CENTRO UNIVERSITRIO DA

FUNDAO EDUCACIONAL DE BARRETOS

DIVISO ACADMICA
CRONOGRAMA DE AULAS PRTICAS
Nome da Disciplina: Bioengenharia
Curso: Engenharia Qumica

Aulas prticas: sexta-feira

Termo: 9
Horrio da
aula:

No de turmas

No de equipes

09:45 s 11:30

01

05

20:40 s 22:30

02

10

Docentes Responsveis: Profa. Dra. Rosangela de Carvalho Goulart Guedes Prado

Profa. Dra. Renata Camacho Miziara

CRONOGRAMA
Seman
a

Data

Aula Prtica

06/02/15

Apresentao do contedo programtico, normas e plano de

ensino.

13/02/15

Biossegurana em laboratrio.

27/02/15

Tcnicas de assepsia e esterilizao.

06/03/15

Preparo de meio de cultura.

13/03/15

Tcnicas de swab e mtodos de inoculao.

20/03/15

Mtodos de quantificao de microrganismos.

27/03/15

Tcnicas de isolamento e armazenamento de cepas isoladas.

10/04/15

Entrega de relatrios.

17/04/15

Avaliao Parcial.

10

24/04/15

Fermentao alcolica.

11

08/05/15

Preparo de meio de fermentao e inoculao de MO no reator.

12

15/05/15

Extrao do produto da fermentao e preparo da curva padro.

13

22/05/15

Quantificao do produto da fermentao.

14

29/05/15

Preparao de iogurte.

15

12/06/15

Avaliao Parcial.

16

19/06/15

Entrega de relatrios.

17

26/06/15

Avaliao Substitutiva.

SUMRIO

INSTRUES SOBRE RELATRIOS................................................................4

BIOSSEGURANA EM LABORATRIO.............................................................5
TCNICAS DE ASSEPSIA E ESTERILIZAO..................................................8
PREPARO DE MEIOS DE CULTURA................................................................17
TCNICA DE SWAB E MTODOS DE INOCULAO.....................................21
MTODOS DE QUANTIFICAO DE MICRO-ORGANISMOS.......................27
TCNICAS DE ISOLAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CEPAS ISOLADAS
............................................................................................................................29
FERMENTAO ALCOLICA...........................................................................33
PREPARO DE MEIO DE FERMENTAO E INOCULAO DO MICROORGANISMO NO REATOR...............................................................................36
EXTRAO DO PRODUTO DA FERMENTAO E PREPARO DA CURVA
PADRO.............................................................................................................39
QUANTIFICAO DO PRODUTO DA FERMENTAO..................................43
APNDICE..........................................................................................................48

INSTRUES SOBRE RELATRIOS

O relatrio das aulas prticas sero feitos em grupo e devero ser

entregues na prxima semana aps a aula prtica. O cumprimento de prazo de
entrega e a qualidade da apresentao dos relatrios, alm da participao nas
aulas prticas far parte da avaliao dos mesmos. O aluno que faltar a uma
aula prtica no poder ser includo no relatrio a ser entregue na prxima
semana.
O relatrio a ser entregue dever ser digitado, obedecendo a seguinte
ordem:

CAPA
- Dever conter o logotipo da instituio na parte superior da pagina;
- O nome da aula pratica realizada;
- O nome de todos os participantes.

INTRODUO
- Deve ser escrita de uma forma clara, apresentando o propsito do
experimento realizado e o porqu esta pratica importante.
- A introduo contida no roteiro de aula no poder ser utilizada para a
produo do relatrio.

MATERIAIS E METODOS
- Dever apresentar todas as etapas realizadas durante a aula prtica,
mesmo que estiver descrito no roteiro;
- Quando no for includo no roteiro da aula prtica, descrever em
etapas ou fluxograma a metodologia utilizada.

RESULTADOS E DISCUSSO
- Dever constar o que voc encontrou e a discusso destes resultados;
- As tabelas e grficos quando apresentados devero ter legendas que
as identifiquem de forma clara e breve o que est contido nas
respectivas, incluindo smbolos quando for o caso;

CONCLUSO
- Apresentar uma afirmao conclusiva sobre a aula prtica.

REFERNCIAS BIBLIOGRAFICA
- Devero ser apresentadas todas as referncias utilizadas na
construo do texto. Siga normas de citao bibliogrficas (ABNT).

ATENO: No deixem de fazer e entregar os relatrios, pois eles

correspondero a 20% da nota final.

BIOSSEGURANA EM LABORATRIO
importante que falemos brevemente sobre como devemos nos portar
dentro de um laboratrio, no importando o que ser estudado, antes de
qualquer atividade prtica.
5

CUIDADOS FUNDAMENTAIS
Alguns experimentos que ns realizaremos podem ser perigosos se
voc manipular os materiais impropriamente ou executar os procedimentos
incorretamente. So necessrias algumas medidas de segurana quando se
trabalha com micro-organismos ou substncias qumicas, alm de vidros,
banhos-maria ferventes, instrumentos cortantes e outros materiais. Se voc
tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, no hesite em
chamar o professor ou o monitor para lhe auxiliar.
PROCEDIMENTOS DE PRECAUO E SEGURANA
O laboratrio ser um lugar onde culturas de micro-organismos sero
manipuladas e examinadas. Este tipo de atividade deve ser realizado em
conjunto com boas tcnicas asspticas, num local de trabalho limpo e
organizado. Todos os materiais que sero utilizados nas aulas prticas sero
esterilizados para eliminar todos os micro-organismos presentes, e deve-se
tomar muito cuidado para no haver recontaminao deste material com microorganismos do ambiente.
Geralmente, os micro-organismos estudados no so patognicos, mas
ainda assim, devemos manipular qualquer cultura ou qualquer organismo como
se fosse potencialmente patognico, lembrando que muitos micro-organismos
que geralmente no so patognicos podem causar doenas oportunistas.
Cada estudante deve aprender e praticar as prticas asspticas no
laboratrio. Isto importante para prevenir a contaminao de suas mos,
cabelos e roupas com material contaminado, alm de evitar a contaminao do
seu trabalho e proteger seus colegas que estaro trabalhando na bancada ao
lado.
CONDUTA GERAL NO LABORATRIO

1 Antes de entrar no laboratrio, retire casacos, jaquetas, etc. Estes itens

devem ser deixados em local apropriado com sua bolsa ou mochila, papis e
outros itens que no sero utilizados na aula prtica.
2 - O avental (ou jaleco) de uso obrigatrio. No ser permitida a entrada
do aluno no laboratrio em horrio de aula ou fora dela sem o mesmo.
3 Antes de comear devemos lembrar:
- prenda os cabelos, quando longos, para evitar o contato com a chama do
Bico de Bunsen;
- no use jias e acessrios durante a aula prtica;
- mantenha seus dedos, lpis, canetas ou qualquer objeto longe da sua boca;
- no comer, beber ou fumar dentro do laboratrio;
- sempre lavar as mos com gua e sabo antes e aps terminar o trabalho
prtico;
- limpar e desinfetar a bancada antes e aps o seu uso;
- no fique andando pelo laboratrio, pois atividades desnecessrias podem
causar acidentes, distrair os outros alunos e promover contaminao.
4 Em caso de algum acidente, comunicar imediatamente ao professor. No
caso de quebra, durante a manipulao com tubos ou placas contendo meios
contaminados, no remover os fragmentos quebrados, deixando-os no local.
5 Se voc est em dvida quanto ao procedimento, confira o manual da aula
prtica. Se a dvida persistir, chame o professor ou monitor. Evite tirar dvidas
com os colegas de outros grupos.
6 Todo o material utilizado nos experimentos, como por exemplo, as placas
de Petri e os tubos de ensaio contendo meios de cultura ou solues, devero
ser devidamente identificados para observaes posteriores.
(Estes devem conter: disciplina, data, curso, equipe, micro-organismo ou
material utilizado).

