Biocontrol del saccharina de Eldana del perforador de la caña de azúcar de Expression de genes del chiA de

los marcescens del bacilo thuringiensis cry1Ac7 y del Serratia en bacterias Caña de azúcar-Asociadas.

El gene cry1Ac7 del bacilo tensión 234 del thuringiensis, demostrando actividad contra el saccharina de Eldana del
perforador de la caña de azúcar, fue reproducido bajo control del promotor del tac. La fusión fue introducida en el
amplio-hostrange plasmid pKT240 y el vector pJFF350 de la integración y sin el promotor del tac en los amplios-
hostrange plasmids pML122 y pKmM0. Estos plasmids fueron introducidos en los Pseudomonas que los fluorescens
filtran aislado del phylloplane de la caña de azúcar y de los seropedicae endophytic de Herbaspirillum de la bacteria
encontrados en caña de azúcar. La construcción ptac-cry1Ac7 fue introducida en el cromosoma de los fluorescens del P.
usando el vector pJFF350 de la integración que llevaba el interposon artificial Omegon-Kilómetro. El análisis occidental
de la mancha blanca /negra demostró que los niveles de la expresión del gene integrado cry1Ac7 eran mucho más altos
bajo control del promotor del tac que bajo control de su promotor endógeno. También fue determinado que la expresión
multicopia en fluorescens del P. y seropedicae del H. de ptac-cry1Ac7 continuó inestabilidad causada pKT240 del plasmid
sin la expresión perceptible de la proteína.

En H. seropedicae del , más toxina Cry1Ac7 fue producida cuando el gene fue reproducido bajo control del promotor Nmr
en pML122 que en la orientación y las pruebas biológicas opuestas demostró que el anterior dado lugar a una mortalidad
más alta de las larvas del saccharina del E. que el último. Fluorescens 14 del P.:: el ptac-tox dio lugar a una mortalidad
más alta de larvas que los fluorescens 14 del P.:: tox. Un efecto tóxico creciente fue observado cuando los fluorescens 14
del P.:: el ptac-tox fue combinado con los fluorescens del P. que llevaban el chiA del gene del chitinase de los marcescens
del Serratia, bajo control del promotor del tac, integrado en el cromosoma.

El bacilo gram-positive, aerobio, spore-forming thuringiensis de la bacteria se ha utilizado como un alternativa y

suplemento seguros a los pesticidas químicos por más de 2 décadas. Es a patógeno de las larvas de insecto que produce
inclusiones cristalinas altamente específicas durante la esporulación. Estos cristales parasporal consisten predominante
en las moléculas del protoxin conocidas como d-endotoxinas, gritan las toxinas, o las proteínas del grito. Las inclusiones
cristalinas disuelven en el midgut larval, donde unos o más protoxins se lanzan y proteolytically se convierten en
polipéptidos tóxicos más pequeños.

Las toxinas activadas son altamente específicas al insecto y mismo al específico en su actividad. A pesar de el éxito de
productos thuringiensis-basados B. convencionales, tienen varias desventajas como bioinsecticides. En el caso del Walker
del saccharina de Eldana del perforador de la caña de azúcar (Lepidoptera: Pyralidae), un parásito extenso que cause
pérdida considerable de la cosecha en las áreas bastón-crecientes de Suráfrica y de Swazilandia, éstos de la caña de
azúcar incluye inestabilidad en el ambiente y en la superficie de la caña de azúcar, así como dificultad en alcanzar las
regiones internas donde las larvas alimentan. El uso de la tecnología de DNA recombinant ha proporcionado soluciones a
los problemas con el desarrollo de dos acercamientos, a saber, los microorganismos genético modificados y las plantas
transgenic.

Como parte de un acercamiento integrado de la gerencia del parásito al control del saccharina del E. en Suráfrica, el
gene cry1Ac7 de la tensión 234 del thuringiensis del B. fue introducido previamente en el aislante 14 de los fluorescens
del P. Este organismo fue aislado de la superficie de las hojas, de los vástagos, y de los borings de la caña de azúcar y
demostrado para ser buen colonizador del phylloplane de la caña de azúcar. Las pruebas biológicas de la toxicidad
indicaron que los fluorescens 14 del P. se reproducen que expresado el gene eran tóxico a las larvas del saccharina del
E., e invernadero los ensayos demostraron que las plantas de la caña de azúcar inoculadas con la tensión que llevaba el
gene integrado eran más resistentes al daño del saccharina del E. que los controles untreated.

