1.

PCR punto final

a. Cmo se desarroll la PCR y con qu objetivo?

Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras
la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta
probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar
personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado.
Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una
tcnica muy extendida, sobre todo en el mbito de la investigacin forense, con
el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevar a cabo dicha
tcnica.
Su objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de
ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una
nica copia de ese fragmento original, o molde
En qu proceso natural se inspir?
Fue inspirada en la replicacin celular, en la que actan varias protenas
para sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona
como molde. El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reaccin
es disponer de fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla
complementarios a los extremos del fragmento a amplificar. Estos
fragmentos servirn como cebadores para que una enzima polimerasa sea
capaz de incorporar nucletidos complementarios a la cadena molde. Una
vez completada la reaccin la cantidad fragmento amplificado se puede
visualizar mediante tcnicas sencillas de separacin de fragmentos de DNA.

b. Cmo se define cul seccin de ADN debe amplificarse?

La regin que hay que amplificar est definida por dos (o ms) secuencias
de nucletidos cortos denominados sitios de los cebadores, que flanquean a
la secuencia diana. Los cebadores, oligonucletidos cortos que son
complementarios a los sitios de los cebadores, se unen a las hebras de ADN
para ser copiadas. Utilizando una polimerasa que no se desnaturalice
durante el ciclo de calentamiento, es posible copiar la secuencia diana
uniendo los nucletidos libres a los cebadores. Repitiendo el rgimen de
ciclos de calentamiento de 20 a 40 veces, la cantidad de ADN diana copiado
que se obtiene aumenta de forma exponencial, produciendo suficiente para
operaciones posteriores, tales como la deteccin, la clonacin y la
secuenciacin.
El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente
forma: partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora
nucletidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada
por la unin de los cebadores al molde.
En la PCR, el templado son las cadenas de ADN que se separan y funcionan
como molde para que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan la
secuencia blanco de inters.

c. Qu caractersticas debe cumplir la enzima polimerasa que

se usa en la PCR?

La ADN polimerasa ha de ser una polimerasa especial capaz de resistir las

elevadas temperaturas a la que vamos a someter a nuestro tubo de
reaccin. Algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de
forma ms eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales
otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad.

d. Cul es el contenido del Master Mix de una reaccin de

PCR?

Master Mix: Es un reactivo Ideal para amplificaciones altamente

reproducibles y robustas con una mnima preparacin. La formulacin
concentrada 2x lista para usar contiene ADN polimerasa Taq de
Eppendorf, nucletidos, tampn autoajustable de Mg2+ y un aditivo
para mejorar la estabilidad e incrementar la actividad de las enzimas.
El kit contiene: MasterMix 2.5x (1,2 unidades Taq/50 uL de
reaccin), solucin de 25 mM de magnesio. Ventajas: Preparacin
sencilla Ideal para la automatizacin de PCR Almacenamiento
cmodo - no precisa congelacin Tecnologa de tampn
autoajustable de Mg2+
Almacenamiento: para uso rutinario, el MasterMix puede
almacenarse entre 2 y 8 C, evitando as repetir los ciclos de
congelacin/descongelacin. El almacenamiento a largo plazo debe
realizarse a 20 C en un congelador a temperatura constante.
Con licencia y autorizacin para PC

e. Qu precauciones debe tenerse en el momento de la

preparacin de un anlisis de PCR?

