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PROGRAMA DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA


INDUSTRIAL
Departamento de Microbiologa
Facultad de Ciencias
TEORIA

Parte fundamental:
1. Microbiologa Industrial y Biotecnologa. Conceptos y desarrollo histrico.
2. Microorganismos de inters industrial : aislamiento, seleccin y mantenimiento.
3. Produccin de metabolitos primarios y secundarios : regulacin gentica en
microorganismos de inters en la industria.
4. Mejora y desarrollo de cepas en Microbiologa Industrial.
5. Medios de cultivo utilizados en los procesos de fermentacin. Preparacin y
propagacin de inculos. Fermentacin a escalas de laboratorio y piloto.
6. Instalaciones y tcnicas empleadas en las fermentaciones a escala industrial.
Biorreactores. Deteccin y ensayo de los productos de fermentacin.
Recuperacin de los productos finales.
7. Procesos continuos. Cultivo continuo.
8. Cultivos con clulas inmovilazadas. Procesos con enzimas inmovilizadas.
9. Depuracin de aguas residuales.

Parte

especial: Principales productos de inters


industrial obtenidos mediante el empleo de
microorganismos:

10. Produccin de cidos orgnicos : Acido lctico. Acido ctrico. Otros.


11. Produccin de Alcoholes. Etanol. Otros.
12. Transformaciones por microorganismos.
13. Transformacin de esteroides.
14. Transformacin de antibiticos.
15. Produccin de aminocidos.
16. Produccin de L-sorbosa. Produccin de cido glucnico. Otras
transformaciones microbianas.
17. Produccin de vitaminas.
18. Produccin de nuclotidos.
19. Produccin de antibiticos. Tcnicas empleadas en la investigacin y
produccin de nuevos antibiticos.
20. Antibiticos -lactmicos. Antibiticos aminoglucsidos.
21. Tetraciclinas. Macrlidos. Otros antibiticos.
22. Produccin de biopolmeros.
23. Produccin de enzimas.
24. Produccin de bebidas alcohlicas. Cerveza.
25. Vinos.
26. Bebidas de destilera.
27. Alimentos. Leche.
28. Productos lcteos : leches fermentadas y quesos.

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29. Otros alimentos fermentados.
30. Produccin de vinagre.
31. Conservacin y control microbiolgico de los alimentos.
32. Produccin de biomasa microbiana. Protenas de origen microbiano.
33. Levaduras de panadera y levaduras pienso.
34. Fertilizantes microbianos.
35. Bioinsecticidas.
36. Otras producciones de inters industrial. Vacunas bacterianas y virales.
Interferones.
PRCTICAS:
I.- Visitas de alumnos en prcticas a industrias relacionadas con Microbiologa
Industrial:
Planta potabilizadora de agua.
Planta depuradora de aguas residuales.
Industrial vitivincola y cervecera.
II.- Prcticas de laboratorio:
Screening para deteccin y aislamiento de microorganismos productores de
antibiticos.
Determinacin del espectro antibacteriano de un antibitico.
Screening para deteccin y aislamiento de microorganismos productores de enzimas.
Anlisis microbiolgicos de aguas
Colimetra
Estreptometra
Caracterizacin de microorganismos de inters industrial: bacterias, levaduras y
hongos.
Obtencin, aislamiento y caracterizacin de mutantes auxtrofos de levadura.
III.- Seminarios:
Tcnicas de Screening para la bsqueda de microorganismos y/o productos de inters
industrial.
Esterilizacin y pasteurizacin. Cintica de muerte por calor.
Microbiologa alimentaria.

BIBLIOGRAFIA
BIOTECNOLOGIA. A texbook of Industrail Microbiology. Second Edition. 1989. W.
Crueger and A. Crueger. Sinatter Associated, Inc.
BIOTECNOLOGA: Crueger y A. Crueger. Ed. Acribia. S.A.
BIOTECNOLOGIA. MANUAL DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL. 1.993. W.
BIOTECHNOLOGY. Second Edition. 1.988. Jobn E. Smith. Eduard Arnold.
MICROBIAL TECHNOLOGY Microbial Processes. Second Edition. 1.979. Vol. 1.
And.11. H.J. Peppler and D. Perlman. Acadernic Press.
PRESCOTT AND DUNN'S INDUSTRIAL MICROBIOLOGY Fourth Edition.

3
1.982. Gerald Reed. MacMillan Publishers Ltd
MICROBIAL
BIOTECNOLOGY.
FUNDAMENTALS

OF

APPLIED

MICROBIOLOGY.1.995. N. Glazer and H. Nikaido. W. H. Freeman and Company.


BROCK BIOLOGY OF MICROORGANISMS. 9 Edition. 2000. Madigan et al.
Prentice Hall International, Inc.
INTRODUCCION A LA BIOTECNOLOGIA DE LOS HONGOS. 1.992. M.
Wainwrigbt. Acribia S.A.
BIOQUIMICA DE LOS MICROORGANISMOS. 1.997. Pars y Jurez. Ed. Revert,
S.A.
SMALL BUGS, BIG BUSINESS: THE ECONOMIC POWER OF THE MICROBE.
2000. A. L. Demain. Biotechnology advances.
MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY. 1999.
A. L. Demain and J. E. Davies, eds. ASM Press, Washington DC.
BIOTECNOLOGA Y SOCIEDAD. ENCUENTROS Y DESENCUENTROS. 2001.
E. Muoz. Cambridge Univ. Press, Madrid.
INDUSTRIAL MICROBIOLOGY. AN INTRODUCTION. 2001. M. J. Waites, N. L.
Morgan, J. S. Rockey, G. Hington. Blackwell Science, Oxford.
PLANTAS TRANSGNICAS: DE LA CIENCIA AL DERECHO. 2002. Enrique
Iez Pareja (Coord.) y 9 autores ms. Editorial Comares, Biblioteca de derecho y
ciencias de la vida. Granada.

SISTEMA DE EVALUACIN:
Teora: Los alumnos sern evaluados mediante exmenes escritos: 1 2 parciales no
obligatorios y un final obligatorio para aquella parte de la asignatura que no baya sido
eliminadapor parciales.
Prcticas: Las Prcticas son obligatorias. Para aprobarlas es necesaria la asistencia y
superar las pruebas correspondientes. Para aprobar la teora es imprescindible haber
aprobado previamente las prcticas. La calificacin definitiva tendr en cuenta tanto la
nota obtenida en prcticas como la obtenida en teora. Podr, en algunos casos,
mejorarse la calificacin final mediante la realizacin de revisiones bibliogrficas, que
podrn ser expuestas en forma de seminarios.

OBJETIVOS:
Conocimientos bsicos fundamentales de:
1. Tcnicas de escreening y aislamiento
2. Regulacin del metabolismo primario y secundario de los microorganismos de
inters industrial
3. Desarrollo y mejora de las cepas
4. Tecnologa de procesos industriales llevados a cabo con microorganismos
Estudio de diversos procesos de produccin que abarcan: metabolitos primarios y
secundarios, enzimas, biomasa microbiana, alimentos y bebidas. En cada caso se

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pretende que el alumno conozca:
1. Los microorganismos adecuados y su mejora.
2. Desarrollo del proceso y recuperacin del producto final.

TEMA 1: INTRODUCCION
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

I. CONCEPTOS
Microbiologa es una Ciencia experimental que se ocupa del estudio de los
microorganismos y de sus interacciones con otros organismos y con el medio
ambiente.
Microbiologa Industrial estudia todos aquellos aspectos de los
microorganismos que tienen una aplicacin industrial, tanto en la
transformacin de productos empleados en la alimentacin como en la
produccin de sustancias tales como antibiticos, vitaminas, enzimas, as
como en la obtencin de masa microbiana (protena unicelular, vacunas,
fertilizantes microbianos, biopesticidas).
Fruto del conocimiento de las capacidades que poseen los microorganismos ha
sido, y sigue siendo, su inmediato aprovechamiento para estos fines y, as, a
los mtodos tradicionales de produccin de sustancias por fermentacin se han
unido recientemente las tcnicas de manipulacin gentica de los mismos que
han permitido obtener, de forma masiva, nuevos productos de inters prctico
que los microorganismos normalmente no sintetizan tales como insulina,

hormona de crecimiento humana e interfern.


Biotecnologa es la aplicacin de los principios cientficos y tcnicos en el
procesamiento de los materiales por agentes biolgicos para obtener bienes y
servicios.
Actualmente, se denomina Biotecnologa Molecular a la aplicacin de las
tcnicas del DNA recombinante en los seres vivos para la obtencin de
productos de inters industrial.

II. OBJETIVOS DE LA MICROBIOLOGIA


INDUSTRIAL
Desde un punto de vista industrial, lo que se pretende es que se obtenga el
mayor rendimiento posible de producto a partir del sustrato utilizado. Estos
altos rendimientos se obtienen en la sntesis qumica; en la biosntesis, la
energa obtenida se utiliza no slo para la obtencin del producto deseado sino
que se aplica en todos los procesos metablicos que van a permitir a ese ser
vivo crecer. Cuanto ms complejo sea el ser vivo, ms energa requerir para
crecer y por lo tanto menor rendimiento obtendremos del producto deseado.
De ah que siempre que se puede se utilizan microorganismos. No obstante
existen una serie de productos que, en la actualidad, no pueden ser
sintetizados por los microorganismos; de ah que se recurra primero a las
plantas y sino a los animales. Por consiguiente, en la obtencin de productos
industriales la primera va es la sntesis qumica, si no funciona se recurre a
los microorganismos, plantas y finalmente animales.
Los productos de inters industrial producidos por los microorganismos se
encuadran en 7 categoras principales:

1.- Las clulas microbianas propiamente dichas.


2.- Las macromolculas que sintetizan, por ejemplo enzimas.
3.- Los productos de su metabolismo, tanto primario (compuestos esenciales
para su crecimiento) como secundario (compuestos no esenciales para su

desarrollo). En trminos generales, los metabolitos tienen un peso molecular


bastante bajo (menos de 1500 Daltons) si lo comparamos con el peso
molecular de los enzimas que vara desde 10000 hasta varios millones de
Daltons.
4.- Se acude tambin a las clulas microbianas para llevar a cabo conversiones
biolgicas a travs de las cuales un compuesto se transforma en otro
estructuralmente relacionado por intervencin de uno o varios enzimas
aportados por las clulas.
5.- La obtencin de los derivados lcteos, cerveza, vino, pan, etc. constituyen
alguno de los procesos biotecnolgicos ms antiguos donde la intervencin de
los microorganismos es crucial.
6.- Ciertos microorganismos se hallan detrs de un proceso metalrgico que se
remonta, al parecer, hasta la poca romana: la lixiviacin bacteriana de menas
de bajo contenido para extraer de ellas metales. En la actualidad se utilizan
microorganismos, Thiobacillus, para extraer hierro, cobre y zinc de menas sin
contaminar la atmsfera.
7.- La actividad microbiana se aplica tambin a la detoxificacin y
degradacin de las aguas residuales y desechos industriales. Las mareas
negras y el vertido de lastres y aguas de lavado de los petroleros son otros
tantos problemas que plantean los residuos, cuya solucin quizs est en
manos de la Microbiologa ya que se han aislado muchos microorganismos
capaces de consumir componentes del petrleo.

III. DESARROLLO HISTORICO


1.- Emprico
El arte de la fermentacin, definido tcnicamente en su sentido ms amplio
como la transformacin qumica de compuestos orgnicos con la ayuda de
enzimas (sobre todo los producidos por microorganismos), es muy antiguo. La
capacidad de las levaduras para producir alcohol en forma de cerveza la
conocan ya los Sumerios y Babilonios antes del ao 6000 a.c. Ms tarde,

aproximadamente hacia el ao 4000 a.c., los Egipcios descubrieron que el


CO2 generado por la accin de las levaduras (Saccharomyces) poda
fermentar el pan. Referencias al vino, otro antiguo producto de fermentacin,
se hallan en el Gnesis, donde consta que No consuma algo ms de lo
debido.
Hacia el siglo XIV d.c., la destilacin de bebidas alcohlicas a partir de grano
fermentado, prctica originaria de China, era comn en muchas zonas del
mundo (Francia-Brandy; Escocia-Whisky). Los microorganismos
proporcionaron alimentos y bebidas durante ms de 8000 aos, sin que se
tuviera nocin de su existencia.
Leeuwenhoek, en el siglo XVIII, fu la primera persona que los describi en
detalle al observar, a travs de su propio microscopio simple, el sedimento de
vinos. Sin embargo, estas observaciones no condujeron a ninguna
investigacin acerca de las posibles actividades de los microorganismos
descritos.
El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fu reconocido hasta
mediados del siglo XIX por Pasteur que descubri que las levaduras
transforman el azcar en alcohol en ausencia de aire. A este proceso
anaerbico se le conoce como fermentacin alcohlica.
A finales del siglo XIX y gracias al desarrollo de las tcnicas de cultivos
puros, se aisla y distribuye la primera cepa de levadura vnica, la Steinberg 92,
para su uso comercial en la produccin del vino. Anteriormente, en 1883,
Emil Christian Hansen obtuvo el primer cultivo puro de levadura cervecera
que denomin Saccharomyces carlsbergensis. Con estos trabajos y los de
Pasteur, la fermentacin pasa de ser un arte (resultados imprevisibles) a ser
una ciencia (resultados previsibles).

2.- Cientfico
Los progresos realizados en investigacin bioqumica bsica a partir del
descubrimiento de los enzimas por Buchner en 1897 fu considerable, pero no
comenzaron a aplicarse en la fermentacin industrial hasta la primera guerra
mundial (1914).
En el lado alemn, la obtencin de glicerol para la fabricacin de explosivos
se convirti en una necesidad urgente. El bloqueo martimo britnico cort la
importacin de aceites vegetales, la materia prima tradicional en la produccin
de glicerol. Pero algunos aos antes, el bioqumico alemn Carl Neuberg
haba vuelto a considerar cierta observacin de Pasteur: en la fermentacin
alcohlica se solan originar pequeas cantidades de glicerol (fermentacin

gliceropirvica -----> lgrima del vino). Avanzando en su estudio, Neuberg


descubri que la adicin de bisulfito sdico al tanque de fermentacin
favoreca la produccin de glicerol a expensas de la de alcohol. Este
descubrimiento fu desarrollado rpidamente por los alemanes en una
fermentacin industrial que produca 1000 toneladas de glicerol al mes.
Los ingleses, por su parte, andaban escasos de acetona para la fabricacin de
municiones. Dificultad de la que sali al paso un qumico de origen ruso,
Chain Weizmann. Weizmann desarroll la fermentacin butanol-acetona que
depende de la bacteria anaerobia Clostridium acetobutylicum. El
descubrimiento de Weizmann jug un papel determinante en el desarrollo de
la guerra. Al finalizar sta, rehus todos los honores que le propuso el
gobierno Britnico. Sin embargo, utiliz su influencia para que el gobierno
Britnico ayudar a establecer el estado Judio en Palestina. En 1949,
Weizmann fu elegido el primer presidente de Israel.
El proceso alemn de obtencin de glicerol desapareci de la escena al final
del conflicto. Destino que no sufri el proceso butanol-acetona; ste persisti
como fuente de acetona durante muchos aos, hasta que al principio de los 50
lo desplazaron otros procesos que se fundamentan en el petrleo.
La produccin de cido ctrico por microorganismos tambin tiene su origen
en la primera guerra mundial. Hasta entonces el cido ctrico se extraa de los
ctricos, siendo Italia el mayor productor. Cuando los hombres fueron
llamados a filas, los cultivos se desatendieron y al final del conflicto la
industria estaba en ruina aumentando el precio del cido ctrico. Todo esto
favoreci la introduccin en 1923 de un proceso microbiano para su
obtencin. El organismo usado para la obtencin de cido ctrico, Aspergillus
niger, es un aerobio obligado, por lo que debe cultivarse en presencia de
oxgeno, justo lo contrario de Clostridium acetobutylicum. Para ello se
desarrollaron los cultivos en superficie y as poder mantener al
microorganismo en contacto con el aire.
En 1928, Alexander Fleming observ que el hongo Penicillium notatum
mataba sus cultivos de la bacteria Staphylococcus aureus. Tras cultivar el
hongo en medio lquido y separar el lquido de las clulas, encontr que el
lquido celular poda inhibir el crecimiento de muchas especies bacterianas.
Llam al ingrediente activo del lquido con el nombre de penicilina, aunque
no continu los estudios debido a que no posea conocimientos qumicos (era
mdico) para aislarla. En la dcada de 1930, cierto nmero de qumicos
britnicos intentaron aislar la penicilina. Pero fracasaron debido a su
inestabilidad. Por ltimo, un estudio comenzado en 1939 en la Universidad de
Oxford por Howard Florey, Ernst Chain y colaboradores condujo a la
preparacin con xito de una forma estable de penicilina y a la demostracin
de su impresionante actividad antibacteriana, primero en cobayas y despus en

el hombre. El primer ensayo clnico con una preparacin de penicilina se llev


a cabo el 12 de Febrero de 1941. El paciente era un polica de Oxford que se
estaba muriendo por una infeccin con Staphylococcus (septicemia). Al
administrarle penicilina se observ un mejoramiento espectacular, pero 5 das
despus, cuando se les acab la penicilina, la infeccin volvi a emerger y el
paciente muri. Este ensayo clnico fall debido a que no se poda obtener una
produccin a gran escala de penicilina. En este punto (1940-1941), los
britnicos estaban inmersos en la segunda guerra mundial. Florey y su colega
Heatley consideraron que las condiciones de una Inglaterra en guerra no eran
las adecuadas para el desarrollo de un proceso industrial de produccin del
antibitico. Y as fu como se trasladaron a los Estados Unidos, en 1941, en
busca de apoyo. Con la ayuda del Departamento de Agricultura y de varias
compaas farmacuticas y Universidades se hizo posible la produccin a gran
escala de Penicilina un ao despus.
Al igual que Aspergillus niger, microorganismo utilizado en la produccin de
cido ctrico, Penicillium notatum es aerobio obligado y por lo tanto deba ser
crecido en cultivos en superficie, lo que favoreca la contaminacin y por lo
tanto disminua el rendimiento de penicilina. La necesidad de utilizar tcnicas
aspticas llev al desarrollo de los fermentadores con agitacin que
actualmente son los que ms se utilizan para cultivar a gran escala los
microorganismos. Las condiciones aspticas se conseguan esterilizando todo
el equipo con vapor antes de la inoculacin y manteniendo la presin del
interior del fermentador superior a la atmosfrica. El oxgeno se introduca a
travs de aire estril y se distribua en el medio por agitacin.
Otra contribucin al desarrollo de la biotecnologa moderna que se realiz
dentro del programa de la penicilina fu el desarrollo de las tcnicas de
seleccin de cepas. El Penicillium notatum original produca 2 mg de
penicilina por litro de cultivo. El muestreo de diferentes Penicillium llev a la
identificacin de una cepa superproductora de Penicilina, Penicillium
chrysogenum. Para incrementar el rendimiento de esta cepa, se someti
posteriormente y de una forma sistemtica a una variedad de agentes
mutgenos, de tal manera que los supervivientes superproductores se
seleccionaban y se sometan a otra ronda de mutaciones. Combinando las
mejoras en la fermentacin con el uso de mutantes, hoy en da el rendimiento
se ha incrementado hasta los 20 g/L.
El advenimiento de la penicilina seal el comienzo de la era de los
antibiticos. Siguieron pronto los descubrimientos de Selman Waksman quien
aisl Streptomyces gryseus que produce estreptomicina. A partir de entonces
se hizo prctica estndar el muestreo de un gran nmero de aislamientos del
suelo, consiguindose obtener numerosos antibiticos nuevos a partir
fundamentalmente de un grupo de bacterias denominadas Actinomicetos.

