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ANDRIA APARECIDA TRAINA

EFEITOS BIOLGICOS DO OZNIO DILUDO EM GUA NA


REPARAO TECIDUAL DE FERIDAS DRMICAS EM RATOS

So Paulo
2008

Andria Aparecida Traina

Efeitos biolgicos do oznio diludo em gua na reparao tecidual


de feridas drmicas em ratos

Tese de Doutorado apresentada Faculdade de


Odontologia da Universidade de So Paulo, para
obter ttulo de Doutor, pelo Programa de PsGraduao em Odontologia.
rea de Concentrao: Cirurgia e Traumatologia
Buco-Maxilo Faciais
Orientadora: Profa. Dra. Maria Cristina Zindel Deboni

So Paulo
2008

Catalogao-na-Publicao
Servio de Documentao Odontolgica
Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo

Traina, Andria Aparecida


Efeitos biolgicos da gua ozonizada na reparao tecidual de feridas drmicas
em ratos / Andria Aparecida Traina; orientador Maria Cristina Zindel Deboni. -So Paulo, 2008.
122p. : fig., tab., graf.; 30 cm.
Tese (Doutorado - Programa de Ps-Graduao em Cincias Odontolgicas.
rea de Concentrao: Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Faciais) -- Faculdade
de Odontologia da Universidade de So Paulo.
1. Oznio
leses

2. Irrigao localizada

3. Tecido animal

4. Ferimentos e

CDD 617.605
BLACK D76

AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR


QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA,
DESDE QUE CITADA A FONTE E COMUNICADA AO AUTOR A REFERNCIA DA CITAO.
So Paulo, ____/____/____
Assinatura:
E-mail:

FOLHA DE APROVAO
Traina AA. Efeitos biolgicos do oznio diludo em gua na reparao tecidual de
feridas drmicas em ratos [Tese de Doutorado]. So Paulo: Faculdade de
Odontologia da USP; 2008.
So Paulo, ...../...../.........

Banca Examinadora
1) Prof(a). Dr(a). ____________________________________________________
Titulao: _______________________________________________________
Julgamento: ______________________

Assinatura:

2) Prof(a). Dr(a). ____________________________________________________


Titulao: _______________________________________________________
Julgamento: ______________________

Assinatura:

3) Prof(a). Dr(a). ____________________________________________________


Titulao: _______________________________________________________
Julgamento: ______________________

Assinatura:

4) Prof(a). Dr(a). ____________________________________________________


Titulao: _______________________________________________________
Julgamento: ______________________

Assinatura:

5) Prof(a). Dr(a). ____________________________________________________


Titulao: _______________________________________________________
Julgamento: ______________________

Assinatura:

Dedico este trabalho aos meus estimados e


queridos pais, Jaime e Marilda, exemplos de
primeira grandeza na minha vida, e que sonharam
antes de mim com as minhas vitrias.

s minhas queridas irms, velyn e Fabola,


minhas melhores e eternas amigas, que sempre
esto ao meu lado.

Tenho a certeza que estaremos sempre prontos


para enfrentar todos os desafios que a vida nos
apresenta, de forma corajosa e fraterna, para que
possamos usufruir a nossa bela famlia.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

minha orientadora Profa. Dra. Maria Cristina Zindel Deboni, pela amizade e
ateno, pela colhida segura e incansvel e pela preocupao com minha formao,
desde a poca acadmica.
Um exemplo de pessoa, cirurgi-dentista, professora e orientadora. A
finalizao deste trabalho mais uma conquista que compartilhamos juntas, fruto de
sua orientao.
Em nome da honra de ser seu discpulo, meu sincero agradecimento.

Profa. Dra. Maria da Graa Naclrio-Homem, por sua orientao na minha


vida pessoal e profissional, e pelo privilgio de trabalhar ao seu lado.
Minha grande admirao.

Sempre serei imensamente grata s minhas professoras e amigas....

Estimarei como aos meus prprios pais quele que me ensinou esta arte
(Juramento de Hipcratis, 460AC).

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Jaime e Marilda, e s minhas irms, velyn e Fabola, pelo
constante apio, incentivo, carinho, amizade, compreenso, amor e pela linda famlia
que compomos. Ao meu cunhado, Marcelo, a alegria que nos trouxe.