Aunque estos resultados animaban, era sentido que había sitio para la mejora adicional en el uso de las bacterias
recombinant para el control de este parásito de la caña de azúcar. La puntería del trabajo presentó en este papel era
aumentar la expresión de la d-endotoxina reproduciendo el gene cry1Ac7 bajo control del promotor del tac con la
integración subsecuente del cassette en el cromosoma de los fluorescens 14 del P.

Además, desde fluorescens recombinant del P. no mantienen a 14 poblaciones estable el los períodos del excedente de la
caña de azúcar de largo, el potencial de las bacterias endophytic presentes en las regiones interiores de las plantas
sanas de la caña de azúcar que expresan el gene como un agente del biocontrol fue investigado. De interés particular
están los seropedicae gram-negative, obligately endophytic, nitrogen-fixing de Herbaspirillum de la bacteria, que se ha
aislado solamente de las plantas monocotyledonous tales como caña de azúcar, arroz, zahína, maíz, 13 diversas malas
hierbas gramíneas, y las raíces de una planta del pigeonpea. El uso de una bacteria endophytic también fue considerado
como solución posible al problema de la inaccesibilidad de productos thuringiensis-basados B. convencionales a las
regiones interiores de la planta. Las ventajas de usar estos endophytes recombinant son su alta estabilidad en caña de
azúcar y la capacidad de ser transferido a las generaciones subsecuentes vía setts de la caña de azúcar.

Otra estrategia para mejorar el biocontrol del saccharina del E. implicó el combinar de tensiones de los fluorescens del P.
produciendo la proteína Cry1Ac7 y un chitinase de los marcescens del Serratia, ChiA.

Los informes han demostrado que el coapplication de las d-endotoxinas del thuringiensis del B. y de los chitinases
bacterianos aumentó perceptiblemente el efecto insecticida del anterior contra larvas de insecto. Se cree que el chitinase
causa perforaciones en la membrana peritrophic chitincontaining de las larvas, de tal modo aumentando la accesibilidad
de las membranas del midgut a la d-endotoxina. La introducción del grito y de ChiA en bacterias o plantas ofrece el gran
potencial para aumentar la actividad insecticida en los sistemas transgenic donde las toxinas del grito se expresan en los
niveles bajos y/o en una forma cristalina.

MATERIALES Y MÉTODOS

Tensiones bacterianas, plasmids, y condiciones de la cultura.

Las tensiones y los plasmids bacterianos usados en este estudio se enumeran en la tabla 1. los fluorescens Rifampin-
resistentes 14 del P. fueron crecidos en el medio de Luria-Bertani (libra) o el medio de la libra con el agar suplido con el
rifampin (100 mg/ml). Los seropedicae HRC54 del endophyte H. de la caña de azúcar fueron proporcionados por J. DE
Obereiner del Empresa Brasiliera de Pesquisa Agnopecuaria, Brasilia, el Brasil. Un mutante a prueba de ácido nalidixic
espontáneo, seropedicae Nal1 del H., fue aislado.

Estas tensiones fueron crecidas en el medio de JNFb, que contuvo, por el litro, 5 g de ácido málico, 0.6 ml de K2HPO4,
1.8 ml de KH2PO4, 0.2 g de MgSO4 z 7H2O, 0.1 g del NaCl, 0.2 g del CaCl2 z H2O, 0.066 g de FeEDTA, 2 ml de azul del
bromothymol, 2 ml de microalimentos, 0.02 g del extracto de levadura, y 4.5 g del KOH (pH 5.8) y suplidas con el
antibiótico apropiado. Para JNFb sólido, 17 g de agar fueron agregados por litro; para JNFb semisólido, 1.9 g de agar
fueron agregados por litro con el extracto de levadura omitido; y para el medio líquido de JNFb, 1 g de NH4Cl fue
agregado por litro además del extracto de levadura.

Los microalimentos consistieron en 0.2 g de Na2MoO4 z 2H2O, 0.235 g de MnSO4 z H2O, 0.28 g de H3BO3, 0.008 g de
CuSO4 z 5H2O, y 0.024 g de ZnSO4 z 7H2O por 200 ml de H2O.

Todas las bacterias fueron crecidas en los fluorescens de 30ºC.P. fueron mantenidas en 0.1 M MgSO4 en 4ºC, y las
tensiones de los seropedicae del H. fueron mantenidas en el medio de JNFb suplido con glicerol del 10% en 270ºC.

Técnicas moleculares.

Las técnicas moleculares fueron realizadas según lo descrito por Sambrook y otros.