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3.- Ingeniera Gentica


Despus de la introduccin de la fermentacin de la penicilina no hubo
prcticamente ningn desarrollo significativo en la microbiologa industrial
durante 30 aos. La mayora de las compaas se dedicaban a la bsqueda de
microorganismos que produjeran metabolitos o actividades deseadas, para
posteriormente, realizar una seleccin de cepas superproductoras y desarrollar
la fermentacin.
Al final de los 60 se gener cierto revuelo ante las expectativas de utilizar las
clulas microbianas (biomasa) como una fuente de protenas, lo que se
denomina Single Cell Protein (SCP). Sin embargo, la introduccin de la SCP
no tuvo el xito esperado debido a que coincidi con un rpido incremento del
precio del petrleo y con el desarrollo de variedades de cultivos con alto
rendimiento con lo que los pases desarrollados no necesitaban SCP y los
pases subdesarrollados no podan construir plantas industriales para obtener
SCP. El desarrollo en Biotecnologa, como en otras reas, est sujeto a
presiones polticas y econmicas (en el mundo de los negocios existe poco
altruismo).
En 1973 Stanley Cohen, Herbert Boyer y sus colaboradores desarrollaron la
metodologa necesaria para transferir la informacin gentica (genes) de un
organismo a otro. El desarrollo de la tecnologa del DNA recombinante ha
cambiado la naturaleza de la biotecnologa ya que la ingeniera gentica
provee la capacidad para crear (ms que aislar) cepas superproductoras.
El 15 de Octubre de 1980, a los 20 minutos de comenzar la sesin en la bolsa
de Nueva York, las acciones de la compaa Genentech subieron de 35 $ a 89
$. Fu, hasta la fecha, la mayor subida de acciones en la historia de la bolsa de
Nueva York. Era la primera vez que esta compaa cotizaba en bolsa.
Cientficos de esta compaa, 2 aos antes (1978), haban conseguido producir
insulina humana en la bacteria Escherichia coli con lo que poda ser usada por
aquellos diabticos que eran alrgicos a la insulina disponible hasta la fecha
(Insulina de cerdo).

IV. FUTURO
Las perspectivas futuras pueden llevar a los siguientes beneficios:

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Diagnstico, prevencin o cura de enfermedades infecciosas y genticas.


Aumento del rendimiento de cultivos creando plantas resistentes a insectos,
hongos y virus.
Desarrollo de microorganismos que producirn compuestos qumicos,
polmeros, aminocidos, enzimas y varios aditivos de alimentos.
Facilitar la eliminacin de contaminantes y residuos txicos del medio
ambiente.
Aunque es importante enfatizar los aspectos positivos de los nuevos avances,
tambin es necesario considerar las consecuencias sociales que pueden
derivarse del uso de esta tecnologa:
Puede ser algn organismo modificado genticamente perjudicial para otros
organismos o el medio ambiente?
Puede el desarrollo y uso de los organismos modificados genticamente
reducir la diversidad gentica natural?
Deben modificarse genticamente a los hombres?
Los nuevos diagnsticos invadirn la privacidad de las personas?
Deben tener propietario los organismos creados por ingeniera gentica?

TEMA 2:
MICROORGANISMOS DE INTERES
INDUSTRIAL

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Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

I. CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS


Existen millones de organismos vivos en la Naturaleza, siendo algo
caracterstico del hombre su afn por ordenar esa gran variedad de
organismos. Con esa necesidad de ordenamiento surge la Taxonoma como la
ciencia de la clasificacin, nomenclatura e identificacin. La Clasificacin es
algo creado por el hombre. Consecuencia de esta artificialidad es la
controversia que existe desde mediados del siglo XVIII sobre las divisiones
que se establecen entre los seres vivos. Lo que comenz con Linneo siendo
una sencilla divisin de los seres vivos, los reinos Animalia y Plantae, ha ido
hacindose cada vez ms complejo al pasar por distintas modificaciones hasta
llegar a nuestros das con la propuesta de los tres dominios y varios reinos y
con la sospecha de que no ser la ltima, ya que los conocimientos de que se
dispone son cada vez mayores, as como las posibilidades de aumentar esos
conocimientos.
Carolus Linnaeus, a mediados del siglo XVIII, orden a todos los seres vivos
en dos Reinos bien definidos: el Reino Animalia que agrupaba a los animales,
organismos mviles y hetertrofos; y el Reino Plantae que inclua a los
vegetales, individuos inmviles, auttrofos y fotosintticos. Segn el esquema
de los dos reinos, los protozoos se incluyeron en el Reino Animalia y el resto
de microorganismos en el Reino Plantae.
Sin embargo, esta clasificacin encontr pronto dificultades ya que existan
numerosos microorganismos que posean caractersticas intermedias que no
permitan su clara adscripcin a uno de los dos reinos preestablecidos. En
1866 Ernst Haeckel propuso un tercer reino, el Reino Protista, para reordenar
todos los seres vivos con organizacin biolgica sencilla ya fueran
unicelulares, cenocticos o multicelulares, pero todos ellos carentes de
especializacin tisular y en los que cada individuo era capaz de realizar las
funciones propias y especficas que los tejidos de organismos superiores,
animales y plantas, tenan encomendadas. Segn Haeckel, el Reino Protista
incluira bacterias, algas, hongos y protozoos. Sin embargo, la validez del
Reino Protista fu cuestionada a medida que se obtena ms informacin
acerca de la estructura interna de los microorganismos debido a los avances en
microscopa electrnica.
En 1937 Chatton dividi el mundo de los seres vivos en dos grandes grupos
segn tuvieran o no membrana nuclear. Aparecieron as los trminos eucariota

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para definir organismos con clulas nucleadas que van desde los protozoos,
algas y hongos hasta los animales y plantas; y procariota para agrupar clulas
sin membrana nuclear, como es el caso de las bacterias. La dicotoma
eucariota-procariota fu utilizada por los taxnomos como una caracterstica
filogentica de primera magnitud.
Aparecieron de esta forma los esquemas de cinco reinos en los que los
microorganismos procariotas constituyeron un grupo taxonmico
filogenticamente independiente. El ms aceptado de todos ellos fu el de
Whittaker, que en 1969 propuso un sistema de clasificacin de los seres vivos
basado en los dos niveles de organizacin celular y las tres formas principales
de nutricin (fotosntesis, absorcin e ingestin) que dieron lugar a los Reinos
Monera (procariotas), Protista (eucariotas unicelulares), Plantae (eucariotas
fotosintticos), Animalia (eucariotas fagotrofos) y Fungi (eucariotas
osmotrofos). En el esquema de Whittaker los microorganismos quedaron
includos en los Reinos Monera (bacterias), Protista (protozoos y microalgas)
y Fungi (hongos filamentosos y levaduras). Hasta este momento se utilizaron
caractersticas morfolgicas y fisiolgicas hasta que el desarrollo de la
biologa molecular permiti utilizar los constituyentes moleculares como
nuevos criterios clasificatorios.
As, en 1987, Woese utilizando el 16S rRNA como reloj molecular comprob
que, a travs de la secuenciacin de esta molcula, los procariotas quedaban
divididos en dos grupos. El primero de ellos incluye las bacterias ms
comunes, aisladas en su mayora del cuerpo, suelo y agua denominndose
eubacterias. El segundo grupo incluye las bacterias que producen metano
(metangenas), ciertas bacterias del azufre que pueden crecer en ambientes
muy cidos y calientes (termfilas extremas) y bacterias que viven en
ambientes salinos (halobacterias). Estas bacterias se denominaron
arqueobacterias.
En 1990 Carl Woese propuso un nuevo taxon superior a Reino que denomin
Dominio (Dominio ----> Reino ----> Divisin ----> Clase ----> Orden ---->
Familia ----> Gnero ----> Especie). Todos los seres vivos se agruparan en 3
dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya. De los cuales, dos son
exclusivamente microbianos y estn compuestos nicamente por clulas
procariotas pertenecientes al Reino Monera (Bacteria y Archaea) y el tercero
(Eukarya), formado por eucariotas, incluira entre otros los Reinos Protista,
Plantae, Animalia y Fungi.

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II. CARACTERISTICAS DE LOS


MICROORGANISMOS INDUSTRIALES
Existen una serie de caractersticas que comparten todos los microorganismos
y que suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. la ms fundamental,
el pequeo tamao de la clula microbiana y su correspondiente alta relacin
de superficie a volumen. Esto facilita el rpido transporte de nutrientes al
interior de la clula y permite, por consiguiente, una elevada tasa metablica.
As, la tasa de produccin de protena en las levaduras es varios rdenes de
magnitud superior que en la planta de soja, que, a su vez, es 10 veces ms alta
que en el ganado. Esta velocidad de biosntesis microbiana extremadamente
alta permite que algunos microorganismos se reproduzcan en tan solo 20
minutos (Escherichia coli). Los ambientes capaces de albergar vida
microbiana son muy variados. Se han encontrado especies que viven a
temperaturas comprendidas entre el punto de congelacin del agua y el punto
de ebullicin, en agua salada y dulce, en presencia y en ausencia de aire.
Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en
respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas permanecen inactivos
durante aos hasta que el medio ambiente, ms favorable, permita el
desarrollo de las clulas. Los microorganismos se hallan capacitados para
acometer una extensa gama de reacciones metablicas y adaptarse as a
muchas fuentes de nutricin. Versatilidad que hace posible el que las
fermentaciones industriales se basen en nutrientes baratos.
Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de inters;
debe estar disponible en cultivo puro; debe ser genticamente estable y debe
crecer en cultivos a gran escala. Otra caracterstica importante es que el
microorganismo industrial crezca rpidamente y produzca el producto deseado
en un corto perodo de tiempo. El microorganismo debe tambin crecer en un
relativamente barato medio de cultivo disponible en grandes cantidades.
Adems, un microorganismo industrial no debe ser patgeno para el hombre o
para los animales o plantas. Otro requisito importante es la facilidad de
separar las clulas microbianas del medio de cultivo; la centrifugacin es
dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales ms
favorables para esto son aquellos de mayor tamao celular (hongos
filamentosos, levaduras y bacterias filamentosas) ya que estas clulas
sedimentan ms fcilmente que las bacterias unicelulares e incluso son ms
fciles de filtrar.

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III. DIFERENTES TIPOS DE MICROORGANISMOS


INDUSTRIALES
Los microorganismos que sintetizan productos tiles para el hombre
representan, como mximo, unos pocos centenares de especies de entre las
ms de 100000 descritas en la Naturaleza. Los pocos que se han encontrado
con utilidad industrial son apreciados por elaborar alguna sustancia que no se
puede obtener de manera fcil o barata por otros mtodos.

1.- Levaduras
Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de aos para la
fabricacin de pan y bebidas alcohlicas. La levadura que sin duda fu la
primera y an hoy en da sigue siendo la ms utilizada por el hombre es
Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la
fabricacin de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales.
Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se
explota en pequea escala para la produccin de alcohol a partir del suero de
la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de cido ctrico.
Trichosporum cutaneum desempea un importante papel en los sistemas de
digestin aerbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de
oxidacin de compuestos orgnicos, includos algunos que son txicos para
otras levaduras y hongos, como los derivados fenlicos.

2.- Hongos filamentosos


Los hongos tienen una gran importancia econmica, no tan slo por su
utilidad, sino tambin por el dao que pueden causar. Los hongos son
responsables de la degradacin de gran parte de la materia orgnica de la
Tierra, una actividad enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de
la materia viva. Por otro lado, los hongos causan gran cantidad de
enfermedades en plantas y animales y pueden destruir alimentos y materiales
de los que depende el hombre.
Los efectos perjudiciales de los hongos estn contrarrestados por su
utilizacin industrial. Los hongos son la base de muchas fermentaciones como
la combinacin de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los
alimentos orientales miso, shoyu y tempeh. Los hongos son tambin la fuente
de muchos enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), cidos
orgnicos (ctrico, lctico), antibiticos (penicilina), quesos especiales
(Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las setas.

16

3.- Bacterias
Entre las especies bacterianas de inters industrial estn las bacterias del cido
actico, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en cido
actico. El gnero Bacillus es productor de antibiticos (gramicidina,
bacitracina, polimixina), proteasas e insecticidas. Del gnero Clostridium cabe
destacar Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azcares
originando acetona y butanol. Las bacterias del cido lctico incluyen, entre
otras, las especies de los gneros Streptococcus y Lactobacillus que producen
yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente industrial de
lisina. El olor caracterstico a tierra mojada se debe a compuestos voltiles
(geosmina) producidos por Streptomyces aunque su principal importancia
radica en la produccin de antibiticos como anfotericina B, kanamicina,
neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc.

TEMA 3:
AISLAMIENTO Y SELECCION DE
MICROORGANISMOS INDUSTRIALES
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

I. OBJETIVOS
Los microorganismos presentan una gran variedad metablica por lo que en
distintos aislados microbianos podemos encontrarnos una amplia variedad de
compuestos. Una de las tareas de la Microbiologa Industrial es desarrollar
procedimientos que permitan el aislamiento y seleccin de microorganismos
de inters industrial. A fin de tener xito, los mtodos de seleccin deben
constituir una actividad interdisciplinaria que combine actividades de

17

microbiologa, qumica, bioqumica, ingeniera y bibliogrficas. El xito de un


programa de seleccin depende de la fuente utilizada para la obtencin de los
microorganismos y del mtodo elegido para detectar la actividad deseada.

II. FUENTES DE OBTENCION DE


MICROORGANISMOS
1.- Fermentaciones naturales: vino, pan, queso, materiales en descomposicin.
2.- Animales y plantas enfermos: vacunas.
3.- Suelo: es el mayor almacn, pero tambin el ms difcil de manejar ya que
se pueden encontrar todo tipo de microorganismos y en una concentracin de
100 millones por gramo de suelo (gran variedad y cantidad).
4.- Colecciones internacionales de cultivos tipo.
Para el aislamiento de nuevos productos metablicos, los investigadores
intentan aislar cepas a partir de ambientes extremos o poco corrientes con la
esperanza de que tales cepas sean capaces de producir nuevos metabolitos. Por
ejemplo, se estn examinando microorganismos de las grandes altitudes,
hbitats fros, aguas marinas, profundidades de los ocanos, desiertos,
giseres, campos de petrleo, etc.

III. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS


El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando las tcnicas
empleadas normalmente en microbiologa, siguiendo el siguiente esquema a
partir de una muestra de suelo:
1.- La muestra de suelo se resuspende en agua estril.

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2.- El sobrenadante se diluye 10-1 a 10-10 veces.


3.- Muestras de estas series de diluciones (c.a. 100 L) se siembran sobre
varios medios de cultivo (dependiendo del tipo de microorganismos que
queramos aislar) y luego se incuban.
4.- Se aislan colonias separadas de distinta morfologa y se purifican por
resiembra.
5.- Los cultivos puros se mantienen en tubos de ensayo como cultivos en
medio slido listos para realizar las pruebas de seleccin.
El procedimiento de seleccin puede ser acelerado frecuentemente probando
la actividad biolgica de los aislados iniciales directamente.

