Fundamento de la Reaccin en Cadena

de la Polimerasa (PCR)
Eva Mas, Julio Poza, Jess Ciriza, Pilar Zaragoza, Rosario Osta y Clementina
Rodellar.
Laboratorio de Gentica, Bioqumica y Grupos Sanguneos.
Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza (Espaa)

La PCR es una tcnica para la sntesis "in vitro" de secuencias especficas de ADN. Es
una forma simple y muy rpida de multiplicar el ADN presente en diferentes muestras
biolgica, obtenindose millones de copias de una determinada secuencia de ADN. En
poco tiempo esta tcnica ha conseguido ser ampliamente utilizada no slo en el campo
de la gentica molecular, sino en otras muchas ciencias. Las siglas PCR significan
"Polimerase Chain Reaction", Reaccin en Cadena de la Polimerasa.
El inventor de esta interesante tcnica fue Kary Mullis por la cual se le adjudic el
Premio Nobel de Qumica en 1993. Utiliz la PCR para la amplificacin del gen de
la -globina humana (Mullis y cols., 1986; Mullis y Faloona., 1987) y el diagnstico
prenatal de la anemia falciforme (Saiki y cols., 1985; Saiki y cols., 1986; Embury y
cols., 1987), desde entonces la PCR ha revolucionado todos los campos que estudian y
manipula los cidos nucleicos.
Mullis se bas en la replicacin del ADN en los organismos eucariotas realizada por la
DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la sntesis de una cadena complementaria de
DNA en el sentido 5-> 3 usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una
regin de doble cadena. Para crear esta regin doble cadena se usan los denominados
cebadores (primers). Son una pareja de oligonucletidos sintetizados de manera que
sean complementarios a cada uno de los extremos 3 del fragmento de DNA que se
desea amplificar.
Partiendo de este principio, la reaccin en Cadena de la Polimerasa se basa en la
repeticin de un ciclo formado por tres etapas:
1 Desnaturalizacin del ADN doble cadena
2 Hibridacin de los cebadores a la zona 3especfica de cada una de las hebras
3 Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasa
En la primera etapa (desnaturalizacin) la doble hlice de ADN se separa en dos hebras.
Para ello se realiza una incubacin de la muestra a altas temperaturas (93-97C). La
renaturalizacin se producir cuando la temperatura disminuya.
En el segundo paso (hibridacin) los cebadores se unen a las zonas 3 complementarias
que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la
temperatura (50-65C).

En la tercera etapa (elongacin) se produce la sntesis de una cadena sencilla

(producindose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la
direccin 5-> 3 mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los
deoxinucletidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Todos estos
pasos se pueden apreciar grficamente en la Figura 1.

Figura 1: Pasos bsicos de la PCR (de Andy Vierstracte 1999)

El proceso se lleva a cabo en un termociclador (fig.2). Un aparato que realiza los ciclos
en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta.

Figura 2: Termociclador de ADN

Como se muestra en las figuras 3a y 3b, observamos que una vez completado el primer
ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo ciclo tenemos
4, al final del tercero 8...Si los ciclos se producen un nmero "n" de veces y suponiendo
que el nmero de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una cantidad de
ADN de 2n, por lo que la amplificacin se realiza en forma de progresin geomtrica.

Figura 3a: Amplificacin exponencial del PCR (de Andy Vierstracte 2001)

Figura 3b: Amplificacin exponencial del PCR (de M.E. Gilles-Gonzlez 1997)
Es importante recalcar que los productos obtenidos tras la tercera etapa son de dos tipos:
"producto corto" y "producto largo". El producto corto tiene una longitud perfectamente
definida por los extremos 5de los cebadores y contiene exactamente la secuencia que se
desea amplificar. Es el fragmento que se almacena de manera exponencial durante la
reaccin. El producto largo es el que incorpora las cadenas de ADN originales de la
muestra y cuyos extremos 3no estn definidos. Sin embargo, es importante aclarar que
al final de la PCR, la cantidad de producto corto sintetizado es muy superior en
comparacin con el producto largo, por lo que generalmente para posteriores estudios a
partir del producto de la PCR, se desestima. (Fig.4)

Figura 4: Detalle de los cuatro primeros pasos de la PCR (de Andy Vierstracte 2001)
La deteccin del producto de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa se realiza
normalmente mediante corrido electrofortico (fig.5). Dependiendo del tamao de la
amplificacin y de la resolucin que deseemos usaremos diferentes geles (agarosa,
poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualizacin se puede realizar
con bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de plata, fluorescencia,
radiactividad (radiografa).

