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Parte fundamental:
1. Microbiologa Industrial y Biotecnologa. Conceptos y desarrollo histrico.
2. Microorganismos de inters industrial : aislamiento, seleccin y mantenimiento.
3. Produccin de metabolitos primarios y secundarios : regulacin gentica en
microorganismos de inters en la industria.
4. Mejora y desarrollo de cepas en Microbiologa Industrial.
5. Medios de cultivo utilizados en los procesos de fermentacin. Preparacin y
propagacin de inculos. Fermentacin a escalas de laboratorio y piloto.
6. Instalaciones y tcnicas empleadas en las fermentaciones a escala industrial.
Biorreactores. Deteccin y ensayo de los productos de fermentacin.
Recuperacin de los productos finales.
7. Procesos continuos. Cultivo continuo.
8. Cultivos con clulas inmovilazadas. Procesos con enzimas inmovilizadas.
9. Depuracin de aguas residuales.
Parte
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29. Otros alimentos fermentados.
30. Produccin de vinagre.
31. Conservacin y control microbiolgico de los alimentos.
32. Produccin de biomasa microbiana. Protenas de origen microbiano.
33. Levaduras de panadera y levaduras pienso.
34. Fertilizantes microbianos.
35. Bioinsecticidas.
36. Otras producciones de inters industrial. Vacunas bacterianas y virales.
Interferones.
PRCTICAS:
I.- Visitas de alumnos en prcticas a industrias relacionadas con Microbiologa
Industrial:
Planta potabilizadora de agua.
Planta depuradora de aguas residuales.
Industrial vitivincola y cervecera.
II.- Prcticas de laboratorio:
Screening para deteccin y aislamiento de microorganismos productores de
antibiticos.
Determinacin del espectro antibacteriano de un antibitico.
Screening para deteccin y aislamiento de microorganismos productores de enzimas.
Anlisis microbiolgicos de aguas
Colimetra
Estreptometra
Caracterizacin de microorganismos de inters industrial: bacterias, levaduras y
hongos.
Obtencin, aislamiento y caracterizacin de mutantes auxtrofos de levadura.
III.- Seminarios:
Tcnicas de Screening para la bsqueda de microorganismos y/o productos de inters
industrial.
Esterilizacin y pasteurizacin. Cintica de muerte por calor.
Microbiologa alimentaria.
BIBLIOGRAFIA
BIOTECNOLOGIA. A texbook of Industrail Microbiology. Second Edition. 1989. W.
Crueger and A. Crueger. Sinatter Associated, Inc.
BIOTECNOLOGA: Crueger y A. Crueger. Ed. Acribia. S.A.
BIOTECNOLOGIA. MANUAL DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL. 1.993. W.
BIOTECHNOLOGY. Second Edition. 1.988. Jobn E. Smith. Eduard Arnold.
MICROBIAL TECHNOLOGY Microbial Processes. Second Edition. 1.979. Vol. 1.
And.11. H.J. Peppler and D. Perlman. Acadernic Press.
PRESCOTT AND DUNN'S INDUSTRIAL MICROBIOLOGY Fourth Edition.
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1.982. Gerald Reed. MacMillan Publishers Ltd
MICROBIAL
BIOTECNOLOGY.
FUNDAMENTALS
OF
APPLIED
SISTEMA DE EVALUACIN:
Teora: Los alumnos sern evaluados mediante exmenes escritos: 1 2 parciales no
obligatorios y un final obligatorio para aquella parte de la asignatura que no baya sido
eliminadapor parciales.
Prcticas: Las Prcticas son obligatorias. Para aprobarlas es necesaria la asistencia y
superar las pruebas correspondientes. Para aprobar la teora es imprescindible haber
aprobado previamente las prcticas. La calificacin definitiva tendr en cuenta tanto la
nota obtenida en prcticas como la obtenida en teora. Podr, en algunos casos,
mejorarse la calificacin final mediante la realizacin de revisiones bibliogrficas, que
podrn ser expuestas en forma de seminarios.
OBJETIVOS:
Conocimientos bsicos fundamentales de:
1. Tcnicas de escreening y aislamiento
2. Regulacin del metabolismo primario y secundario de los microorganismos de
inters industrial
3. Desarrollo y mejora de las cepas
4. Tecnologa de procesos industriales llevados a cabo con microorganismos
Estudio de diversos procesos de produccin que abarcan: metabolitos primarios y
secundarios, enzimas, biomasa microbiana, alimentos y bebidas. En cada caso se
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pretende que el alumno conozca:
1. Los microorganismos adecuados y su mejora.
2. Desarrollo del proceso y recuperacin del producto final.
TEMA 1: INTRODUCCION
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez
I. CONCEPTOS
Microbiologa es una Ciencia experimental que se ocupa del estudio de los
microorganismos y de sus interacciones con otros organismos y con el medio
ambiente.
Microbiologa Industrial estudia todos aquellos aspectos de los
microorganismos que tienen una aplicacin industrial, tanto en la
transformacin de productos empleados en la alimentacin como en la
produccin de sustancias tales como antibiticos, vitaminas, enzimas, as
como en la obtencin de masa microbiana (protena unicelular, vacunas,
fertilizantes microbianos, biopesticidas).
Fruto del conocimiento de las capacidades que poseen los microorganismos ha
sido, y sigue siendo, su inmediato aprovechamiento para estos fines y, as, a
los mtodos tradicionales de produccin de sustancias por fermentacin se han
unido recientemente las tcnicas de manipulacin gentica de los mismos que
han permitido obtener, de forma masiva, nuevos productos de inters prctico
que los microorganismos normalmente no sintetizan tales como insulina,
2.- Cientfico
Los progresos realizados en investigacin bioqumica bsica a partir del
descubrimiento de los enzimas por Buchner en 1897 fu considerable, pero no
comenzaron a aplicarse en la fermentacin industrial hasta la primera guerra
mundial (1914).