IV. SELECCION DE MICROORGANISMOS


Screening (Bsqueda): Deteccin y aislamiento de microorganismos de
inters industrial de entre una poblacin compleja de organismos utilizando
procedimientos selectivos.
Screening Primario: Deteccin y aislamiento de microorganismos
potencialmente tiles.
Screening Secundario: Estudio de los microorganismos aislados en el
screening primario para separar los que tienen inters potencial de los que
tienen inters real y mejorar estas cepas seleccionadas.
Para llevar a cabo un screening primario generalmente se parte de una
poblacin mixta (suelo, fermentaciones naturales, etc.) donde existe tanto una
gran cantidad como variedad de microorganismos potencialmente tiles que
debemos seleccionar. Para ello lo primero que hacemos es utilizar medios
selectivos donde crezca el tipo de microorganismo que nos interesa aislar. A
este medio se le pueden aadir inhibidores para eliminar los que no nos
interesan. Por ejemplo, si queremos obtener un microorganismo aerobio lo
creceramos en presencia de O2 con lo que los anaerobios no creceran; o bien

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si queremos seleccionar hongos, aadiramos cloranfenicol, antibitico que


acta frente a bacterias pero que no afecta a los hongos. Los parmetros
generales que tenemos que tener en cuenta son la fuente de carbono, fuente de
nitrgeno, aireacin, temperatura, pH e inhibidores. Posteriormente se reaislan
en cultivo puro aquellos microorganismos que hemos aislado para su posterior
estudio.

1.- Seleccin de microorganismos productores de


antibiticos y otros agentes inhibidores del crecimiento
Los microorganismos productores de antibiticos se encuadran dentro de las
bacterias (Bacillus, Pseudomonas y fundamentalmente actinomicetos) y
hongos (Penicillium). Los parmetros que se utilizaran para seleccionar estos
microorganismos productores de antibiticos seran:
Temperatura: Hongos 20-22C; Actinomicetos 28C
pH: Hongos pH cido; Bacterias pH neutro
Oxgeno: Todos los productores son aerobios
Carbono: Actinomicetos glicerol, quitina, almidn
Nitrgeno: Actinomicetos caseina, arginina, asparragina; En general amonio o
nitrato.
Una vez crecidas las colonias que nos interesan, se utiliza un medio que
contenga el microorganismo que sea susceptible de inhibirse su crecimiento
por los antibiticos que queramos seleccionar: Gram +, Gram -, amplio
espectro, etc. Se aislan, para ensayos posteriores, aquellas colonias que
produzcan halos de inhibicin.

2.- Seleccin de microorganismos productores de


vitaminas y otros factores de crecimiento
Necesitamos, al igual que para la deteccin de antibiticos, un
microorganismo test que posea un requerimiento absoluto para el factor de
crecimiento que nos interesa (auxtrofos). Estos microorganismos pueden ser
bien mutantes naturales o mutantes provocados por la accin de agentes
mutgenos. El screening se realiza de forma similar al de la produccin de
antibiticos, aunque en este caso al medio de cultivo le falta el factor de
crecimiento buscado, de tal manera que el microorganismo test slo crecer
alrededor de las colonias que produzcan este factor de crecimiento (halo de
crecimiento).
A escala industrial y de forma general se utilizan como microorganismos
productores de aminocidos a las bacterias y como microorganismos

20

productores de vitaminas a los eucariotas (levaduras y hongos filamentosos).


Esta premisa nos sirve de orientacin para elegir los medios selectivos y de
enriquecimiento para aislar inicialmente a los microorganismos productores,
bacterias u hongos.

3.- Seleccin de microorganismos productores de enzimas


Debido a la dificultad que entraa el manejo de microorganismos, siempre que
sea posible, se recurre a utilizar las enzimas producidas por stos en lugar de
las clulas enteras. A la hora de realizar el screening se debe utilizar en el
medio de enriquecimiento como fuente de carbono el sustrato del enzima que
buscamos (Amilasas ----> Almidn; Celulasas ----> Celulosa).

TEMA 4: MANTENIMIENTO Y
CONSERVACION DE
MICROORGANISMOS INDUSTRIALES
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

I. OBJETIVOS
En cualquier laboratorio de microbiologa es fundamental el mantenimiento y
conservacin de las colecciones de microorganismos con las que trabajamos
ya que, obviamente, son nuestro reactivo primordial. Existen una gran
variedad de mtodos de mantenimiento y conservacin de los
microorganismos cuya utilizacin va a depender en parte del tiempo previsto
(Mantenimiento ---->Cortos perodos de tiempo, das; Conservacin ---->
Largos perodos de tiempo, aos) y en parte de las caractersticas de los

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diferentes microorganismos (bacterias, hongos, virus, algas, protozoos).


Los objetivos de las colecciones de los microorganismos son muy simples:
1.- Mantener los cultivos viables a lo largo del tiempo.
2.- Mantener los cultivos puros, sin contaminaciones.
3.- Mantener los cultivos sin cambios en sus caractersticas, es decir estables.

II. TECNICAS DE MANTENIMIENTO Y


CONSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS
1.- Subcultivo seriado
Consiste en resembrar el microorganismo cada cierto tiempo en un medio
adecuado; generalmente se utiliza agar inclinado ya que en medio slido se
detectan mejor los contaminantes que en medio lquido y el hacerlo inclinado
tiene por objeto el evitar la desecacin rpida del medio.
Este mtodo es vlido para cortos perodos de tiempo (semana - 15 das) por
lo que deben ser resembrados con frecuencia lo que incrementa el riesgo de
contaminacin. Adems, al mantenerlos a temperatura ambiente, pueden
crecer y espontneamente cambiar sus caractersticas genticas (mutacin,
prdida de plsmidos, etc.) que pueden afectar al carcter por el que fueron
seleccionados. Estos dos inconvenientes pueden subsanarse en parte
enlenteciendo el metabolismo de los microorganismos al mantenerlos a 4C
con lo que su crecimiento es inferior y la necesidad de hacer subcultivos se
prolonga a 1 - 3 meses. En microbiologa industrial hay que pensar en
mantener las colecciones durante perodos de aos y no de meses, por lo tanto
se utilizan otras tcnicas que nos ahorran trabajo y disminuyen los riesgos.

2.- Desecacin
La eliminacin del agua (deshidratacin) es un mtodo de conservacin que
reduce drsticamente el metabolismo. Sin embargo, no todos los
microorganismos sobreviven a estos mtodos de secado, por lo que se hace

22

necesario aadir agentes protectores (leche descremada, glutamato sdico al


10%). Una vez secos es importante mantener el producto sellado (tapn de
rosca, ampolla) para evitar el contacto con el aire ya que son higroscpicos.
Los soportes que se suelen utilizar son arena, suelo, slica gel previamente
secados y esterilizados por calentamiento con aire caliente (no utilizar
autoclave y s calor seco). Sobre estos soportes se aade la suspensin de los
microorganismos y se deja secar a temperatura ambiente. Tambin se pueden
utilizar como soportes discos o tiras de papel, agar , discos de gelatina donde
se aade la suspensin de microorganismos y posteriormente se seca al vaco
evitando la congelacin, lo que se denomina L-secado (L-drying).
Estos mtodos de secado son particularmente tiles para conservar
microorganismos productores de esporas, p.j. actinomicetos.

3.- Congelacin
Al bajar la temperatura hasta el punto de congelacin o por debajo de ste se
reduce el metabolismo drsticamente hasta el caso de prcticamente anularlo
con nitrgeno lquido (-196C).
Sin embargo, existen una serie de problemas que debemos tener en cuenta. La
formacin de cristales de hielo pueden romper las clulas, adems al eliminar
el agua lquida por convertirse en hielo existe una concentracin de sales que
puede ser perjudicial. Para evitar estos problemas se deben utilizar
suspensiones que contengan el mnimo de sales posibles as como utilizar
agentes protectores como el glicerol (25%) o dimetilsulfxido (DMSO c.a.
10%) que neutralizan el efecto de las sales. El realizar el proceso de
congelacin de una forma rpida o gradualmente no est claro. Algunos
recomiendan una bajada gradual (1C/min) hasta -20C para posteriormente
enfriar rpidamente. Sin embargo, la descongelacin debe ser rpida.
Las distintas temperaturas que se utilizan para la conservacin de los
microorganismos por congelacin son:
-30C: congelador de frigorfico. No se recomienda debido a la formacin de
eutcticos (suspensin con distintos puntos de congelacin debido a los
solutos que pueden daar a las clulas).
-70C: nieve carbnica (CO2 slido) o ultracongeladores. Es el mtodo ms
utilizado en los laboratorios de microbiologa.
-196C: nitrgeno lquido. Se utiliza para la conservacin de bacterias, virus y
lneas celulares. Existen varios problemas prcticos: el nitrgeno se evapora

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continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se deben utilizar


recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estn bien cerrados para
evitar la entrada de nitrgeno lquido.

4.- Liofilizacin
Es el mtodo ms utilizado por las colecciones internacionales de cultivos tipo
para la conservacin de los microorganismos. Bsicamente consiste en
congelar rpidamente una suspensin de microorganismos y eliminar el agua
como vapor de agua directamente del hielo sin pasar por el estado intermedio
lquido. Por lo tanto, combina las dos tcnicas anteriormente citadas ya que es
una desecacin por sublimacin. El sistema requiere tres componentes:
mecanismo de congelacin, bomba de vaco y una trampa de agua.
Los lifilos se conservan entre 0 y 5C durante muchos aos. Para su
recuperacin se resuspende el lifilo en el medio de cultivo adecuado y se
incuban a la temperatura adecuada. No obstante, hay que estudiar, como en los
casos anteriores (desecacin y congelacin), las condiciones ptimas de
supervivencia de nuestro microorganismo.

III. CONSERVACION DE DIFERENTES GRUPOS DE


MICROORGANISMOS
Debido a la gran variedad que presentan los microorganismos no existe
ningn mtodo ptimo para todos e incluso para un grupo particular de
microorganismos ya que lo que funciona bien para algunos no es til para
otros. No obstante, en lneas generales podemos asumir lo siguiente:

1.- Algas y cianobacterias


La mayor parte de los cultivos se han mantenido como subcultivos seriados a
temperaturas entre 10 y 15C. Para crecer estos cultivos se necesita luz
(fotosintticos). Algunas cianobacterias pueden conservarse bien desecadas ya
que presentan formas de resistencia (akinetos). En general, las algas no
aguantan bien la liofilizacin ni la desecacin. En cuanto a la congelacin los
mejores resultados se obtienen con nitrgeno lquido.

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2.- Bacterias
Prcticamente se han usado todos los mtodos conocidos con buenos y malos
resultados, aunque en lneas generales el mejor mtodo es la liofilizacin
debido a su facilidad de transporte.

3.- Virus
Se han utilizado todos los mtodos obteniendo en lneas generales baja
supervivencia. Se recomienda para su conservacin durante largos perodos de
tiempo el nitrgeno lquido.

4.- Hongos
La mayora de los hongos pueden conservarse por desecacin en suelo.
Aunque, al igual que las bacterias, presentan una gran diversidad
encontrndonos de todo.

TEMA 5: NUTRICION DE LOS


MICROORGANISMOS
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

I. OBJETIVOS
El crecimiento de los microorganismos, su multiplicacin, implica que
necesitan duplicar su material celular. Las clulas utilizan elementos qumicos
que provienen del medio ambiente para transformarlos en los constituyentes
caractersticos que componen dicha clula. Estos compuestos qumicos se
llaman nutrientes y el proceso por el cual una clula transforma estos

25

nutrientes en sus componentes celulares se denomina anabolismo o


biosntesis.
Cuando los microorganismos se separan de su hbitat (donde adquieren los
nutrientes) y se cultivan en laboratorio o industrias, se deben usar medios de
cultivo que contengan los elementos qumicos necesarios para su crecimiento.
Los nutrientes que requiere una clula para su crecimiento (duplicacin)
vendrn determinados por la composicin de la clula, que atendiendo a sus
necesidades se clasifican en cuatro grupos:
Macronutrientes: Carbono, Hidrgeno, Oxgeno, Nitrgeno.
Micronutrientes (c.a. 200 mg/L): Fsforo, Potasio, Azufre, Magnesio
Vitaminas y hormonas
Elementos traza (c.a. 25 mg/L): Zinc, Cobre, Manganeso, Molibdeno,
Cobalto
Por lo tanto, los medios utilizados en el cultivo de los microorganismos
contienen todos los elementos en una forma adecuada para la sntesis del
material celular y para la produccin de productos metablicos. En la
investigacin con microorganismos en un laboratorio pueden utilizarse
productos qumicos definidos puros para la obtencin de medios de cultivo,
pero en las fermentaciones industriales se utilizan frecuentemente, por
motivos econmicos, sustratos complejos casi indefinibles. En muchos casos
los ingredientes de los medios son subproductos de otras industrias siendo
extremadamente variados en su composicin.
La composicin de los medios de cultivo debe ser constantemente adaptada al
proceso de fermentacin. Los lotes nuevos de los sustratos tienen que ser
evaluados cuidadosamente en fermentaciones de prueba, antes de que puedan
ser utilizados en la produccin. Adems de los costes del material y del
rendimiento de producto, debe considerarse si los materiales utilizados estn
fcilmente disponibles en cantidad suficiente sin altos costes de transporte y si
las impurezas dificultarn la recuperacin del producto o aumentarn los
costes de recuperacin del producto.

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II. MATERIAS PRIMAS EMPLEADAS EN LAS


FERMENTACIONES INDUSTRIALES
1.- Fuentes de Carbono
Los carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de carbono utilizadas en la
industria de la fermentacin. Por razones econmicas la glucosa o la sacarosa
puras rara vez son utilizadas como nica fuente de carbono, excepto en los
procesos que exigen un control exacto de la fermentacin.
Las melazas, un subproducto de la produccin del azcar, es una de las
fuentes ms baratas de carbohidrato. Adems de una gran cantidad de azcar,
las melazas contienen sustancias nitrogenadas, vitaminas y elementos traza.
Sin embargo, la composicin de las melazas vara dependiendo de la materia
prima utilizada para la produccin de azcar (caa o remolacha) y la calidad
de las melazas depende de la localidad, condiciones climticas y proceso de
produccin.
El extracto de malta, un extracto acuoso de la cebada malteada (cebada
germinada que produce enzimas que hidrolizan el almidn), es un sustrato
excelente para muchos hongos filamentosos, levaduras y actinomicetos. El
extracto seco de malta contiene aproximadamente 90-92% de carbohidratos y
est compuesto de hexosas (glucosa y fructosa), disacridos (maltosa,
sacarosa), trisacridos (maltotriosa) y dextrinas (polmeros de glucosa 1,4
con ramificaciones 1,6). Las sustancias nitrogenadas presentes en el
extracto de malta incluyen protenas, pptidos, aminocidos, purinas,
pirimidinas y vitaminas. Los medios de cultivo que contienen extracto de
malta deben ser esterilizados cuidadosamente. Cuando existe
sobrecalentamiento se produce la reaccin de Maillard debido al bajo pH y a
la alta proporcin de azcares reductores. En esta conversin los grupos
aminos de las aminas, aminocidos (especialmente lisina) o las protenas
reaccionan con los grupos carbonilo de los azcares reductores, aldehidos y
cetonas, lo que resulta en la formacin de productos de condensacin de color
tostado. Estos productos de reaccin no son sustratos adecuados para los
microorganismos.
Debido a su amplia disponibilidad y bajo coste, la celulosa est siendo
extensamente estudiada como sustrato de fermentacin. La produccin anual
de celulosa se estima en 1011 toneladas; la mayor parte de ella existe como
residuos en formas tales como paja, residuos de las mazorcas, desechos de la
madera y residuos de papel. Frecuentemente no es posible utilizar la celulosa
directamente como fuente de carbono, de forma que ha de ser hidrolizada
primero qumica o enzimticamente.

27

Los aceites vegetales como el aceite de soja, el aceite de algodn y el aceite de


palma son utilizados principalmente como cosustratos, siendo aadidos al
medio en el que los carbohidratos proporcionan la principal fuente de energa.

2.- Fuentes de Nitrgeno


Una fuente de nitrgeno que es metabolizada eficientemente es el lquido de
maceracin del maiz, que se forma durante la produccin de almidn a partir
de maiz. Este lquido contiene numerosos aminocidos como alanina,
arginina, cido glutmico, isoleucina, treonina, valina, fenilalanina, metionina
y cistena.
Los extractos de levadura son excelentes sustratos para muchos
microorganismos. Son producidos a partir de la levadura de panadera
mediante autolisis a 50-55C o mediante plasmolisis en presencia de altas
concentraciones de NaCl. El extracto de levadura contiene aminocidos,
pptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. La composicin del
extracto vara de un lote a otro, parcialmente debido a que los sustratos
utilizados para el cultivo de las levaduras afectan a la calidad del extracto de
levadura obtenido.
Las peptonas (hidrolizados de protenas) pueden ser utilizadas por muchos
microorganismos pero son relativamente caras para la aplicacin industrial.
Las fuentes de peptonas incluyen la carne, casena, gelatina, queratina,
semillas de cacahuete, harina de soja, semillas de algodn y semillas de
girasol. La composicin de las peptonas vara dependiendo de su origen. El
producto final est tambin influido por el tipo de hidrlisis (cida o
enzimtica) especialmente en relacin a su contenido en triptfano.