Precauciones y controles Teniendo en cuenta la incertidumbre en torno a

la seguridad y fiabilidad de la PCR en el diagnstico rutinario, se deben
tomar precauciones especiales en cualquier laboratorio que utilice la tcnica
de la PCR para la deteccin de agentes infecciosos, con el fin de evitar
resultados positivos falsos o negativos falsos. Estos, junto con los controles
internos (mimticos) garantizan la evaluacin segura de los resultados,
excluyendo los resultados positivos falsos causados por la contaminacin.
Los controles internos autnticos utilizando genes locales tambin
completan el objetivo de la PCR, pero solo para los reactivos que se
encuentran en cantidades excesivas, tales como la polimerasa y los
nucletidos. Una competicin mnima implica que se conoce el nivel real de
la diana, lo que no sera el caso para las muestras de campo. Los ARN
blindados permiten la imitacin que se aade en el proceso de extraccin,
que es un paso para conocer que la extraccin ha funcionado. Un control
interno autntico proporciona ms seguridad de que la extraccin se ha
realizado de forma correcta. El punto dbil de la uti Precauciones y controles
Teniendo en cuenta la incertidumbre en torno a la seguridad y fiabilidad de
la PCR en el diagnstico rutinario, se deben tomar precauciones especiales
en cualquier laboratorio que utilice la tcnica de la PCR. para la deteccin de
agentes infecciosos, con el fin de evitar resultados positivos falsos o
negativos falsos. Estos, junto con los controles internos (mimticos)
garantizan la evaluacin segura de los resultados, excluyendo los resultados
positivos falsos causados por la contaminacin. Los controles internos
autnticos utilizando genes locales tambin completan el objetivo de la PCR,
pero solo para los reactivos que se encuentran en cantidades excesivas,
tales como la polimerasa y los nucletidos. Una competicin mnima implica
que se conoce el nivel real de la diana, lo que no sera el caso para las
muestras de campo. Los
ARN blindados permiten la imitacin que se aade en el proceso de
extraccin, que es un paso para conocer que la extraccin ha funcionado.
Un control interno autntico proporciona ms seguridad de que la extraccin
se ha realizado de forma correcta. El punto dbil de la utilizacin de genes
locales como controles internos es que dichos genes pueden estar presentes
en mayores cantidades que los patgenos diana.
b) Precauciones para evitar resultados positivos falsos:

Los resultados positivos falsos (muestras negativas que presentan una

reaccin positiva), pueden surgir bien de temas relacionados con el
laboratorio, tales como la contaminacin cruzada, o factores relacionados
con la prueba, como por ejemplo, una realizacin del ensayo o de la
optimizacin ineficaces. Los restos de productos de las muestras positivas o,
ms comnmente, de la contaminacin cruzada por los productos de la PCR
provenientes de experimentos anteriores constituyen una posible fuente de
error, y se han aplicado varias tcnicas y herramientas para evitar los
resultados positivos falsos de la PCR. Las muestras y los reactivos se deben
manejar en campanas de aire de flujo laminar, que se descontaminan
regularmente utilizando luz UV y leja (para que el uso de los rayos
ultravioleta sea eficaz, se requiere un mantenimiento muy cuidadoso). La
construccin y utilizacin de soportes de tubos y abridores especiales ayuda
a evitar resultados positivos falsos de la PCR. Adems, se deberan aplicar
prcticas de laboratorio seguras, esto es, realizar las etapas bsicas
(extraccin del ADN, preparacin y mezcla del cebador, preparacin de la
muestra, electroforesis de los productos de amplificacin con gel de
agarosa, etc.) en reas o dependencias del laboratorio separadas. Se deben
utilizar diferentes juegos de pipetas en cada una de las etapas. Se
recomienda el empleo de un desplazamiento positivo y de filtered tips.
Tambin se recomienda que diferentes personas lleven a cabo las distintas
etapas, que estn restringidas a las respectivas reas del laboratorio. Se
deben tomar precauciones para evitar la introduccin de material
amplificado procedente de laboratorios potencialmente contaminados
dentro de las reas limpias del laboratorio mediante las restricciones en
los movimientos de las muestras, los documentos, el equipo, las personas o
cualquier otra forma de contaminacin potencial. El movimiento en la
direccin contraria debera ocurrir slo despus de la descontaminacin del
equipo y los tubos y del cambio de vestimenta y guantes de laboratorio. Si
se considera que la muestra va a contener una gran cantidad de cido
nucleico del agente o diana, es preferible diluirlo antes de introducirlo en las
reas limpias del laboratorio. Localizacin de genes locales como
controles internos es que dichos genes pueden estar presentes en mayores
cantidades que los patgenos diana. b) Precauciones para evitar resultados
positivos falsos Los resultados positivos falsos (muestras negativas que
presentan una reaccin positiva), pueden surgir bien de temas relacionados
con el laboratorio, tales como la contaminacin cruzada, o factores
relacionados con la prueba, como por ejemplo, una realizacin del ensayo o
de la optimizacin ineficaces. Los restos de productos de las muestras
positivas o, ms comnmente, de la contaminacin cruzada por los
productos de la PCR provenientes de experimentos anteriores constituyen
una posible fuente de error, y se han aplicado varias tcnicas y
herramientas para evitar los resultados positivos falsos de la PCR. Las
muestras y los reactivos se deben manejar en campanas de aire de flujo
laminar, que se descontaminan regularmente utilizando luz UV y leja (para
que el uso de los rayos ultravioleta sea eficaz, se requiere un
mantenimiento muy cuidadoso). La construccin y utilizacin de soportes de
tubos y abridores especiales ayuda a evitar resultados positivos falsos de la
PCR. Adems, se deberan aplicar prcticas de laboratorio seguras, esto es,
realizar las etapas bsicas (extraccin del ADN, preparacin y mezcla del
cebador, preparacin de la muestra, electroforesis de los productos de
amplificacin con gel de agarosa, etc.) en reas o dependencias del
laboratorio separadas. Se deben utilizar diferentes juegos de pipetas en
cada una de las etapas. Se recomienda el empleo de un desplazamiento