7 Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro,
cd, marcador, etc.)
8 Anote todos os detalhes da aula prtica.
9 Nunca retire culturas ou equipamentos do laboratrio em quaisquer
circunstncias.
10 Terminado o trabalho prtico, deixar a bancada em ordem.
11 Descartar todo o material contaminado em local apropriado e seguro.
OBS: Cada aula prtica dever iniciar-se com uma explicao e um perodo de
demonstrao. O trabalho no deve ser iniciado pelo aluno, at que haja
recebido todas as instrues necessrias.

TCNICAS DE ASSEPSIA E ESTERILIZAO

INTRODUO
Os micro-organismos esto presentes em todos os ambientes e
superfcies, e no desejvel que muitos materiais se contaminem com eles,
como os alimentos, os utenslios utilizados na sua preparao, medicamentos,

entre outros. Para tanto, podemos aplicar diversos mtodos de controle

microbiano.
O controle microbiano compreende uma srie de procedimentos com a
finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir / impedir a multiplicao
de micro-organismos existente em ambientes, utenslios e superfcies.
Antes de conhecer os processos utilizados para controle microbiano e
compreender seu modo de ao, importante que alguns conceitos muito
utilizados sejam definidos:

Desinfeco: um processo menos rigoroso de eliminao de microorganismos, envolvendo usualmente o uso de um agente qumico,

denominado desinfetante ou germicida;

Esterilizao: e um processo fsico ou qumico que destri ou inativa

todas as formas de vida presentes em um determinado material;

Antissepsia: reduo do nmero de micro-organismos em matria viva

(pele);
Assepsia: conjunto de tcnicas e/ou medidas asspticas, que visam a
no contaminao de algo (por exemplo, de alimentos durante o

preparo);
Pasteurizao: tratamento trmico utilizado para reduo drstica no

nmero de micro-organismos;
Tindalizao: processo de esterilizao capaz de eliminar esporos

altamente resistentes ao calor;

Biocidas: agentes capazes de causar a morte de micro-organismos;
Biostticos: agentes capazes de impedir a reproduo de microorganismos, sem necessariamente mata-los.
Definidos estes conceitos, podemos comentar sobre os principais meios

de controle microbiano, que pode ser feito atravs de agentes fsicos ou

qumicos.
CONTROLE MICROBIANO POR AGENTES FSICOS
Os principais agentes fsicos utilizados so: calor seco, calor mido,
radiao ultravioleta e radiao gama e sonicao.

CALOR
ao esterilizante (causa a morte do microorganismo).
- Condies de esterilizao: de 150 a 180C,
Forno ou
Estufa

de 3 a 4 horas.
- Utilizao: esterilizao de substncias
imiscveis

em

gua

(como

ps,

leos),

instrumentos cortantes (tesouras) e vidrarias

limpas e secas (placas de Petri, pipetas, etc)
ao esterilizante (leva carbonizao do
Calor
seco

material e dos micro-organismos).

Incinerao

- Para descartveis: animais usados em

experimentos

produtos

contaminados

(cotonetes, curativos e ataduras contaminadas,

seringas plsticas contaminadas e etc).
ao esterilizante (carbonizao do

micro-

organismo).
Flambagem

- O material submetido ao direta da

chama.
- Uso: apenas na rotina microbiolgica (alas

Calor

e agulhas de platina, estiletes, bocas dos tubos).

aparelhos que utilizam vapor saturado sob

mido

presso. Ao esterilizante. Causa a morte por

promover a desnaturao das protenas que
Autoclave

constituem os micro-organismos.
- Condies para esterilizao: 121C por 15 a 30
minutos a 1 atm.
- Substncias miscveis com gua (meios de

cultura, soluo salina, gua e etc).

Pasteurizao processo utilizado para alimentos.
apenas

micro-organismos

Elimina

patognicos:

Salmonella typhi, Brucella abortus e etc.

- Condies: 63C por 30 minutos ou 72C por 15
segundos, seguido de resfriamento rpido (leite e
vinho). UHT: leite aquecido a 74C, em seguida
10

aquecido a 140C (5 segundos) e resfriamento

imediato.
RADIAES
baixo poder de penetrao: comprimento de
Radiaes No
Ionizantes
(raios Ultra-Violeta)

onda longo (carreia menos energia). Utilizado

apenas em superfcies. Causam danos ao DNA.
- Utilizado: eliminao de micro-organismos
em superfcies do material exposto e o ar ao
redor.
alta penetrabilidade. Comprimento de onda curto
(muita

Radiaes Ionizantes
(raios Gama)

energia).

Promove

excitao

de

eltrons, formando radicais altamente reativos

(OH-, H+, H2O2 ). Promove leso no DNA.
- Esterilizao de materiais como vidrarias,
metais, e materiais slidos como ps, solo,
alimentos, sementes, embalagens, etc.

FILTRAO
Remove
Esterilizante

os

micro-organismos

atravs

da

passagem por membranas ou cartuchos.

Promove a remoo por meio fsico.

SONICAO
Vibraes snicas

os micro-organismos so destrudos por lise e

extravasamento do contedo celular.

CONTROLE MICROBIANO POR AGENTES QUMICOS

LCOOL ETLICO
um dos mtodos qumicos mais empregados para controle microbiano,
por seu baixo custo, relativa eficcia e fcil aplicao. Pode ser usado como

11

desinfetante ou antissptico. Possui maior atividade germicida quando

hidratado (70%), pois nessa condio possui maior poder penetrante.
O lcool absoluto possui poder bacteriosttico, enquanto o lcool
hidratado

a 70% possui poder bactericida. So

apontados diversos

mecanismos de ao para o etanol:

- ao detergente: solvente de lipdeos
- ao desidratante: retira gua das clulas
- ao desnaturante: agindo sobre protenas celulares
FENIS E DERIVADOS
O fenol um desinfetante fraco, porm utilizado como um desinfetante
de referncia para ser comparado com outros produtos. Atua como
desnaturantes de componentes proticos. Dentre os cresis, o mais importante
a creolina, uma mistura de cresis muito utilizada para pisos e sanitrios. O
hexaclorofeno muito utilizado na antissepsia cirrgica.
HALOGNIOS
Os principais halognios utilizados no controle microbiano so o cloro e
o iodo.
- Cloro: usado como desinfetante de guas, alimentos e pisos. Seu
mecanismo de ao dado pela reao:
Cl2 + H2O H+ + Cl- + HClO
cido
hipocloroso
O cido hipocloroso a forma mais eficaz do que o cloro, pois tem carga
eltrica neutra e se difunde to rapidamente quanto a gua por meio da parede
celular.
O cido hipocloroso instvel, se decompondo espontaneamente em H +
+ OCl-, que eliminar os micro-organismos atravs de oxidao de
componentes celulares.
12