TEMA 6: MECANISMOS

28

REGULADORES Y FERMENTACIONES
INDUSTRIALES
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

I. REGULACION Y COORDINACION DEL


METABOLISMO MICROBIANO
Un microorganismo que est creciendo rompe molculas de alto peso
molecular (almidn) introduciendo en la clula estos derivados ms pequeos
(glucosa, 6C) donde los degrada a molculas ms pequeas (piruvato, 3C)
convirtindolas en amino cidos, nucletidos, vitaminas, carbohidratos y
cidos grasos para finalmente construir a partir de estos materiales bsicos
protenas, coenzimas, cidos nucleicos, mucopptidos, polisacridos y lpidos.
Todo este proceso implica que cientos de enzimas deben de producirse y
actuar de una manera coordinada para evitar el caos. Alrededor de unas 500
reacciones metablicas comunes se conectan con la va glucoltica y con el
ciclo del cido ctrico. Cada reaccin requiere un enzima determinado, el cual,
a su vez, es el producto de toda una serie de reacciones de transferencia de
informacin y de sntesis proteica.
Para realizar todo esto, las clulas poseen una elaborada red de mecanismos
de control que regulan las reacciones qumicas, permitindoles competir
eficientemente con otras formas de vida para poder sobrevivir en la
Naturaleza. Por lo tanto, una clula ideal no tiene produccin excesiva de
metabolitos ya que una buena regulacin es una ventaja evolutiva; pero por
otra parte las clulas no pueden renunciar a una cierta adaptabilidad que les
permita subsistir en ecosistemas diferentes. Esto ha permitido que existan
microorganismos mal regulados en determinados aspectos y que por lo tanto
produzcan en demasa determinados metabolitos. Estos son los
microorganismos que nos interesan. Pero adems, podemos provocar que un
microorganismo bien regulado produzca un determinado compuesto alterando
sus mecanismos reguladores. Por lo tanto, es esencial para la microbiologa
industrial el conocimiento de los mecanismos reguladores que a continuacin
se describen.

29

II. INDUCCION
Entre la enorme cantidad de enzimas que un microorganismo es capaz de
producir existen algunos que siempre estn presentes. Son los llamados
enzimas constitutivos. Pero tambin existen otros que o bien no estn
presentes o bien lo estn en cantidades mnimas y que ante la presencia de una
sustancia, que suele ser su sustrato, la clula aumenta enormemente su
cantidad. estos son los denominados enzimas inducibles y la sustancia que
incrementa la sntesis de novo de estos enzimas se llama inductor. Muchos
enzimas catablicos, donde se encuentran la mayor parte de los industriales,
son inducibles. A esta forma de regulacin de la expresin de genes, slo
cuando el apropiado sustrato del enzima est presente, se llama induccin.
El mecanismo a travs del cual las protenas represoras de la expresin gnica
controlan la transcripcin gnica en los procariotas comienza cuando la
protena represora y el enzima RNA polimerasa se unen fuertemente a
diferentes secuencias especficas de nucletidos del DNA, que reciben el
nombre de regin operadora y regin promotora. Si est presente la protena
represora, la RNA polimerasa no puede actuar, no producindose la
transcripcin. Si no est presente la protena represora, la RNA polimerasa se
une, producindose la transcripcin. Esta protena represora reconoce un
ligando especfico y esta unin activa la transcripcin al disminuir la afinidad
de la protena represora por su secuencia de DNA especfica. Este caso de
regulacin en el que el gen en condiciones normales est reprimido se llama
induccin negativa.
Una alternativa de la regulacin negativa, es la regulacin por medio de
protenas activadoras de la expresin gnica. En este caso la protena facilita
la unin de la RNA polimerasa. Al igual que las protenas represoras, stas
protenas activadoras se unen a ligandos especficos (inductor) pero en este
caso se incrementa la afinidad de la protena activadora por el DNA con lo que
se activa la transcripcin. Si la protena activadora se halla presente, la RNA
polimerasa se une y tiene lugar la transcripcin. Si por el contrario la protena
activadora no se halla presente, la RNA polimerasa no puede unirse no
teniendo lugar la transcripcin. Este tipo de control gnico recibe el nombre
de induccin positiva.
A modo de ejemplo veamos que ocurre en Escherichia coli en la sntesis de
los enzimas que hidrolizan la lactosa en glucosa y galactosa. Cuando la
protena represora est unida a la secuencia del operador, bloquea el acceso de
la RNA polimerasa a su regin de unin (promotor) impidiendo la

30

transcripcin. Cuando existe lactosa en la clula, sta se une a la protena


represora eliminndola del DNA y con ello permitiendo la unin de la RNA
polimerasa, activando la transcripcin. En este caso la lactosa es un inductor
natural del opern Lac de Escherichia coli. Sin embargo, el mejor inductor del
opern Lac es el isopropil -D-galactsido. Por lo tanto, podremos manipular,
a nivel de sntesis, la produccin de un enzima bien sea introduciendo
inductores autnticos o anlogos. Tambin se puede manipular por mutacin
del gen regulador (el que codifica para la protena represora) inactivando la
protena represora, o bien por mutacin del operador con lo que la protena
represora no presentar afinidad por l.

III. REGULACION CATABOLICA


Supongamos a la bacteria Escherichia coli creciendo en un medio con varias
fuentes de carbono. La bacteria podra sintetizar enzimas para degradar todas
las fuentes de carbono presentes. Esto supondra un enorme derroche de
energa al sintetizar protenas que no son estrictamente necesarias. La bacteria
lo que hace es sintetizar el sistema enzimtico para la utilizacin del mejor
sustrato, reprimindose la sntesis de los otros sistemas enzimticos. La
glucosa fu el primer sustrato estudiado que ocasionaba represin catablica,
por lo que tambin se le llama efecto glucosa, aunque no es el nico sustrato
que produce este efecto.
Slo cuando se agota el primer sustrato se sintetizan enzimas para la
utilizacin del siguiente. La combinacin de la induccin y represin aseguran
una economa celular notable ya que slo se sintetizan los enzimas
indispensables.
Evitando el uso de fuentes de carbono represoras en el medio de cultivo se
puede aumentar la produccin de enzimas sensibles a la represin catablica.
Por ejemplo, usando manosa en el crecimiento de Pseudomonas fluorescens
var. cellulosa se produce 1500 veces ms celulasa que crecindola en
presencia de galactosa.

31

IV. REGULACION POR RETROALIMENTACION


En contraste a las rutas catablicas que suelen estar reguladas por el sustrato
inicial, como ocurre en los dos sistemas de regulacin ya descritos (Induccin
y Regulacin catablica); las rutas anablicas o de biosntesis suelen estar
reguladas por el producto final, como es el caso de la retroalimentacin.
Existen dos tipos fundamentales de regulacin por retroalimentacin:
1.- Inhibicin por retroalimentacin
2.- Represin por retroalimentacin

1.- Inhibicin por retroalimentacin


Es un fenmeno en el cual un metabolito, generalmente el metabolito final de
una secuencia metablica, inhibe la accin de un enzima anterior que,
generalmente, es el primero de la secuencia.
El inhibidor es el producto final y no un derivado en contraste con el sistema
clsico de inhibicin por competicin en el cual el inhibidor se asemeja al
sustrato y compite por el sitio activo del enzima (Inhibidor Isostrico). En la
inhibicin por retroalimentacin el inhibidor (producto final) no se parece ni
en tamao, ni en forma, ni en carga al sustrato por lo que se llama inhibicin
alostrica. Generalmente, los enzimas alostricos estn formados por dos o
ms subunidades, una de las cuales lleva el centro activo (sitio de unin al
sustrato) y la otra el sitio de unin al inhibidor. Cuando el inhibidor se une a
su centro, se distorsiona la conformacin del enzima impidiendo la unin del
enzima a su sustrato.

2.- Represin por retroalimentacin


La represin por retroalimentacin es un fenmeno muy comn que regula la
sntesis de aminocidos y los nucletidos pricos y pirimidnicos. Por
ejemplo, si existe un nivel alto del aminocido triptfano en el medio de
cultivo, el microorganismo no va a gastar energa sintetizando los enzimas
implicados en la biosntesis de triptfano. Esta regulacin se lleva a cabo
mediante el producto final, en este caso triptfano, que impide que los genes
que codifican para esos enzimas no se transcriban en RNA mensajero.

32

En Escherichia coli el opern trp est formado por un promotor, un operador


y cinco genes que codifican para los enzimas implicados en la sntesis de
triptfano. El gen regulador codifica para una protena represora inactiva que
no se puede unir al operador por lo que la RNA polimerasa se une al promotor
sintetizndose los enzimas. Por el contrario, si el triptfano est presente y no
se necesita ms, la protena represora se une al triptfano y se convierte en su
forma activa, la cual se une al operador bloqueando la unin de la RNA
polimerasa al promotor e impidiendo la sntesis de los enzimas.

3.- Regulacin por retroalimentacin en rutas ramificadas


Existen tres tipos de regulacin por retroalimentacin en rutas ramificadas:
a) Isoenzimas o Diferencial
b) Concertado
c) Acumulativo
En la regulacin diferencial varios enzimas diferentes (denominados
isoenzimas) catalizan la reaccin inicial estando cada uno de ellos inhibido
por un producto distinto.
En la regulacin concertada distintos productos se unen para inhibir un nico
enzima.
En la regulacin acumulativa distintos productos inhiben en distinta
proporcin a un nico enzima.
A la hora de utilizar un microorganismo a nivel industrial, el ms fcil de
desregular sera el concertado, por lo que se tiende a usar aquellos
microorganismos que utilizan este sistema, como es el caso de
Corynebacterium glutamicum para la produccin de lisina (aminocido
deficitario en vegetales).

V. REGULACION DE LA SINTESIS DE RNA POR


AMINOACIDOS

33

La mayor parte de los ejemplos de regulacin vistos hasta ahora responden a


condiciones nutricionales especficas tales como la presencia de un disacrido
o la ausencia de un aminocido en el medio. Hace ms de 20 aos se
descubri en Escherichia coli un "control global" al observar que cuando se
transferan las clulas de un medio rico a un medio pobre se paraba la sntesis
de RNA disminuyendo la sntesis de protenas. Esta observacin indica que las
clulas bacterianas pueden regular la sntesis de RNA en los casos de crisis
metablica.
Actualmente se sabe que la sntesis de rRNA y tRNA cesan bajo esas
condiciones, cuando se acumulan dos guaninas polifosfatos (ppGpp y
pppGpp) las cuales son sintetizadas por un enzima llamado Rel A. Cuando
falta un aminocido, en la sntesis de protenas el correspondiente tRNA se
encuentra en el ribosoma sin su grupo aminoacil, lo que provoca que la
protena Rel A sintetice pppGpp a partir de GTP (que se utiliza como fuente
de energa en muchos pasos de la sntesis proteica). Este pppGpp por medio
de una pirofosforilasa llamada Gpp lo convierte en ppGpp que a su vez inhibe
la sntesis de rRNA y tRNA permitiendo nicamente la sntesis de
aminocidos. Cuando existen niveles aceptables de aminocidos, el ppGpp
por medio de una 3' fosforilasa llamada Spo T se convierte en el intermediario
normal GDP. El mecanismo por el cual se activan unos mRNA (los
implicados en la sntesis de aminocidos) y otros se inhiben no se conoce de
momento. Este mecanismo, preciso y rpido, protege a la bacteria de un
crecimiento deficiente.

VI. REGULACION POR EL ESTADO O CARGA


ENERGETICA
Existe una ecuacin emprica mediante la cual se puede determinar el estado
energtico de una clula:

[ATP] + 1/2 [ADP]


E = --------------------------------[ATP] + [ADP] + [AMP]

34

Cuando el valor de E es alto indica que no hay biosntesis; por el contrario,


cuando el valor de E es bajo indica que hay biosntesis puesto que se est
consumiendo ATP.
Se ha comprobado que una clula en fase logartmica de crecimiento,
metabolismo primario, presenta un valor de E = 0,5. Sin embargo, en fase
estacionaria tiene un valor de E = 0,8. En fase estacionaria cambia
drsticamente el metabolismo celular pasando al secundario. Los motivos por
los cuales ocurren estos cambios no se conocen, aunque deben ser mltiples
debido al gran nmero de reacciones metablicas donde actan el ATP, ADP y
AMP.

VI. REGULACION POR CONTROL DE LA


PERMEABILIDAD
La membrana citoplasmtica controla el paso de los nutrientes al interior de la
clula, as como hacia el exterior de la clula. Existen cuatro mecanismos que
regulan el transporte de nutrientes.

1.- Difusin pasiva


Molculas de H2O y algunos nutrientes liposolubles pasan libremente a travs
de la membrana hasta equilibrar concentraciones. No hay consumo de energa.

2.- Difusin facilitada


Los nutrientes se unen a una protena transportadora para atravesar la
membrana pasando de mayor a menor concentracin. No hay consumo de
energa.

3.- Transporte activo


La mayor parte de los nutrientes son transportados mediante este mecanismo.
Este proceso permite concentrar, en el interior celular, altos niveles de
nutrientes necesarios para las actividades metablicas. Hay consumo de
energa. El ATP distorsiona el sitio de unin a la protena transportadora

35

dificultando a la molcula la salida de la clula.

4.- Transporte por translocacin de grupo


En este tipo la protena transportadora es un enzima que aade un grupo
fosfato del cido fosfoenolpirvico al nutriente durante el transporte. Este
nutriente alterado ya no es capaz de unirse a la protena transportadora por lo
que se acumula dentro de la clula.

TEMA 7: PRODUCCION INDUSTRIAL


DE METABOLITOS PRIMARIOS
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

I. METABOLITOS PRIMARIOS DE INTERES


INDUSTRIAL
Los metabolitos primarios son molculas de bajo peso molecular que
intervienen, bien como productos finales o intermediarios, en las distintas
rutas anablicas y catablicas. Los ms importantes desde el punto de vista
industrial son los aminocidos, nucletidos, vitaminas, cidos orgnicos y
alcoholes.
Alcoholes: etanol
Aminocidos: cido glutmico, lisina, treonina

36

Nucletidos: cido 5' guanlico, cido 5' inosnico


Acidos orgnicos: cido actico, cido propinico, cido succnico, cido
fumrico, cido lctico, cido mlico, cido tartrico, cido ctrico, cido
glucnico
Polioles: glicerol, manitol
Polisacridos: xantano
Azcares: fructosa, sorbosa
Vitaminas: riboflavina (B2), cianocobalamina (B12)
Como ya hemos dicho, la superproduccin de metabolitos primarios es
evitada por la mayora de los microorganismos, puesto que son procesos que
consumen gran cantidad de energa, lo cual hace que sean menos competitivos
en los ambientes naturales. Sin embargo, existen en la Naturaleza
microorganismos que tienen alterados sus sistemas regulatorios y stos son
precisamente los que a lo largo del proceso de bsqueda son seleccionados
para su utilizacin en microbiologa industrial. Estos cultivos posteriormente
se someten a un profundo estudio mediante el cual, alterando las condiciones
del medio y/o por modificaciones genticas, incrementamos la
superproduccin del producto que nos interesa.
Mediante estas alteraciones se ha conseguido, por ejemplo, que la bacteria
Pseudomonas denitrificans produzca 50.000 veces ms vitamina B12. Las
manipulaciones ms frecuentes son la alteracin de la regulacin por
retroalimentacin y la alteracin de la permeabilidad.

II. ALTERACION DE LA REGULACION POR


RETROALIMENTACION
La regulacin por retroalimentacin es el control que utilizan los
microorganismos para evitar la superproduccin de aminocidos y

37

nucletidos. Para eliminar este control se han empleado dos tipos de


manipulaciones: alteracin de la acumulacin de productos finales y
obtencin de mutantes resistentes a la regulacin por retroalimentacin.