Figura 5: Preparacin del corrido electroforetico

En la actualidad se desarrollan mtodos para poder cuantificar el producto de la PCR,
visualizando in situ sobre tejidos (Cao, Y. y cols, 2000). Lo que hace prever un
crecimiento, si cabe mayor, del uso de la tcnica de la PCR.
A continuacin trataremos de profundizar en los componentes y parmetros ms
importantes para obtener una amplificacin ptima.
Componentes y optimizacin de la reaccin de amplificacin:
Muestra de ADN

Existen una serie de reglas sencillas para que el DNA molde no sea un problema en la
reaccin:
Integridad del ADN: no puede estar fragmentado en trozos ms pequeos de lo que
queremos amplificar.
Origen de la muestra y proceso de extraccin: la muestra no debe llevar agentes
quelantes (EDTA) que reducen la concentracin de iones de Mg. en la disolucin.
Tampoco debe haber determinados factores sanguneos, fenol, detergentes... que
inhibiran la actividad de la polimerasa.
Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la amplificacin de
ADN genmico de copia nica se usan cantidades de 100-500 ng. En el caso de zonas
repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng. El mnimo oscila entre 10-100 ng. y
el mximo entre 400-500 ng.
Diseo de los cebadores
Para la eleccin de los primers, existen una serie de normas que nos pueden ayudar,
aunque hay que indicar tambin que existen programas de ordenador que nos facilitan
esta tarea (DNAsis, Primer3, etc.).
El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. La relacin mxima de
purinas/pirimidinas ser 60%/40%.
Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base.
No seleccionar cebadores que en su extremo 3 tenga una importante estructura
secundaria.
Se recomienda que los extremos las ltimas bases sean G o C.
Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de primers. Si sta existe entre los
extremos 3, se aumenta la posibilidad de que se creen dmeros de cebadores.
Normalmente deben tener un tamao de 18-30 pb.
La T de hibridacin de los cebadores ha de ser similar en ambos y ser variable en
funcin de la secuencia de los mismos. Generalmente oscila entre 45 y 65C.
Si el primer es menor a 20 pb, la temperatura de fusin (Tm), se calcula en base a la
siguiente frmula:
Tm= 4 (G+C) + 2(A+T)
Siendo G, C, T y A el nmero de cada una de las bases que forman cada uno de los
oligos. La temperatura de hibridacin debe ser aproximadamente 5C menor que la
temperatura calculada.

DNA Polimerasa
Existen diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo la replicacin del ADN,
siguiendo el mismo mtodo de sntesis. Se pueden clasificar en:
Termolbiles: T ptima de 37-42C. Se desnaturalizan con el calor.

TIPO

DNA
polimerasa I
(E. coli)

Fragmento
Klenow
de DNA
polimerasa I
(E. coli)

T4 DNA
polimerasa
(E. coli)

DNA polimerasa
dependiente de
RNA
(retrovirus)

5-> 3
polimerasa

S (baja)

S (baja)

S (medio)

5-> 3
S
exonucleasa

No

No

Exorribonucleasa

3-> 5
S (baja)
exonucleasa

S (baja)

S (alta)

exorribonucleasa

Termoestables: T ptima de 74 C. Resiste durante 40-50a 96C.

Tipo

Taq DNA
Taq DNA
Replicasa Tth polimerasa
polimeras (94 Kda) polimeras (61 Kda)

5-> 3
polimerasa

5-> 3
S
exonucleasa

No

3-> 5
No
exonucleasa

No

No

Tipos

Taq

Pwo

Pfu

Pfx

Fidelidad

1x

12x

30x

48x

Amplificacin Mxima

1 Kb

4 Kb

5 Kb

12 Kb

U/Reaccin

2.5

2.5

1.25-5

1.25-5

Inicialmente se us el fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E. coli (Saiki y

cols., 1985) la cual posee actividad 3-> 5 exonuclesica que le proporciona la
capacidad de cambiar el nucletido que ha sido errneamente incorporado. La
importancia de esta actividad radica en que aumenta la fidelidad de la replicacin del

ADN original. Sin embargo, se trata de una enzima termolbil por lo que no soporta los
ciclos y temperaturas utilizados en una PCR.
Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq polimerasa (Estivil, 1991). Es una
enzima termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que soporta altas
temperaturas. La Taq polimerasa ha simplificado enormemente la tcnica de la PCR, ya
que ha permitido su automatizacin (desarrollo del termociclador).
Como se observa en las Tablas anteriormente descritas, las polimerasas termoestables,
como la Taq polimerasa, carecen de actividad 3-> 5 exonuclesica, lo que las hace
menos seguras a la hora de comparar las fidelidades. Por ello hay que intentar conseguir
las mejores condiciones para que sta aumente. Podemos citar:
No usar un alto nmero de ciclos, ya que la tasa de error es proporcional al nmero de
estos. Normalmente el nmero de ciclos utilizado es de 25-30.
La concentracin de los deoxinucletidos (dNTPs) debe ser igual para los 4 y debe ser
la ms baja posible para que nos permita conseguir la cantidad de ADN necesaria.
Disminuir en lo posible el tiempo de cada etapa.
La concentracin de Mg++ en la reaccin oscila entre 0,50 y 2,5 M. Se trata de un in
necesario, pero su exceso hace que disminuya la especificidad de la PCR.
Deoxinucletidos trifosfato (dNTPs)
Son cuatro: dATP, dGTP, dCTP y dTTP. Como hemos sealado anteriormente se deben
aadir en la solucin de la reaccin en concentraciones iguales que normalmente oscila
entre los 20 y los 200 mbol">M. Los dNTPs pueden captar Mg++, por lo que las
concentraciones de ambos componentes deben guardar siempre la misma relacin. No
debemos variar ninguno de ellos de manera independiente. Se aconseja (Bradley, 1991)
que la concentracin de Mg++ sea 0,5-1 mM veces superior a la concentracin de
dNTPs.
Tampn de la reaccin
Por lo general est formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 a T ambiente), 50 mM ClK,
0.1% w/v gelatina y 1.5 mM MgCl2.
Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales ayudaran en la prctica a
aumentar la especificidad y fidelidad de la reaccin en cadena de la polimerasa. El
dimetilsulfxido (DMSO) aadido al buffer de la reaccin en un 10% contribuye a la
disminucin de la estructura secundaria del ADN (Anderson, 1990). Tambin se pueden
usar detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritn x10, que ayudan a
estabilizar la enzima. Existen tambin protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG),