- Iodo: reage de forma irreversvel com aminocidos aromticos de protenas

celulares (fenilalanina e tirosina), desnaturando-as.
DETERGENTES CATINICOS
Alteram a permeabilidade da membrana. mais ativo contra Gram
negativos. Exemplo: compostos quaternrios de amnio sol. aq. at 0,2%.
SAIS DE METAIS PESADOS
Os metais pesados agem na inativao de enzimas, por sua alta
afinidade por apoprotenas. Os principais metais pesados utilizados no controle
microbiano so:
- Mercrio (Hg): j foi muito utilizado como antissptico, mas seu uso
est decaindo devido ao risco de intoxicao por absoro cutnea.
- Sulfato de Cobre (CuSO4): utilizado como desinfetante para guas de
recreao
- Nitrato de Prata (AgNO3): um antissptico altamente eficiente contra
gonococos, que causam oftalmia em recm-nascidos.
CIDOS
Tanto os cidos orgnicos quanto os inorgnicos so muito utilizados na
conservao de alimentos. So mais utilizados os cidos fracos, e na forma de
sal, pois assim apresentam maior solubilidade.
A atividade antimicrobiolgica dos cidos fracos atribuda a sua forma
no dissociada (HA), pois est penetra atravs da membrana tornando-se
ionizada aps alcanar o interior da clula. A concentrao intracelular destes
cidos orgnicos altera o funcionamento normal do gradiente envolvido no
sistema de transporte da membrana celular.
LCALIS

13

Os principais lcalis utilizados so NaOH, KOH e Ca(OH) 2. O NaOH,

principalmente, est presente nos sabes, conferindo-lhes relativa ao
antissptica.
REDUTORES
Reduzem compostos celulares, levando as clulas morte. Aldedos e
derivados: formaldedo e formalina so utilizados para desinfetar paredes e
pisos, mas causam irritaes cutneas.
OXIDANTES
Oxidam componentes celulares levando morte das clulas. So muito
utilizados

como

desinfetantes.

Exemplo:

Oznio,

gua

oxigenada,

permanganato de potssio, perxido de zinco.

- xido de etileno (gs): um agente alquilante, age inativando
protenas e cidos nuclicos. temperatura de 52C o xido de etileno passa
do estado lquido para o gasoso. Seus vapores so utilizados para esterilizao
de materiais de borracha ou plstico.
REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS
BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E. Biotecnologa
Industrial: Fundamentos. So Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA,
2001. vol. 1. 251p.
SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W. Biotecnologa
Industrial: Engenharia Bioqumica. So Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA,
2001. vol. 2. 541p.
TORTORA, G. J., FUNKE, B.R., CASE, C.L. Microbiologia. Porto Alegre, RS,
Ed. 8, 2005.

14

MATERIAL POR EQUIPE:

04- Ala de platina.
02- Bico de Bunsem.
04- Tubos de ensaio com tampo de algodo, dois com uma soluo aquosa
de uma cor e dois de outra cor.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:
A. FLAMBAGEM ALA DE PLATINA
1. Ascender o bico de Bunsen. Pegar uma ala de platina. Observe o modo
correto de segur-la.
2. Flambar a ala de platina. Observe a posio VERTICAL.
3. Resfriar a ala na zona assptica do bico de Bunsen.
4. Deposit-la na grande. Verifique o modo correto.

B. DESTAMPANDO TUBOS DE CULTURA.

1. Dispor o material da grade de modo correto para a execuo do trabalho
pegar um tubo de cultura e destamp-lo. OBSERVE O TAMPO
RETIRADO COM O DEDO MNIMO DA MO DIREITA (isto para destros e o
inverso para os canhotos).
2. Passar a boca do tubo pela chama. O ato de passar a boca do tubo pelo
fogo ao abri-lo e fech-lo dever ser efetuado durante todo o curso.
3. Depositar o tubo na grade.

C. EXCERCCIO PARA TRANSFERNCIA DE LQUIDOS.

1. Flambar a ala de platina observando a posio vertical. Resfriar a ala na
Zona assptica do bico de Bunsen.

15

2. Segurando a ala na Zona assptica, destampar um tubo de cultura.

Observe a ala no deve sair da zona assptica.
3. Passar a boca do tubo pela chama. Manter a ala na zona assptica.
4. Tomar pequena poro do lquido com a ala.
5. Passar a boca do tubo novamente pela chama e tamp-lo.
Obs: a ala no deve sair da zona assptica.
6. Abrir o segundo tubo passar a boca do mesmo pelo fogo mantendo a ala
na zona assptica. Transferir o lquido contido na laa para o mesmo.
7. Mantendo a ala na zona assptica passar a boca do tubo pela chama e
fech-lo. Flambar novamente a ala de platina e deposit-la na grade.

16

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

INTRODUO
O cultivo de micro-organismos requer a formulao de meios de cultura
e o estabelecimento de condies que favoream seu crescimento fora do seu
habitat natural. Assim se queremos cultivar e manter micro-organismos vivo em
laboratrio, e necessrio coloc-los em meios de cultura, contendo os
nutrientes apropriados para o seu crescimento. Alm de nutrientes
igualmente necessrio que as condies de oxignio (presena ou ausncia),
pH e presso osmtica sejam adequadas ao crescimento desses microorganismos. Os meios de cultura mais comumente utilizados podem ser
SINTTICOS (componentes qumicos puros e em quantidades conhecidas) ou
COMPLEXOS (quantidade e o tipo de nutrientes no so determinados).
Existem ainda os meios SELETIVOS (contm uma ou mais substncias que
inibem o crescimento de um determinado grupo de micro-organismos, mas
permite o desenvolvimento de outros), de ENRIQUECIMENTO (aumentam a
possibilidade de crescimento da espcie desejada, quando a mesma se
encontra em pequeno nmero) e DIFERENCIAL (permite a distino de
colnias de micro-organismos).
Dependendo da finalidade a que se destinam os meios podem ser
lquidos, usados em estudos de crescimento, de fermentao e na produo de
biomassa, e slidos, teis para contagem e isolamento de micro-organismos.
No preparo dos meios slidos e utilizado como agente solidificante o agar,
devido a sua propriedade de se fundir a 96 oC e solidificar 45oC, e por no ser
utilizado como nutriente pela maioria dos micro-organismos.

17

OBJETIVOS
Com a aula prtica o aluno dever ser capaz de conceituar e identificar
quais os tipos de meios mais comumente utilizados; preparar meios de cultura
em estado slido; praticar as tcnicas de esterilizao e de assepsia.
MATERIAIS POR EQUIPE:
- 4 bequer de 100 mL
- 3 erlenmeyer de 125 mL.
- 5 tubos de ensaio de 16x 160 mm.
- 1 proveta de 50 mL.
- 1 basto de vidro.
- 1 pipeta graduada de 10 mL com seringa para suco.
- 1 esptula para pesagem.