positivo y de filtered tips. Tambin se recomienda que diferentes personas

lleven a cabo las distintas etapas, que estn restringidas a las respectivas
reas del laboratorio. Se deben tomar precauciones para evitar la
introduccin de material amplificado procedente de laboratorios
potencialmente contaminados dentro de las reas limpias del laboratorio
mediante las restricciones en los movimientos de las muestras, los
documentos, el equipo, las personas o cualquier otra forma de
contaminacin potencial. El movimiento en la direccin contraria debera
ocurrir slo despus de la descontaminacin del equipo y los tubos y del
cambio de vestimenta y guantes de laboratorio. Si se considera que la
muestra va a contener una gran cantidad de cido nucleico del agente o
diana, es preferible diluirlo antes de introducirlo en las reas limpiasdel
laboratorio.

f. Describa el proceso molecular de cada paso de la PCR punto

final.
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios
repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3
pasos a diferentes temperaturas. La PCR comn se realiza con ciclos que
tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo estn
precedidos por un choque trmico (llamado "hold") a alta temperatura (>
90 C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensin de
producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo
aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parmetros. stos
incluyen la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin de iones
divalentes y de los dNTP en la reaccin, y la temperatura de unin de los
cebadores, as como la longitud del ADN que se desea amplificar. 2
Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opcin de realizar la
reaccin de PCR con la llamada " tapa caliente". Es decir, que el sistema del
termociclador aplicar calor a la parte de arriba del vial que contiene la
mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que empezaron a usar los
primeros aparatos que se comercializaron y que no incluan este sistema
tenan que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El objetivo de este
procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la condensacin
de la muestra, ya que en el eppendorf se encuentran dos fases:lquido y
gas. Al condensarse la muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin
embargo, calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este
proceso fsico, conservando casi intacto el volumen de la muestra.
Inicio
Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C
( 98 C si se est usando una polimerasa termoestable extrema), que se
mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es necesario para ADN
polimerasas que requieran activacin por calor.
Desnaturalizacin
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las
cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos,
siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la forma ms habitual. La
temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por
ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la cadena, como tambin del
largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica de la
PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la
desnaturalizacin.
Alineamiento o unin del cebador