Análisis Western blot:

Determinación de la expresión del gene cry1Ac7 adentro Los fluorescens 14 del P. y los seropedicae Nal1 del H. fueron
realizados por análisis occidental de la mancha blanca /negra. Los extractos de la célula fueron preparados a partir de 1
ml de culturas de la inmóvil-fase suspendiendo de nuevo pelotillas de la célula en 100 ml de desnaturalizar el
almacenador intermediario del cargamento. Las muestras (20 ml) fueron cargadas sobre un gel de la acrilamida del
gradiente que desnaturalizaba (10 a el 5%), y las proteínas fueron separadas por electrophoresis dodecyl del gel del
sulfato-polyacrylamide del sodio (SDS-PAGE) por el método de Laemmli. Para el análisis cuantitativo de la producción
Cry1Ac7, las culturas de coli de Escherichia fueron crecidas durante la noche en 30�C en medio de la libra suplidas con
el antibiótico apropiado, diluidas cien veces, venidas fase mediados de-exponencial en 37ºC, e inducidas con 0.3
milímetros de isopropyl-b-D-THIOGALACTOPYRANOSIDe (IPTG) según lo descrito por Ausubel y otros.

Los controles de Uninduced fueron preparados dividiendo la cultura de la mediados de-exponencial-fase (densidad óptica
en 600 nanómetro, 0.4) en dos antes de agregar IPTG. Las muestras de uninduced e indujeron culturas fueron quitadas
en los varios intervalos del tiempo después de la inducción. Las muestras (1 ml) de las culturas inducidas para 24 h
sonicated, y la concentración de la proteína fue determinada por el método de Bradford. Volúmenes de la célula
desnaturalizada los extractos que representaban el magnesio 50 de la proteína fueron separados por SDS-PAGE.

Las proteínas fueron transferidas de los geles del SDS-polyacrylamide sobre las membranas de la nitrocelulosa por el
método de Towbin y otros. El análisis occidental de la mancha blanca /negra fue realizado usando el anticuerpo primario
levantado contra la proteína Cry1Ac7 (proveída por SASEX) y la inmunoglobulina G del contra-conejo de la cabra conjugó
al phosphatase alcalino (sigma) como el anticuerpo secundario.

Transformación bacteriana por el electroporation y la conjugación.

Los Amplios-hostrange plasmids y el vector de la integración que llevaba el cassette ptac-cry1Ac7 eran electroporated en
los fluorescens 14 del P. y los seropedicae Nal1 del H. usando una modificación del método de Waalwijk y otros. Las
células cosechadas en la fase mediados de-exponencial y lavadas tres veces en 300 milímetros de sucrosa eran
electroporated en volúmenes de 40 ml con el magnesio 1 a 3 de la DNA usar Bio-Rad un gene Pulser y el regulador fijó
en 25 frecuencias intermedias, 2.5 kilovoltios, y 200 V.

La expresión Phenotypic fue realizada en 30�C para 2 h en 1 ml de libra o de medio de JNFb (para los fluorescens del P.
y los seropedicae del H., respectivamente). Las células fueron plateadas no diluidas sobre medio de la libra con el agar o
el medio sólido de JNFb suplido con el kanamycin (100 mg/ml) y crecido en 30ºC. Para aumentar la eficacia del
electroporation de los seropedicae del H., el método descrito en Wirth y otros. fue procurado. Los Plasmids también
fueron movilizados en los seropedicae Nal1 del H. según lo descrito por Simon y otros.

con modificaciones. El E. coli JM105 que llevaba los plasmids para la movilización (células dispensadoras de aceite), el E.
coli HB101 que llevaba el plasmid pRK2013 del ayudante para la movilización, y las bacterias receptoras fueron crecidos
durante la noche en 5 ml de libra (para E. coli) o de medio de JNFb (para los seropedicae del H.) suplido con el
antibiótico apropiado en 30�C con sacudarir. Un volumen igual (1.5 ml) de cada tensión fue cosechado, lavado tres
veces con el medio de la libra, combinado en 1:1: 1 cociente (500 ml de cada uno), y suspendido de nuevo en 100 ml de
medio de la libra. La cultura mixta entonces fue manchada en volúmenes de 20 ml sobre las placas que contenían una
mezcla de JNFb y los medios de la libra sin los antibióticos y crecidos durante la noche en las dilusiones seriales 30ºC. de
las colonias que resultaban fueron plateados sobre el medio de JNFb suplido con el ácido nalidixic (100 mg/ml) y el
kanamycin (100 mg/ml) e incubado en 30ºC durante la noche.