1.- Alteracin de la acumulacin de productos finales

A. Evitar la acumulacin de productos finales


En una ruta metablica sencilla (no ramificada) la limitacin de la capacidad
de la clula para acumular intracelularmente productos finales inhibidores o
represores, se utiliza generalmente para la superproduccin de algn
intermediario de esta ruta metablica. En el siguiente esquema se representa
este principio:
Si nosotros deseamos obtener una superproduccin del producto intermediario
C en una ruta metablica sencilla donde el producto final E por
retroalimentacin inhibe al enzima a y reprime a los enzimas a y b, lo primero
que se hace es obtener un mutante auxtrofo que le falte el enzima c. Al no
poder sintetizar el producto E, este mutante requiere para su crecimiento que
se aada en el medio E. Si se aaden bajos niveles de E, los necesarios para
que el microorganismo crezca, ste microorganismo no podr acumular
concentraciones de E que inhiban o repriman a los enzimas a y b con lo que
ser posible obtener una gran acumulacin de C.
Mediante este tipo de manipulacin se ha conseguido por ejemplo, que un
mutante de Corynebacterium glutamicum auxtrofo en Arginina produzca 26
gramos/litro de L-Ornitina.
B. Acumulacin de productos finales
Se utiliza en rutas metablicas ramificadas. Consideremos una ruta metablica
ramificada que conduce a dos productos finales, A y B. Con frecuencia, si
conseguimos disminuir la concentracin de B, el producto A se acumulara.
El ejemplo ms importante, con inters comercial, de la utilizacin de esta
estrategia es la superproduccin de lisina. Este aminocido se utiliza como
aditivo nutritivo, puesto que la mayora de las protenas de cereales son
deficientes en este aminocido. Pertenece a la familia del aspartato y se
produce en la mayora de las bacterias en una ruta metablica ramificada que
produce adems metionina, treonina e isoleucina.
En Escherichia coli, el primer paso de esta ruta est regido por tres aspartato

38

quinasas, cada una de las cuales est regulada por un producto final diferente
y, adems, cada producto final regula el primer enzima despus de cada
ramificacin.
Sin embargo, en los microorganismos utilizados en la fermentacin para la
produccin de lisina (Corynebacterium glutamicum) existe una nica
aspartato quinasa regulada por un mecanismo concertado de retroalimentacin
por la treonina y lisina. As mismo, tampoco poseen regulacin en la
ramificacin.
Mediante la eliminacin gentica del enzima homoserina deshidrogenasa, se
obtiene un mutante que no puede crecer salvo que se aada en el medio
metionina y treonina. Mientras que los niveles de treonina que se aadan sean
bajos, pero suficientes para el crecimiento del microorganismo, no se
producir una inhibicin por retroalimentacin de la aspartato quinasa, con lo
que estos microorganismos son capaces de producir 50 gramos de L-lisina por
litro.

2.- Mutantes resistentes a la regulacin por


retroalimentacin
Una segunda va para eliminar la regulacin por retroalimentacin y as
obtener una superproduccin de metabolitos primarios es alterando la
estructura del enzima sujeto a la inhibicin o modificando los genes
reguladores de tal manera que el sistema no sea reprimible.
El sistema ms sencillo para aislar estos mutantes es seleccionar las cepas
resistentes a los efectos txicos que produce un anlogo del compuesto que
nos interesa. Para ello se someten a mutacin los microorganismos y,
posteriormente se siembran en placa en presencia del anlogo. Aquellas cepas
que son capaces de crecer y formar colonias son las que se seleccionan.
Algunos de estos mutantes resistentes sern superproductores del metabolito
que nos interesa.
D'
A --------> B --------> C -------->D
Si el anlogo D' inhibe la sntesis de D, el microorganismo no puede producir
este metabolito y muere. Por el contrario, si D' no inhibe la sntesis de D, el
microorganismo seguir produciendo D y sobrevivir. En este caso puede
haber ocurrido una alteracin en la estructura del enzima, con lo que
obtenemos mutantes resistentes a la inhibicin por retroalimentacin. O bien,

39

puede haber ocurrido una alteracin en el sistema de sntesis del enzima, con
lo que obtenemos mutantes resistentes a la represin por retroalimentacin. En
cualquier caso y debido a la alteracin de estos controles, el microorganismo
superproduce D.

III. ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD


El incremento de la permeabilidad de la membrana citoplasmtica es el
responsable de la superproduccin de cido glutmico, que es con diferencia
el aminocido ms importante de los producidos por fermentacin. Se utiliza
en forma de glutamato monosdico como potenciador de aromas.
Todos los microorganismos superproductores de glutamato tienen dos
caractersticas comunes:
(i) Una deficiencia en el enzima -cetoglutarato deshidrogenasa.
(ii) Requerimiento nutricional de biotina.

La deficiencia del enzima del ciclo de Krebs canaliza el metabolismo del


carbono hacia glutamato; mientras que la deficiencia en el bloque biosinttico
de la biotina da lugar a una alteracin de la permeabilidad de la membrana lo
que permite la excrecin del glutamato producido.
La principal ruta en la produccin de glutamato a partir de glucosa es la ruta
de Embden-Meyerhof y los primeros pasos del ciclo de los cidos
tricarboxlicos. El -cetoglutarato, el cual normalmente se convierte en
succinil CoA en el ciclo, es aminado por accin de la glutamato
deshidrogenasa y se transforma en glutamato debido a la deficiencia en la cetoglutarato deshidrogenasa. De esta manera se pueden llegar a conseguir
100 gramos por litro de glutamato.
Durante el crecimiento con glucosa, los microorganismos superproductores
acumulan intracelularmente glutamato, hasta que la clula es saturada (c.a. 50
mg/g de peso seco). Entonces, y por medio de la regulacin por
retroalimentacin, se bloquea la sntesis de glutamato salvo que se modifique
la permeabilidad y as se facilite la salida del aminocido al exterior de la

40

clula. Esta modificacin de la permeabilidad se consigue mediante una


deficiencia en el bloque biosinttico de la biotina. Una deficiencia en biotina
origina cambios en la composicin lipdica de la membrana debido al papel
que desempea la biotina en la sntesis de cidos grasos. Los niveles de
biotina que se deben aadir al medio son crticos a la hora de obtener una
buena produccin de glutamato. Las concentraciones que se usan estn entre 1
y 5 g/L de biotina. Una concentracin de 15 g/L elimina la excrecin de
glutamato, con lo que se acumulara en la clula.
Esta modificacin de la permeabilidad tambin se puede alterar aadiendo
penicilina durante la fase logartmica de crecimiento. Aunque la penicilina no
inhibe la sntesis de fosfolpidos, su adicin resulta en una inmediata
excrecin de fosfolpidos. Otra forma de alterar la permeabilidad de la
membrana es aadiendo detergentes.

TEMA 8: PRODUCCION INDUSTRIAL


DE METABOLITOS SECUNDARIOS
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

I. METABOLITOS SECUNDARIOS DE INTERES


INDUSTRIAL
Los metabolitos secundarios son molculas sintetizadas por determinados
microorganismos, normalmente en una fase tarda de su ciclo de crecimiento,
cuyas caractersticas son:

41

(i) No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce.
En estado natural, sus funciones se hallan ordenadas a la supervivencia de la
especie, pero cuando los microorganismos que los producen se desarrollan en
cultivo puro los metabolitos secundarios no desempean esa misin.
(ii) Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados
qumicamente entre s. Por ejemplo, una nica cepa de una especie del gnero
Streptomyces produce 32 antraciclinas diferentes.
(iii) Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de
organismos.
(iv) La produccin puede perderse fcilmente por mutacin espontnea
(degeneracin de la raza), por lo que son muy importantes las tcnicas de
conservacin de estos microorganismos.
De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentacin, los ms
importantes para la salud humana son los metabolitos secundarios. Donde se
incluyen, adems de los antibiticos, ciertas toxinas (micotoxinas), alcaloides
(cido lisrgico), factores de crecimiento vegetal (giberelinas) y pigmentos.
Los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibiticos, de los que
se han descubierto ms de 5000, cifra que aumenta a razn de una media
aproximada de 300 por ao, aunque la mayora carecen de utilidad pues son
txicos para los organismos vivos. Aproximadamente el 75% de los
antibiticos conocidos son producidos por actinomicetos. Algunas especies
son excepcionales productores de antibiticos, por ejemplo Streptomyces
gryseus produce al menos 40 antibiticos diferentes.

II. RELACIONES ENTRE TROFOFASE - IDIOFASE


En el metabolismo secundario las fases de crecimiento se denominan
trofofase, fase de crecimiento logartmico donde normalmente no se producen
los metabolitos secundarios, e idiofase, fase estacionaria donde normalmente
se producen los metabolitos secundarios. Aunque es una simplificacin pensar
slo en dos fases, esta simplificacin nos permite comprender mejor la
fermentaccin industrial de los metabolitos secundarios. Es decir, si nosotros
queremos producir un metabolito secundario primero debemos asegurar las
condiciones apropiadas durante la trofofase para un buen crecimiento y

42

despus, debemos alterar esas condiciones en el momento adecuado para


asegurar una excelente produccin del metabolito secundario.
Este retraso en la formacin de metabolitos secundarios es uno de los
principales mecanismos mediante el cual los microorganismos productores de
antibiticos evitan el suicidio, puesto que al comienzo de la fase logartmica
de crecimiento son sensibles a su propio antibitico, para posteriormente,
durante la idiofase, volverse resistentes al antibitico que estn produciendo.
Los factores que ponen en marcha la produccin de metabolitos secundarios al
final de la trofofase no se conocen; nicamente se sabe que este mecanismo se
dispara normalmente cuando algn nutriente del medio se ha agotado. En
algunas ocasiones el nutriente responsable es una fuente de Carbono, en otras,
sin embargo es el Nitrgeno o el Fsforo. La explicacin puede ser que al
faltar nutrientes se alteren los metabolitos primarios y se originen inductores
de los enzimas encargados de la sntesis de los metabolitos secundarios. Otra
explicacin puede ser que al faltar la fuente de Carbono cesa la represin por
catabolito, sintetizndose a partir de este momento los enzimas necesarios
para la biosntesis de estos metabolitos secundarios.
Cualquiera que sea el mecanismo general por el que se dispara el metabolismo
secundario al final de la trofofase, es un hecho que en este punto hay unos
cambios muy fuertes en la composicin enzimtica de las clulas, apareciendo
los enzimas que estn especficamente relacionados con la formacin de
metabolitos secundarios. Sin embargo, e independientemente de este aspecto
general del metabolismo secundario, se ha puesto de manifiesto la existencia
de sistemas de regulacin que juegan un papel importante en la sntesis de
determinados productos industriales.

III. EFECTO DE LOS PRECURSORES


Las manipulaciones, tanto del medio de cultivo como de las condiciones
ambientales que se llevan a cabo durante el screening secundario de una forma
sistemtica, incluyen la adicin de centenares de aditivos en los medios de
cultivo que puedan actuar como posibles precursores del producto que
estamos investigando. Ocasionalmente se encuentra un precursor que
incrementa de forma notable la produccin de este metabolito secundario. El
precursor puede incluso dirigir la sntesis de un determinado producto de entre
varios que se producan anteriormente; es lo que se conoce como biosntesis
dirigida.

43

Como ejemplos de precursores estn el cido fenilactico en el caso de la


produccin de bencil penicilina; determinados aminocidos especficos en la
produccin de actinomicinas y tirociclinas; cidos benzoicos sustituidos en la
formacin de novobiocinas.
En muchas fermentaciones, sin embargo, los precursores no muestran ninguna
actividad. Esto es debido a que su sntesis por el microorganismo no es el
factor limitante de la produccin del metabolito secundario. En estos casos, la
adicin de aditivos ha revelado efectos dramticos, tanto estimuladores como
inhibidores en la produccin del metabolito secundario por parte de una
molcula no precursora. Este efecto se debe normalmente a la interaccin de
estos compuestos con los mecanismos reguladores del microorganismo
productor. Precisamente, estudiando estos efectos se puso de manifiesto que
los mecanismos reguladores de los microorganismos ejercen un efecto notable
en la produccin de los metabolitos secundarios.

IV. INDUCCION ENZIMATICA


A lo largo de los estudios sobre el papel que el triptfano juega como
estimulador de la biosntesis de alcaloides por Claviceps (Cornezuelo del
centeno) se puso de manifiesto que la induccin enzimtica juega un papel
importante en la produccin de metabolitos secundarios.
Si bien el triptfano es un precursor en la biosntesis de estos alcaloides, no es
un factor limitante; ya que su efecto estimulador se debe en gran parte a la
induccin de la sntesis de los enzimas que dan lugar a la sntesis de los
alcaloides. Existen tres razones que han llevado a esta conclusin:
(i) Los anlogos del triptfano, que no se incorporan a la molcula del
alcaloide, es decir, que no son precursores, estimulan la produccin de los
alcaloides.
(ii) El triptfano se debe aadir durante la trofofase ya que si se aade durante
la idiofase tiene poco efecto.
(iii) El triptfano aadido es absorbido por la clula durante la fase de
crecimiento y alcanza su mayor concentracin intracelular justo antes de la
sntesis de los alcaloides.

44

Otro efecto de induccin similar es el de la metionina en la biosntesis de


cefalosporina por Cephalosporium acremonium. A pesar de que la metionina
provee azufre al antibitico, la estimulacin de la formacin de cefalosporina
C se debe a un efecto de induccin. Se lleg a esta conclusin ya que la
metionina debe aadirse durante la trofofase; adems, la metionina puede ser
reemplazada por su anlogo norleucina que no tiene azufre en su molcula,
por lo que su efecto no puede ser debido al hecho de aportar azufre.
La induccin tambin juega un papel muy importante en determinar la
relacin entre los componentes de la mezcla que se produce en una
fermentacin. Por ejemplo, en la fermentacin para la produccin de
estreptomicina se produce estreptomicina y mansido estreptomicina. La
conversin de mansido estreptomicina en estreptomicina se cataliza mediante
el enzima -D-manosidasa que es inducido por manano.

V. REGULACION POR RETROALIMENTACION


La regulacin por retroalimentacin tambin parece jugar un papel
fundamental en el metabolismo secundario. Por ejemplo, el cloranfenicol al
igual que la cicloheximida, penicilina y otros antibiticos limitan su propia
produccin actuando por retroalimentacin generalmente sobre el primer
enzima de la ramificacin que conduce a la sntesis de este metabolito.
Otro caso de regulacin por retroalimentacin sucede cuando la ruta
metablica ramificada, mediante la cual se sintetiza el metabolito secundario,
conduce a su vez a la sntesis de un metabolito primario, como es el caso de la
lisina y la penicilina en Penicillium chrysogenum. En un primer momento se
encontr que la L-lisina disminua la produccin de penicilina, pero no se
saba porqu; hasta que se descubri que el -aminoadipato es un
intermediario en la biosntesis de los dos, lisina y penicilina. La disminucin
en la formacin de penicilina por lisina est causada por la inhibicin por
retroalimentacin de la homocitrato sintasa, que es el primer enzima en la
biosntesis de lisina.
Otro camino mediante el cual acta la regulacin por retroalimentacin en la
formacin de metabolitos secundarios implica la inhibicin y la represin de
las fosfatasas por fosfato. Muchas fermentaciones se inhiben por ortofosfato
(H3PO4) a concentraciones (>10 mM) que no son inhibidoras para el
crecimiento. En algunos casos se explica ya que los intermediarios de la ruta

45

metablica del producto que nos interesa estn fosforilados, aunque el


producto final no lo est. Las fosfatasas actuaran en estos intermediarios.
Un ejemplo lo tenemos en la biosntesis de estreptomicina donde actan varias
fosfatasas en la formacin de estreptidina y en el ltimo paso, desfosforilacin
de la estreptomicina fosfato, donde el enzima que cataliza esta reaccin
tambin est inhibida por el fosfato inorgnico.

VI. REGULACION CATABOLICA


La represin catablica fue observada en la industria de antibiticos mucho
antes de que se conociera y se entendiera el significado general de este
fenmeno. Durante el desarrollo de la produccin de penicilina se observ que
la glucosa, que era una magnfica fuente de carbono para el crecimiento del
microorganismo, era un sustrato muy malo para la produccin de penicilina;
sin embargo, se observ que la lactosa, que soporta un crecimiento muy pobre,
es un buen sustrato para la produccin de penicilina. Por lo tanto, el medio
clsico de Jarvis y Johnson lleva una mezcla de glucosa y lactosa.
Los mecanismos moleculares de la regulacin catablica se esclarecieron en la
dcada de los 70. Hoy sabemos que la regulacin catablica est mediada por
el nivel intracelular de un nucletido especial, el monofosfato cclico de
adenosina (AMPc), cuyo nivel intracelular es inverso a la concentracin de
glucosa en el medio de cultivo. Mientras existe glucosa en el medio de cultivo
el nivel intracelular de AMPc es sumamente reducido, debido a que la glucosa
inhibe la actividad adenilciclasa, enzima que interviene en la sntesis de
AMPc. Cuando la glucosa del medio se agota, la concentracin intracelular de
AMPc aumenta rpidamente. El AMPc sintetizado forma un complejo con una
protena existente en la clula, denominada "protena receptora de AMPc".
Este complejo de protena receptora y AMPc acta sobre el gen promotor al
objeto de inducir la sntesis de los enzimas necesarios para la utilizacin de
otras fuentes de carbono distintas a la glucosa. La glucosa inhibe gran
cantidad de metabolitos secundarios.
La represin catablica tambin juega un papel importante en la
determinacin de la concentracin relativa de cada uno de los antibiticos de
una misma familia qumica que se producen en una fermentacin. Este es el
caso de la produccin de estreptomicina por Streptomyces gryseus. Como ya
hemos dicho, el manano es el inductor de la manosidasa que convierte la
mansido estreptomicina en estreptomicina; sin embargo, este enzima no se

46

sintetiza si hay glucosa (>0,5%) en el medio debido a la represin catablica.


Slo cuando la glucosa ha desaparecido se produce el enzima que es inducido
por manano. En este caso la represin catablica juega un papel fundamental
en el porcentaje de mansido estreptomicina producido en esta fermentacin.