Material de uso comum

- Balana semi-analtica.
- Microondas.
- 2 folhas de papel manteiga.
- Algodo hidrfilo.
- Latas para acondicionar tubos.
- Esptula para pesagem.
- Meios de cultura: Agar MacConKey, Agar EMB, Agar Nutriente e Caldo
nutriente.

MTODOS
Calcular e pesar a quantidade de meio de cultura para preparar 50 mL de; gar
MacConKey, Agar EMB, Agar nutriente e caldo nutriente.
Aquecer em micro-ondas ou banho-maria os meios slidos (Agar) para
dissolver o gar.
18

Tampar o frasco contendo os meios slidos (erlen) com algodo, e proteger o

mesmo com papel para embrulho.
Aquecer em micro-ondas ou banho-maria o meio lquido Caldo nutriente, e
distribuir 8 mL em cada tudo de ensaio.
Fechar o tubo de ensaio com algodo, e proteger o mesmo com papel para
embrulho.
Autoclaver os meios de cultura preparados a 121 0C por 15 minutos.
Aps autoclavagem armazenar em geladeira.
Esterilizao do meio de cultura
Para a esterilizao do meio de cultura ser utilizado autoclave, a qual
e um agente fsico que utiliza o calor mido no processo.
Para o uso do equipamento, devero ser seguidas as seguintes
instrues:
Retire o cesto interno da autoclave e complete o nvel com gua destilada
Introduza o material a ser esterilizado e feche a autoclave
Inicie o aquecimento
Abra a vlvula de equalizao para a remoo do ar em seu interior,
deixando o vapor sair continuamente por 5 minutos. Esta etapa obtm
vapor saturado
Feche a vlvula de equalizao
Observe a elevao da presso de vapor e temperatura da autoclave.
Aps atingir 1 atm (temperatura de 121oC) inicie a contagem do tempo
de esterilizao (20 minutos)
Desligue o equipamento e espere a autoclave esfriar, ate que o
manmetro alcance o valor zero, s ento abra a autoclave.

19

Preparo de placas com o meio de cultura

Aps a esterilizao do meio de cultura o mesmo ser adicionado as
placas de Petri, da seguinte forma:
1234-

Inicialmente limpe bem a bancada de trabalho com lcool 70%;

Ligar o bico de Bunsen;
Posicionar todo o material necessrio atrs do bico de Bunsen;
Abra as placas de Petri e adicione aproximadamente 20 mL de meio
de cultura (temperatura aproximada de 45 oC) em seu interior de
acordo com a representao esquematizada abaixo;

5- Aps a adio do meio, fecha as placas de Petri com a tampa e

deixe-as em repouso ate que ocorra a solidificao do meio de
cultura;
6- Aps solidificar vede as placas com plstico PVC.
REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS
NEDER, R. N. M. Microbiologia: manual de laboratrio. So Paulo. Novel,
1992. 138p.
BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E. Biotecnologa
Industrial: Fundamentos. So Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA,
2001. vol. 1. 251p.

20

TCNICA DE SWAB E MTODOS DE INOCULAO

INTRODUO
As chamadas "tcnicas asspticas" so indispensveis quando se
trabalha com micro-organismos. Elas tm a finalidade de evitar contaminaes
do meio de cultura ou dos materiais utilizados para determinado procedimento
por micro-organismos presentes no meio (ar, gua, mos, roupas, etc.).
Portanto, a aula prtica tem como propsito demonstrar que os microorganismos esto presentes em todos os lugares, sendo assim, e de extrema
importncia que ao se trabalhar com equipamentos, meios de cultura ou algum
tipo de material que foi esterilizado, se tome muito cuidado para que no haja
recontaminao por micro-organismos presente no ambiente.
OBJETIVOS
A aula prtica tem como objetivo constatar a presena de microorganismos no ambiente; demonstrar mtodos de coleta de amostras para
anlise microbiolgica de equipamentos, superfcies, manipuladores e
ambientes; compreender a importncia dos critrios bsicos de higiene.
MATERIAIS
Para aula prtica ser necessrio:
Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):

Agitador de tubos (vortex)

Estufa de crescimento microbiano
Banho-maria
Rolo de plstico filme do tipo PVC
21

 Vidrarias e Materiais (por grupo):

Meio de cultura preparado pelos alunos na aula anterior.

07 placas de Petri estreis
01 erlen contendo 60 mL de meio gar nutriente ou PCA.
02 tubos com 8 mL de soluo salina 0,85% (tubos com soluo

salina estreis).
06 tubos com 9 ml de agua peptonada esterilizada para a
realizao das diluies nos mtodos de espalhamento e Pour

plate
02 moldes de 50 cm2 (faixa de 5 X 10 cm)
01 pipetador automtico de 1000 L
01 caixa de ponteiras de 1000 L estril
01 pisseta de 500 mL com gua destilada
01 pisseta com lcool 70%
01 bico de Bunsen
01 swab estril
01tesoura de metal (ser submetida a flambagem)
01 ala de Drigalsky
01 bquer com lcool absoluto

MTODOS
Micro-organismos presentes em superfcies
1- Retirar um swab esterilizado, segurando-o com cuidado para no tocar
em qualquer parte que venha a ter contato com a soluo tamponada;
2- Abrir, assepticamente, o tubo com soluo tamponada. Umedecer o
algodo e pression-lo contra a parede do tubo drenando o excesso de
lquido;
3- Esfregar o swab, lenta e firmemente, trs vezes sobre a superfcie
conforme relacionado abaixo:
Utenslios de uso individual toda a superfcie que o individuo pode ter
contato com a boca;
Grandes utenslios ou superfcies de trabalho 5 reas de 50 cm 2 (faixa
de 5 X 10 cm);
Amostragem de mos dever ser feita com o swab percorrendo toda a
extenso da palma e dorso da mo e entre os dedos;
22

4- Voltar o swab para o tubo com soluo tamponada e agitar com

movimentos rotatrios. Retirar o excesso de liquido pressionando o
algodo contra a parede do tubo;
5- Repetir a operao, com o mesmo swab, em 4 outras faixas, 50 cm 2, no
caso de grandes utenslios e superfcies, e no caso de utenslios
individuais e amostragem de mos, mais 3 vezes;
6- Cortar o swab com uma tesoura sanificada em lcool e flambada,
deixando o algodo no interior do tubo com a soluo tamponada;
7- Agitar vigorosamente por 10 segundos (50 ciclos de 15 cm, batendo
contra a palma de outra mo) ou em agitador de tubos;
8- Realizar diluies seriadas (10-1, 10-2 e 10-3) do material coletado. As
diluies sero utilizadas no mtodo de superfcie e no mtodo de Pour
Plate;
9- Sero utilizados 3 placas para o mtodo de espalhamento, 3 placas para
o mtodo de Pour Plate (iro ser feitas na hora) e 1 placa para anlise
do ambiente.
Mtodo de superfcie (Spread plate)
1- Marcar as placas contendo gar PCA com nome da amostra coletada e
a diluio a ser plaqueada;
2- Transferir 0,1 mL de cada diluio para placa contendo gar padro para
contagem (PCA) e previamente identificadas;
3- Espalhar a mostra sobre a superfcie da placa com um ala de Drigalsky
flambada com lcool. Flambar a ala novamente antes de espalhar a
diluio seguinte. Comear da diluio mais elevada. Deixar a placa
secar;
4- Incubar as placas, invertidas, a 37oC por 48 horas;
5- Contar as colnias conforme normas dadas no prximo roteiro de aula
prtica.
Mtodo Pour Plate
1- Marcar a placa com o nome da amostra coletada e a diluio a ser
plaqueada;