En el lado alemn, la obtencin de glicerol para la fabricacin de explosivos
se convirti en una necesidad urgente. El bloqueo martimo britnico cort la
importacin de aceites vegetales, la materia prima tradicional en la produccin
de glicerol. Pero algunos aos antes, el bioqumico alemn Carl Neuberg
haba vuelto a considerar cierta observacin de Pasteur: en la fermentacin
alcohlica se solan originar pequeas cantidades de glicerol (fermentacin
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IV. FUTURO
Las perspectivas futuras pueden llevar a los siguientes beneficios:
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TEMA 2:
MICROORGANISMOS DE INTERES
INDUSTRIAL
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para definir organismos con clulas nucleadas que van desde los protozoos,
algas y hongos hasta los animales y plantas; y procariota para agrupar clulas
sin membrana nuclear, como es el caso de las bacterias. La dicotoma
eucariota-procariota fu utilizada por los taxnomos como una caracterstica
filogentica de primera magnitud.
Aparecieron de esta forma los esquemas de cinco reinos en los que los
microorganismos procariotas constituyeron un grupo taxonmico
filogenticamente independiente. El ms aceptado de todos ellos fu el de
Whittaker, que en 1969 propuso un sistema de clasificacin de los seres vivos
basado en los dos niveles de organizacin celular y las tres formas principales
de nutricin (fotosntesis, absorcin e ingestin) que dieron lugar a los Reinos
Monera (procariotas), Protista (eucariotas unicelulares), Plantae (eucariotas
fotosintticos), Animalia (eucariotas fagotrofos) y Fungi (eucariotas
osmotrofos). En el esquema de Whittaker los microorganismos quedaron
includos en los Reinos Monera (bacterias), Protista (protozoos y microalgas)
y Fungi (hongos filamentosos y levaduras). Hasta este momento se utilizaron
caractersticas morfolgicas y fisiolgicas hasta que el desarrollo de la
biologa molecular permiti utilizar los constituyentes moleculares como
nuevos criterios clasificatorios.
As, en 1987, Woese utilizando el 16S rRNA como reloj molecular comprob
que, a travs de la secuenciacin de esta molcula, los procariotas quedaban
divididos en dos grupos. El primero de ellos incluye las bacterias ms
comunes, aisladas en su mayora del cuerpo, suelo y agua denominndose
eubacterias. El segundo grupo incluye las bacterias que producen metano
(metangenas), ciertas bacterias del azufre que pueden crecer en ambientes
muy cidos y calientes (termfilas extremas) y bacterias que viven en
ambientes salinos (halobacterias). Estas bacterias se denominaron
arqueobacterias.
En 1990 Carl Woese propuso un nuevo taxon superior a Reino que denomin
Dominio (Dominio ----> Reino ----> Divisin ----> Clase ----> Orden ---->
Familia ----> Gnero ----> Especie). Todos los seres vivos se agruparan en 3
dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya. De los cuales, dos son
exclusivamente microbianos y estn compuestos nicamente por clulas
procariotas pertenecientes al Reino Monera (Bacteria y Archaea) y el tercero
(Eukarya), formado por eucariotas, incluira entre otros los Reinos Protista,
Plantae, Animalia y Fungi.
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1.- Levaduras
Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de aos para la
fabricacin de pan y bebidas alcohlicas. La levadura que sin duda fu la
primera y an hoy en da sigue siendo la ms utilizada por el hombre es
Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la
fabricacin de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales.
Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se
explota en pequea escala para la produccin de alcohol a partir del suero de
la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de cido ctrico.
Trichosporum cutaneum desempea un importante papel en los sistemas de
digestin aerbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de
oxidacin de compuestos orgnicos, includos algunos que son txicos para
otras levaduras y hongos, como los derivados fenlicos.
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3.- Bacterias
Entre las especies bacterianas de inters industrial estn las bacterias del cido
actico, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en cido
actico. El gnero Bacillus es productor de antibiticos (gramicidina,
bacitracina, polimixina), proteasas e insecticidas. Del gnero Clostridium cabe
destacar Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azcares
originando acetona y butanol. Las bacterias del cido lctico incluyen, entre
otras, las especies de los gneros Streptococcus y Lactobacillus que producen
yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente industrial de
lisina. El olor caracterstico a tierra mojada se debe a compuestos voltiles
(geosmina) producidos por Streptomyces aunque su principal importancia
radica en la produccin de antibiticos como anfotericina B, kanamicina,
neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc.
TEMA 3:
AISLAMIENTO Y SELECCION DE
MICROORGANISMOS INDUSTRIALES
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez
I. OBJETIVOS
Los microorganismos presentan una gran variedad metablica por lo que en
distintos aislados microbianos podemos encontrarnos una amplia variedad de
compuestos. Una de las tareas de la Microbiologa Industrial es desarrollar
procedimientos que permitan el aislamiento y seleccin de microorganismos
de inters industrial. A fin de tener xito, los mtodos de seleccin deben
constituir una actividad interdisciplinaria que combine actividades de
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TEMA 4: MANTENIMIENTO Y
CONSERVACION DE
MICROORGANISMOS INDUSTRIALES
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez
I. OBJETIVOS
En cualquier laboratorio de microbiologa es fundamental el mantenimiento y
conservacin de las colecciones de microorganismos con las que trabajamos
ya que, obviamente, son nuestro reactivo primordial. Existen una gran
variedad de mtodos de mantenimiento y conservacin de los
microorganismos cuya utilizacin va a depender en parte del tiempo previsto
(Mantenimiento ---->Cortos perodos de tiempo, das; Conservacin ---->
Largos perodos de tiempo, aos) y en parte de las caractersticas de los
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2.- Desecacin
La eliminacin del agua (deshidratacin) es un mtodo de conservacin que
reduce drsticamente el metabolismo. Sin embargo, no todos los
microorganismos sobreviven a estos mtodos de secado, por lo que se hace
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3.- Congelacin
Al bajar la temperatura hasta el punto de congelacin o por debajo de ste se
reduce el metabolismo drsticamente hasta el caso de prcticamente anularlo
con nitrgeno lquido (-196C).