VII. REGULACION POR EL ESTADO O CARGA


ENERGETICA
La produccin de clortetraciclina se reduce en gran cantidad cuando existe
fosfato inorgnico en el medio. En las fermentaciones para la produccin de
clortetraciclina, la idiofase comienza cuando se agota el fosfato en el medio.
Puesto que en la biosntesis de clortetraciclina donde intervienen 72
intermediarios, ninguno de ellos fosforilado, este efecto del fosfato no se debe
a la regulacin por retroalimentacin de fosfatasas. Sin embargo, es posible
que esta regulacin est mediada por la carga energtica ya que el contenido
en ATP de dos cepas de Streptomyces aureofaciens, una poco productora (200
g/mL) y la otra muy productora (2000 g/mL) de clortetraciclina, difieren en
que la cepa menos productora tiene de 2 a 4 veces ms ATP que la ms
productora. En ambas cepas la concentracin de ATP aumenta en la trofofase
y disminuye en la idiofase, durante la produccin de clortetraciclina.

VIII. INCREMENTO DE LA PRODUCCION DE


METABOLITOS SECUNDARIOS
La mayora de los controles descritos en este captulo se eliminan mediante
manipulacin ambiental o mediante la obtencin de mutantes mal regulados.

1.- Manipulacin ambiental


Catabolito: eliminacin de la glucosa del medio.
Induccin: adicin de manano al medio.

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Carga energtica: disminucin de fosfato en el medio.


Precursores: adicin de precursores al medio.

2.- Seleccin de mutantes mal regulados


A. Revertientes
La estrategia consiste primeramente en seleccionar las mejores cepas
productoras del antibitico. Estas cepas se someten a mutacin con un agente
mutgeno (UV, luz ultravioleta o NTG, nitrosoguanidina). De los mutantes
obtenidos se seleccionan aquellos que no sean productores del antibitico (se
seleccionan aquellas cepas que poseen una protena inactiva). Estos mutantes
se vuelven a someter a mutacin y se seleccionan aquellas cepas que sean de
nuevo productoras del antibitico (se obtienen mutantes dobles desregulados
en un gen en el que acta esa protena inactiva).
B. Resistencia a anlogos
La estrategia es la misma que la descrita con los metabolitos primarios.
C. Mutasntesis
Se realiza mediante la mutacin en el gen que codifica para un precursor del
antibitico natural, con lo que se consigue la sntesis de una molcula de
antibitico incompleta. Cuando se aade al medio el precursor que no puede
sintetizar el microorganismo, ste reanuda la produccin del antibitico
natural. De esta manera se pueden obtener nuevos antibiticos simplemente
aadiendo precursores con estructuras ligeramente diferentes.

Programa

PROGRAMA DE BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA INDUSTRIALES

48

LICENCIATURA EN BIOQUIMICA
UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

Programa de Clases Tericas

I.- Introducci
01.- Concepto, desarrollo histrico y futuro de la Microbiologa Industrial.
(PRESENTACIN)

II.- Material Biolgico


02.- Microorganismos de inters industrial. (PRESENTACIN)
03.- Aislamiento y seleccin de microorganismos de inters industrial.
(PRESENTACIN)
04.- Conservacin y mantenimiento de los microorganismos industriales.
(PRESENTACIN)
05.- Nutricin de los microorganismos. (PRESENTACIN)
06.- Mecanismos reguladores y fermentaciones industriales. (PRESENTACIN)
07.- Produccin industrial de metabolitos primarios. (PRESENTACIN)
08.- Produccin industrial de metabolitos secundarios. (PRESENTACIN)

III.- Desarrollo de Cepas


Mutacin.

49

Recombinacin gentica.
Tecnologa del ADN recombinante "in vitro".

IV.- Tecnologa de las Fermentaciones


09.- Esterilizacin industrial. (PRESENTACIN)
10.- Preparacin y propagacin de inculos (PRESENTACIN)
11.- Procesos fermentativos. (PRESENTACIN)
12.- Recuperacin de los productos finales. (PRESENTACIN)

V.- Microbiologa Industrial en Biomedicina


13.- Produccin de antibiticos. (PRESENTACIN)
14.- Produccin de vacunas. (PRESENTACIN)
15.- Produccin de hormonas esteroideas. (PRESENTACIN)
16.- Produccin de vitaminas. (PRESENTACIN)
17.- Produccin de protenas humanas recombinantes. (PRESENTACIN)

VI.- Microbiologa Industrial en Alimentacin


18.- Produccin industrial de bebidas alcohlicas. (PRESENTACIN)
19.- Produccin industrial de productos lcteos. (PRESENTACIN)
20.- Produccin industrial de cidos orgnicos. (PRESENTACIN)
21.- Produccin industrial de aminocidos. (PRESENTACIN)

50

22.- Produccin industrial de enzimas. (PRESENTACIN)

VII.- Microbiologa Industrial en Agricultura


23.- Biofertilizantes. (PRESENTACIN)

VIII.- Combustibles
24.- Produccin de bioetanol.

Programa de Clases Prcticas

Las clases prcticas consistirn en el aprendizaje de las tcnicas utilizadas en el


aislamiento, identificacin y ensayos de produccin de antibiticos, a escala de
laboratorio, por microorganismos aislados de suelo.
1.- Aislamiento de microorganismos a partir del suelo.
2.- Seleccin de microorganismos productores de antibiticos.
3.- Identificacin de los microorganismos seleccionados.
4.- Determinacin del espectro de actividad antimicrobiana.
5.- Determinacin de la produccin de antibiticos.

Bibliografa

AG BIOTECHNOLOG
BOURGEOIS, C.M. y LARPENT, J.P. Microbiologa Alimentaria. Vol. 2:
Fermentaciones alimentarias. Acribia. Zaragoza. 1995.

51

CRUEGER, W. y CRUEGER, A.: Biotecnologa: Manual de Microbiologa Industrial.


Editorial Acribia. Zaragoza. 1989.
DEMAIN, A. y SOLOMON, N.: Biology of industrial microorganisms. The Benjamin /
Cummings Publishing Company, Inc. London. 1985.
FLEET, G.: Wine Microbiology and Biotechnology. Camberwell. Harwood Academic
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GLAZER, A. y NIKAIDO, H.: Microbial Biotechnology. Freeman and Company. New
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Washington, D. C. 1998.
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LEVEAU, J. y BOUIX, M.: Microbiologie Industrielle. Apria. Pars. 1993.
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Sons. Chichester. 1981.
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1993.
VEIGA ANEIROS, M.: Produccin de Antibiticos por Fermentacin. Universidade de
Santiago de Compostela. 1988.

PRACTICAS BIOQUIMICA Y MICROBIOLOGIA INDUSTRIALES


LICENCIATURA EN BIOQUIMICA

52

Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez


Dr. Pedro Miguel Coll Fresno

1.- AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DEL SUELO

1.1.- Preparar una suspensin al 10% de suelo en H2O estril.


1.2.- Mantener en agitacin la suspensin anterior durante 30 a 60 minutos.
1.3.- Preparar diluciones seriadas de 1/10, 1/100, 1/1.000, 1/10.000, 1/100.000,
1/1.000.000, 1/10.000.0000 de la suspensin anterior.
1.4.- Sembrar 0.1 mL de cada dilucin en una placa Petri con Agar Nutritivo y con
ayuda de un asa de Digralski extenderlo por toda la placa.
1.5.- Incubar a 37C durante 2-3 das.
1.6.- Realizar el recuento de los microorganismos presentes en la muestra de suelo. Dar
el resultado en ufc/g:
N colonias en placa entre 30 y 300 X inverso de la dilucin X (1000/10)

2.- SELECCION DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE


ANTIBIOTICOS

2.1.- Preparar placas para la seleccin de microorganismos productores de antibitico:


Se aade a cada tubo con 15-20 mL de Agar nutritivo en agar fundido mantenidos a
55C, 1 mL de una suspensin de esporas de Bacillus subtilis; se agita bien para que la

53
suspensin sea lo ms homognea posible y se vierte sobre una placa Petri estril y
vaca. Esperar a que el agar est solidificado y fro.
2.2.- Sobre la superficie de estas placas se siembran, con ayuda de palillos estriles,
estras a partir de las colonias aisladas y separadas en la prctica 1. Sembrar 2 placas por
pareja y 8 estras por placa procurando, si es posible, que cada estra corresponda a
colonias de morfologa distinta.
2.3.- Incubar las placas a 37C durante 48 h. (para permitir el crecimiento de los
microorganismos aislados a partir del suelo y la produccin de antibiticos as como
permitir el crecimiento de Bacillus subtilis y as poder observar halos de inhibicin en
aquellos microorganismos aislados del suelo que producen antibitico).
2.4.- Observar halos de inhibicin sobre Bacillus subtilis de las colonias aisladas a partir
de suelo productoras de antibitico.

3.- IDENTIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS


SELECCIONADOS

3.1.- Tincin de Gram de los microorganismos productores de antibitico y observacin


al microscopio ptico.
3.2.- Identificacin del microorganismo productor de antibitico mediante el sistema
API utilizando las galeras API 20E. Inocular las galeras e incubar a 37C durante 24h.
3.3.- Revelar las galeras API 20E e identificar el microorganismo.

4.- DETERMINACION DEL ESPECTRO DE ACTIVIDAD


ANTIMICROBIANA

4.1.- Sembrar una estra del microorganismo productor de antibitico, con ayuda de un

54
asa de siembra, a lo largo de una placa Petri con Agar nutritivo e incubar a 37C durante
48 h. (para permitir el crecimiento del microorganismo as como la produccin y
difusin del antibitico).
4.2.- Sobre la placa utilizada para determinar el espectro de actividad del antibitico y
donde se sembr una estra del microorganismo productor de antibitico se siembran,
con ayuda del asa de siembra, cuatro estras perpendiculares a sta de los siguientes
microorganismos:
Microccus luteus (Coco G+); Escherichia coli (Cocobacilo G-); Bacillus subtilis (Bacilo
G+); Saccharomyces cerevisiae (Levadura).
4.3.- Incubar las placas Petri a 37C durante 24h.
4.4.- Observar el espectro de actividad y anotar los resultados.

5.- DETERMINACION DE LA PRODUCCION DE ANTIBIOTICOS

5.1.- Sembrar en matraces de 250 mL con 25 mL de Caldo Nutritivo, 0.5 mL de una


suspensin del microorganismo productor de antibitico e incubar a 37C durante 48 h
en agitacin a 200 rpm.
5.2.- Preparar placas Petri para realizar el antibiograma:
Se aade a cada tubo con 15-20 mL de Medio antibitico en agar fundido mantenidos a
55C, 1 mL de una suspensin de esporas de Bacillus subtilis; se agita bien para que la
suspensin sea lo ms homognea posible y se vierte sobre una placa Petri estril y
vaca. Esperar a que el agar est solidificado y fro.
5.3.- Sobre la superficie de estas placas se colocan, con ayuda de una pinza metlica, 5
pocillos metlicos y estriles procurando no incrustarlos en el agar. La disposicin de
los pocillos en la placa Petri debe ser equidistante entre ellos y entre los bordes de la
placa colocando uno de ellos en posicin central.
5.4.- A partir del cultivo lquido sembrado con el microorganismo productor de
antibitico se toma una alcuota de 1 mL y se separan las clulas del sobrenadante de
cultivo por centrifugacin a 12.000 rpm durante 5 minutos en una microcentrfuga.
5.5.- Se preparan cuatro concentraciones distintas de penicilina (por ejemplo 1.25, 2.50,
5.00 y 10.00 g/mL) a partir de una suspensin madre.
5.6.- Se aaden a cada pocillo 0.2 mL de las distintas concentraciones de penicilina y en
el pocillo central se colocan 0.2 mL del sobrenadante de cultivo obtenido por
centrifugacin.
5.7.- Las placas Petri se marcan, al contrario que las anteriores, sobre la tapadera y se

55
incuban a 37C durante 24 h colocndolas en la estufa con la tapadera en la parte
superior.
5.8.- Anotar los resultados del antibiograma:
Medir los halos de inhibicin de los pocillos que contienen las distintas concentraciones
de penicilina y representar en papel semilogartmico la concentracin del antibitico
frente al dimetro del halo. En caso de no disponer de papel semilogartmico se puede
representar en papel milimetrado el logaritmo de la concentracin del antibitico frente
al dimetro del halo. A partir de esta recta patrn y conociendo el dimetro del halo del
antibitico problema se puede calcular su concentracin en g/mL

6.- DISCUSION

6.1.- Analizar y discutir los resultados obtenidos:


- Aislamiento; fuentes; recuento (ufc/g).
- Seleccin de microorganismos productores de antibitico; identificacin.
- Condiciones de produccin.
- Rendimiento (g/mL).
- Espectro de actividad del antibitico.

TEMA 12: TIPOS DE


FERMENTADORES
Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

I. INTRODUCCION

56

El objetivo de la biotecnologa es obtener productos metablicos tiles a partir


de materiales biolgicos. La biotecnologa comprende dos fases distintas: la
fermentacin y la recuperacin de los productos. Para el cultivo de
microorganismos en condiciones ptimas, as como para la produccin, por
parte de los microorganismos, de los metabolitos o los enzimas deseados,
deben ser desarrollados procedimientos de fermentacin como son el
desarrollo de cepas mediante manipulacin gentica y/o la regulacin del
metabolismo mediante la optimizacin del medio de cultivo as como el
control adecuado de los factores fsico-qumicos que afectan al rendimiento de
las fermentaciones industriales (02, T, pH, etc.). La recuperacin del producto
o "procesamiento posterior" (del ingls downstream processing) conlleva la
extraccin y purificacin de los productos biolgicos. La recuperacin en los
procesos bioqumicos difiere de la recuperacin qumica, principalmente, en
que los materiales biolgicos son frecuentemente mucho ms lbiles. Por lo
tanto, la produccin de productos metablicos tiles a partir de
microorganismos conlleva una ntima relacin entre la Ciencia y la
Tecnologa. por un lado se deben desarrollar los microorganismos de inters
industrial y por otro se debe asegurar que estos microorganismos puedan
crecer en gran cantidad bajo aquellas condiciones que originen el mejor
rendimiento posible del producto.
A simple vista uno puede pensar que aquellas condiciones que se han
encontrado ser las ms efectivas a pequea escala deberan ser igual de
efectivas a larga escala y que para conseguir este objetivo nicamente es
necesario usar un recipiente mayor con el correspondiente incremento de
volumen del medio. Nada ms lejos de la realidad. Por ejemplo, se puede
conseguir un buen crecimiento de un microorganismo aerobio en un matraz de
200 mL mediante agitacin en un incubador usando un rotor de 300 w. Si
nosotros simplemente ampliamos este sistema, un nico fermentador de
10.000 litros requerira un agitador con un motor de 15 megawatios. Dicho
motor debera ser tan grande como una casa y el calor generado durante la
agitacin hervira a los microorganismos.
En lneas generales, un proceso tpico de fermentacin comienza con la
formulacin y esterilizacin del medio de cultivo as como la esterilizacin
del equipamiento. Las clulas se crecen primero en un cultivo de
mantenimiento (5 a 10 mL), posteriormente en un matraz (200 a 1.000 mL) y
de ah en un prefermentador (10 a 100 L) para finalmente inocular el
fermentador de produccin (1.000 a 100.000 L). Una vez que la fermentacin
se ha completado, las clulas se separan del cultivo lquido. Si el producto es
intracelular, se rompen las clulas, se eliminan los restos celulares y se
recupera el producto del fluido libre de restos celulares. Si el producto es
extracelular, se purifica a partir del sobrenadante libre de clulas. Hasta ahora
hemos visto el desarrollo de las cepas as como el diseo de los medios de

57

cultivo. A continuacin vamos a desarrollar los aspectos tecnolgicos de las


fermentaciones.

II. DISEO Y FUNCIONAMIENTO DEL


FERMENTADOR
El estudio detallado del diseo de un fermentador cae fuera del objetivo de
esta asignatura que se concentra en los principios biolgicos de la
biotecnologa. Sin embargo, como la tecnologa de los procesos fermentativos
es una amalgama de tcnicas biolgicas e ingeniera qumica, se hace
necesario proporcionar un breve resumen de los tipos de fermentadores
disponibles y de sus principales caractersticas. A continuacin paso a
describir una lista de 13 puntos considerados como los criterios ms
importantes para el diseo de un fermentador:
1.- El tanque debe disearse para que funcione aspticamente durante
numerosos das, as como para las operaciones de ms larga duracin.
2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireacin y agitacin para
cubrir las necesidades metablicas de los microorganismos.
3.- El consumo de energa debe ser tan bajo como sea posible.
4.- Debe tener un sistema para el control del pH.
5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras.
6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura.
7.- Las prdidas por evaporacin no deben ser excesivas.
8.- El diseo del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el
funcionamiento, recoleccin, limpieza y mantenimiento sean mnimas.
9.- El tanque debe ser verstil para la aplicacin de diversas modalidades de
procesos.
10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea
posible, soldaduras.

58

11.- La geometra del fermentador debe ser similar a otros tanques ms


pequeos o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder
reproducir procesos a diferentes escalas.
12.- deben emplearse los materiales ms baratos que proporcionen resultados
satisfactorios.
13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.
El mantenimiento de un ambiente asptico y unas condiciones aerbicas son,
probablemente, los dos puntos de mayor relevancia que hay que considerar.
Los fermentadores ms ampliamente utilizados a nivel industrial estn
provistos de mecanismos de agitacin, dispersin y aireacin as como de
sistemas para el control de la temperatura, pH y formacin de espuma.