Aos docentes, aos alunos e aos pacientes da Disciplina de Cirurgia, pela


participao na minha formao como cirurgi-dentista, que me proporcionaram
experincia didtica para minha formao acadmica. Ao Prof. Dr. Antonio Carlos de
Campos pelas oportunidades oferecidas.
Cida, Angela, Rose, Natlia, Belira e Edson por todas perguntas respondidas.
Ao Prof. Dr. Joo Gualberto e a Dra. Lucimar pela orientao e oportunidade de
utilizar o biotrio.

Aos queridos amigos, Dr. Basile Jos Neto e a mdica Dra. Vera Pozzani, que
sempre me apoiaram na minha vida pessoal e profissional, agradeo a oportunidade
de compartilhamos momentos juntos.

Ao Prof. Dr. Wilfredo Urruchi, que nortiou os passos tcnicos inicias desta
linha de pesquisa.

Ao Dr. Leandro Botelha Hanna pela oportunidade de estarmos juntos e


compartilhamos uma vida de muitas emoes e objetivos em comum.

A todos os meus queridos amigos que sempre esto ao meu lado, me


ajudando e apoindo, e queles que contriburam para a finalizao deste
trabalho.

Ao Departamento de Patologia Geral e Bucal que possibilitou a realizao da


parte laboratorial deste trabalho. Profa. Dra. Luciana Correia pela excelente
recepo e auxlio fundamentais para a elaborao desta pesquisa. Ao Prof. Dr.
Dcio das Santos Pinto Junior, por ter desprendido parte do seu tempo para
realizao das fotos. Elisa e Bia que me guiaram na resoluo dos mistrios de
cada experimento no laboratrio. A aluna de doutorado Renata Aai, pela orientao
e contribuio gentilmente concebidas.

agncia financiadora, Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So


Paulo - FAPESP.

Agradeo a Deus a oportunidade da vida, da sade, de uma famlia feliz, de


ter conhecido todas as pessoas aqui citadas e outras especiais, de ter seguido este
caminho e, mais uma vez, conquistar um objetivo.

A FOUSP, a certeza de uma vez estado aqui, serei sempre daqui, me enche
de alegria e muito orgulho...

Traina AA. Efeitos biolgicos do oznio diludo em gua na reparao tecidual de


feridas drmicas em ratos [Tese de Doutorado]. So Paulo: Faculdade de
Odontologia da USP; 2008.

RESUMO

A ozonioterapia tem sido descrita como uma alternativa de tratamento para vrias
doenas por intervir possivelmente de forma favorvel na reparao tecidual. A
proposio desta pesquisa foi analisar os efeitos biolgicos do oznio diludo em
gua no processo de reparao tecidual, empregando duas concentraes
diferentes. Foram realizadas feridas drmicas padronizadas, com a utilizao de
punch, para exciso de fragmento da pele, com 5mm de dimetro e profundidade,
no dorso de 48 ratos. Os animais foram divididos em quatro grupos, conforme o
tratamento realizado: em um grupo as feridas foram irrigadas com gua ozonizada
na concentrao de 4ppm (GO3>), em outro foi utilizada gua ozonizada na
concentrao de 1ppm (GO3<), no grupo controle positivo a gua empregada no foi
ozonizada (Ggua) e no controle negativo as leses no receberam tratamento
(Gnada). As irrigaes foram realizadas durante dez minutos no trans-operatrio e
durante cinco minutos no ps-operatrio dirio, e os animais foram sacrificados nos
perodos de 2, 7 e 14 dias. Nestes momentos, as feridas foram fotografadas para
avaliao macroscpica, sendo que as imagens foram analisadas por software de
morfometria (ImageLab2000), e os espcimes foram processados para avaliao
microscpica, em anlise histomorfolgica, histomorfomtrica (por meio do mesmo
software) e imunoistoqumica para anticorpo colgeno tipo-I e anti-actina. Todos os