Sin embargo, existen una serie de problemas que debemos tener en cuenta. La
formacin de cristales de hielo pueden romper las clulas, adems al eliminar
el agua lquida por convertirse en hielo existe una concentracin de sales que
puede ser perjudicial. Para evitar estos problemas se deben utilizar
suspensiones que contengan el mnimo de sales posibles as como utilizar
agentes protectores como el glicerol (25%) o dimetilsulfxido (DMSO c.a.
10%) que neutralizan el efecto de las sales. El realizar el proceso de
congelacin de una forma rpida o gradualmente no est claro. Algunos
recomiendan una bajada gradual (1C/min) hasta -20C para posteriormente
enfriar rpidamente. Sin embargo, la descongelacin debe ser rpida.
Las distintas temperaturas que se utilizan para la conservacin de los
microorganismos por congelacin son:
-30C: congelador de frigorfico. No se recomienda debido a la formacin de
eutcticos (suspensin con distintos puntos de congelacin debido a los
solutos que pueden daar a las clulas).
-70C: nieve carbnica (CO2 slido) o ultracongeladores. Es el mtodo ms
utilizado en los laboratorios de microbiologa.
-196C: nitrgeno lquido. Se utiliza para la conservacin de bacterias, virus y
lneas celulares. Existen varios problemas prcticos: el nitrgeno se evapora
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4.- Liofilizacin
Es el mtodo ms utilizado por las colecciones internacionales de cultivos tipo
para la conservacin de los microorganismos. Bsicamente consiste en
congelar rpidamente una suspensin de microorganismos y eliminar el agua
como vapor de agua directamente del hielo sin pasar por el estado intermedio
lquido. Por lo tanto, combina las dos tcnicas anteriormente citadas ya que es
una desecacin por sublimacin. El sistema requiere tres componentes:
mecanismo de congelacin, bomba de vaco y una trampa de agua.
Los lifilos se conservan entre 0 y 5C durante muchos aos. Para su
recuperacin se resuspende el lifilo en el medio de cultivo adecuado y se
incuban a la temperatura adecuada. No obstante, hay que estudiar, como en los
casos anteriores (desecacin y congelacin), las condiciones ptimas de
supervivencia de nuestro microorganismo.
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2.- Bacterias
Prcticamente se han usado todos los mtodos conocidos con buenos y malos
resultados, aunque en lneas generales el mejor mtodo es la liofilizacin
debido a su facilidad de transporte.
3.- Virus
Se han utilizado todos los mtodos obteniendo en lneas generales baja
supervivencia. Se recomienda para su conservacin durante largos perodos de
tiempo el nitrgeno lquido.
4.- Hongos
La mayora de los hongos pueden conservarse por desecacin en suelo.
Aunque, al igual que las bacterias, presentan una gran diversidad
encontrndonos de todo.
I. OBJETIVOS
El crecimiento de los microorganismos, su multiplicacin, implica que
necesitan duplicar su material celular. Las clulas utilizan elementos qumicos
que provienen del medio ambiente para transformarlos en los constituyentes
caractersticos que componen dicha clula. Estos compuestos qumicos se
llaman nutrientes y el proceso por el cual una clula transforma estos
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TEMA 6: MECANISMOS
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REGULADORES Y FERMENTACIONES
INDUSTRIALES
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez
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II. INDUCCION
Entre la enorme cantidad de enzimas que un microorganismo es capaz de
producir existen algunos que siempre estn presentes. Son los llamados
enzimas constitutivos. Pero tambin existen otros que o bien no estn
presentes o bien lo estn en cantidades mnimas y que ante la presencia de una
sustancia, que suele ser su sustrato, la clula aumenta enormemente su
cantidad. estos son los denominados enzimas inducibles y la sustancia que
incrementa la sntesis de novo de estos enzimas se llama inductor. Muchos
enzimas catablicos, donde se encuentran la mayor parte de los industriales,
son inducibles. A esta forma de regulacin de la expresin de genes, slo
cuando el apropiado sustrato del enzima est presente, se llama induccin.
El mecanismo a travs del cual las protenas represoras de la expresin gnica
controlan la transcripcin gnica en los procariotas comienza cuando la
protena represora y el enzima RNA polimerasa se unen fuertemente a
diferentes secuencias especficas de nucletidos del DNA, que reciben el
nombre de regin operadora y regin promotora. Si est presente la protena
represora, la RNA polimerasa no puede actuar, no producindose la
transcripcin. Si no est presente la protena represora, la RNA polimerasa se
une, producindose la transcripcin. Esta protena represora reconoce un
ligando especfico y esta unin activa la transcripcin al disminuir la afinidad
de la protena represora por su secuencia de DNA especfica. Este caso de
regulacin en el que el gen en condiciones normales est reprimido se llama
induccin negativa.
Una alternativa de la regulacin negativa, es la regulacin por medio de
protenas activadoras de la expresin gnica. En este caso la protena facilita
la unin de la RNA polimerasa. Al igual que las protenas represoras, stas
protenas activadoras se unen a ligandos especficos (inductor) pero en este
caso se incrementa la afinidad de la protena activadora por el DNA con lo que
se activa la transcripcin. Si la protena activadora se halla presente, la RNA
polimerasa se une y tiene lugar la transcripcin. Si por el contrario la protena
activadora no se halla presente, la RNA polimerasa no puede unirse no
teniendo lugar la transcripcin. Este tipo de control gnico recibe el nombre
de induccin positiva.
