Antisenso 469-GTGTATCAGCTGCAGTAGGGTT

Nmero de acesso ao GenBank

Figura 1. Amplificao de DNA por PCR com primers especficos para espcie bovina. M, 100 bp ladder; L1, leite bovino; L2,
0,5% de leite bovino; L3, 1% de leite bovino; L4, controle de reagentes; L5, 5% de leite bovino; L6, 10% de leite de bovino;
L7, 25% de leite bovino; L8, controle de reagentes; L9, 50% de leite bovino; L10, controle de reagentes; L11, leite de cabra.

Fragmento (pb)
279
326

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adio de leite bovino.
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Figura 2. Amplificao de DNA por PCR com primers especficos para espcie bovina. M, 100 bp ladder; L1, leite bovino; L2 - L13, amostras de leite caprino de produtores; L14, controle dos reagentes; L15
leite caprino.

Figura 3. Amplificao de DNA por PCR com primers especficos para espcie bovina. M, 100 bp ladder; L1, leite bovino; L2 - L16, amostras de leite caprino de tanques de resfriamento; L17, controle dos
reagentes; L18, leite caprino.

Figura 4. Amplificao de DNA por PCR com primers especficos para espcie bovina. M, 100 bp ladder;
L1, queijo bovino; L2, 0,5% de leite bovino; L3, 1% de leite bovino; L4, controle de reagentes; L5, 5%
de leite bovino; L6, 10% de leite de bovino; L7, 25% de leite bovino; L8, controle de reagentes; L9, 50%
de leite bovino; L10, controle de reagentes; L11, queijo de cabra.

M.R. Abrantes, A.R.M. Oliveira, M.O.C. Rocha, et al. 2014. Deteco de fraude em leite e queijo de coalho caprino por
adio de leite bovino.
Acta Scientiae Veterinariae. 42: 1213.
DISCUSSO

zada na rotina de inspeo, fiscalizao rigorosa e

acompanhamento tcnico aos produtores, o que pode
comprometer a qualidade de produtos lcteos caprinos,
podendo levar a desvalorizao do produto.
O controle de qualidade do leite e derivados
deve tornar-se cada vez mais rigoroso e frequente. A
indstria de lacticnios e as entidades responsveis por
assegurar a autenticidade destes produtos, necessitam
ter sua disposio meios que possam dar respostas
rpidas e precisas a serem utilizadas na rotina, ao longo
das vrias etapas de fabricao e comercializao, minimizando os custos decorrentes de qualquer anomalia
que possa surgir [14].
Utilizando o mesmo ensaio na deteco de
fraude em queijos de coalho caprino foi determinado
limite de deteco de leite de vaca de 5%. O limiar
de deteco de DNA bovino para o queijo de coalho
pode ser considerado alto, isto pode ser justificado
pelas suas caractersticas como a textura compacta e
consistncia semidura apresentando como uma das
principais caractersticas a firmeza depois de assado,
alm de apresentar o teor de gordura varivel entre 35,0
e 60,0%, um componente que pode inibir a amplificao do fragmento de DNA pela tcnica da PCR [15].
Assim sendo, a extrao do material gentico
para esse tipo de produto exige um protocolo que possa
recuperar a quantidade mxima de DNA de boa qualidade. Shaw et al. [13] afirmaram que o isolamento de
DNA de amostras biolgicas realizadas a partir da PCR
eficiente quando se utiliza DNA purificado livre de
potenciais inibidores da amplificao da reao, podendo ser limitada devido a sua quantidade e qualidade.
O protocolo usado neste trabalho pode ser adotado para deteco de fraudes de adio de leite bovino
na elaborao do queijo de coalho de cabra, uma vez
que permite a extrao e identificao do DNA bovino;
e sendo este estudo o pioneiro em relao utilizao
da PCR para conferir autenticidade ao produto, a
metodologia adotada poder ser uma tcnica eficiente
para identificar este tipo de fraude.

A relao entre a quantidade de DNA e de

protena usada como parmetro para avaliao da
qualidade do DNA extrado e, desse modo, a relao
DO260/DO280 pode ser usado para este fim. As amostras cujos valores dessa relao so inferiores a 1,8
apresentam contaminao com protena [10]. Neste
trabalho, os valores apresentaram prximo ao limite
mnimo, isto pode estar associado ao alto valor proteico
das amostras.
O limite de deteco do leite de vaca foi de
0,5%, corroborando ao encontrado em estudo no estado
da Paraiba/PB [12], no entanto, limite ainda menor
(0,1%) j foi observado na deteco de fraude de leite
caprino por adio de leite bovino [9].
A anlise das amostras de leite de cabra de
produtores e de tanques de resfriamento realizado neste
estudo indicou alto ndice de adulterao (87,7%) de
leite de cabra com leite de vaca. Estes dados so preocupantes levando em conta a quantidade de protenas
do leite de vaca que pode conter o produto, gerando
um srio problema a consumidores alrgicos ao leite
de vaca. A alergia ao leite de vaca considerada uma
doena comum, com prevalncia de 2,5% em crianas
durante os primeiros trs anos de idade, ocorrendo em
12-30% das crianas com menos de trs meses de idade
[7]. Alm disso, compromete tambm os regulamentos
do governo e objees de ordem tica ou cultural [8].
Em pesquisa no semirido da Paraba [12], foi
utilizado a PCR duplex para anlise de 160 amostras de
leite caprino de produtores individuais e verificaram que
66 (41,2%) apresentaram-se positivos para DNA bovino.
Rodrigues et al. [12] afirmaram que a maioria
dos produtores caprinos desconhecem o impacto real
da adulterao, necessitando de programas educacionais e acreditam ainda que a causa da adulterao
seja por razes econmicas, embora a presena no
intencional seja possvel devido ao uso compartilhado
de equipamento de ordenha entre as espcies. Este ltimo, advindo da contaminao devido a procedimentos
ineficazes de limpeza dos equipamentos de instalaes
comuns a ambas as espcies utilizadas no processamento do leite [8]. sabido que a criao associada de
caprinos, ovinos e bovinos prtica comum na regio
do semirido nordestino [5], o que pode contribuir para
a contaminao entre espcies.
Outros fatores podem favorecer a adulterao
do leite caprino, como a falta de uma tcnica utili-

CONCLUSO

As amostras de leite caprino produzido no

Estado do Rio Grande do Norte apresentaram DNA
bovino, oferecendo risco sade das pessoas alrgicas ao leite bovino. O mtodo mostrou-se eficiente na
identificao de adulterao de leite e queijo de coalho
caprino pela adio de leite bovino.

M.R. Abrantes, A.R.M. Oliveira, M.O.C. Rocha, et al. 2014. Deteco de fraude em leite e queijo de coalho caprino por
adio de leite bovino.
Acta Scientiae Veterinariae. 42: 1213.

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writing of the paper.

SOURCE AND MANUFACTURER

1
Thermo Scientific NanoDrop 2000c, So Paulo, SP, Brazil.

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www.ufrgs.br/actavet

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