A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador

se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es
necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos (segn
el caso), permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables
entre las cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la
secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La
polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a
sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de
la molcula que va a ser amplificada.
Extensin o elongacin de la cadena
Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena
complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para
la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN
complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP complementarios en
direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La
temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para
la polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad est en 75-80 C
(comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende tanto del ADN
polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a
amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la
polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto.
Elongacin final
Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 515 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier
ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.
Conservacin
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido
para conservar la reaccin a corto plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L,
en pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se
emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN
generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y
dependiendo de la matriz empleada, a su tamao: tpicamente se emplean
la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; enacrilamida,
para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable a la PCR
asociada a marcaje fluorescente, laelectroforesis capilar.3 El/los tamao/s de
los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso
molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao conocido,
y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

g. Cuntas copias debiese encontrarse por cada copia

original despus de 25 ciclos? De 30 ciclos?
La amplificacin exponencial y la duplicacin del fragmento especifico en
cada ciclo. Partiendo de una molecula del fragmento, al cabo de 30 ciclos se
obtiene en teora 1 millon de molculas de ADN del fragmento amplificado
Qu frmula puede expresar este nmero?

h. Cmo se interpreta los resultados de la PCR punto final?

Visualizacin de productos de PCR: El procedimiento ms comn para el
anlisis de los fragmentos obtenidos en la PCR es la electroforesis, ya sea
en geles de agarosa o de acrilamida. La electroforesis permite separar
fragmentos de acuerdo a su tamao. Los fragmentos de ADN (cargados
negativamente) se desplazan por el gel a travs de un campo elctrico
hacia el polo positivo. Los fragmentos ms pequeos migran ms rpido y
son los que vemos ms abajo en el gel. La eleccin de la matriz (agarosa o
acrilamida) y el porcentaje en la cual separar los productos, depender del
tamao de los mismos y los largos diferentes que deseemos separar.
Generalmente, los geles de agarosa se visualizan agregando Bromuro de
etidio, un agente que se intercala en el ADN y fluoresce cuando es expuesto
a la luz UV, y en el caso de los geles de acrilamida, la tincin se realiza con
nitrato de plata, que por interacciones electrostticas se une al ADN.

i.

Qu limitaciones tiene esta tcnica?

No detecta coinfecciones, las cuales tienen una prevalencia del 40% y

debemos tomar en cuenta que el porcentaje de coinfecciones de virus
de Alto y Bajo Riesgo juntos es de un 20%, con la PCR existe la
posibilidad de que solamente se amplifique el VPH de Bajo Riesgo
enmascarando as uno de Alto Riesgo en 2 de cada 10 mujeres.
No es recomendable como mtodo de tamizaje.

No es cuantitativa de manera que no se puede establecer una carga

viral, ni siquiera de manera relativa, para conocer el nivel de la
infeccin.
Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se
conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40 pb.
Se necesitan primers especficos que sean complementarios al
fragmento que se desea sintetizar.
La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN
Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador
o de cualquier otro)

La desventaja de esta tcnica es que no nos permite cuantificar la

muestra de ADN, adems que para llevarla a cabo adecuadamente y sin
errores se requiere de una cuidadosa optimizacin del proceso.
2. PCR tiempo real
a. Qu caracterstica de esta tcnica le da el nombre de
tiempo real?
Muestra la capacidad de monitorear el progreso de la reaccin de PCR a
medida que esta ocurre. Los datos son colectados a lo largo del proceso
de PCR y no al final como se realizaba antes. Este mtodo revolucion la
forma en que se usaba la tcnica de PCR para cuantificacin de ADN y
ARN. El RT-PCR usa molculas de un reportero fluorescente para
monitorear la amplificacin de productos durante cada ciclo de reaccin.
Esta tcnica combina los pasos de amplificacin de ADN y la deteccin
en un nico ensayo y evita tener que preparar geles de electroforesis
para detectar los productos amplificados
b. Por qu se le conoce como qPCR?
Debido a que el anlisis del avance de las reacciones en cada ciclo se
puden cuantificar las muestras de ADN.
c. Cmo se define cul seccin de ADN se amplifica, y cul seccin
de ADN se detecta
Para poder definir la seccin de ADN que se ampliara se utilizan
primersy para definir la seccin de ADN a detectar se utilizan sondas
fluorescentes que son complementarias a la regin que se busca ampliar.
Las sondas pueden ser: fluoroforo reportero cuyo propsito es indicar
que existe la secuencia que se busca. Y un fluoroforoquencher cuyo
propsito es opacar al reportero cuando la secuencia que se busca no
est presente.
Ademas existen otros tipos de sondas como la tipo TaqMan, tipo Beacon,