A modo de ejemplo veamos que ocurre en Escherichia coli en la sntesis de
los enzimas que hidrolizan la lactosa en glucosa y galactosa. Cuando la
protena represora est unida a la secuencia del operador, bloquea el acceso de
la RNA polimerasa a su regin de unin (promotor) impidiendo la
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quinasas, cada una de las cuales est regulada por un producto final diferente
y, adems, cada producto final regula el primer enzima despus de cada
ramificacin.
Sin embargo, en los microorganismos utilizados en la fermentacin para la
produccin de lisina (Corynebacterium glutamicum) existe una nica
aspartato quinasa regulada por un mecanismo concertado de retroalimentacin
por la treonina y lisina. As mismo, tampoco poseen regulacin en la
ramificacin.
Mediante la eliminacin gentica del enzima homoserina deshidrogenasa, se
obtiene un mutante que no puede crecer salvo que se aada en el medio
metionina y treonina. Mientras que los niveles de treonina que se aadan sean
bajos, pero suficientes para el crecimiento del microorganismo, no se
producir una inhibicin por retroalimentacin de la aspartato quinasa, con lo
que estos microorganismos son capaces de producir 50 gramos de L-lisina por
litro.
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puede haber ocurrido una alteracin en el sistema de sntesis del enzima, con
lo que obtenemos mutantes resistentes a la represin por retroalimentacin. En
cualquier caso y debido a la alteracin de estos controles, el microorganismo
superproduce D.
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(i) No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce.
En estado natural, sus funciones se hallan ordenadas a la supervivencia de la
especie, pero cuando los microorganismos que los producen se desarrollan en
cultivo puro los metabolitos secundarios no desempean esa misin.
(ii) Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados
qumicamente entre s. Por ejemplo, una nica cepa de una especie del gnero
Streptomyces produce 32 antraciclinas diferentes.
(iii) Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de
organismos.
(iv) La produccin puede perderse fcilmente por mutacin espontnea
(degeneracin de la raza), por lo que son muy importantes las tcnicas de
conservacin de estos microorganismos.
De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentacin, los ms
importantes para la salud humana son los metabolitos secundarios. Donde se
incluyen, adems de los antibiticos, ciertas toxinas (micotoxinas), alcaloides
(cido lisrgico), factores de crecimiento vegetal (giberelinas) y pigmentos.
Los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibiticos, de los que
se han descubierto ms de 5000, cifra que aumenta a razn de una media
aproximada de 300 por ao, aunque la mayora carecen de utilidad pues son
txicos para los organismos vivos. Aproximadamente el 75% de los
antibiticos conocidos son producidos por actinomicetos. Algunas especies
son excepcionales productores de antibiticos, por ejemplo Streptomyces
gryseus produce al menos 40 antibiticos diferentes.
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Programa
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LICENCIATURA EN BIOQUIMICA
UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
I.- Introducci
01.- Concepto, desarrollo histrico y futuro de la Microbiologa Industrial.
(PRESENTACIN)
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Recombinacin gentica.
Tecnologa del ADN recombinante "in vitro".
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VIII.- Combustibles
24.- Produccin de bioetanol.
Bibliografa
AG BIOTECHNOLOG
BOURGEOIS, C.M. y LARPENT, J.P. Microbiologa Alimentaria. Vol. 2:
Fermentaciones alimentarias. Acribia. Zaragoza. 1995.
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suspensin sea lo ms homognea posible y se vierte sobre una placa Petri estril y
vaca. Esperar a que el agar est solidificado y fro.
2.2.- Sobre la superficie de estas placas se siembran, con ayuda de palillos estriles,
estras a partir de las colonias aisladas y separadas en la prctica 1. Sembrar 2 placas por
pareja y 8 estras por placa procurando, si es posible, que cada estra corresponda a
colonias de morfologa distinta.
2.3.- Incubar las placas a 37C durante 48 h. (para permitir el crecimiento de los
microorganismos aislados a partir del suelo y la produccin de antibiticos as como
permitir el crecimiento de Bacillus subtilis y as poder observar halos de inhibicin en
aquellos microorganismos aislados del suelo que producen antibitico).
2.4.- Observar halos de inhibicin sobre Bacillus subtilis de las colonias aisladas a partir
de suelo productoras de antibitico.
4.1.- Sembrar una estra del microorganismo productor de antibitico, con ayuda de un
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asa de siembra, a lo largo de una placa Petri con Agar nutritivo e incubar a 37C durante
48 h. (para permitir el crecimiento del microorganismo as como la produccin y
difusin del antibitico).
4.2.- Sobre la placa utilizada para determinar el espectro de actividad del antibitico y
donde se sembr una estra del microorganismo productor de antibitico se siembran,
con ayuda del asa de siembra, cuatro estras perpendiculares a sta de los siguientes
microorganismos:
Microccus luteus (Coco G+); Escherichia coli (Cocobacilo G-); Bacillus subtilis (Bacilo
G+); Saccharomyces cerevisiae (Levadura).
4.3.- Incubar las placas Petri a 37C durante 24h.
4.4.- Observar el espectro de actividad y anotar los resultados.
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incuban a 37C durante 24 h colocndolas en la estufa con la tapadera en la parte
superior.