III. TIPOS DE FERMENTACIONES


1.- Fermentacin discontinua
Una fermentacin discontinua (en batch) puede ser considerada como un
"sistema cerrado". Al inicio de la operacin se aade la solucin esterilizada
de nutrientes y se inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a
cabo la incubacin en condiciones ptimas de fermentacin. A lo largo de toda
la fermentacin no se aade nada, excepto oxgeno (en forma de aire), un
agente antiespumante y cidos o bases para controlar el pH. La composicin
del medio de cultivo, la concentracin de la biomasa y la concentracin de
metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo de las
clulas observndose las cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de latencia,
fase logartmica, fase estacionaria y fase de muerte.
En los procesos comerciales la fermentacin frecuentemente se interrumpe al
final de la fase logartmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la
fase de muerte (metabolitos secundarios).

2.- Fermentacin alimentada (fed-batch)


En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos
los sustratos se aaden al principio de la fermentacin. Una mejora del

59

proceso cerrado discontinuo es la fermentacin alimentada que se utiliza en la


produccin de sustancias como la penicilina. En los procesos alimentados, los
sustratos se aaden escalonadamente a medida que progresa la fermentacin.
La formacin de muchos metabolitos secundarios est sometida a represin
catablica (efecto glucosa). Por esta razn en el mtodo alimentado los
elementos crticos de la solucin de nutrientes se aaden en pequeas
concentraciones al principio de la fermentacin y continuan aadindose a
pequeas dosis durante la fase de produccin.

3.- Fermentacin continua


En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. La solucin
nutritiva estril se aade continuamente al biorreactor y una cantidad
equivalente de solucin utilizada de los nutrientes, con los microorganismos,
se saca simultneamente del sistema.
El objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones es minimizar
costes e incrementar los rendimientos. Este objetivo puede alcanzarse si se
desarrolla el tipo de fermentacin ms adecuado para cada paso en particular.
Si bien los procesos de fermentacin continua no se utilizan de forma general
en la industria, debido fundamentalmente al mayor nivel de experiencia que se
tiene en el crecimiento de clulas en fermentacin discontinua, el coste de
produccin de biomasa mediante cultivo continuo es potencialmente inferior
al de cultivo discontinuo. De este modo se han instalado plantas de
produccin para la produccin continua de protena de origen unicelular a
partir de n-alcanos, compuestos C1 y almidones.
Aunque muchas fermentaciones para la produccin de metabolitos funcionan
bien como procesos continuos, slo unos pocos procesos han resultado tiles
para la aplicacin prctica por varias razones:
a.- Muchos mtodos de laboratorio operan continuamente durante solamente
20 a 200 horas; para que sea de utilidad industrial el sistema debe ser estable
durante al menos 500 a 1.000 horas.
b.- Mantener las condiciones estriles a escala industrial a lo largo de un largo
perodo de tiempo es difcil.
c.- La composicin de los sustratos debe ser constante a fin de obtener una
produccin mxima. La composicin de las soluciones de nutrientes
industriales son variables (lquido de maceracin del maiz, peptona, etc.) lo
que puede originar cambios en la fisiologa de la clula y disminuir la
productividad.

60

d.- Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producen mutantes


degenerados, los cuales pueden crecer en cultivo continuo ms deprisa que las
cepas de produccin por lo que el rendimiento disminuye con el tiempo ya
que cada vez son menos clulas las que sintetizan el producto de inters.

4.- Reactores de enzimas o clulas inmovilizadas


Consiste en pasar el medio fresco a travs de un biorreactor en el que por
diversas tcnicas hemos inmovilizado clulas (o enzimas). En el biorreactor se
producen las transformaciones bioqumicas que deseamos y recuperamos el
producto transformado tras su paso por la columna. Con este sistema se
eliminan los problemas de desequilibrio (estabilidad) del sistema continuo
clsico y adems el producto resultante est libre de clulas. Presenta el
inconveniente de que no todos los microorganismos pueden inmovilizarse.
Existen tres mtodos de inmovilizar las clulas:
a.- Asociacin fsica mediante resinas de intercambio inico. La unin se
puede romper fcilmente.
b.- Unin covalente mediante glutaraldehido, tolueno, di-isocianato, iodo
acetil celulosa. Unin fuerte aunque inactivacin.
c.- Atrapamiento mediante colgeno, gelatina, agar, alginatos, poliacrilamida,
poliestireno. Es el mtodo ms utilizado en inmovilizacin de clulas; para
ello se mezclan las clulas con el polisacrido lquido y posteriormente se deja
enfriar para que solidifique. Finalmente se fragmenta o granula y se
empaqueta en una columna.

IV. FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN


AL RENDIMIENTO DE LAS FERMENTACIONES
INDUSTRIALES
1.- Oxgeno
2.- Temperatura

61

3.- pH

1.- Oxgeno
Uno de los factores ms crticos en la operacin de fermentacin a gran escala
es el suministro de un intercambio de gases adecuado. El oxgeno es el
sustrato gaseoso ms importante para el metabolismo microbiano y el
anhdrido carbnico es el producto metablico ms importante. El oxgeno no
es un gas muy soluble ya que una solucin saturada de oxgeno contiene
aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua. debido a la influencia de los
ingredientes del cultivo, el contenido mximo de oxgeno realmente es ms
bajo de lo que debera ser en agua pura. El suministro se logra pulverizando
aire en el fermentador durante el proceso.
La ley de Henry describe la solubilidad del oxgeno en soluciones de
nutrientes en relacin a la presin parcial del oxgeno en la fase gaseosa:
P0
C = -----H
En esta ecuacin C es la concentracin de O2 de la solucin de nutrientes a
saturacin, P0 es la presin parcial del gas en la fase gaseosa y H es la
constante de Henry que es especfica para cada tipo de gas. A medida que
aumenta la concentracin de O2 en la fase gaseosa, aumenta la proporcin de
O2 en la solucin de nutrientes. En consecuencia, la presin ms alta de O 2 se
consigue durante la aireacin con oxgeno puro. Comparado con el valor
obtenido al utilizar aire (9 mg O2/L), en agua se disuelven 43 mg O2/L cuando
se utiliza oxgeno puro. Otra caracterstica es que a medida que aumenta la
temperatura desciende la solubilidad del oxgeno.
Una vez disuelto el O2 ste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a
cada clula individual. Para ello deben ser superadas varias resistencias
parcialmente independientes:
a.- La resistencia dentro de la pelcula de gas a la interfase.
b.- La penetracin de la interfase entre la burbuja de gas y el lquido.
c.- Transferencia desde la interfase al lquido.

62

d.- Movimientos dentro de la solucin de nutrientes.


e.- Transferencia a la superficie de la clula.
En las fermentaciones que se llevan a cabo con organismos unicelulares como
bacterias o levaduras, el factor ms importante que controla la velocidad de
transferencia es la resistencia en la interfase entre la burbuja de gas y el
lquido. Las clulas microbianas prximas a la burbuja de gas pueden absorber
directamente el O2 a travs de la interfase aumentando la transferencia del gas
a estas clulas. En los aglomerados de clulas o en las bolitas de micelio, la
transferencia de gas dentro del aglomerado puede ser un factor limitante.
Por ltimo indicar la concentracin crtica de oxgeno que es el trmino
utilizado para expresar el valor de la velocidad especfica de absorcin de
oxgeno que permite la respiracin sin impedimentos. Esta concentracin
crtica de oxgeno suele tener unos valores concretos para cada
microorganismo oscilando de forma general entre el 5% y el 25% de los
valores de saturacin de oxgeno en los cultivos.

2.- Temperatura
La temperatura es otro de los parmetros esenciales para el xito de una
fermentacin. Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la
ptima tienen retardado su crecimiento y por lo tanto reducida la produccin
celular, es decir su productividad. Por otro lado, si la temperatura es
demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrs al
choque trmico con la consiguiente produccin de proteasas celulares que
ocasionan una disminucin en el rendimiento de los productos proteicos. A fin
de obtener rendimientos ptimos, las fermentaciones deben ser llevadas a
cabo en un margen estrecho de temperatura y a ser posible constante. La
velocidad de produccin de calor debida a la agitacin y a la actividad
metablica de los microorganismos no se ve compensada por las prdidas de
calor que resultan de la evaporacin, por lo que se debe recurrir a sistemas de
refrigeracin. Dentro de stos, los ms utilizados en las fermentaciones
industriales son las camisas de agua.

3.- pH
La mayor parte de los microorganismos crecen ptimamente entre pH 5,5 y
8,5. Pero durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares
son liberados al medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de
cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de cultivo y aadir un

63

cido o una base cuando se necesite para mantener constante el pH. Por
supuesto que esta adicin del cido o base debe ser mezclada rpidamente de
tal manera que el pH del medio de cultivo sea el mismo en todo el
fermentador.

V. AGITACION Y MEZCLADO
La agitacin es la operacin que crea o que acelera el contacto entre dos o
varias fases. Una fermentacin microbiana puede ser considerada como un
sistema de tres fases, que implica reacciones lquido-slido, gas-slido y gaslquido.
1.- La fase lquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede
existir, en algunos casos, una segunda fase lquida si existe un sustrato
inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos.
2.- La fase slida consiste en clulas individuales, bolitas de micelio, sustratos
insolubles o productos del metabolismo que precipitan.
3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxgeno,
para la eliminacin del CO2 o para el ajuste del pH con amonio gaseoso.
Una adecuada agitacin de un cultivo microbiano es esencial para la
fermentacin ya que produce los siguientes efectos en las tres fases:
1.- Dispersin del aire en la solucin de nutrientes.
2.- Homogeneizacin, para igualar la temperatura, pH y concentracin de
nutrientes, en el fermentador.
3.- Suspensin de los microorganismos y de los nutrientes slidos.
4.- Dispersin de los lquidos inmiscibles.
Bajo estas premisas se podra concluir que cuanto mayor sea la agitacin,
mejor ser el crecimiento. Sin embargo, la agitacin excesiva puede romper
las clulas grandes e incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso
en la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe conseguir un balance entre la

64

necesidad del mezclado y la necesidad de evitar el dao celular.


Los diferentes tipos de agitacin que se utilizan en las fermentaciones se
incluyen dentro de las siguientes clases:
1.- Agitadores rotativos, los cuales tienen un sistema interno mecnico de
agitacin.
2.- Columnas de burbujas, la agitacin se realiza mediante la introduccin de
aire a sobrepresin.
3.- Sistema aero-elevado (airlift), que pueden tener un circuito interno o
externo. La mezcla y circulacin de los fluidos son el resultado de las
corrientes de aire introducido, las cuales causan diferencias en la densidad
dentro de las diferentes partes del fermentador.
De estos tres tipos el ms utilizado es el primero ya que es ms flexible en las
condiciones de operacin, es ms fcil de conseguir comercialmente, provee
una eficiente transferencia de gases a las clulas y es el tipo con el que se tiene
ms experiencia.

La utilizacin de leche cruda versus pasteurizada en la


elaboracin de quesos. II. Pasteurizacin
Cecilia Snchez
Investigador FONAIAP. Centro de Investigaciones Agropecuarias del Estado Lara. Barquismeto .

Tabla de contenido
Pasteurizacin
En la fabricacin tradicional, el queso es producido sin control sobre la flora de la
leche. Como sta vara constantemente en cantidad y calidad, los resultados obtenidos
son siempre variables. La sustitucin de la microflora espontnea por cepas
seleccionadas permite obtener una calidad ms uniforme en la produccin quesera.
Bajo el punto de vista sanitario, higinico y tcnico, se hace necesario pasteurizar la
leche destinada a la produccin de quesos. Para fabricar un producto lcteo de buena
calidad, es indispensable contar con materia prima de ptima calidad.
La pasteurizacin de la leche tiene las siguientes finalidades que se traducen en
ventajas para la elaboracin de quesos:
a) Finalidad higinica

65
- Destruccin de 100% de las bacterias patgenas que existen en la leche y 99%
de las saprofticas.

b) Finalidades tcnicas

- Destruccin de microorganismos indeseables.


- Destruccin de bacterias del grupo Coli, levaduras y algunas de las enzimas de la
leche.
- Control ms fcil de los mtodos de produccin (velocidad de maduracin).
- Produccin de queso estandarizado durante todo el ao.
- Maduracin del queso a temperatura ms alta que la usada en queso de leche cruda
(menos requerimiento de enfriamiento en las bodegas).
- Obtencin de productos de ms larga vida.
- Disminucin apreciable de la produccin de quesos de inferior calidad.
- Obtencin de quesos con sabor y aroma ms puro, aunque dedistintas
caractersticas que el
elaborado con leche cruda.
-Aumento ligero del rendimiento (1 a 10%), variacin debida a diferencias en la
composicin de la leche, a la forma de calentamiento y a los mtodos de fabricacin
por desnaturalizacin de las protenas solubles, cuya intensidad es proporciona a la
temperatura alcanzada, mejor retencin de la materia grasa en la cuajada e
insolubilizacin de una parte de las sales minerales.
Consideraciones tcnicas
La pasteurizacin debe ser aplicada para conseguir resultados efectivos, bajo el
punto de vista microbiolgico, sin alterar el equilibrio de los elementos qumicos y el
estado fsico de la leche.
a) Caractersticas

fisicoqumicas

La casena es muy resistente a la accin del calor, aun cuando las temperaturas
altas afectan las uniones entre calcio, fsforo y casena, provocando insolubilidad de
las sales de calcio de la leche. La acidificacin de la leche antes y despus de la
coagulacin elimina las sales minerales originalmente fijadas sobre la micela
(estructura que se forma durante el proceso de coagulacin de la leche), siendo este
nivel de mineralizacin residual de las protenas el que determinar grado de cohesin
de la cuajada, su aptitud al escurrido, as como el extracto seco final del queso.
El calor exagerado produce perjuicios en la leche destinada a la elaboracin de
quesos. La leche pasteurizada cuaja ms difcilmente que la leche cruda, el tiempo de
coagulacin es mayor, se produce un cogulo ms blando, el desuerado es ms lento
y debido a la formacin de un cogulo dbil, se pierde mayor materia seca en el suero.
La separacin de lactosuero es muy difcil.
Los defectos que se derivan del calentamiento son tanto ms graves cunto ms
intenso haya sido el tratamiento trmico. Es necesario no pasarse de 72 IC por 15
segundos. Un tratamiento trmico ms fuerte provoca la desnaturalizacin de las
protenas del suero, insolubilizndose y precipitando junto con la casena (protena de
la leche) en la coagulacin por cido y cuajo y quesos de inferior calidad.
En el caso de quesos de pasta cocida, la pasteurizacin puede tener un efecto
perjudicial si la leche se encuentra muy contaminada con fermentos butricos. Este tipo
de grmenes no se destruyen y por otro lado, la fermentacin butrica se encuentra

66

estirnulada en los quesos fabricados con leche pasteurizada.


Las leches que llegan a la quesera son, a veces, demasiado cidas para someterlas a
la pasteurizacin. Generalmente, los tratamientos trmicos producen ligera
acidificacin, producindose a veces protelisis, una ligera alcalinizacin y por tanto
disminucin de rendimiento quesero (Metro, 1979).
Un factor importante es la velocidad de fermentacin durante el proceso en la tina o en
otras palabras, el valor de pH con el que se ha logrado la cuajada en la salida de
latina. 90% de las bacterias se concentran en la cuajada. Cuando la cuajada no est
ms en contacto con el suero se termina el reemplazo de lactosa y la fermentacin
final depender de la cantidad de lactosa que lleva el queso y el pH en ese momento.
b) Caractersticas

organolpticas:

El sabor del queso est fraccionado entre el agua y el aceite soluble, las fracciones
voltiles y no voltiles, siendo ste el resultado de lo producido por los constituyentes
de la leche original y los productos de fermentacin derivados que existen al momento
de la evaluacin.
En general, los microorganismos alteran los productos por liplisis, protelisis (donde
se produce un aguado de los quesos) y puede haber cambios de consistencia, de color
(hongos y levaduras), de olor, sabor y aspecto.
Es conveniente no homogeneizar antes de la pasteurizacin, pues en la leche cruda
est la presencia de una lipasa lipo-proteica. Esta enzima es capaz de considerable
actividad en leche, pero se puede prevenir su acercamiento a su sustrato, el
triglicrido. La homogenizacin favorece este acercamiento, razn por la cual es
conveniente destruir primero la lipasa con la pasteurizacin.
Para ciertos tipos de quesos es difcil obtener con la leche pasteurizada una textura y
aroma tan buenos como con la leche cruda, por lo menos si se compara con los
quesos de mejor calidad. La modificacin de la textura se debe, probablemente, a las
albminas y globulinas precipitadas en la casena.
c) Caractersticas

microbiolgicas:

La leche cruda no debe contener ms de 300.000 colonias bacterianas/ml,


determinados por recuento de placa. La leche pasteurizada no debe tener ms de
30.000/mililitros.
La flora microbiana vara con los distintos tipos de quesos e inclusive entre varios
quesos del mismo tipo. Los microorganismos ms importantes para recuento de
quesos son: conformes, bacterias psicotrofas, presencia
de hongos y levaduras, Staphlococcus aureus (mastitis), salmonella sp., gacillus
cereus, Lactobacillus y Clostridum perfrgens.
Aparte de la salmonella, el peligro potencial de fabricar quesos con leche cruda estara
tam bin en brucelosis y tuberculosis. Sin embargo, en Venezuela, se elaboran quesos
con una concentracin alta de sal (3 a 6%), lo cual los protege.
La leche cruda debera ser de buena calidad bacteriolgico, para evitar fermentaciones
y reacciones enzimticas indeseables y debera estar libre de sustancias inhibitorias
como antibiticos residuales, los cuales interfieren con el crecimiento de la bacteria
iniciadora. Generalmente se considera que el queso con leche cruda tiene ms sabor
(Robinson,