23

2- Usar uma pipeta para a transferncia, de 1,0 mL de cada diluio para

as placas;
3- Verter o gar (20 mL) liquefeito, a 45 oC, em cada placa, assepticamente.
Mover a placa sobre a bancada, em rotao no sentido horrio (em 8) e,
em seguida anti-horrio, com cuidado de no espalhar nas bordas da
placa. Deixar solidificar;
4- Incubar as placas, invertidas, a 37oC por 48 horas;
5- Contar as colnias conforme normas dadas no prximo roteiro de aula
prtica.

Micro-organismos presentes no ambiente

1- Para a avaliao da contaminao de ambientes, placas com gar PCA
devem ser exposta ao ambiente, fora da rea de segurana. Cada grupo
deixar a placa em exposio por um tempo diferente (10 / 20 / 30 / 40
minutos);
2- Aps o tempo de exposio, a placa deve ser tampada novamente e
vedada;
3- Escreva o nome do grupo e o tempo de exposio e leve as placas para
serem incubadas a 37oC. As placas devem ser incubadas invertidas.

24

REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS
AMERICAN PUBLIC HEALT ASSOCIATION APHA. Compendium of methods
for Microbiological Examination of Foods. 4. ed. Washington: 2001.
OBS: NO TEM RELATORIO. SER ENTREGUE JUNTO COM O PROXIMO
ROTEIRO.
MTODOS DE QUANTIFICAO DE MICRO-ORGANISMOS
INTRODUO
25

A contagem de colnias em placas o mtodo mais comum de se

determinar o nmero de micro-organismos. Baseia-se no pressuposto terico
de uma clula microbiana ou um grupo de clulas viveis (Unidades
Formadoras de Colnias UFC), d origem a uma colnia que se desenvolve
na superfcie ou no interior do meio slido na placa de Petri. Para garantir a
contagem, a amostra original precisa ser corretamente diluda, semeada e
incubada por um tempo determinado. A composio do meio, suas
caractersticas

(ex.

composio,

pH)

as

condies

de

incubao

(temperatura, tenso de O2) determinam os micro-organismos que iro se

desenvolver e formar colnias.
Para computar o nmero final de micro-organismos por cm 2 ou por
objeto avaliado, considera-se a alquota e a diluio utilizada. Por exemplo:
encontraram-se 30 colnias na placa aps a incubao, quando foi utilizado 0,1
mL de uma diluio 1:1000 (10-4) de um superfcie; o resultado deve ser
computado como:

UFC =

Nmero de colnias X Fator de diluio

Alquota plaqueada

30 x 10
UFC /cm 2 ,isto , 3,0 x 106 UFC /cm2
0,1

A contagem de colnias em placas pode ser adaptada para diversos

propsitos. Sua utilidade depende de se definirem os meios e condies de
incubao para permitir o crescimento dos micro-organismos.
OBJETIVOS
Introduzir mtodos de contagem de colnias em gar, considerando as
limitaes da tcnica.

26

MTODOS
Procedimento para contagem
1- Contar placas que apresentarem entre 25 e 300 colnias.
2- Para superfcies que tiverem 5 reas de 50 cm 2 amostradas, a contagem
residual de bactrias no deve exceder 500 (mdia de 2 UFC por cm 2).
3- Para utenslios de uso individual e outros, considera-se aceitvel at o
nvel de 100 UFC por utenslio.

Contagem de colnias em placas Mtodo de superfcie (Spread plate)

Amostra

Nmero de
colnias

Alquota
Diluio

plaquead

Resultado

a
10-1
10-2
10-3

Contagem de colnias em placas Mtodo Pour plate

Amostra

Nmero de
colnias

Alquota
Diluio

plaquead

Resultado

a
10-1
10-2
10-3

Contagem de colnias em placas Micro-organismos presentes no ambiente

27

Tempo de exposio

Nmero de
colnias

Resultado

REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS
AMERICAN PUBLIC HEALT ASSOCIATION APHA. Compendium of methods
for Microbiological Examination of Foods. 4. ed. Washington: 2001.
BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E. Biotecnologa
Industrial: Fundamentos. So Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA,
2001. vol. 1. 251p.

TCNICAS DE ISOLAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CEPAS ISOLADAS

INTRODUO

28

O isolamento de micro-organismos consiste, a partir de uma amostra

contendo uma cultura mista de micro-organismos, na separao de uma
espcie microbiana de outra. Para isso uma amostra da mistura de microorganismo pode ser recolhida e, assepticamente, transferida para placa
contendo meio agar nutriente. Quando as clulas da amostra so
eficientemente

separadas,

formaro

agregados

de

clulas

idnticas

denominadas colnias. Este mtodo assume que uma colnia, que contem
milhares de clulas, proveniente de uma nica cultura microbiana. Quando
esta for transferida para novo meio de cultura, as clulas se multiplicaro livres
de outros micro-organismos, constituindo assim, uma cultura pura, se a colnia
for originada de uma clula, ou axnica, se for originada de mais de uma
clula.
O isolamento de um micro-organismo adequado para um processo
comercial pode ser longo e muito caro e, portanto de extrema importncia
sua preservao. As tcnicas de preservao de cepas isoladas visam evitar
problemas como: um novo isolamento de micro-organismos; evitar o problema
da contaminao decorrente de pesquisadores com falta de experincia; perda
de viabilidade e evitar problemas de mutao (que causa a perda das
caractersticas fisiolgicas da linhagem isolada).
As tcnicas de preservao tm sido desenvolvidas para a manuteno
de culturas em estado de animao suspensa. O armazenamento das cepas
podem ser feito por; tcnicas de armazenamento em curto prazo (repique
continuo), tcnicas de armazenamento de mdio prazo (preservao em leo
mineral; preservao em gua; congelamento a -20C; secagem em slica, solo
e papel de filtro) ou tcnicas de armazenamento longo-termo (liofilizao;
congelamento a - 80C; criopreservao em nitrognio lquido).
OBJETIVOS
Nesta aula ser realizado o procedimento para obteno de cultura pura,
pelo mtodo de esgotamento do inoculo em superfcie de agar, utilizando
Estrias simples e Estrias compostas.
MATERIAIS
29

Para aula prtica ser necessrio:

Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):

Estufa para crescimento microbiano

Vidrarias e Materiais (por equipe):

01 placas de Petri com cultura microbiana de E. coli.