5.8.- Anotar los resultados del antibiograma:
Medir los halos de inhibicin de los pocillos que contienen las distintas concentraciones
de penicilina y representar en papel semilogartmico la concentracin del antibitico
frente al dimetro del halo. En caso de no disponer de papel semilogartmico se puede
representar en papel milimetrado el logaritmo de la concentracin del antibitico frente
al dimetro del halo. A partir de esta recta patrn y conociendo el dimetro del halo del
antibitico problema se puede calcular su concentracin en g/mL
6.- DISCUSION
I. INTRODUCCION
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3.- pH
1.- Oxgeno
Uno de los factores ms crticos en la operacin de fermentacin a gran escala
es el suministro de un intercambio de gases adecuado. El oxgeno es el
sustrato gaseoso ms importante para el metabolismo microbiano y el
anhdrido carbnico es el producto metablico ms importante. El oxgeno no
es un gas muy soluble ya que una solucin saturada de oxgeno contiene
aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua. debido a la influencia de los
ingredientes del cultivo, el contenido mximo de oxgeno realmente es ms
bajo de lo que debera ser en agua pura. El suministro se logra pulverizando
aire en el fermentador durante el proceso.
La ley de Henry describe la solubilidad del oxgeno en soluciones de
nutrientes en relacin a la presin parcial del oxgeno en la fase gaseosa:
P0
C = -----H
En esta ecuacin C es la concentracin de O2 de la solucin de nutrientes a
saturacin, P0 es la presin parcial del gas en la fase gaseosa y H es la
constante de Henry que es especfica para cada tipo de gas. A medida que
aumenta la concentracin de O2 en la fase gaseosa, aumenta la proporcin de
O2 en la solucin de nutrientes. En consecuencia, la presin ms alta de O 2 se
consigue durante la aireacin con oxgeno puro. Comparado con el valor
obtenido al utilizar aire (9 mg O2/L), en agua se disuelven 43 mg O2/L cuando
se utiliza oxgeno puro. Otra caracterstica es que a medida que aumenta la
temperatura desciende la solubilidad del oxgeno.
Una vez disuelto el O2 ste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a
cada clula individual. Para ello deben ser superadas varias resistencias
parcialmente independientes:
a.- La resistencia dentro de la pelcula de gas a la interfase.
b.- La penetracin de la interfase entre la burbuja de gas y el lquido.
c.- Transferencia desde la interfase al lquido.
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2.- Temperatura
La temperatura es otro de los parmetros esenciales para el xito de una
fermentacin. Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la
ptima tienen retardado su crecimiento y por lo tanto reducida la produccin
celular, es decir su productividad. Por otro lado, si la temperatura es
demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrs al
choque trmico con la consiguiente produccin de proteasas celulares que
ocasionan una disminucin en el rendimiento de los productos proteicos. A fin
de obtener rendimientos ptimos, las fermentaciones deben ser llevadas a
cabo en un margen estrecho de temperatura y a ser posible constante. La
velocidad de produccin de calor debida a la agitacin y a la actividad
metablica de los microorganismos no se ve compensada por las prdidas de
calor que resultan de la evaporacin, por lo que se debe recurrir a sistemas de
refrigeracin. Dentro de stos, los ms utilizados en las fermentaciones
industriales son las camisas de agua.
3.- pH
La mayor parte de los microorganismos crecen ptimamente entre pH 5,5 y
8,5. Pero durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares
son liberados al medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de
cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de cultivo y aadir un
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cido o una base cuando se necesite para mantener constante el pH. Por
supuesto que esta adicin del cido o base debe ser mezclada rpidamente de
tal manera que el pH del medio de cultivo sea el mismo en todo el
fermentador.
V. AGITACION Y MEZCLADO
La agitacin es la operacin que crea o que acelera el contacto entre dos o
varias fases. Una fermentacin microbiana puede ser considerada como un
sistema de tres fases, que implica reacciones lquido-slido, gas-slido y gaslquido.
1.- La fase lquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede
existir, en algunos casos, una segunda fase lquida si existe un sustrato
inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos.
2.- La fase slida consiste en clulas individuales, bolitas de micelio, sustratos
insolubles o productos del metabolismo que precipitan.
3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxgeno,
para la eliminacin del CO2 o para el ajuste del pH con amonio gaseoso.
Una adecuada agitacin de un cultivo microbiano es esencial para la
fermentacin ya que produce los siguientes efectos en las tres fases:
1.- Dispersin del aire en la solucin de nutrientes.
2.- Homogeneizacin, para igualar la temperatura, pH y concentracin de
nutrientes, en el fermentador.
3.- Suspensin de los microorganismos y de los nutrientes slidos.
4.- Dispersin de los lquidos inmiscibles.
Bajo estas premisas se podra concluir que cuanto mayor sea la agitacin,
mejor ser el crecimiento. Sin embargo, la agitacin excesiva puede romper
las clulas grandes e incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso
en la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe conseguir un balance entre la
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Tabla de contenido
Pasteurizacin
En la fabricacin tradicional, el queso es producido sin control sobre la flora de la
leche. Como sta vara constantemente en cantidad y calidad, los resultados obtenidos
son siempre variables. La sustitucin de la microflora espontnea por cepas
seleccionadas permite obtener una calidad ms uniforme en la produccin quesera.
Bajo el punto de vista sanitario, higinico y tcnico, se hace necesario pasteurizar la
leche destinada a la produccin de quesos. Para fabricar un producto lcteo de buena
calidad, es indispensable contar con materia prima de ptima calidad.
La pasteurizacin de la leche tiene las siguientes finalidades que se traducen en
ventajas para la elaboracin de quesos:
a) Finalidad higinica
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- Destruccin de 100% de las bacterias patgenas que existen en la leche y 99%
de las saprofticas.
b) Finalidades tcnicas
fisicoqumicas
La casena es muy resistente a la accin del calor, aun cuando las temperaturas
altas afectan las uniones entre calcio, fsforo y casena, provocando insolubilidad de
las sales de calcio de la leche. La acidificacin de la leche antes y despus de la
coagulacin elimina las sales minerales originalmente fijadas sobre la micela
(estructura que se forma durante el proceso de coagulacin de la leche), siendo este
nivel de mineralizacin residual de las protenas el que determinar grado de cohesin
de la cuajada, su aptitud al escurrido, as como el extracto seco final del queso.