El donante, el recipiente, y el ayudante que las tensiones que no había sido mezclado fueron tratadas describieron tan ya
para servir como controles. Las placas fueron incubadas en 30�C.

Estabilidad del Plasmid.

La estabilidad de los plasmids pMT7 y pMT11 de pML122-derived que llevaban el gene cry1Ac7 en los seropedicae Nal1
del H. fue determinada. Las tensiones fueron crecidas en el medio líquido de JNFb suplido con el kanamycin (100 mg/ml)
a la fase inmóvil en 30ºC, diluido a 1026 bacterias por 20 ml de medio de JNFb sin los antibióticos, y la fase inmóvil
venida. Este ciclo del crecimiento y la dilusión fue realizada cinco veces. Las células de una dilusión 1026 fueron
plateadas sobre las placas de JNFb después de cada ciclo del crecimiento. Cientos del CFU que resultaba fueron
remendados sobre las placas de JNFb suplidas con el kanamycin (100 mg/ml). El porcentaje de las colonias remendadas
que crecieron en estas placas fue registrado. Este experimento fue realizado tres veces.

Análisis Southern blot.

El análisis meridional de la mancha blanca /negra fue utilizado para demostrar la integración del cassette Omegon-
Kmptac-cry1Ac7 en el cromosoma de los fluorescens 14 del P. se reproduce. La DNA bacteriana total fue aislada según lo
descrito por Ausubel y otros. Las puntas de prueba fueron etiquetadas con digoxigenin-11-dUTP (Boehringer Mannheim)
por el método de etiquetado preparado al azar de la DNA de acuerdo con las instrucciones de los manufacturers. El
análisis meridional de la mancha blanca /negra fue realizado por el método descrito en la guía de los users del sistema
de digoxigenin-11-dUTP.

Pruebas biológicas de la toxicidad.

Las cantidades pesadas de las varias preparaciones bacterianas liofilizadas que expresaban los genes de cry1Ac7 y del
chiA fueron mezcladas con cantidades pesadas de una dieta artificial del insecto tales que una cantidad sabida de
preparación bacteriana por el gramo de la dieta fue obtenida. Las partes alícuotas (0.2 g) fueron agregadas a los tubos
de Eppendorf, y al semana-viejo E. recién nacido del saccharina de cinco 2 que las larvas fueron colocadas en cada tubo.
Cada tratamiento abarcó cinco tubos. La mortalidad de las larvas fue registrada cada 24 h por 5 días. Un análisis de la
variación fue hecho con los dentro-temas uno los entre-temas variables (tratamiento) y uno variables (tiempo).

Pues la variable de la respuesta, mortalidad, era una proporción, tuvo que ser transformada usando la transformación
variación-que se estabilizaba generalmente para las proporciones, a saber, raíz cuadrada del arcoseno. Las
comparaciones múltiples fueron hechas usando procedimiento de la del del diferencia menos de significativo Fishers.

RESULTADOS:

la introducción del gene cry1Ac7 del aislante 234 del thuringiensis del B. en la expresión, amplio-anfitrión-
gama, y los vectores de la integración y la expresión Cry1Ac7.

Para mejorar la expresión del gene cry1Ac7, referida como el tox en este informe, de pGH37D-1 para el uso subsecuente
del biocontrol, él fue reproducido en el plasmid pKK223-3 para la expresión bajo control del promotor del tac. El
fragmento de 3.7 KB NdeI de pGH37D-1, llevando el gene cry1Ac7 bajo control de su propio promotor, fue reproducido
en el sitio de SmaI de pKK223-3.

La construcción que resultaba fue llamada ptac-tox. El fragmento de 4 KB BamHI del ptac-tox fue reproducido en el sitio
de BamHI del amplio-hostrange plasmid pKT240, rindiendo el pKTT (pKT240tactox). Overexpression de un gene del
chitinase en pKT240 fue demostrado para ser altamente inestable en los seropedicae y los fluorescens del P. (datos del
H. no demostrados), y el gene altamente expresado cry1Ac7 en pKTT tenía un efecto perjudicial en la última tensión
(véase abajo). Por lo tanto era decidido para reproducir el gene cry1Ac7 bajo control de su propio promotor en los
plasmids pML122 y pKmM0, un derivado de la amplio-anfitrión-gama de Kmr del plasmid pDER405 de la amplio-
anfitrión-gama demostrado para ser mantenido estable en Herbaspirillum spp. (datos no demostrados).