dados foram submetidos a estudo quantitativo e os obtidos pelo software tambm a


estudo estatstico (Teste de Hiptese de Wilcoxon). Os resultados morfomtricos
demonstraram que, em 7dias, entre todos os grupos irrigados, o GO3< apresentou
maior reduo da rea e que, no ltimo perodo de observao, o GO3> apresentou
contrao da ferida mais regular, com diferenas estatisticamente significantes em
comparao aos outros grupos. No perodo inicial de observao, a anlise
histomorfolgica revelou que os GO3> e GO3< apresentaram expresso mais intensa
do processo inflamatrio, do que o grupo controle positivo, e demonstraram maior
produo de matriz colagnica. No ltimo perodo, em ambas anlises histolgicas,
o GO3> e Gnada apresentaram de forma mais expressiva as caractersticas
histolgicas do tecido de granulao em formao, como expresso mais intensa de
sntese de colgeno e formao de matriz colagnica mais organizada. As anlises
imunoistoqumicas revelaram que a marcao do colgeno tipo-I foi regular para
todos os grupos, e que os grupos irrigados com gua ozonizada apresentaram maior
nmero de miofibroblastos. Provavelmente a capacidade do oznio em interferir em
reaes bioqumicas celulares, bem como a maior quantidade de oxignio
proveniente da gua ozonizada, podem estar relacionados aos eventos observados
reparao tecidual, que podem ser interpretados como favorveis dependendo da
situao clnica. Os resultados desta pesquisa sugeriram atuao do oznio diludo
em gua na reparao das leses teciduais, de forma dependente da dose, com
possvel favorecimento ao fechamento tecidual e provvel estmulos inflamatrios e
reparadores que favoreceram a sntese de tecido, sem produzir efeito txico ou
prejudicial.
Palavras-Chave: Oznio, Reparao tecidual, Contrao de ferida, Irrigaes
cirrgicas

Traina AA. Biological effects of ozone in water on dermal wound healing in rats [Tese
de Doutorado]. So Paulo: Faculdade de Odontologia da USP; 2008.

ABSTRACT

The ozone therapy has been described as an alternative treatment for many
diseases due to its action on tissue healing. The purpose of this research was to
analyze the biological effects of ozonized water, in two different concentrations, on
tissue healing. Standard dermical wounds were made with a punch to excise a skin
fragment with 5 millimeters diameter and depth, in the back of 48 rats. The animals
were divided in four groups according to treatment: in one group the wounds were
irrigated with ozonized water at 4ppm (GO3>), in other group the wounds were
irrigated with ozonized water at 1ppm (GO3<), in the positive control the water was
not ozonized (Gwater) and in the negative control the wound did not received any
treatment (Gnoun). The irrigations were realized during ten minutes in the transoperative time and daily, during five minutes, in the post-operative period. The
animals were sacrificed on days 2, 7, and 14 following the procedure. At the time of
sacrifice, the wounds were photographed to macroscopic assessment. The images
were analyzed by morphometry software (ImageLab2000) and the specimen were
processed for microscopic, histomorfologic and histomorfometric (by the same
software) analysis, and also for immunohistochemistry with antibody collagen type-I
and anti-actyn. All data were submitted to quantitative analysis and the data got by
the software were also submitted to statistic analysis (Wilcoxon Test). The

morphometric analysis demonstrated that, in 7 days, among all groups, the GO3<
group showed a bigger area reduction, and in the last period (14 days), the GO3>
group showed more regular wound contraction; with statistically significant
differences in comparison with the others groups. In the last period, the GO3> group
showed a better shape factor (relation between area and perimeter) with statically
significant differences in comparison to others groups. In the initial period of
observation (2 days), the histomorphologic analysis revealed that the GO3> and
GO3< groups showed more intense expression of inflammatory process than the
positive control group, and also demonstrated increased production of collagen
matrix. In the last period, for both histologic analyses, the GO3> e Gnoun showed more
evident features of healing process, as such more intense expression of fibrils
collagen and collagen matrix synthesis. The immunohistochemistry studies revealed
that the collagen type-I scoring was regular for all groups and that the irrigated
groups with ozonized water showed a higher number of miofibroblasts. Probably, the
ozones capacity to interfere in biochemistry cellular reactions, as well the high
oxygen quantity originated from ozonized water, may be related to tissue healing
events, that may be favorable for some clinical situation. These results suggest that
the ozonized water acts on tissue repair, in a dose dependent way, contributing to
wound contraction and to tissue synthesis, without toxic effect.