El calor exagerado produce perjuicios en la leche destinada a la elaboracin de
quesos. La leche pasteurizada cuaja ms difcilmente que la leche cruda, el tiempo de
coagulacin es mayor, se produce un cogulo ms blando, el desuerado es ms lento
y debido a la formacin de un cogulo dbil, se pierde mayor materia seca en el suero.
La separacin de lactosuero es muy difcil.
Los defectos que se derivan del calentamiento son tanto ms graves cunto ms
intenso haya sido el tratamiento trmico. Es necesario no pasarse de 72 IC por 15
segundos. Un tratamiento trmico ms fuerte provoca la desnaturalizacin de las
protenas del suero, insolubilizndose y precipitando junto con la casena (protena de
la leche) en la coagulacin por cido y cuajo y quesos de inferior calidad.
En el caso de quesos de pasta cocida, la pasteurizacin puede tener un efecto
perjudicial si la leche se encuentra muy contaminada con fermentos butricos. Este tipo
de grmenes no se destruyen y por otro lado, la fermentacin butrica se encuentra
66
organolpticas:
El sabor del queso est fraccionado entre el agua y el aceite soluble, las fracciones
voltiles y no voltiles, siendo ste el resultado de lo producido por los constituyentes
de la leche original y los productos de fermentacin derivados que existen al momento
de la evaluacin.
En general, los microorganismos alteran los productos por liplisis, protelisis (donde
se produce un aguado de los quesos) y puede haber cambios de consistencia, de color
(hongos y levaduras), de olor, sabor y aspecto.
Es conveniente no homogeneizar antes de la pasteurizacin, pues en la leche cruda
est la presencia de una lipasa lipo-proteica. Esta enzima es capaz de considerable
actividad en leche, pero se puede prevenir su acercamiento a su sustrato, el
triglicrido. La homogenizacin favorece este acercamiento, razn por la cual es
conveniente destruir primero la lipasa con la pasteurizacin.
Para ciertos tipos de quesos es difcil obtener con la leche pasteurizada una textura y
aroma tan buenos como con la leche cruda, por lo menos si se compara con los
quesos de mejor calidad. La modificacin de la textura se debe, probablemente, a las
albminas y globulinas precipitadas en la casena.
c) Caractersticas
microbiolgicas:
67
1981).
A nivel de granjas se est generalizando el uso de refrigeracin, con la cual sobreviven
bacterias, principalmente psicotrofas como Pseudomonas, Aeromonas y Alcalgenes
que se multiplicarn durante el transporte y el almacenamiento. Una eficiente
pasteurizacin reduce el contaje total de los microorganismos en el queso, pero sus
enzimas pueden sobrevivir el tratamiento de calor y ocasionar sabores desagradables
en los quesos.
Estas enzimas tienen el potencial de perjudicar las propiedades de procesamiento de
la leche. Las lipasas pueden causar rancidez en el queso cheddar, holands, suizo y
camembert. Las enzimas pueden degradar la casena en la leche cruda durante el
almacenamiento, produciendo pptidos, los cuales se pierden en el suero y afectan los
rendimientos del queso.
Con la pasteurizacin es importante el uso de fermentos y/o del cultivo iniciador. Estas
enzirnas o bacterias aadidas conjuntamente con las bacterias de la leche pueden
verse afectadas en su actividad por productos generados por bacterias de la leche o
puede ocurrir una inhibicin competitiva, estando sujetas a inactivacin y/o protelisis.
Los organismos patgenos que pueden estar presentes en la leche cruda para
elaboracin de quesos, pueden derivarse de ubres infectadas (mastticas), de heces e
instrumentos infectados, en los cuales los microorganismos, a excepcin de los
formadores de esporas y los enterococos, pueden ser destruidos por pasteurizacin
total. Sin embargo, cuando el queso se hace de leche cruda o hay una
postcontaminacin con patgenos o permanecen sus enterotoxinas, puede causar un
dao alimenticio.
Debido a la contaminacin frecuente de la leche por el personal obrero y la alta
incidencia de mastitis estafiloccica en los rebaos lecheros,
lacausafrecuentededaoporiosalimentos es debido a las enterotoxinas producidas por
Staphilococcus aureus. La salmonella aparece poco, no as las cadenas
enteropatognicas de E. colque causa desquebrajamientos en humanos y cuya
contaminacin postpasteurizacin es rara.
Los iniciadores lcticos usados en la elaboracin de quesos pueden efectivamente
proteger al queso contra patgenos por la produccin de cido lctico, cido actico,
agua oxigenada y antibitico (ejemplo: nisina). Bajo condiciones ptimas de
acidificacin, la multiplicacin y muertede lospatgenospuedeestarinfluenciada por las
cepas iniciadoras usadas.
La inclusin de eches mastticas causa dificultades de coagulacin, producen bajos
rendimientos o un queso muy hmedo. Las altas temperaturas pueden bloquear
tambin la actividad enzimtica al depositarse las sales de la leche, especialmente
bajo condiciones cidas y a temperaturas sobre 75 C, lo cual produce cuajadas
suaves que liberan agua lentamente, en comparacin con las cuajadas elaboradas a
partir de leche cruda.
Conclusiones
La leche necesita condiciones especiales de transporte como rapidez, puntualidad y
eficiencia, pero se presenta el problema del alto costo del transporte. Sin embargo, con
el cumplimiento de esas condiciones y de una higiene adecuada, el productor puede
fabricar quesos con menores riesgos de contaminacin si utiliza leche cruda y en caso
de pasteurizar la leche los beneficios sern mayores, debiendo slo pasteurizar
aquellas leches sanitariamente paseurizables.
Una leche de alta calidad (sin problemas de mastitis y con calidad higinica) permite
68
una mayor duracin de los productos y una gran aceptacin de los productos lcteos
por parte del consumidor.