El fragmento blunted 3.7 KB de NdeI de pGH37D-1 fue reproducido en el sitio blunted de EcoRI de pML122 en ambas
orientaciones con respecto al promotor Nmr presente en el vector, dando por resultado los plasmids pMT7 y pMT11
(pML122tox). En pMT7, el gene cry1Ac7 fue reproducido bajo control del promotor Nmr además de su promotor
endógeno mientras que en pMT11, el gene cry1Ac7 estaba bajo control de su propio promotor. El fragmento fue
reproducido en el sitio de EcoRV de pKmM0 para rendir pKmM0tox. Para reproducirse en el vector de la integración, el
fragmento de BamHI ptac-cry1Ac7 del ptac-tox fue hecho embotado y reproducido en el sitio blunted de NdeI del vector
pJFF350, que de la integración lleva el interposon artificial Omegon-Kilómetro, generando el cassette Omegon-Km�ptac-
cry1Ac7 en el pJTT (pJFF350tactox).
La expresión del gene cry1Ac7 en E. coli JM105 fue determinada por análisis occidental de la mancha blanca /negra, y
era evidente que está expresada del promotor del tac en ptac-tox en los niveles considerablemente más arriba que de su
propio promotor (resultados no demostrados).

Construcción del cassette y de la introducción del ptac-chiA en los fluorescens Rif1 del P.

Para la expresión de alto nivel del gene del chiA de los marcescens del S. en las bacterias gram-negative para el
biocontrol de hongos phytopathogenic, el gene fue reproducido bajo control del promotor del tac e introducido en el
cromosoma de los fluorescens Rif1 del aislante P. según lo descrito por tragar y Thomson.

La construcción de los fluorescens 14 del P. y de los seropedicae Nal1 del H. filtra expresar el gene cry1Ac7. El pKTT y el
pJTT de los plasmids, llevando el cassette ptac-cry1Ac7 en pKT240 y el vector pJFF350 de la integración,
respectivamente, fueron introducidos en los fluorescens 14 del P. por el electroporation. Los fluorescens del P. 14
electrotransformants (del pKTT) crecieron mal en el medio líquido, indicando que la expresión constitutiva del gene
cry1Ac7 en los altos niveles tenía un efecto mortal en este organismo. Para evitar este problema y para prevenir la
transferencia horizontal del gene a la otra especie bacteriana, el cassette Omegon-Km�ptac-cry1Ac7 fue insertado en el
cromosoma y la integración fue confirmada por análisis meridional de la mancha blanca /negra. DNA total de los
fluorescens 14 del P.:: ptac-cry1Ac7 fue cortado con EcoRI y sondado con el fragmento de 4 KB BamHI del ptac-tox que
llevaba el cassette ptac-cry1Ac7 (higo 1).

Cuatro fragmentos de 3.5, 3.3, 0.7, y 0.2 KB cruzaron por hibridación al pJTT EcoRI-restricto. En todo el reproduce
analizado, dos fragmentos de EcoRI de 0.7 y 0.2 KB, correspondiendo a los fragmentos internos al cassette Omegon-
Kmptac-cry1Ac7, y a dos de diversos tamaños los 3.5 y 3.3 KB mayor que, cruzado por hibridación a la punta de prueba.
La integración al azar, sola del cassette fue indicada por el hecho de que los dos fragmentos más grandes de EcoRI
estaban de diversos tamaños y solamente dos de los fragmentos más grandes de EcoRI fueron detectados en éstos se
reproduce.

La estabilidad del cassette integrado no fue establecida definitivo, pero no había evidencia de la expresión disminuida
Cry1Ac7 en SDS-PAGE después de que 48 h (resultados no demostrados) y el índice de crecimiento de la tensión
recombinant no aparecía ser diferente de el de los fluorescens 14 del P. Los plasmids pKT240 y pJFF350, sus derivados
recombinant ptaccry1Ac7, y los plasmids de pML122- y de pKmM0-derived que llevaban el gene cry1Ac7 eran
electroporated en los seropedicae Nal1 del H. pKT240 y los plasmids de pKmM0- y pML122- basado que llevaban el gene
cry1Ac7 fueron introducidos con éxito con una eficacia de ca. 8 3 104 transformants/mg de la DNA. Electroporation del
pKTT de pKT240-derived que llevaba el cassette ptac-cry1Ac7 dio lugar solamente a algunas colonias de Kmr,
posiblemente debido a la inestabilidad de esta construcción en seropedicae del H.