Key-words: Ozone, Tissue healing, Wound contraction, Surgical irrigation

LISTA DE GRFICOS

Grfico 5.1 - Morfometria - representao da rea da ferida.................................... 75


Grfico 5.2 - Morfometria - representao do fator de forma.....................................76
Grfico 5.3 - Histomorfometria - representao da celularidade................................83
Grfico 5.4 - Histomorfometria representao do espao branco...........................83
Grfico 5.5 - Histomorfometria representao da matriz colagnica......................84

LISTA DE TABELAS

Tabela 5.1 - Dados da anlise morfolgica com relao porcentagem de permetro,


rea e fator de forma.............................................................................73
Tabela 5.2 - Dados da anlise histomorfolgica de acordo com escala arbitrria de
expresso .............................................................................................77
Tabela 5.3 - Dados da anlise histomorfomtrica digital............................................82
Tabela 5.4 Dados da anlise da imunoistoqumica para colgeno tipo-I de acordo
com escala arbitrria de expresso de expresso...............................85

LISTA DE FIGURAS

Figura 4.1 - Utilizao do punch.................................................................................61


Figura 4.2 - Exciso do tecido....................................................................................61
Figura 4.3 - Delimitao do permetro........................................................................66
Figura 4.4 - Clculo da rea.......................................................................................66
Figura 4.5 - Esquema dos campos escolhidos para histomorfometria no perodo de
2 dias......................................................................................................69
Figura 4.6 - Esquema dos campos escolhidos para histomorfometria no perodo de
7 dias......................................................................................................69
Figura 4.7 - Esquema dos campos escolhidos para histomorfometria no perodo
de 14 dias...............................................................................................69
Figura 5.1 - Fotografias das feridas de acordo com os grupos e perodos................74
Figura 5.2 - Fotomicrografia dos cortes histolgicos de cada um dos grupos no
perodo de 2 dias....................................................................................79
Figura 5.3 - Fotomicrografia dos cortes histolgicos de cada um dos grupos no
perodo de 7 dias....................................................................................80
Figura 5.4 - Fotomicrografia dos cortes histolgicos de cada um dos grupos no
perodo de 15 dias..................................................................................81
Figura 5.5 - Fotomicrografia dos cortes histolgicos corados pela reao de
imunoistoqumica para anticorpo colgeno tipo-I de cada um dos grupos
no perodo de 7 dias...............................................................................87
Figura 5.6 - Fotomicrografia dos cortes corados pelas reaes de imunoistoqumica
para anticorpo colgeno tipo-I de cada um dos grupos no perodo de 14
dias.........................................................................................................88

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BSA

Soluo salina fosfato-tamponada com albumina bovina

DAB

Diaminobenzidina

DNA

cido desoxirribonuclico

EGF

Fator de crescimento epitelial

ERO

Espcies reativas de oxignio

FGF

Fator de crescimento fibroblstico

FOUSP

Faculdade de Odontologia de So Paulo

GO3>

Grupo que empregou gua ozonizada na maior concentrao

GO3<

Grupo que empregou gua ozonizada na menor concentrao

Ggua

Grupo que empregou gua no ozonizada - controle positivo

Gnada

Grupo que no recebeu irrigao - controle negativo

HE

Hematoxilina e Eosina

IFN-

Interferon-

IL

Interleucinas

LIDO

Laboratrio de Informtica Dedicado Odontologia

NFB

Fator nuclear B

tomo de Oxignio

O3

Oznio

O2

Oxignio / dioxignio

PDGF

Fator de crescimento derivado da plaqueta

pH

Potencial hidrogeninica

POL

Produtos oxidativos lipdios

Redox

Reaes de oxidao e reduo

RNA

cido ribonuclico

VEGF

Fator de crescimento endotelial vascular

TGF-

Fator de crescimento tumoral-

TRIS

Tri-hidroxil-metil-aminometano

TNF-

Fator de necrose tumoral-

LISTA DE SMBOLOS

Graus Celsius

Micrmetro

Microgramas

dpi

Dots per Inch = Pontos por Polegada

Kg

Kilograma

Litro

Metro

m3

Metros cbicos

min

Minuto

ml

Mililitro

mg

Miligramas

mm

Mililitros

MHz

Um milho de Hertz

Nmero

ppm

Partes por milho (=mg/L)

Vezes

Por cento

+/-

Desvio Padro

pi = 3,14...