No necesariamente la filtracin, la homogenizacin y la pasteurizacin dan como
resultado productos lcteos de alta calidad. Un procesador lcteo no puede obtener un
producto acabado de un producto crudo deficiente, ya que en la leche cruda hay
especies resistentes, en menor o mayor grado.
Es conveniente que la homogenizacin de la leche se efecte despus de la
pasteurizacin, para as eliminar primero las lipasas y evitar el enranciamiento de la
leche. La pasteurizacin (al menos la corta) es aconsejable, buscando en la medida de
lo posible que se mantengan las propiedades de la leche cruda:
- Capacidad de formacin de nata.
- Contenido vitamnico.
- Caractersticas qumicas.
- Valor nutritivo.
- Sabor.
En general, se puede reglamentar la utilizacin de uno u otro recurso (leche cruda o
pasteurizada), de acuerdo con el peligro potencial existente. Sin embargo, en
Venezuela, por la falta de control sobre los rebaos es ms conveniente pasteurizar la
leche.
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69
70
Horquetas, Pedro Juan Caballero, Capitn Bado, Quiindy, Coronel Oviedo y la
regin del Chaco.
Actualmente Japn, China, Brasil y Paraguay parecen ser los principales
productores. Del Japn se ha extendido a todo el sudeste asitico (Jordn
Molero, 1984).
Descripcin botnica:
Stevia rebaudiana Bert. (yerba dulce), es una planta arbustiva originaria del
noreste de Paraguay, perteneciente a la familia de las compuestas, que crece
en estado silvestre en forma de planta aislada. Fue descripta botnicamente en
1905, por el naturalista Moiss Santiago Bertoni, como una planta herbcea de
40 a 80 cm de altura.
La raz es fibrosa, filiforme y perenne, formando abundante cepa que apenas
ramifica y no profundiza, distribuyndose cerca de la superficie; es el nico
rgano de la planta que no contiene el estevisido (De Vargas, 1980). En
plantas que se propagan asexualmente por pedazos de tallos en arena gruesa,
se ha observado abundante ramificacin del sistema radicular. Sumida (1980)
observ que las races finas abundan en la superficie y las gruesas en las
zonas ms profundas del suelo.
El tallo es anual, subleoso, ms o menos pubescente, con tendencia a
inclinarse, es ms o menos ramificado. Durante su desarrollo inicial no posee
ramificaciones, tornndose multicaule despus del primer ciclo vegetativo
llegando a producir hasta 20 tallos en 3 a 4 aos. En condiciones ptimas, el
tallo puede llegar hasta un metro y medio de altura (Sagakuchi, 1982).
Las hojas son elpticas oval o lanceoladas, pequeas, simples; borde o margen
dentado; a veces en verticilos; algo velludas. La hoja es el rgano con mayor
contenido del edulcorante (C.C.N., 1980).
Una planta tarda ms de un mes en producir todas sus flores. En Paraguay
florece en octubre, diciembre y marzo pero se clasifica como una planta de da
corto, situando el fotoperodo crtico en 12 - 13 horas segn el ecotipo. La flor
es hermafrodita pequea y blanquecina, en captulos pequeos terminales o
axilares, agrupados en panculas corimbosas (Shock, 1982).
La polinizacin es entomfila; se dice que la planta es autoincompatible
(protandria) de tipo esporoftico y clasificada como apomctica obligatoria
(Monteiro, 1982).
El fruto es un aquenio que es diseminado por el viento. Se clasifica en: claro
estril, oscuro frtil y oscuro estril (Gattoni, 1945).
El gnero Stevia tiene ms de 100 especies en el continente americano, de
donde es originaria, pero Stevia rebaudiana Bert. es la nica especie con
principios edulcorantes en las hojas (Grashoff, 1972). En el Paraguay es
71
conocida con su denominacin: Ka'-He', que significa yerba dulce en
espaol.
Ecotipos:
Esta especie presenta numerosos ecotipos. Mitsuhashi (1975), seleccion 28
ecotipos diferentes. Para diferenciarlos se bas principalmente en sus
caractersticas morfolgicas. Al determinar el contenido de estevisidos estos
variaron entre 2,07 y 18,34 %. Sumida (1980) describe una serie de
experimentos donde 22 variedades de Stevia rebaudiana Bert. fueron
estudiadas para correlacionar, varias caractersticas de la planta con la
heredabilidad. Se observ 11 caractersticas morfolgicas y 6 caractersticas de
contenido. De estas 17 caractersticas, solamente el peso seco de hojas mostr
una baja correlacin con la heredabilidad. Sumida, concluy, que
caractersticas morfolgicas y de contenido, principalmente de principios
activos, tienen efecto seleccionador evidente.
Citologa:
Observaciones de Brucher (1974), revelan que la planta es diploide,
conteniendo 22 cromosomas.
Estudios de poliplodia fueron realizados por Brucher (1974), por Utsunomiya
(1977) y Sato y Kawakami (1975). Estos ltimos investigadores obtuvieron
variedades de alta calidad. La poliplodia puede resultar un buen mtodo para
obtener aumentos de productividad en trminos de masa foliar y contenido de
principio activo, reduciendo el rea plantada y por ello los costos (Handro,
1984).
Clima:
La regin donde crece el kaa-hee es subtropical, semihmeda, con 1.400 a
1.800 mm. de lluvia, que se distribuyen regularmente durante todo el ao y
temperaturas extremas de -6 a 43C, con promedio de 24C. Segn Sakaguchi
(1982) la temperatura ms apropiada para Stevia es de 15 a 30C con un lmite
inferior de -3C. Soporta medias mnimas de 5C.