d. Hay alguna diferencia en la enzima que se utiliza?

primers?

En los

Si, esta utiliza un reportero y un quencher. Cuando el reportero y el

apagador se encuentran prximos, el apagador absorbe toda la
fluorescencia del reportero. Cuando este par de molculas se separa, la
fluorescencia del reportero no puede ser absorbida por el apagador y en
consecuencia puede ser detectada por el fotodetector.

e. Qu es una sonda, y cmo se caracteriza las que se usan en

qPCR? Qu tipos hay?
Una sonda es un fragmento de ADN (o raramente ARN) de pequeo tamao
usado en biologa molecular como herramienta para detectar la presencia
de ADN o ARN de secuencia complementaria parecida o igual.Adems de los
primers, en este paso tambin se usa una sonda fluorescente que es
complementaria a la regin que se busca amplificar
Existen varios tipos de sonda:
. a) Sondas de hidrlisis: Son oligonucletidos marcados con un fluorforo
donador en el extremo 5 que emite fluorescencia al ser excitado y un
aceptor en el extremo 3 que absorbe la fluorescencia liberada por el
donador. Para que esto ocurra, las molculas donadora y aceptora deben
estar espacialmente prximas. Adems, el espectro de emisin de la
primera se ha de solapar con el espectro de absorcin de la segunda
b) Molecular beacons: Son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una
molcula donadora en el extremo 5 y una aceptora en el extremo 3 pero,
adems, presentan una estructura secundaria en forma de asa, en la que
reside la secuencia de unin especfica con el ADN diana. Los extremos
permanecen plegados cuando la sonda no est hibridada, lo que conlleva a
que donador y aceptor estn muy cerca uno de otro. En esta conformacin
la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es
captada por el lector del equipo.
c) Scorpions: Son molculas bifuncionales que contienen un primer
covalentemente unido a una sonda. Las molculas tambin contienen un
fluorforo que puede interactuar con un represor (quencher) para reducir la
fluorescencia. Cuando las molculas se usan en una reaccin de PCR, el
fluorforo y el represor se separan generando un incremento en la luz
emitida Las ventajas de los scorpions se basan en que la sonda est
acoplada fsicamente al primer. Esto significa que la reaccin que se lleva a
cabo para generar la seal es un cambio un molecular.
d) Sondas FRET: El sistema se compone de dos sondas que se unen a
secuencias adyacentes del ADN blanco. Una de las sondas lleva un donador
en el extremo 3 y la otra un aceptor en el extremo 5. Cuando las sondas

estn hibridadas, los dos fluorforos estn prximos. Al ser excitado, el

donador transfiere su energa al aceptor que, a su vez, emite la
fluorescencia que detecta el lector del equipo.
f. Describa el proceso molecular de cada paso de la PCR tiempo
real, comparando con los eventos que se dan en cada paso en la
PCR punto final.
1)
2)
3)
4)
5)
6)

Aislamiento y caracterizacin de ARN

Sntesis de cDNA
Adquisicin de datos de PCR tiempo real.
Generacin de factores de normalizacin
Datos normalizados.
Anlisis de datos.

g. Cmo se interpretan los resultados de la PCR tiempo real?