SUMRIO

p.
1 INTRODUO .......................................................................................................19
2 REVISO DA LITERATURA .................................................................................21
2.1 Histrico da ozonioterapia ...............................................................................21
2.2 Biofsica do oznio ..............................................................................................24
2.3 Bioqumica do oznio ..........................................................................................27
2.4 Formas de administraes da ozonioterapia .......................................................45
2.5 Indicaes da ozonioterapia ................................................................................46
2.6 Aplicaes da ozonioterapia na odontologia .......................................................50
3 PROPOSIO .......................................................................................................59
4 MATERIAL E METODOS ......................................................................................60
4.1 Amostra experimental .......................................................................................60
4.2 Procedimentos realizados ................................................................................60
4.3 Produo da gua ozonizada ...........................................................................63
4.4 Anlise das leses induzidas ...........................................................................65
4.4.1 Avaliao macroscpica Anlise morfomtrica .............................................65
4.4.2 Avaliao microscpica ....................................................................................67
4.4.2.1 anlise histomorfolgica ................................................................................67
4.4.2.2 anlise histomorfomtrica .............................................................................67
4.4.2.3 anlise imunoistoqumica ..............................................................................70
5 RESULTADOS .......................................................................................................73
5.1 Avaliao macroscpica morfomtrica ........................................................73

5.2 Avaliao microscpica ....................................................................................77


5.2.1 Anlise histomorfolgica ...................................................................................77
5.2.2 Anlise histomorfomtrica ................................................................................82
5.2.3 Anlise imunoistoqumica .................................................................................85
6 DISCUSSO ..........................................................................................................89
7 CONCLUSO ......................................................................................................105
REFERNCIAS .......................................................................................................106
ANEXOS .................................................................................................................117

19

1 INTRODUO

A reparao tecidual considerada um fenmeno complexo que envolve uma


seqncia anloga de estgios bioqumicos celulares modulados por reaes de
oxidao e reduo de um organismo (SEN et al. 2002; SEN; ROY, 2008). Enfatizase que a mesma essencial para qualquer processo de recuperao frente a um
traumatismo ou a uma doena.
Atualmente, a ozonioterapia tem sido explorada como uma alternativa
teraputica no tratamento de muitas doenas agudas e crnicas, por ser capaz de
intervir no equilbrio de oxido-reduo. O oznio, sendo um potente oxidante,
quando em contato com fluidos orgnicos acarreta na formao de molculas
reativas de oxignio, que influenciam eventos bioqumicos do metabolismo celular, o
que

pode

proporcionar

benefcios

reparao

tecidual,

alm

do

efeito

antimicrobiano.
H inmeras possibilidades de indicao para o uso teraputico do oznio, j
com bons indcios comprovados para o tratamento de algumas situaes clnicas.
Alm disso, vrias vantagens desta terapia so referidas na literatura, por exemplo,
potente ao antimicrobiana, fcil aplicao sistmica ou local, baixo custo, ausncia
de efeito adverso, intolerncia ou contra-indicao (BAYSAN; WHILEY; LYNCH,
2000; BOCCI, 2006c; MARTNEZ-SANCHES et al., 2005).
At o momento, h muita ateno e debate com relao dose teraputica
adequada, pois, se o oznio for empregado em concentraes imprprias, pode ser
intil ou txico, o que torna muitas vezes sua aplicao controversa e questionada
na literatura. Adicionalmente, apesar do crescente nmero de publicaes a respeito

20

do emprego teraputico do oznio ainda h um relativo empirismo quanto aos


conhecimentos tericos e clnicos. Desta forma, a ozonioterapia se revela um campo
aberto para pesquisa sobre sua efetividade e seu desempenho biolgico que
certifique o controle das suas aes teraputicas.
Uma perspectiva de uso fcil e seguro a aplicao local do oznio diludo
em gua. A gua ozonizada pode ser capaz de beneficiar a reparao tecidual e
apresentar diversas indicaes na rea da odontologia.
Neste contesto, propusemo-nos a pesquisar os efeitos biolgicos do oznio
diludo em gua na reparao tecidual de feridas drmicas induzidas em animais,
como uma etapa inicial importante para subsdio cientfico que fundamente seu
possvel uso clnico.