La habilidad para resistir inviernos, aparentemente es determinada por la
temperatura del suelo. La amplitud crtica est entre 0 a 2C. Mudas de 5 cms.
con 10 hojas soportaron temperaturas de -5C por 70 minutos (Sagacuchi,
1982), lo que implica que las reas potenciales de produccin de la especie
podra extenderse a latitudes mayores. En nuestra facultad existe una pequea
parcela, con 50 plantas desde hace aproximadamente 2 aos. Durante el
invierno su parte area se seca, rebrotando desde la base en primavera.
La planta resiste la humedad pero no la sequa, y esto puede explicarse por la
morfologa de su sistema radicular.
Desarrolla mejor donde la estacin de crecimiento es larga, donde la intensidad
de luz es alta, con temperaturas tibias, riesgos mnimos de heladas luego de la
72
brotacin y sin perodos de larga sequa. Los fotoperodos largos aumentan la
longitud de los entrenudos, rea foliar, peso seco y aceleran la aparicin de
hojas. La materia seca se reduce a la mitad con fotoperodos, de das cortos.
Azcares, protenas y estevisidos aumentan tanto en valores absolutos como
relativos en das largos (Sagacuchi, 1982).
Para la produccin de mudas (propagacin) es necesario temperaturas por
sobre los 15C.
Suelos:
Se la puede cultivar en suelos muy variados. En su estado natural, la planta
crece en suelos tanto de baja fertilidad, cidos, de tipo arenoso como hasta
orgnicos y con alta humedad (Shock, 1982). Algunos autores recomiendan
tierras areno-arcillo-humfera-ferruginosa o simplemente arena humfera. Se
desarrolla bien en suelos colorados del Alto Paran. La tierra ideal es la arenoarcillosa con regular proporcin de humus. Se adapta bien a suelos arcillosos
con buen drenaje, no as a lugares con exceso de humedad. Prospera bien en
suelos de desmonte, no as en tierras recin desmontadas, con mucha materia
orgnica, por problemas de enfermedades (C.C.N., 1980). La planta crece
naturalmente en suelos de ph 4-5, pero crece bien entre 6.5-7.5 siempre que
no sean salinos (Shock, 1982).
Caractersticas agronmicas:
Stevia rebaudiana Bert. es una especie semiperenne que en cultivo puede
durar entre 5 y 6 aos, con 2 o 3 cortes anuales; el rendimiento anual de hoja
seca en Paraguay oscila entre 1500 y 2500 kg/ha, en condiciones de secano y
alrededor de 4300 kg/ha con riego (Jordn Molero, 1984).
En Japn, en 1 o 2 cosechas por ao, el rendimiento de hoja seca vara entre
3000 y 3500 kg/ha en el primer ao, 4000 a 4500 kg/ha en el segundo, 4000 a
6000 kg/ha en el tercero, disminuyendo a 4000 kg/ha en el cuarto (Sumida,
1980).
Segn distintos autores la densidad de plantacin puede variar entre 20.000 a
400.000 pl/ha, en hileras sencillas, dobles o triples. Altas densidades, reducen
el desarrollo de ramas laterales y el rendimiento en peso seco por planta,
aumentando el nmero de plantas muertas luego de la cosecha y las
dificultades en la misma (Sakaguchi, 1982).
Se estima que la densidad optima de 88000 pl/ha, se da a distancias de 75 cm
entre hileras y 15 cm dentro de la misma (Jordn Molero, 1984).
Propagacin sexual de Stevia rebaudiana (Bert):
Se reproduce sexualmente por aquenios, observndose alta heterogeneidad en
las poblaciones resultantes. La planta es de polinizacin cruzada y gran parte
de sus aquenios son estriles; son livianos y de fcil dispersin por el viento. La
floracin no es uniforme, lo mismo que la maduracin de la semilla, siendo la
73
recoleccin lenta y difcil. Para mejorar la calidad de las semillas se recomienda
incorporar apiarios en la plantacin. El porcentaje de germinacin varia entre
10 y 38 %. La longevidad de los aquenios es corta y ya a los 4 meses el
potencial de germinacin se reduce un 40-70 %, despus de 8 meses es casi
nulo. Las semillas deben guardarse en condiciones de baja humedad, baja
temperatura, preferentemente en la oscuridad y en envases hermticos
(Felippe et al., 1971; De Vargas, 1980; Sagakuchi et al., 1982; Jordn Molero,
1984).
Propagacin vegetativa de Stevia rebaudiana (Bert):
Esta especie puede propagarse vegetativamente por separacin de hijuelos.
Este mtodo slo puede utilizarse para pequeas plantaciones, ya que el
nmero de mudas producidas es reducido.
En la base del tallo, o bajo tierra, en la primavera temprana aparecen pequeos
vstagos, muchos con sus respectivas races que pueden separarse y
plantarse en el lugar definitivo (Jordn Molero, 1984).
Otra forma de propagacin vegetativa es a travs de estacas; mtodo que
convenientemente ajustado podra ser usado a escala comercial.
Diferentes autores obtuvieron respuestas variables al utilizar estacas apicales o
subapicales, con diversos sustratos, en distintas pocas del ao y al incluir
tratamiento rizognico (Felippe, 1977; De Vargas, 1980; Sumida, 1980; Shock,
1982; Jordn Molero, !983 y 1984).
El cultivo de tejidos es otro mtodo de propagacin vegetativa que permite
obtener plantaciones ms uniformes, adems de la rpida multiplicacin clonal
(Yang, 1979 y 1981; Marcavillaca, 1985).
Marcavillaca et al (1993) proponen la combinacin de macro y
micropropagacin; las plantas micropropagadas se utilizan como banco de
plantas madres y en slo 3 ciclos de multiplicacin (1 de micro y 2 de
macropropagacin), se lograra a partir de una sola planta, material para
cultivar 3 ha (225.000 plantas).
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76
Autor:
Daro Rubn Taiariol.
Ingeniero Agrnomo.