01 placas de Petri com cultura microbiana de Staphylococcus

aureus.
01 tubo de caldo nutriente com cultura microbiana.
04 placas de Petri com meio gar nutriente.
01 Pisseta com lcool 70%
01 bico de Bunsen
01 ala de nquel cromo

MTODOS
Isolamento de cultura pura Estrias em placa
1- Inicialmente limpe bem a bancada de trabalho com lcool 70%;
2- Acenda o bico de Bunsen;
3- Coloque os materiais (placa com os micro-organismos, placas de agar
nutriente, ala de nquel - cromo) que sero utilizados atrs do bico de
Bunsen;
4- Esterilize a ala de nquel cromo na chama do bico de Bunsen;
5- Transferir, de forma assptica a suspenso bacteriana contida na placa
contendo a cultura mista para a superfcie do agar nutriente;
6- Espalhe as colnias conforme as tcnicas descritas a seguir:
ESTRIAS SIMPLES

ESTRIAS COMPOSTAS

30

Com a ala de repicagem espalhe o

Divida a placa em 4 quadrantes.

inoculo na parte superior da placa,

Espalhe

como se estivesse limpando a ala

quadrante, esgotando com a ala de

(esgotamento), em movimentos de

repicagem,

zigue-zague, bem prximos. Faa

zigue-zague. Flambe novamente a

isso deslizando suavemente a ponta

ala

da ala sobre o meio sem perfura-lo.

cantinho do agar. Gire a placa 90o,

Continue o movimento de zigue-

encoste a ala no primeiro quadrante

zague, aproveitando ao mximo a

e deslizea at o segundo quadrante

superfcie da placa.

e realize movimentos de zigue-

inoculo
em

resfrie,

no

primeiro

movimentos
encostando-a

de
no

zague. Repita os procedimentos para

os demais quadrantes.

7- Aps a realizao das estrias, esterilize novamente a ala;

8- Incube as placas em posio invertida, a 37 oC por 24 horas. Observe e
anote o crescimento de colnias isoladas.
REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS
BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E. Biotecnologa
Industrial: Fundamentos. So Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA,
2001. vol. 1. 251p.
STANBURY, P. F., WHITAKER, A., HALL, S. J.. Principles of Fermentation
Technology. Butterworth Heinemann. Ed. 2, 1995. 357p.

31

FERMENTAO ALCOLICA
INTRODUO
As leveduras e outros micro-organismos fermentam glicose produzindo
etanol e CO2. Os monossacardeos glicose e frutose so convertidos
anaerobicamente para piruvato atravs da Via Glicoltica e o piruvato
convertido em etanol e CO2 atravs das enzimas piruvato descarboxilase e
lcool desidrogenase. A piruvato descarboxilase produzida por leveduras de
cervejarias e de panificao e outros micro-organismos que realizam a
fermentao alcolica. Est enzima no encontrada em animais nem em
32

bactrias lcticas que realizam a fermentao lctica. O CO 2 produzido pela

piruvato

carboxilase

da

levedura

responsvel

pela

carbonatao

caracterstica do champanhe pelo aumento do volume de pes durante a

fermentao.
Na fermentao alcolica da sacarose, este dissacardeo inicialmente
hidrolisado pela invertase da levedura em glicose e frutose. Em condies
anaerbicas a fermentao alcolica favorecida. Em condies aerbicas a
levedura cresce e reproduz rapidamente utilizando a energia de carboidratos.
Neste ultimo caso, etanol formado em pequena quantidade porque a levedura
suprida com grande quantidade de oxignio, oxida o piruvato formando CO 2 e
H2O atravs do ciclo do acido ctrico. Quando o oxignio dissolvido no mostro
consumido, as leveduras mudam o metabolismo aerbio dos carboidratos para
metabolismo anaerbico e comearam a fermentar os carboidratos produzindo
etanol e CO2.
OBJETIVOS
Estudar

fermentao

alcolica

da

sacarose

pela

levedura

Saccharomyces cerevisiae.

MATERIAIS
Para aula prtica ser necessrio:
Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):

Balana semi-anlitica
Saccharomyces cerevisiae (fermento biolgico) (40 g)
02 elernmeyer de 250 mL
100 mL de agua destilada esterelizada.

Vidrarias e Materiais (por equipe):

33

01 erlenmeyer de 250 mL contendo 150 mL de meio de sacarose

13% (contendo 1% de peptona; 0,02% de extrato de carne; 0,2%
de (NH4)2SO4; 0,02% MgSO4 e 0,2% de Na2HPO4, com pH

ajustado para 5,5) e esterilizado.

01 Pisseta com lcool 70%
01 pipeta de vidro de 10 mL
01 seringa para suco (pra para pipetar de vidro)
01 bquer de 100 mL esterilizado.
01 proveta de 50 mL
01 esptula para pesagem esterelizada.
01 bico de Bunsen

MTODOS
1- Prepare um suspenso de S. cerevisiae 20 % (p/v) em gua destilada
2- Adicione assepticamente 5 mL de suspenso de S. cerevisiae 20% p/v
no erlenmeyer contendo o meio de sacarose 13%.
3- Pesar o frasco (tempo zero de fermentao). Como controle pesar o
frasco de erlenmeyer de 250 mL contendo gua destilada.
4- Incubar os frascos a 30oC e pesar os frascos aps aproximadamente 24,
72 e 96 horas de fermentao. (Agitar os frascos antes da pesagem).
5- Traar o grfico: g de CO2 formado X Tempo de fermentao.

Tabela 1 - Fermentao alcolica pela levedura S. cerevisiae

Tempo de
fermentao

Meio de
sacarose

Controle

13%

Peso dos frascos inicial (g)

Peso dos frascos aps 24
h (g)
Diferena do peso aps 24
h
34

Peso dos frascos aps 72

h (g)
Diferena do peso aps72
h
Peso dos frascos aps 96
h (g)
Diferena do peso aps 96
h

PREPARO DE MEIO DE FERMENTAO E INOCULAO DO MICROORGANISMO NO REATOR

INTRODUO

A invertase ou

- frutofuranisidase pode ser obtida a partir de

leveduras (Saccharomyces cerevisiae) e fungos (Aspergillus niger). A levedura

Saccharomyces cerevisiae tem grande aplicao na produo de etanol a partir
de melao de cana e fermento biolgico em panificao.
A enzima invertase ( - frutofuranisidase) utilizada para a produo
de xarope de acar invertido (mistura de glicose e frutose) partir de
35

sacarose. A sacarose cristaliza-se em altas concentraes. Desta forma em

alguns produtos desejvel o uso de acar invertido. A invertase pode ser
aplicada na produo de balas e chocolate de centro liquido ou centro macio. A
- frutofuranisidase apresenta atividade de sntese em altas concentraes

de substrato e pode ser utilizada na produo de frutooligossacardeos.