El parmetro Ct se ha convertido en el ms utilizado para realizar
cuantificaciones utilizando la tcnica de RT-PCR en tiempo real.
Anteriormente explicamos que el ciclo umbral (Ct) se define como el
ciclo donde la fluorescencia excede un valor umbral escogido por
encima del ruido de fondo. Aqu la palabra crtica es escogido, dado
que el ruido de fondo no es un valor absoluto y tambin se ve
influenciado por las condiciones de la reaccin. Muchas veces, los
valores de Ct no son indicativos de una amplificacin genuina, y en
otros casos, una verdadera amplificacin no provee un valor de Ct
significativo. Este ltimo caso se da cuando el nmero de ciclos que
determinan el ruido de fondo se escogen de forma incorrecta, a
partir de los cuales se establece la lnea umbral de fluorescencia.
Normalmente, estos ciclos son los primeros antes de que el producto
de PCR se acumule de forma significativa al inicio de la fase
exponencial, y suelen ser del 3 al 15 (AB Prism 7700) o del 5 al 9
(instrumentos de Stratagene), dependiendo del equipo. Muchas
veces, la lnea base de fluorescencia que se determina en el
experimento no es la apropiada para cada pozo de reaccin, donde se
muestra una comparacin de dos curvas de amplificacin que tienen
valores de Rn similares. Pero slo uno de ellos rebasa la lnea umbral
y da una respuesta positiva. Esto se debe a que la fluorescencia verde
se mantiene constante desde las primeras etapas del ensayo de PCR
y comienza a incrementarse a partir del mismo nivel de la
fluorescencia umbral, sin embargo, la fluorescencia representada por
la lnea roja sufre un descenso significativo de 0.015 unidades, por lo
que el aumento de fluorescencia en la fase exponencial de
amplificacin no rebasa la lnea umbral. Este fenmeno puede darse
por diferencias en la sensibilidad qumica de los fluorforos a los

mltiples cambios de temperatura que ocurren normalmente en toda

reaccin de PCR. Aqu no podemos decir que no ocurre
Amplificacin en el ensayo representado por el fluorforo rojo, sino
que es necesario realizar un ajuste de la lnea basal donde se incluya
el ciclo donde la lnea roja presenta la menor fluorescencia (de 3 a 32
y no de 3 a 15 como estaba previamente determinada), lo Trampas
del RT-PCR en tiempo real Rodrguez M & Rodrguez W 49 cual se
traduce en valores de Ct similares para ambos fluorforos. Una
analoga til es la comparacin entre la altura que alcanzan dos
personas al saltar: slo podemos compararlo si ambas saltan desde el
mismo nivel.
h. Qu limitaciones tiene esta tcnica?
Entre las desventajas de la deteccin no especfica se encuentra la
unin indiscriminada hacia cualquier estructura de doble cadena, lo
que produce fluorescencia en el control sin templado debido a su
unin a los dmeros de primers. Un segundo problema es que las
curvas de disociacin para analizar la calidad del producto obtenido
son absolutamente necesarias, lo cual incrementa la complejidad de
los anlisis. Un tercer problema es que muchas de estas molculas
son capaces de unirse a una sola molcula de amplicn, por lo que la
intensidad de la seal fluorescente luego de la radiacin depender
del tamao del ADN de doble cadena. Si asumimos similares
eficiencias de amplificacin, el PCR en tiempo real de un templado
ms largo generar una mayor seal fluorescente.
OTROS TIPOS DE PCR
a. Qu es RT-PCR y para que se utiliza?
RT-PCR es la reaccin en cadena de la polimerasa con
transcriptasa inversa.
Se usa para retrotranscribir una hebra de ARN en ADN
complementario usando una enzima llamada transcriptasa
inversa y el resultado se amplifica en una PCR tradicional.
b. Qu significa el trmino de PCR anidado? Qu utilidad tiene y
que precauciones deben tomarse al momento de la preparacin
de un anlisis?
PCR anidada conocida como Nsted PCR es una variante de la
PCR convencional que comprende dos rondas de amplificacin
con distintos pares de cebadores en cada una, con el fin de
incrementar la sensibilidad y la especificidad de la deteccin.