Los estudios de la estabilidad del Plasmid demostraron que pMT7 que llevaba el gene cry1Ac7 insertado río abajo del
promotor Nmr fuerte en pML122 era extremadamente inestable después de crecimiento de noche, mientras que pMT11,
con el gene en la orientación opuesta con respecto a este promotor, era estable sobre las 60 generaciones probadas (los
resultados no demostrados). Esto es probable ser debido a la intolerancia de altos niveles de cry1Ac7 constitutivo
expresado en células de los seropedicae del H. pKmM0-tox era estable sobre las 40 generaciones probadas (los
resultados no demostrados). Los esfuerzos de introducir el cassette ptaccry1Ac7 en el pJTT integrante de la construcción
en seropedicae del H. por el electroporation y la transferencia conjugative dieron lugar a los números muy bajos de las
colonias de Kmr, indicativos de frecuencias bajas de la transposición, creído para ser debido a la transformación ineficaz.

Expresión del gene de la d-endotoxina.

La expresión del gene cry1Ac7 en los fluorescens 14 del P. y los seropedicae Nal1
del H. fue determinada por análisis occidental cuantitativo de la mancha blanca
/negra. Los 134 - la proteína del kDa Cry1Ac7 no fue detectada en los
fluorescens 14 (pKTT) del P. reproduce llevar el cassette ptac-cry1Ac7 en pKT240
(higo 2A, carril 4). Sin embargo, este gene, bajo control de su promotor
endógeno en pKT240 y pDER405, fue expresado en los fluorescens 14 del P. en
los niveles de la proteína de la toxina de 3.5 y 2.2%, respectivamente, de las
proteínas totales. Esto implicó que la expresión constitutiva de cry1Ac7 en los
altos niveles en los fluorescens 14 (pKTT) del P. debe haber dado lugar a la
acumulación de los mutantes defectuosos en la expresión cry1Ac7 después de
crecimiento de noche.

Todos los fluorescens analizados 14 del P.:: el ptac-tox se reproduce, llevando el

cassette integrado de Omegon-Kmptac-tox, produjo la proteína 134-kDa en los
niveles considerablemente mayor que el de los fluorescens previamente
construidos 14 del P.:: Tensión de OmegonKmcry, mencionada en este informe
como fluorescens 14 del P.:: tox (el higo 2A, compara los carriles 6 a 10 con el
carril 5).

La proteína Cry1Ac7 no fue detectada por el análisis occidental de la mancha blanca /negra de los seropedicae del H.
(pKTT) que llevaban el cassette ptac-cry1Ac7 en pKT240 (resultados no demostrados). Como en los fluorescens 14
(pKTT) del P. se reproduce, esto es posiblemente debido a la acumulación de los mutantes Cry1Ac72 resultando de altos
niveles del gene constitutivo expresado cry1Ac7 en los seropedicae del H. (pKTT). En cambio, los seropedicae del H.
(pMT7) se reproducen con el gene cry1Ac7 río abajo del promotor Nmr en pML122 que los niveles más altos producidos
de la proteína Cry1Ac7 que los seropedicae del H. (pMT11) se reproducen con el gene en la orientación opuesta con
respecto a este promotor (higo 2B).

Esto indicó que la expresión del gene en el anterior se reproduce estaba bajo control del promotor Nmr, que podría
explicar los altos niveles de la inestabilidad de este plasmid. Labes y otros. divulgado que el promotor Nmr era un
promotor eficiente y más eficaz que el promotor del tac para el overexpression de genes extranjeros en bacterias del
suelo, incluyendo los Pseudomonas spp. La proteína Cry1Ac7 también fue detectada en las tensiones que llevaban
pKmM0-tox (resultados no demostrados).

El efecto de los fluorescens de Cry1Ac71 P. y de los seropedicae del H. filtra en larvas del saccharina del E.

La actividad biológica de las tensiones de los fluorescens de Cry1Ac71 P. y de los seropedicae del H. fue determinada en
pruebas biológicas de la toxicidad usando el magnesio 3 de bacterias liofilizadas por g de la dieta (tabla 2). Los
resultados, en el nivel de la significación del 5%, demostraron que los fluorescens 14 del P.:: ptac-cry1Ac7 era
perceptiblemente diferente de los fluorescens 14 del P.:: cry1Ac7. Ambos fluorescens 14 del P.:: cry1Ac7 y 14:: ptac-
cry1Ac7 eran perceptiblemente diferentes de la tensión parental, que no era perceptiblemente diferente del control
untreated. Los seropedicae Nal1 (pMT7) del H. eran perceptiblemente diferentes de los seropedicae Nal1 del H., que no
era perceptiblemente diferente del control. Los seropedicae Nal1 (pMT11) del H. eran diferentes de los seropedicae Nal1
del H., pero del tamaño de muestra no eran bastante grandes declarar la significación en el nivel del 5%.