OBJETIVOS
Demonstrar em escala laboratorial o processo de produo de
compostos de alto valor a partir de micro-organismos, com a utilizao do meio
de cultura semi-slido.
MATERIAL
Para aula prtica ser necessrio:
Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):

Balana semi-anlitica
Farelo de trigo
Estufa de crescimento microbiano
Papel alumnio
Autoclave

Vidrarias e Materiais (por equipe):

36

01 erlenmeyer de 250 mL
03 tubos inclinado de agar batata com o Aspergillus niger.
01 Pisseta de 500 mL com gua destilada
01 Pisseta com lcool 70%
01 tampo feito de gaze e algodo para erlenmeyer 250 mL
01 bquer de 100 mL
01 proveta de 100 mL
01 esptula para pesagem
01 bico de Bunsen
Ala de nquel cromo

MTODOS
Preparo do meio de fermentao
12345-

Inicialmente em um erlenmeyer de 250 mL pese 20 g de farelo de trigo;

Adicione gua destilada ao frasco na proporo 1:1 (p/v);
Tampe o erlenmeyer com o tampo feito com gaze e algodo;
Coloque papel alumnio sobre o tampo;
Leve o frasco para autoclave para ser esterilizado. O meio de
fermentao ser esterilizado em autoclave por 20 minutos a 121 oC, 1
atm de presso.

Inoculao do fungo Aspergillus niger para fermentao em meio semislido

1- Para est etapa do trabalho, o meio (farelo de trigo e gua destilada)
que foi submetido ao processo de esterilizao em autoclave, deve ser
resfriado at a temperatura ambiente. Para acelerar o processo aps a
retirada dos frascos da autoclave, coloque-os em uma bandeja com
gua.
2- Antes de iniciar o processo, faa a limpeza da bancada de trabalho com
lcool 70%;
3- Acenda o bico de Bunsen;
4- Coloque todos os materiais (elernmeyer, tubos com o micro-organismo,
ala de nquel-cromo) que sero necessrios atrs do bico de Bunsen;
5- Esterilize a ala de nquel-cromo no bico de Bunsen;
37

6- Aps a ala estril, transferir assepticamente perto da chama do bico de

Bunsen, os esporos da cultura do fungo Aspergillus niger (4 aladas)
para o frasco de erlenmeyer de 250 mL contendo o meio de farelo de
trigo previamente esterilizado;
7- Tampe o frasco com o tampo e agite o frasco no sentido horizontal para
espalhar inoculo no farelo de trigo (nesta etapa o papel alumnio no
ser adicionado sobre o tampo);
8- Coloque o frasco de erlenmeyer na estufa a 30 oC (Os frascos sero
incubados a 30oC em estufa por sete dias).

EXTRAO DO PRODUTO DA FERMENTAO E PREPARO DA CURVA

PADRO

INTRODUO
O fungo Aspergillus nger produtor de varias enzimas de grande
interesse industrial, como por exemplo, as amilases, proteases,

glicosidases, invertase, etc. Essa enzimas so excretadas no meio extracelular

e podem ser obtidas do sobrenadante do meio de cultura ou por adio de
gua destilada ou soluo tampo no substrato slido (por exemplo, o farelo de
trigo). A obteno de enzimas na forma extracelulares tem como vantagem o
no requerimento de uma etapa de lise da parede celular. As enzimas
extracelulares so excretadas pelos micro-organismos no meio extracelular,
onde podem hidrolisar polmeros de alta massa molecular em compostos que
podem ser absorvidos facilmente.
OBJETIVOS
Demonstrar a metodologia de extrao de enzimas; executar o preparo
da curva padro.

38

MATERIAIS
Para aula prtica ser necessrio:
Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):

Banho-maria 40oC
Banho-maria em ebulio
Glicose P.A.
Agitador rotatrio (Shaker)
Reagente de Somogyi e Nelson (reagentes SN1 e SN2)

(preparado pelo tcnico - APNDICE)

Geladeira
Gelo
Balana analtica
Espectrofotmetro
Cubetas de 2,0 mL
Agitador de tubos (Vortex)

Vidrarias e Materiais (por equipe):

01 Pisseta de 500 mL com gua destilada

01 Pisseta com lcool 70%
01 funil
02 papeis de filtro cortado para ser usado no processo de filtrao
01 frasco para armazenar 100 mL de meio fermentado
01 basto de vidro
01 bquer de 100 mL
01 balo volumtrico de 100 mL
01 esptula para pesagem
01 bico de Bunsen
01 pipetador automtico de 1000 L e 200 L
01 caixa de ponteiras de 1000 L e 200 L
01 bandeja
30 tubos de ensaio para o preparo da curva padro
01 suporte para tubos
01 banho de gelo
MTODOS
Extrao da Invertase extracelular do meio de cultura semi-slido

39

1- Retire o frasco de erlenmeyer da estufa e acrescente lentamente

(adicionar com cuidado para no espalhar esporos no meio ambiente)
50 mL de gua destilada ao erlenmeyer de meio de cultura;
2- Triturar o meio de cultura com basto de vidro, com cuidado, at
desintegrar o meio de farelo de trigo compactado;
3- Colocar o frasco em agitador rotatrio por 15 minutos para extrao da
enzima;
4- Filtrar a amostra em papel de filtro. O filtrado obtido ser utilizado como
extrato enzimtico bruto de Invertase;
5- O material extrado ser armazenado sob-refrigerao (temperatura de
-18oC) para sua utilizao na prxima aula prtica.
Preparo da curva padro
Preparao das solues de glicose
1- Pese 1,0 g de glicose P.A. em um bquer de 100 mL;
2- Dissolva a glicose com um pouco de gua destilada;
3- Com um balo volumtrico de 100 mL, adicione a glicose diluda e
complete com gua destilada at o menisco. (A soluo preparada ter a
concentrao de 1 mg/mL);
4- Aps o preparo da soluo inicial realize as seguintes diluies abaixo
para serem utilizadas no preparo da curva padro:
Soluo de
Tubos

glicose

1
2
3
4
5
6
7
8

(mL)
0,125
0,250
0,500
0,750
1,250
1,500
2,0
2,500

gua destilada

Volume

Concentrao de

(mL)

final (mL)

glicose (mg/mL)

4,875
4,750
4,500
4,250
3,750
3,500
3,000
2,500

5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0

0,025
0,05
0,10
0,15
0,25
0,3
0,4
0,5

5- Aps o preparo das solues seguir os seguintes passos:

Determinao de aucares redutores pelo mtodo de SomogyiNelson:
40

Pipetar 0,5 mL de cada diluio em diferentes tubos

Adicionar 1,0 mL de reagente SN1 em todos os tubos
Agitar os tubos e colocar em banho-maria em ebulio por 6 minutos
Retirar os tubos e colocar em banho de gelo
Retirar os tubos do banho de gelo e adicionar 1,0 mL de reagentes SN2
Agitar os tubos e deixar em repouso por 5 minutos
Adicionar 10 mL de gua destilada. Misturar por inverso
Medir a absorbncia a 540 nm

Nota: No mtodo original utilizado 1,0 mL de amostra, 2,0 mL de reagente de

SN1, etc. Est sendo utilizado metade da quantidade das solues para
diminuir a quantidade de resduos qumicos.
6- Aps a obteno das absorbncias, montar uma curva no Excel
[Absorbncia (nm) vs Concentrao de glicose (mg/mL)] para a prxima
aula prtica.