Se utiliza para deteccin de microorganismos como

RickettsiaBartonella, herpesvirus y enterovirus a partir de LCR,
y M. tuberculosis.
1. Determine el tamao del fragmento amplificado e interprete el
resultado tanto del paciente como de su esposa. Y explique su

400 bp

determinacin y su interpretacin

La PCR es una tcnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mnima

cantidad de ADN para obtener un gran nmero de copias. Se determinan los
resultados por la intensidad que la banda presente. , eso quiere decir que entre
mayor intensidad, mayor cantidad de genes que se buscan existen.

En el paciente se puede observar que la intensidad de la banda es considerable

para poder sospechar la presencia de genes de mycoplasmaHaemofelis.No as,
en el caso de la esposa, que no muestra intensidad alguna, por lo que no hay
presencia del gen, dando un resultado negativo para MycoplasmaHaemofelis

Valores Y
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0

10

15

20

25

30

35

40

PCR tiempo real

Se decidi hacer un estudio de muestras de jugos de naranja de tres
diferentes ventas ambulantes. Para ello, se realiz una PCR tiempo
real de la carga bacteriolgica de la bacteria E. coli, usando un gen
especfico para este microorganismo. Se us un control positivo con
un cultivo en laboratorio. Si la muestra nmero 1 es el control de
laboratorio y los dems son las muestras de las diferentes ventas (2,
3, y 4), en cul venta no volvera a comprar jugo y por qu?

45

RESPUESTA:
Las ventas 2, 3 y 4 son positivas por tanto no deberan de comprar
jugo en ninguna de las tres ventas. Aunque la muestra 2 es la que
ms se asemeja a la muestra control.
Existe la formacin de curvas por tanto la secuencia buscada est
presente, las curvas sobrepasan el umbral lo que significa que es positivo ya
que se interpreta bsicamente evaluando si la curva de amplificacin
resultante cruza o no cruza el umbral determinado.

Hoja de Trabajo de Ejercicios de Repaso La foto de la derecha

es de un gel real de electroforesis.

1. Cul es la apariencia de las bandas? Claramente

definidas o borrosas e indistinguibles?
Despus de la separacin, los fragmentos de ADN resultantes
son visibles como bandas claramente definidas
2. Cul de las bandas identificadas (A, B, C, etc.)
contienen los fragmentos de ADN ms pequeos?
El inciso E, ya que las molculas ms pequeas se mueven
ms rpido y migran una distancia ms larga que las molculas
ms grandes.
3. Cul de las bandas identificadas (A, B, C, etc.) contienen los
fragmentos de ADN ms grandes?
El inciso A, ya que la agarosa es usada para separar macromolculas de
tamao grande como el ADN y ARN. La concentracin del gel de agarosa
depende del tamao del ADN, y las molculas del plsmido. Entre ms
grande sea el peso molecular del ADN, ARN o plsmido se requiere menos
concentracin de gel de agarosa.
Las molculas de ADN y ARN estn cargadas negativamente y se mueve
hacia el nodo (con carga positiva) cuando un campo elctrico es aplicado.
Este movimiento depende del tamao, es decir el peso molecular de los
cidos nucledos. El factor ms importante es la longitud de la molcula de
ADN, entre ms grande sean las molculas viajaran menos distancia.

