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17/05/2016

HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS
MONOCLONALES
MSc. Adriana Paredes Arredondo
adriana.paredes.a@upch.pe

Modulo II Inmunotecnologa

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984

17/05/2016

Activacin clonal
Respuesta
Monoclonal
Respuesta
Monoclonal

Antgeno
(multiepitopes)

Respuesta
Monoclonal

Respuesta
Monoclonal
Respuesta
Policlonal

Ac. Monoclonales vs Ac. Policlonales


Ventajas
Reconoce un solo epitope en el antgeno
Produccin a gran escala de Ac muy especficos
Todos los lotes de produccin son semejantes

Desventajas
Altos costos de produccin
Equipamiento adecuado
Entrenamiento especializado

17/05/2016

Etapas en el desarrollo de un
anticuerpo monoclonal
1. Inmunizacin
2. Fusin (generacin de hibridomas)
3. Seleccin de hibridomas
4. Seleccin de clonas especficas
5. Produccin de los AcMo
6. Purificacin y caracterizacin de los AcMo

Generacin de linfocitos B
productores de Ac especficos
Seleccin del
Antgeno

Da 1

Inmunizacin

Da 21

Da 35
Da 26

Da 38

Fusin

Control

17/05/2016

Generacin de hibridomas
Antgeno
Seleccionado

2. Fusin
Cel de mieloma
SP2/0

Cel plasmticas
del bazo

+
1

4 5

7 8

9 10 11 12

A
B
C
D
E
F
G
H

1. Inmunizacin

3. Seleccin de los
Hibridomas con
suplemento HAT

Generacin de hibridomas
4. Crecimiento de los hibridomas

5. Tamizaje de los hibridomas


productores de Ac especficos

9 10 11 12

A
B
C
D
E
F
G
H

1 2
A 12
B
C
D
E
F
G
H

7. Expansin, congelamiento
y caracterizacin

9 10 11

6. Clonamiento

17/05/2016

Generacin de hibridomas

Generacin de hibridomas

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Control de calidad de los lotes de


produccin
Pureza
Funcionalidad
Especificidad
Control Microbiolgico
Bacterias
Virus
Hongos
Micoplasma
Almacenamiento en condiciones adecuadas
Temperatura
Uso de preservantes

Aplicaciones de los anticuerpos


monoclonales
Diagnstico

Investigacin
Bsica

Inmunoterapia

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Conjugacin de anticuerpos
Enzimas
Enzimainmunoensayos

Radioisotopos
Radioinmunoensayos

Fluorocromos
Inmunofluorescencia

Nanochips
Biosensores

Biotina
AmplificacinEstreptavidina

Oro Coloidal
Inmunoprecipitacin

PURIFICACIN DE
ANTICUERPOS Y ANTIGENOS
MSc. Adriana Paredes Arredondo
adriana.paredes.a@upch.pe

Modulo II Inmunotecnologa

17/05/2016

1. Purificacin de
Anticuerpos

Purificacin de anticuerpos:
precipitacin con compuestos qumicos

1. Sales: Sulfato de Amonio, Sulfato de Sodio


2. Solventes orgnicos: Etanol, Acetona
3. Polimeros no-inicos: Polietilenglicol (PEG)

17/05/2016

Purificacin de anticuerpos:
cromatografa de afinidad con protena A/G agarosa
Protena a ser
purificada:
Anticuerpo

Ligando:
Proteina A

Fracciones colectadas

Fracciones
colectadas

Medicin de
protenas
a 280 nm

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Especie
Humano

Ratn

Rata

Conejo

Tipo de Ig

Protena A

Protena G

IgG1

fuerte

fuerte

IgG2

fuerte

fuerte

IgG3

no se une

fuerte

IgG4

fuerte

fuerte

IgG1

dbil

fuerte

IgG2a

fuerte

fuerte

IgG2b

media

media

IgG3

dbil

media

IgG1

no se une

fuerte

IgG2a

no se une

fuerte

IgG2b

no se une

fuerte

IgG2c

dbil

fuerte

IgG

fuerte

dbil

Produccion de Ac en biorreactores
Adaptacin de los
hibridomas al medio
qumicamente
definido
7mo da de
cultivo

Inoculo inicial
1.5 x 106 cel/ml

Tomar
alcuotas a los
2, 5 y 7 das.
Evaluar
viabilidad,
concentracin
de protenas,
funcionalidad
de los Ac.

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Concentracin de Proteinas
(mg/ml)

Rendimiento de la produccin de Ac
en biorreactores
7
6

5.84

5
4
3
2

1.84

0.74

0.18

0
0

5
7
Tiempo (das)

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2. Purificacin de
protenas

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Caractersticas de la protena a
considerar para la purificacin

1. Peso molecular
2. Carga inica
3. Hidrofobicidad
4. Unin especfica a ligandos

Purificacin por cromatografa


Permite la separacin de molculas
diferentes presentes en una misma muestra.
El mtodo se basa en la circulacin de una
fase mvil (que arrastra la mezcla de
compuestos a separar), a travs de una fase
estacionaria o fase solida.
TIPOS:
1. Exclusin molecular
2. Intercambio inico
3. Afinidad

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Cromatografa por exclusin molecular


-Tambin conocida como
cromatografa de filtracin en gel
-La separacin de protenas es de
acuerdo a su tamao :
las molculas de mayor tamao
caern primero y sern
colectados en las primeras
fracciones
las molculas de menor tamao
difunden a travs de los poros
de la fase solida, lo cual retarda
su cada y sern colectadas en
la fraccin final

Sephadex,
agarosa,
poliacrilamida,
etc

Seguimiento del proceso de


purificacin

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Cromatografa de intercambio ionico


Separacin que se basa en la carga
elctrica de las protenas:
1. Intercambio Aninico: las
molculas a separar estn
cargadas negativamente y la resina
usada es Catinica
2. Intercambio Catinico: las
molculas a separar estn
cargadas positivamente y la resina
usada es Aninica

Intercambio aninico

Cromatografa de afinidad
Se basa en la afinidad biolgica
especifica de cada protena hacia un
ligando en particular, como por ejm.
Protena Ligando
Enzima Sustrato
Receptor Hormona
Anticuerpo Antgeno

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Particulas magneticas

Ventajas
Capacidad de explotar sus propiedades bioqumicas

(nicas).
Se evitan varios pasos de purificacin que con otras
tcnicas clsicas .
Normalmente se obtienen altos rendimientos y alta
actividad especifica .
Se pueden separar protenas, enzimas, anticuerpos,
membranas, receptores, vitaminas, antgenos incluso
clulas enteras

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