QUANTIFICAO DO PRODUTO DA FERMENTAO

41

INTRODUO
A espectrofotometria visvel e ultravioleta um dos mtodos analticos
mais usados nas determinaes analticas em diversas reas. aplicada para
determinaes de compostos orgnicos e inorgnicos, como, por exemplo, na
identificao do princpio ativo de frmacos, enzimas, etc.
Espectrofotmetros so instrumentos capazes de registrar dados de
absorbncia ou transmitncia em funo do comprimento de onda. Este
registro chamado de espectro de absoro ou de espectro de transmisso,
segundo

dado

registrado

for

de

absorbncia

ou

transmitncia,

respectivamente. O espectro de absoro caracterstico para cada espcie

qumica, sendo possvel a identificao de uma espcie qumica por seu
espectro de absoro.
A caracterstica mais importante dos espectrofotmetros a seleo de
radiaes

monocromticas,

que

possibilita

inmeras

determinaes

quantitativas regidas pela Lei de Beer. Quando a regio espectral usada a

ultravioleta/visvel, so necessrios componentes ticos de quartzo e
detectores altamente sensveis capazes de detectar radiaes nessa extensa
faixa espectral em que atua o instrumento. A regio ultravioleta do espectro
geralmente considerada na faixa de 200 a 400 nm, e a regio do visvel entre
400 a 800 nm.
Os espectrofotmetros, em geral, contm cinco componentes principais:
fontes de radiao, monocromador, recipientes para conter as solues,
detectores e indicadores de sinal.

Fontes de radiao

Monocromado
r

Dispositivo de
processamentos de dados

Compartimento
Amostra/padro

Sistema detector

42

Esquema dos componentes principais de um espectrofotmetro

OBJETIVOS
Demonstrar

tcnica

de

quantificao

denominada

de

espectrofotometria. Ensinar como se manuseia o espectrofotmetro.

MATERIAIS
Para aula prtica ser necessrio:
Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):

Banho-maria 40oC
Banho-maria em ebulio
Reagente de Somogyi e Nelson (reagentes SN1 e SN2)

(preparado pelo tcnico - APNDICE)

Gelo
Espectrofotmetro
Cubetas de 2,0 mL
Soluo de de sacarose 10 mg/mL em tampo acetato 0,05 mol/L
pH 5,6

Vidrarias e Materiais (por equipe):

01 Pisseta de 500 mL com gua destilada

01 Pisseta com lcool 70%
02 bquer de 50 mL
01 pipetador automtico de 1000 L e 200 L
01 caixa de ponteiras de 1000 L e 200 L
01 bandeja
30 tubos de ensaio
01 suporte para tubos
01 banho de gelo
MTODOS
Determinao da atividade de invertase
43

Grupos de numero par (preparar diluies 1:3; 1:10; 1:15; 1:30)

Grupos de numero impar (preparar as diluies 1:5; 1:12; 1:20; 1:40)

1- Pipetar 4 mL de soluo de sacarose na concentrao de 10 mg/mL em

tampo acetato 0,05 Mol/L pH 5,6 em 5 tubos de ensaio, numerados
comas diluies;
2- Incubar por 10 minutos em banho-maria 40 oC, para equilibrar a
temperatura;
3- Adicionar 1,0 mL das amostras diludas de extrato bruto respectivamente
em cada tubo numerado. No tubo BRANCO deve ser adicionado 1,0
mL de gua destilada;
4- Agitar os tubos e deixar incubado por 20 minutos a 40 oC. Aps a
incubao retirar os tubos do banho-maria e colocar em banho de gelo
para paralisar a reao.
5- Determinar a concentrao de acar redutor formado pelo mtodo de
Somogyi e Nelson , de acordo com o procedimento a seguir.
Nota: Uma unidade de invertase (U/mL) ser expressa como moles de
acar redutor/min/mL de enzima. Utilizar a curva padro feita na aula passada
para realizao dos clculos.

Determinao de aucares redutores pelo mtodo de Somogyi-Nelson:

Pipetar 0,5 mL de cada diluio em diferentes tubos
Adicionar 1,0 mL de reagente SN1 em todos os tubos de ensaio numerados
Agitar os tubos e colocar em banho-maria em ebulio por 6 minutos
Retirar os tubos e colocar em banho de gelo
Retirar os tubos do banho de gelo e adicionar 1,0 mL de reagentes SN2
44

Agitar os tubos e deixar em repouso por 5 minutos

Adicionar 10 mL de gua destilada. Misturar por inverso
Calibrar o espectrofotmetro com a soluo do tubo BRANCO
Medir a absorbncia a 540 nm contra a soluo do tubo BRANCO
Nota: No mtodo original utilizado 1,0 mL de amostra, 2,0 mL de reagente de
SN1, etc. Est sendo utilizado metade da quantidade das solues para
diminuir a quantidade de resduos qumicos.

PREPARAO DE IOGURTE

MATERIAL POR EQUIPE:

01 Litro de leite previamente inoculado com iogurte natural
01 Lata de leite condensado
01 caixinha de morango
01 liquidificador

MATERIAL DE USO EM COMUM:

03 pacotes de gelatina incolor
04 iogurtes naturais

PROCEDIMENTO:

45

Em uma panela ferver trs litros de leite e com o auxlio de um

termmetro deixar esfriar at a temperatura de 42 0C. Coloque o contedo de
um pote de iogurte natural no leite, mexendo-o com uma colher esterilizada.
Tampe e mantenha a temperatura por duas a trs horas, at a acidez atingir 90
0

D a 95 0D, onde o pH deve estar por volta de 4,6 que o ponto isoeltrico da

protena do leite, ocorrendo a formao do coagulo (com o calor o processo de

coagulao mais rpido), pode-se acrescentar uma colher de sopa de
gelatina incolor para o iogurte ficar mais firme. Esse procedimento foi
previamente preparado antes de iniciar essa aula. Depois de pronto
conserve na geladeira, bem tampado.
Para a preparao do iogurte batido, transfira o litro do leite previamente
fermentado para um liquidificador, adicione a fruta (morango) e o leite
condensado. Armazenar sob refrigerao.

APNDICE
REAGENTE DE SOMOGYI E NELSON
Forma de preparo:
REAGENTE SN1:
Dissolve-se 4 g CuSO4 .5H2O, 24 g Na2CO3, 16 g NaHCO3, 12 g Tartarato
de sdio e potssio, 18 g Na2SO4 em 1000 mL de gua destilada (conservar em
frasco escuro).
REAGENTE SN2

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Soluo A = 50 g de Molibdato de amnio em 900 mL H 2O + 42 mL de

H2SO4
Soluo B = 6 g de Arseniato dissdico (Na 2HAsO4) em 50 mL de gua
destilada (conservar em frasco escuro)
Misturar A e B e manter a 37oC por 24 horas
SOLUO SALINA 0,85%
Preparo da soluo salina 0,85% tamponada (estril):
Utiliza 0,85 g de NaCl para 100 mL de gua destilada.

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