El efecto de los fluorescens del P. filtra expresar el cry1Ac7 y los genes del chiA en larvas del saccharina del
E. P.
Fluorescens 14 del.:: ptaccry1Ac7 y fluorescens Rif1 del P.:: el ptac-chiA fue combinado en diversas concentraciones y
utilizado en las pruebas biológicas de la toxicidad (tabla 3). La mortalidad fue determinada después de 2 y 5 días.

Los resultados, en el nivel del 5% de la significación, demuestran que cuando la tensión chitinaseexpressing fue
agregada en 0.3 o 30 mg/g de dieta junto con la tensión de Cry1Ac7-expressing en 0.3 mg/g de dieta, había un efecto
tóxico perceptiblemente creciente. La razón de la carencia de la toxicidad creciente cuando la tensión chitinase-que
expresaba fue agregada en 3.0 mg/g de dieta junto con el Cry1Ac7- que expresaba la tensión en 0.3 mg/g de dieta es
más probable el tamaño de muestra más pequeño de este experimento (n 5 4). Aunque la tensión chitinaseexpressing
demostró toxicidad en 30 mg/g de dieta, no hizo tan en 0.3 o 3 mg/g de dieta. Sin embargo, había un aumento
significativo en toxicidad cuando fue mezclado con la tensión de Cry1Ac7-expressing en 0.3 mg/g de dieta.

DISCUSIÓN

Los genes del grito del thuringiensis de la B. se han introducido en bacterias con excepción de thuringiensis del B., tal
como los fluorescens de los colonizadores P. de la raíz y el radiobacter de la agrobacteria y el aquaticus de Ancylobacter,
una bacteria aislada de habitat acuáticos. Estas tensiones eran tóxicas contra las larvas del hornworm del tabaco (sexta
de Manduca), del stephensi de los Anopheles del mosquito de la malaria, y del leatherjacket (oleracea de Tipula).

La introducción del gene del cryIA (c) del subsp del thuringiensis del B. kurstaki en el cromosoma del subsp del xyli de
Clavibacter. los cynodontis, que coloniza naturalmente el xylem de la hierba de Bermudas, son el único informe del uso
de un endophyte genético modificado como agente del biocontrol. Este endophyte recombinant fue demostrado para
colonizar maíz y probado para su eficacia contra el perforador de maíz europeo (nubilalis de Ostrinia). El control
moderado de este parásito fue alcanzado por la expresión del gene de la toxina integrado cromosómico en el endophyte.

Sin embargo, integración de las secuencias del gene de la endotoxina en el cromosoma del subsp del xyli de la C. los
cynodontis eran inestables y las colonias segregant compusieron el 15% de las colonias aisladas de maíz en el final de la
estación de crecimiento. Los autores sugirieron que la pérdida del gene integrado podría servir como característica
ambiental de seguridad. Como poca investigación había sido hecha sobre la conveniencia de bacterias endophytic como
agentes del biocontrol hasta la fecha, estaba de interés de investigar el potencial del diazotrophicus de los endophytes A.
de la caña de azúcar y de los seropedicae del H., además de los fluorescens 14 de la bacteria P. del phylloplane, dirigidos
para expresar un gene del grito del thuringiensis del B. contra el saccharina del perforador E. de la caña de azúcar.

Para mejorar la expresión del gene cry1Ac7, lo reprodujimos bajo control del promotor fuerte del tac y utilizamos el
vector pJFF350, que lleva el interposon artificial Omegon- kilómetro, para integrarlo en el cromosoma de los fluorescens
14 del P. En este plasmid, el interposon de V es flanqueado por dos sintéticos invertidos 28 repeticiones del punto de
ebullición de IS1, que puede transportar si se proveen los productos del gene IS1.

El vector tiene un origen de la transferencia que permite la movilización en bacterias gram-negative. También lleva un
elemento lisiado IS1 que permita la transposición del cassette Omegon-Kilómetro aunque no puede transportarse, dando
por resultado genes estable integrados. Aunque la estabilidad del cassette ptac-cry1Ac7 en los fluorescens 14 del P. no
fue investigada, Herrera demostró que el cassette de Omegon-Kmcry en los fluorescens 14 del P. estable fue integrado
por lo menos 100 generaciones y la integración estable de los genes del grito en rootcolonizing tensiones de los
fluorescens del P. usando un sistema del transposon Tn5-mediated o los vectores del suicidio para la integración por la
recombinación homóloga se ha descrito en la literatura.