21

2 REVISO DA LITERATURA

2.1 Histrico da ozonioterapia

Em 1840, Christian Friedrich Schnbien descobriu uma variante mais


alotrpica e mais ativa do que o oxignio (O2): o oznio (O3) (GROOTVELT et al.,
2004a; VERANES et al., 1998; VERANES et al., 1999). Este gs foi primeiramente
mensurado em 1853 em montanhas australianas (VALACCHI; FORTINO; BOCCI,
2005).
O primeiro gerador de oznio foi desenvolvido por Werner von Siemens, na
Alemanha por volta de 1854, e o primeiro relato do seu uso teraputico foi feito por
C. Lender em 1870, com o propsito de purificar o sangue (GROOTVELT et al.,
2004b).
Desde a Primeira Guerra Mundial, a aplicao tpica do oznio reportada
para o tratamento de feridas infectadas devido suas propriedades antimicrobianas
(CARDOSO et al., 2000; GROOTVELT et al., 2004a).
Em 1974, Wolf publicou um mtodo de auto-hemoterapia com oznio, no qual
o sangue humano era retirado do paciente, exposto a uma mistura de oznio e
oxignio durante poucos minutos em vidros adequados, e reinfundido no paciente
doador. Desde ento, este mtodo tem sido utilizado com finalidades teraputicas
(TRAVAGLI; ZANARDI; BOCCI, 2006).
Na odontologia, por volta de 1933, o oznio foi utilizado para o tratamento de

22

cries e infeces periodontais crnicas por E. A. Fisch1 (1934, apud STNGER;


SABER; FILIPPI, 2006). A utilizao teraputica em cirurgias bucais referendada a
outro cirurgio alemo Dr. Erwin Payr, com dados reportados em um congresso
alemo de cirurgia, em 1935, sem publicao indexada. A literatura disserta que
nesta poca a gua ozonizada foi utilizada nas cirurgias para promover hemostasia,
melhorar oxigenao local e inibir a proliferao bacteriana (AZARPAZHOOH;
LIMEBACK, 2008).
De acordo com Bocci (2004a), Bulis et al. (1997) e Grootvelt et al. (2004b), o
oznio um gs que alimenta controvrsias porque, ao mesmo tempo em que
apresenta grande possibilidade de utilizao teraputica, um gs altamente txico
por via respiratria, embora seja til na estratosfera para a absoro da radiao de
raios ultravioleta, B e C. O sistema broncopulmonar, olhos e a pele so os rgos
mais vulnerveis ao oznio na atmosfera. Os efeitos txicos locais e sistmicos
deste gs no sistema pulmonar, quando respirados, incluem hiperatividade das vias
areas, aumento da permeabilidade macromolecular epitelial, infiltrao de
neutrfilos e hipersecreo de muco (PRYOR; SQUADRITO; FRIEDMAN, 1995).
Bocci (2006b) relatou alguns argumentos que poderiam coligir proibio do
uso do oznio na medicina: um gs txico que no deve ser respirado; muitas
doenas so perpetuadas por um estresse oxidativo crnico, nas quais um gs
gerador de radicais livres (oxidantes) no deveria ser utilizado; e sua aplicao
intravenosa incorreta tem grande risco de embolia pulmonar e morte (procedimento
proibido na Alemanha deste 1984).
Para Bocci (2004a, 2006b, 2006c, 2008) e Re et al. (2008), durante muito
tempo, a ozonioterapia foi utilizada de forma emprica por profissionais no
1

Fisch EA. Die ozontherapie in der Zahn-, Mund-, Kieferheikunde [thesis]. Bonn, Germany: Rheinische
Friedrich Wilhems Universitt; 1934.