glicerol, formamida, seroalbmina bovina (BSA), etc, aunque no son en ningn caso
imprescindibles.
Sales
Es de gran importancia la concentracin de dos cationes que son aadidos en forma de
sales.
Cloruro potsico (KCl). Influye en la desnaturalizacin del ADN.
Elevadas concentraciones del in K+ favorece la desnaturalizacin de secuencias cortas
de ADN.
Bajas concentraciones de K+ ayudan a la desnaturalizacin de secuencias largas de
ADN.

Cloruro de magnesio (MgCl2). Aumenta la temperatura de hibridacin del DNA. La

concentracin de este ion resulta fundamental para la optimizacin de la reaccin.
Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de la PCR.
Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reaccin.

Temperaturas y tiempos de los ciclos

Como hemos explicado anteriormente la Reaccin en Cadena de la Polimerasa se
realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un nmero
determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el nmero de ciclos son factores
determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificndolos podemos
optimizar la reaccin.
Las primeras reacciones se realizaban manualmente cambiando continuamente los tubos
de un bao Mara a otro de diferente temperatura (la T de desnaturalizacin, la de
hibridacin y la de elongacin). El proceso resultaba demasiado tedioso y era difcil
alcanzar las temperaturas y los tiempos correctos, por lo que se desarroll el
termociclador que lo haca de manera automtica.
A continuacin describiremos de forma ms detallada el tiempo y la temperatura de
cada una de las etapas de un ciclo.
Desnaturalizacin
Se trata de una etapa crtica ya que es muy importante que el ADN molde se
desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan

temperaturas de 94C durante 30-1. Si la muestra tiene alto contenido de G+C se

puede aumentar el tiempo o la temperatura.
Sin embargo hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de manera
muy rpida a partir de los 95C, por lo que a estas temperaturas o superiores es
aconsejable disminuir el tiempo de incubacin.
En la prctica se suele aadir un perodo de desnaturalizacin antes de comenzar los
ciclos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de ADN. Esta etapa
suele ser de 5a 94C.
Hibridacin
En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores relacionados con
los oligonucletidos: la composicin de bases, el tamao y la concentracin.
En la prctica, la temperatura de hibridacin puede oscilar entre 45C y 65C, durante
un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto. Un aumento de temperatura o
del tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones incorrectas de los
cebadores con la hebra molde.
Elongacin
En la mayora de las reacciones, la etapa de extensin se realiza a 72C. Tericamente
esta temperatura puede variar entre 70-72C. El tiempo de extensin depende del
tamao de la amplificacin. Se puede estimar un tiempo de 1min. para elongar 1 Kb.
En la prctica es normal que al final de todos los ciclos se realice una ltima elongacin
de 5a 72C.
Nmero de ciclos
Tambin adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR el nmero de ciclos
que se utilizan. Este nmero depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra
una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de manera
emprica).
Es importante no realizar un nmero alto de ciclos ya que puede dar lugar a la
amplificacin de productos no deseados originados por hibridaciones no especficas.
Hay que tener en cuenta que la reaccin est producida por una enzima que sufre el
efecto meseta que describe la atenuacin en la tasa de la acumulacin del producto.
Despus de un nmero determinado de ciclos la amplificacin deja producirse de
manera exponencial y llega a una fase estacionaria. Generalmente cuando el efecto
meseta se produce, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior
utilizacin.
Contaminacin en la PCR
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa es una tcnica muy sensible, por lo que es de
gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado

(aunque se encuentre en una cantidad muy pequea) se amplifique y obtengamos un

resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la tcnica, se
convierte a la vez en el principal inconveniente (Kwok y Higuchi, 1989).
Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso de
trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al mximo:
Lugar fsico exclusivo para realizar la PCR
Uso de instrumental exclusivo para la PCR
Utilizacin de reactivos y tubos estriles
Uso de guantes por el manipulador
Realizacin de controles de blanco (se aade agua en lugar de ADN, no debe existir
amplificacin).
Bibliografa
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