67

1981).
A nivel de granjas se est generalizando el uso de refrigeracin, con la cual sobreviven
bacterias, principalmente psicotrofas como Pseudomonas, Aeromonas y Alcalgenes
que se multiplicarn durante el transporte y el almacenamiento. Una eficiente
pasteurizacin reduce el contaje total de los microorganismos en el queso, pero sus
enzimas pueden sobrevivir el tratamiento de calor y ocasionar sabores desagradables
en los quesos.
Estas enzimas tienen el potencial de perjudicar las propiedades de procesamiento de
la leche. Las lipasas pueden causar rancidez en el queso cheddar, holands, suizo y
camembert. Las enzimas pueden degradar la casena en la leche cruda durante el
almacenamiento, produciendo pptidos, los cuales se pierden en el suero y afectan los
rendimientos del queso.
Con la pasteurizacin es importante el uso de fermentos y/o del cultivo iniciador. Estas
enzirnas o bacterias aadidas conjuntamente con las bacterias de la leche pueden
verse afectadas en su actividad por productos generados por bacterias de la leche o
puede ocurrir una inhibicin competitiva, estando sujetas a inactivacin y/o protelisis.
Los organismos patgenos que pueden estar presentes en la leche cruda para
elaboracin de quesos, pueden derivarse de ubres infectadas (mastticas), de heces e
instrumentos infectados, en los cuales los microorganismos, a excepcin de los
formadores de esporas y los enterococos, pueden ser destruidos por pasteurizacin
total. Sin embargo, cuando el queso se hace de leche cruda o hay una
postcontaminacin con patgenos o permanecen sus enterotoxinas, puede causar un
dao alimenticio.
Debido a la contaminacin frecuente de la leche por el personal obrero y la alta
incidencia de mastitis estafiloccica en los rebaos lecheros,
lacausafrecuentededaoporiosalimentos es debido a las enterotoxinas producidas por
Staphilococcus aureus. La salmonella aparece poco, no as las cadenas
enteropatognicas de E. colque causa desquebrajamientos en humanos y cuya
contaminacin postpasteurizacin es rara.
Los iniciadores lcticos usados en la elaboracin de quesos pueden efectivamente
proteger al queso contra patgenos por la produccin de cido lctico, cido actico,
agua oxigenada y antibitico (ejemplo: nisina). Bajo condiciones ptimas de
acidificacin, la multiplicacin y muertede lospatgenospuedeestarinfluenciada por las
cepas iniciadoras usadas.
La inclusin de eches mastticas causa dificultades de coagulacin, producen bajos
rendimientos o un queso muy hmedo. Las altas temperaturas pueden bloquear
tambin la actividad enzimtica al depositarse las sales de la leche, especialmente
bajo condiciones cidas y a temperaturas sobre 75 C, lo cual produce cuajadas
suaves que liberan agua lentamente, en comparacin con las cuajadas elaboradas a
partir de leche cruda.
Conclusiones
La leche necesita condiciones especiales de transporte como rapidez, puntualidad y
eficiencia, pero se presenta el problema del alto costo del transporte. Sin embargo, con
el cumplimiento de esas condiciones y de una higiene adecuada, el productor puede
fabricar quesos con menores riesgos de contaminacin si utiliza leche cruda y en caso
de pasteurizar la leche los beneficios sern mayores, debiendo slo pasteurizar
aquellas leches sanitariamente paseurizables.
Una leche de alta calidad (sin problemas de mastitis y con calidad higinica) permite

68

una mayor duracin de los productos y una gran aceptacin de los productos lcteos
por parte del consumidor.
No necesariamente la filtracin, la homogenizacin y la pasteurizacin dan como
resultado productos lcteos de alta calidad. Un procesador lcteo no puede obtener un
producto acabado de un producto crudo deficiente, ya que en la leche cruda hay
especies resistentes, en menor o mayor grado.
Es conveniente que la homogenizacin de la leche se efecte despus de la
pasteurizacin, para as eliminar primero las lipasas y evitar el enranciamiento de la
leche. La pasteurizacin (al menos la corta) es aconsejable, buscando en la medida de
lo posible que se mantengan las propiedades de la leche cruda:
- Capacidad de formacin de nata.
- Contenido vitamnico.
- Caractersticas qumicas.
- Valor nutritivo.
- Sabor.
En general, se puede reglamentar la utilizacin de uno u otro recurso (leche cruda o
pasteurizada), de acuerdo con el peligro potencial existente. Sin embargo, en
Venezuela, por la falta de control sobre los rebaos es ms conveniente pasteurizar la
leche.
Bibliografa
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de Microbiologa.
Tabla de contenido

Caracterizacin de la Stevia rebaudiana Bert.


1. Origen y distribucin
2. Descripcin botnica
3. Ecotipos
4. Citologa
5. Clima
6. Suelos
7. Caractersticas agronmicas
8. Propagacin sexual de Stevia rebaudiana (Bert)
9. Propagacin vegetativa de Stevia rebaudiana (Bert):
10. Bibliografa
Origen y distribucin:
La mayora de los estudiosos admiten que el ka-he es una planta
autnticamente paraguaya, originaria de la Regin Oriental del pas, donde era
utilizada por los indios como edulcorante y para fines medicinales (Shock,
1982).
Segn distintas fuentes se encuentra desde las sierras del Mbaracay, Campos
Altos del Amambay hasta el Monday, zonas de San Pedro, Capitn Bado, Yh,
Bella Vista, San Salvador, Vac Ret, entre el ro Ypan e Ybyrar, prximo al
Cerro Cuarepot, en Itacu y en Campos de Cerro Cuata (Shock, 1982). La
regin se encuentra entre 22-26 sur y 54-57 oeste. Los Departamentos de
Amambay, Concepcin, San Pedro, Canendiy, Alto Paran y Caaguaz
estaran representados en la zona mencionada. Otros autores indican que la
planta es autctona de las fronteras del Paraguay con Brasil (Pagliosa, 1982)
encontrndose en el suroeste del Brasil en la regin de Amambay, divisin del
Paraguay con Matto Grosso do Sul. ha sido colectada en Ponta Por (Felippe,
1982). Monteiro (1982) menciona estudios de especies brasileas de Stevia y
su interrelacin con el ka-he y de revisin taxonmica - morfolgica de la
serie Multiaristatae de Stevia en Brasil. Sumida (1980) observa que Stevia
crece naturalmente o es cultivada en los distritos de Amambay e Iguaz,
frontera de Brasil, Paraguay y Argentina (latitud 25S). Se ha naturalizado en
todo el Noreste Argentino. Se cultiva en Brasil en Santa Catarina, Paran, Sao
Paulo, Matto Grosso do Sul y Goias; en Paraguay en el Alto Paran,

70
Horquetas, Pedro Juan Caballero, Capitn Bado, Quiindy, Coronel Oviedo y la
regin del Chaco.
Actualmente Japn, China, Brasil y Paraguay parecen ser los principales
productores. Del Japn se ha extendido a todo el sudeste asitico (Jordn
Molero, 1984).
Descripcin botnica:
Stevia rebaudiana Bert. (yerba dulce), es una planta arbustiva originaria del
noreste de Paraguay, perteneciente a la familia de las compuestas, que crece
en estado silvestre en forma de planta aislada. Fue descripta botnicamente en
1905, por el naturalista Moiss Santiago Bertoni, como una planta herbcea de
40 a 80 cm de altura.
La raz es fibrosa, filiforme y perenne, formando abundante cepa que apenas
ramifica y no profundiza, distribuyndose cerca de la superficie; es el nico
rgano de la planta que no contiene el estevisido (De Vargas, 1980). En
plantas que se propagan asexualmente por pedazos de tallos en arena gruesa,
se ha observado abundante ramificacin del sistema radicular. Sumida (1980)
observ que las races finas abundan en la superficie y las gruesas en las
zonas ms profundas del suelo.
El tallo es anual, subleoso, ms o menos pubescente, con tendencia a
inclinarse, es ms o menos ramificado. Durante su desarrollo inicial no posee
ramificaciones, tornndose multicaule despus del primer ciclo vegetativo
llegando a producir hasta 20 tallos en 3 a 4 aos. En condiciones ptimas, el
tallo puede llegar hasta un metro y medio de altura (Sagakuchi, 1982).
Las hojas son elpticas oval o lanceoladas, pequeas, simples; borde o margen
dentado; a veces en verticilos; algo velludas. La hoja es el rgano con mayor
contenido del edulcorante (C.C.N., 1980).
Una planta tarda ms de un mes en producir todas sus flores. En Paraguay
florece en octubre, diciembre y marzo pero se clasifica como una planta de da
corto, situando el fotoperodo crtico en 12 - 13 horas segn el ecotipo. La flor
es hermafrodita pequea y blanquecina, en captulos pequeos terminales o
axilares, agrupados en panculas corimbosas (Shock, 1982).
La polinizacin es entomfila; se dice que la planta es autoincompatible
(protandria) de tipo esporoftico y clasificada como apomctica obligatoria
(Monteiro, 1982).
El fruto es un aquenio que es diseminado por el viento. Se clasifica en: claro
estril, oscuro frtil y oscuro estril (Gattoni, 1945).
El gnero Stevia tiene ms de 100 especies en el continente americano, de
donde es originaria, pero Stevia rebaudiana Bert. es la nica especie con
principios edulcorantes en las hojas (Grashoff, 1972). En el Paraguay es

71
conocida con su denominacin: Ka'-He', que significa yerba dulce en
espaol.
Ecotipos:
Esta especie presenta numerosos ecotipos. Mitsuhashi (1975), seleccion 28
ecotipos diferentes. Para diferenciarlos se bas principalmente en sus
caractersticas morfolgicas. Al determinar el contenido de estevisidos estos
variaron entre 2,07 y 18,34 %. Sumida (1980) describe una serie de
experimentos donde 22 variedades de Stevia rebaudiana Bert. fueron
estudiadas para correlacionar, varias caractersticas de la planta con la
heredabilidad. Se observ 11 caractersticas morfolgicas y 6 caractersticas de
contenido. De estas 17 caractersticas, solamente el peso seco de hojas mostr
una baja correlacin con la heredabilidad. Sumida, concluy, que
caractersticas morfolgicas y de contenido, principalmente de principios
activos, tienen efecto seleccionador evidente.
Citologa:
Observaciones de Brucher (1974), revelan que la planta es diploide,
conteniendo 22 cromosomas.
Estudios de poliplodia fueron realizados por Brucher (1974), por Utsunomiya
(1977) y Sato y Kawakami (1975). Estos ltimos investigadores obtuvieron
variedades de alta calidad. La poliplodia puede resultar un buen mtodo para
obtener aumentos de productividad en trminos de masa foliar y contenido de
principio activo, reduciendo el rea plantada y por ello los costos (Handro,
1984).
Clima:
La regin donde crece el kaa-hee es subtropical, semihmeda, con 1.400 a
1.800 mm. de lluvia, que se distribuyen regularmente durante todo el ao y
temperaturas extremas de -6 a 43C, con promedio de 24C. Segn Sakaguchi
(1982) la temperatura ms apropiada para Stevia es de 15 a 30C con un lmite
inferior de -3C. Soporta medias mnimas de 5C.
La habilidad para resistir inviernos, aparentemente es determinada por la
temperatura del suelo. La amplitud crtica est entre 0 a 2C. Mudas de 5 cms.
con 10 hojas soportaron temperaturas de -5C por 70 minutos (Sagacuchi,
1982), lo que implica que las reas potenciales de produccin de la especie
podra extenderse a latitudes mayores. En nuestra facultad existe una pequea
parcela, con 50 plantas desde hace aproximadamente 2 aos. Durante el
invierno su parte area se seca, rebrotando desde la base en primavera.
La planta resiste la humedad pero no la sequa, y esto puede explicarse por la
morfologa de su sistema radicular.
Desarrolla mejor donde la estacin de crecimiento es larga, donde la intensidad
de luz es alta, con temperaturas tibias, riesgos mnimos de heladas luego de la

72
brotacin y sin perodos de larga sequa. Los fotoperodos largos aumentan la
longitud de los entrenudos, rea foliar, peso seco y aceleran la aparicin de
hojas. La materia seca se reduce a la mitad con fotoperodos, de das cortos.
Azcares, protenas y estevisidos aumentan tanto en valores absolutos como
relativos en das largos (Sagacuchi, 1982).
Para la produccin de mudas (propagacin) es necesario temperaturas por
sobre los 15C.
Suelos:
Se la puede cultivar en suelos muy variados. En su estado natural, la planta
crece en suelos tanto de baja fertilidad, cidos, de tipo arenoso como hasta
orgnicos y con alta humedad (Shock, 1982). Algunos autores recomiendan
tierras areno-arcillo-humfera-ferruginosa o simplemente arena humfera. Se
desarrolla bien en suelos colorados del Alto Paran. La tierra ideal es la arenoarcillosa con regular proporcin de humus. Se adapta bien a suelos arcillosos
con buen drenaje, no as a lugares con exceso de humedad. Prospera bien en
suelos de desmonte, no as en tierras recin desmontadas, con mucha materia
orgnica, por problemas de enfermedades (C.C.N., 1980). La planta crece
naturalmente en suelos de ph 4-5, pero crece bien entre 6.5-7.5 siempre que
no sean salinos (Shock, 1982).
Caractersticas agronmicas:
Stevia rebaudiana Bert. es una especie semiperenne que en cultivo puede
durar entre 5 y 6 aos, con 2 o 3 cortes anuales; el rendimiento anual de hoja
seca en Paraguay oscila entre 1500 y 2500 kg/ha, en condiciones de secano y
alrededor de 4300 kg/ha con riego (Jordn Molero, 1984).
En Japn, en 1 o 2 cosechas por ao, el rendimiento de hoja seca vara entre
3000 y 3500 kg/ha en el primer ao, 4000 a 4500 kg/ha en el segundo, 4000 a
6000 kg/ha en el tercero, disminuyendo a 4000 kg/ha en el cuarto (Sumida,
1980).
Segn distintos autores la densidad de plantacin puede variar entre 20.000 a
400.000 pl/ha, en hileras sencillas, dobles o triples. Altas densidades, reducen
el desarrollo de ramas laterales y el rendimiento en peso seco por planta,
aumentando el nmero de plantas muertas luego de la cosecha y las
dificultades en la misma (Sakaguchi, 1982).
Se estima que la densidad optima de 88000 pl/ha, se da a distancias de 75 cm
entre hileras y 15 cm dentro de la misma (Jordn Molero, 1984).
Propagacin sexual de Stevia rebaudiana (Bert):
Se reproduce sexualmente por aquenios, observndose alta heterogeneidad en
las poblaciones resultantes. La planta es de polinizacin cruzada y gran parte
de sus aquenios son estriles; son livianos y de fcil dispersin por el viento. La
floracin no es uniforme, lo mismo que la maduracin de la semilla, siendo la

73
recoleccin lenta y difcil. Para mejorar la calidad de las semillas se recomienda
incorporar apiarios en la plantacin. El porcentaje de germinacin varia entre
10 y 38 %. La longevidad de los aquenios es corta y ya a los 4 meses el
potencial de germinacin se reduce un 40-70 %, despus de 8 meses es casi
nulo. Las semillas deben guardarse en condiciones de baja humedad, baja
temperatura, preferentemente en la oscuridad y en envases hermticos
(Felippe et al., 1971; De Vargas, 1980; Sagakuchi et al., 1982; Jordn Molero,
1984).
Propagacin vegetativa de Stevia rebaudiana (Bert):
Esta especie puede propagarse vegetativamente por separacin de hijuelos.
Este mtodo slo puede utilizarse para pequeas plantaciones, ya que el
nmero de mudas producidas es reducido.
En la base del tallo, o bajo tierra, en la primavera temprana aparecen pequeos
vstagos, muchos con sus respectivas races que pueden separarse y
plantarse en el lugar definitivo (Jordn Molero, 1984).
Otra forma de propagacin vegetativa es a travs de estacas; mtodo que
convenientemente ajustado podra ser usado a escala comercial.
Diferentes autores obtuvieron respuestas variables al utilizar estacas apicales o
subapicales, con diversos sustratos, en distintas pocas del ao y al incluir
tratamiento rizognico (Felippe, 1977; De Vargas, 1980; Sumida, 1980; Shock,
1982; Jordn Molero, !983 y 1984).
El cultivo de tejidos es otro mtodo de propagacin vegetativa que permite
obtener plantaciones ms uniformes, adems de la rpida multiplicacin clonal
(Yang, 1979 y 1981; Marcavillaca, 1985).
Marcavillaca et al (1993) proponen la combinacin de macro y
micropropagacin; las plantas micropropagadas se utilizan como banco de
plantas madres y en slo 3 ciclos de multiplicacin (1 de micro y 2 de
macropropagacin), se lograra a partir de una sola planta, material para
cultivar 3 ha (225.000 plantas).
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76
Autor:
Daro Rubn Taiariol.
Ingeniero Agrnomo.