23

adequadamente qualificados, criando um ceticismo com relao aos seus efeitos.


Esses fatos, juntamente com a falta de preciso dos geradores de oznio, a
dificuldade em se estabelecer a dose teraputica adequada, o charlatanismo das
empresas, a falta de interesse das autoridades governamentais para regulamentar
seu uso, o pouco suporte financeiro para pesquisas cientificas, a inexistncia de
veemncia por parte da indstria farmacutica por no ser um produto patentevel, a
escassez de pesquisas controladas que estabelecesse sua real eficincia clnica e
sua toxicidade, ao lado da existncia de trabalhos com metodologias inadequadas,
tm mantido a ozonioterapia questionvel na medicina e tem impedindo sua maior
utilizao.
Inmeros estudos tm investigado a ao do oznio para tentar elucidar os
efeitos txicos decorrentes da sua exposio e para estabelecer a dose teraputica
correta (BOCCI, 2006b, 2006c; CARDOSO et al., 2000; VALACCHI et al., 2002,
2003, 2004; VALACCHI; FORTINO; BOCCI, 2005). Atualmente, segundo Re et al.
(2008), a literatura sobre o tema vem sendo ampliada, ainda com incertezas sobre
seu potencial txico e sua eficincia clnica. Bocci (2007, 2008) e Larini e Bocci
(2005) afirmaram que a toxidade do oznio hoje bem conhecida e controlvel, e
que, aps dcadas de estudos clnicos e experimentais, este gs considerado, em
concentraes apropriadas, teraputico, seguro e no txico, e deveria ser integrado
medicina convencional.
A ozonioterapia no oficializada em muitos pases, onde servios privados
tm utilizado-a vastamente (HERNNDEZ, 2007). Seu emprego freqente em
pases subdesenvolvidos, onde os geradores de oznio no tm acompanhamento
tcnico adequado e faltam recursos para pesquisa dos conhecimentos bsicos sobre
suas aes biolgicas. Pases como Alemanha e Itlia, com experincia do uso do

24

oznio principalmente em hrnia de disco, tem pouqussimos trabalhos cientficos. A


Inglaterra, Frana e Estados Unidos dificilmente utilizam a ozonioterapia,
principalmente devido ao pouco estmulo das autoridades em sade e da indstria
farmacutica que no tem interesse comercial nesta terapia (BOCCI, 2007). Naes
emergentes como China, ndia e Mxico esto investindo no uso do oznio,
especialmente para tratamento de doenas vasculares e ortopdicas (BOCCI, 2008).
De acordo com Al-Dalain et al. (2001), o oznio vem sendo utilizado como
agente teraputico pela observao clnica dos seus efeitos benficos, sendo que
seus mecanismos bioqumicos e farmacolgicos precisam ser melhores elucidados,
necessitando de mais pesquisas cientficas.
Nas

ltimas

quatro

dcadas,

ozonioterapia

tem

sido

estudada

cientificamente, tanto com relao a seus conceitos bsicos como a seus efeitos
clnicos, o que tem permitido que na atualidade haja um melhor conhecimento de
sua ao biolgica (BOCCI, 2004a, 2008), ampliando sua utilizao na Europa e em
alguns pases, como Austrlia, Israel, Cuba, Brasil e Colmbia (GROOTVELT et al.,
2004a). Segundo Stbinger, Saber e Filippi (2006), o uso desta terapia ainda
insipiente em cirurgia buco-maxilo-facial.

2.2 Biofsica do oznio

O oznio formado por uma molcula tri-atmica do tomo de oxignio (O)


de estrutura cclica. Dependendo de uma srie de condies, como temperatura e
presso, o O3 pode se decompor rapidamente em molculas de tomos puros de