Nuestros resultados probaron que el promotor del tac es capaz del funcionamiento eficientemente en Pseudomonas y es
responsable de los niveles crecientes de la expresión del gene. Somos inconscientes de cualquier informe de un gene de
cry1A (c) bajo control del promotor del tac que es integrado en el cromosoma de un SP de los Pseudomonas. Análisis
cuantitativo de la d-endotoxina por análisis enzima-ligado del immunosorbent en los fluorescens 14 del P.:: ptac-cry1Ac7
se reproduce no fue determinado, solamente Herrera y otros. demostrado que fluorescens 14 del P.:: cry1Ac7 reproduce
los altos niveles producidos de la proteína Cry1Ac7 similares a ésos producidos por pKT240 cry1Ac7 se reproduce,
representando 3.7 y 3.5% de la proteína total, respectivamente.

Estos niveles eran comparables a los de 0.5 a el 1% divulgados por Obuckowicz para un gene similar del grito en
pseudomonads de raíz-colonización. Ge y otros. divulgado que la expresión del gene 73 de cry1A (c) de su propio
promotor en E. coli era 0.24% de la proteína celular total y eso del promotor del tac después de que la inducción fuera el
cerca de 50% de la proteína celular total. En otro sistema, expresión de un subsp del thuringiensis del B. el gene de la
proteína del aizawai 130-kDa del promotor del tac en E. coli era el 38% de la proteína celular total comparada hasta el
3% de la proteína celular total cuando estaba expresado de su propio promotor. Por lo tanto, se cree que los niveles de
la proteína Cry1Ac7 expresada del promotor del tac en fluorescens del P. serían 3.7% considerablemente mayor que.
Esto resultaría solamente si el cassette ptac-cry1Ac7 estaba presente en la célula pues una sola copia integrada, pues
está claro de los mutantes nonexpressing de los fluorescens del P. que llevan el cassette en el pKTT multicopia del
plasmid que solamente cierto nivel de la expresión es tolerado por estas células.

Las pruebas biológicas de la toxicidad demostraron que la expresión creciente del gene cry1Ac7 en los fluorescens 14
del P. y los seropedicae del H. mejora el control de las larvas del saccharina del E. Sin embargo, es importante considerar
que aunque la expresión creciente conduce a la toxicidad creciente, puede también ser una carga en las células
bacterianas, dando por resultado la acumulación de mutantes nonexpressing o en mortalidad. Todos estos factores
necesitan considerado al planear las estrategias para el control biológico del saccharina del E. en caña de azúcar.

Los efectos insecticidas sinérgicos con las suspensiones del thuringiensis del B. y las bacterias combinadas del chitinase
o el chitinase-producir, así como los efectos combinados de una proteína y de marcescens ChiA de Cry1C del S., se han
demostrado previamente. La adición del thuringiensis y del chitinase del B. aumentó el efecto insecticida sobre signifi- de
las larvas del fumiferana de Chonstoneura cantly. La perforación de la membrana peritrophic de ChiA causó un aumento
en la toxicidad de Cry1C, posiblemente debido a un aumento en los números de las moléculas de la toxina de Cry1C que
ataban a los receptores de la membrana presentes en el epitelio de las larvas de insecto. Una concentración de Cry1C de
20 mg/ml fue requerida para un efecto tóxico máximo sobre larvas en ausencia del chitinase, mientras que el magnesio
solamente 3 de Cry1C por el ml era necesario para el mismo efecto tóxico en presencia de ChiA.

Nuestros resultados demuestran que por el cointroduction de cry1Ac7 y de los genes del chitinase en tensiones de los
fluorescens del P., el biocontrol creciente de los parásitos del insecto se podría alcanzar, requiriendo niveles inferiores de
la expresión de la proteína Cry1Ac7. Esto es ventajoso, puesto que una expresión más baja puede permitir a las
bacterias competir mejor en el ambiente con un riesgo disminuido de la generación de poblaciones larvales resistentes
resultando de la exposición a los altos niveles de la proteína del grito. El grado óptimo, las concentraciones eficaces de
las tensiones recombinant, así como el efecto tóxico sinérgico de las tensiones de los seropedicae del H. produciendo la
proteína Cry1Ac7 y el chitinase, necesitan ser investigados.