4. Qu tamao tienen los fragmentos identificados como B?

Son de un tamao aproximado de 52 kilodalton
5. Vinieron todas estas muestras de una
misma fuente de ADN? Cmo lo sabe? La
foto de la derecha es de un gel real de
electroforesis.
Si, estos es posible saberlo, ya que cuenta con un
bandaje similar en la mayora de la zona del gel.
6. Los carriles 1 y 14 son estndares. Qu
nota sobre las bandas que produce estndar?
Que tienen un desplazamiento continuo y que la
luminiscencia se va deteriorando segn el peso del
ADN
7. El estndar consiste de fragmentos de ADN
cuyo tamao es conocido. Por qu es
importante correr un estndar (o escalera molecular)?
El estndar de ADN o escalera debe ser separado a un grado que permita la
determinacin til de los tamaos de las bandas de la muestra.
El estndar de ADN contiene una mezcla de fragmentos de ADN de tamaos
predeterminados que pueden ser comparados contra las muestras de ADN
desconocidos. Es importante sealar que las diferentes formas de ADN se
mueven a travs del gel a diferentes velocidades.
8. Vinieron todas estas muestras de una misma fuente de ADN?
Cmo lo sabe?
Por la similitud de las bandas asi como los patrones que se logran observar
despus de la electroforesis
9. Vea los patrones (o huellas) de ADN. Algunas muestras vinieron
del mismo individuo? Cmo lo sabe?
Por la comparacin de las bandas, son similares
10. Indique dos situaciones en las que la huella gentica (patrones
de bandas) son tiles.

Es un mtodo usado an por varios laboratorios para la

determinacin de paternidad por ADN.
Los patrones polimrficos detectados empleando marcadores RFLP
pueden tener orgenes diversos. Por ejemplo, la ocurrencia de una o
varias mutaciones puntuales en la zona de unin del cebador puede
conducir a la no amplificacin de uno de los fragmentos

La tcnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos

particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades
genticas, en ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros
campos, ya que puede mostrar la relacin gentica entre individuos.

11. Cmo migra el ADN de un extremo del gel al otro durante una
electroforesis?
Cuando la separacin es de protenas,ADN o cidos nucleicos pequeos
(ADN, ARN oribonucletidos), el gel est compuesto por diferentes
concentraciones de acrilamida/bis-acrilamida y un iniciador de la
polimerizacin, para producir redes de poliacrilamida de diferentes tamaos.
Para separar cidos nucleicos grandes (ms de unos centenares de bases),
la matriz empleada es agarosa purificada. En ambos casos, el gel forma una
matriz slida pero porosa. La acrilamida, en contraste con la poliacrilamida,
es una neurotoxina y debe ser manipulada con precaucin.
La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza
electromotriz que es empleada para desplazar las molculas a travs del
gel. Al situar las molculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial
elctrico, las molculas se mueven a diferentes velocidades, hacia
el ctodo, si estn cargadas positivamente, y hacia el nodo, si estn
cargadas negativamente (en una electroforesis, los electrodos se comportan
igual que en una cubeta electroltica).

12. Qu es lo
electroforesis?

que

corta

los

trozos

de

ADN

antes

de

la

El ADN de la muestra es cortado en fragmentos, los que resultan ser de

tamaos diversos, precisamente porque estos tamaos dependen de la
diversidad y variabilidad gentica de la muestra. El nombre RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphisms) significa que se usa la
propiedad de ciertas enzimas llamadas de restriccin para cortar regiones
especficas del ADN que sucede que son muy variables (hipervariables) de
individuo
a
individuo
(polimorfismo).
Los fragmentos de ADN son colocados en una superficie gelatinosa (gel de
agarosa) con el propsito de someterlos a una separacin en base a su
diferente tamao.

Ejercicio No. 1

Si es muy probable que el papa de la bebe Jessica sea el

numero 2 ya que tiene ms bandas similares a las del
nio, este es de 4 bandas similares y el del padre uno
podran ser solamente 2.

Ejercicio No. 2

El criminal seria el S2 ya que las bandas son similares

de los de la escena del crimen

Ejercicio No. 3

El sospechoso que tiene ms probabilidades es el S1

ya que todas las bandas concuerdan.

Ejercicio No. 4
Los bebes gemelos corresponden a los
nmeros ( 1 y 5) ya que el numero de
bandas corresponden a la mitad del
padre del seor y de la seora jones.

Ejercicio No. 5
El hijo que probablemente sea legitimo es
hijo1 y la srta big ya que sus bandas
concuerdan con las de la seora big.