25

oxignio, dioxignio (O2) e em potentes oxidantes (STBINGER; SABER; FILIPPI,


2006).
Em temperatura ambiente, um gs azul de odor caracterstico que pode ser
notado em concentraes acima de 2ppm (STBINGER; SABER; FILIPPI, 2006).
Em condies normais, a concentrao do oznio no ar atmosfrico gira em torno de
0,1ppm e, em condies de muita poluio (dias quentes em cidades industriais),
pode exceder 0,8ppm (VALACCHI et al., 2002, 2003, 2004).
A molcula do oznio a terceira oxidante mais potente, aps o fluoreto e
persulfato. Em relao ao oxignio (O2), tem um maior poder oxidante, uma ao
mais seletiva sobre os componentes orgnicos, muito mais instvel, 1,6 mais
denso e 10 vezes mais solvel na gua (BOCCI, 2004a; BULIS et al., 1997).
Atualmente, h vrios tipos de geradores de oznio com o propsito de
aplicaes clnicas (GROOTVELT et al., 2004a). Atravs de um gradiente de alta
voltagem, esses geradores produzem o O3 a partir da passagem e fotodissociao
do dioxignio em tomos de oxignio (O2 2O), que reagem com outras molculas
de dioxignio, formando o oznio (O2 + O O3). Para esta produo, deve-se
empregar oxignio puro porque na presena do ar atmosfrico, outros compostos,
como dixido de nitrognio, tambm sero formados. essencial que os geradores
sejam produzidos com alta qualidade e com materiais resistentes ao oznio, como o
ao inoxidvel, o vidro e o Teflon (BOCCI, 2004a, 2006b).
Segundo Filippi (1998), o oznio liberado no ar durante sua produo por
geradores e durante a produo da gua ozonizada no atinge concentrao
atmosfrica que represente riscos ou contra-indicaes para sua utilizao.
Como o oznio uma molcula instvel, esse se decompe facilmente em
oxignio por reao exotrmica (GROOTVELT et al., 2004a), apresentando meia

26

vida de quarenta minutos a 20-25C, no podendo ser armazenado, devendo ser


rapidamente utilizado (BOCCI, 2004a, b; BULIS et al., 1997).
O oznio dissolve-se fisicamente em gua pura, dependendo da temperatura,
presso e concentrao do gs. Nesta situao sua instabilidade de modifica, sendo
que parte das molculas se decompe em segundos e parte permanece estvel por
horas (STBINGER; SABER; FILIPPI, 2006). Assim, a meia-vida da poro estvel
gira em torno de 10 horas (em um pH=7 e a 20oC), podendo permanecer na gua
por alguns dias se armazenado em recipiente de vidro rigorosamente fechado
(BOCCI, 2004a, b, 2006c; BULIS et al., 1997).
O oznio pode ser misturado com leos, por meio de descargas eltricas,
como o de girassol que possui alta afinidade por ser rico em cidos insaturados.
Quando ozonizados esses cidos formam ozondeos e, da hidrlise destes, podem
ser gerados aldedos, cetonas e perxidos de hidrognio, que so responsveis pelo
desencadeamento das reaes bioqumicas (LINCHETA et al., 2000; SIQUEIRA et
al., 2000).
Aps a formao do oznio, este reage com qualquer doador de eltron que
sofre oxidao, gerando o O3- (anion radical), que se decompe em radical hidroxila,
formando tambm molcula de dioxignio. Dessa forma, esta reao torna o oznio
um oxidante potente que pode agir como precursor de uma srie de radicais, com
aes tanto in vitro como in vivo (GROOTVELT et al., 2004a).

27

2.3 Bioqumica do oznio

Quando em contato com fluidos orgnicos (saliva, plasma, urina e linfa), o


oznio reage imediatamente (O3 + biomolculas = O2 + O-), deixando de existir. Em
ordem de preferncia, o oznio reage com cidos gordurosos poliinsaturados,
antioxidantes (como cido ascrbico e rico) e compostos tiol com grupo SH (como
cistena, glutadiona e albumina). Dependendo da concentrao do oznio,
carboidratos, enzimas, DNA e RNA tambm podem interagir. Todos esses reagentes
funcionam como eltrons doadores e sofrem oxidao, e as reaes que ocorrem
formam simultaneamente molculas de espcies reativas de oxignio (ERO) e
produtos oxidantes lipdios (POL). Essas molculas so responsveis pelas reaes
bioqumicas induzidas pelo oznio (BOCCI, 2004a, 2006c, 2007).
A formao das ERO extremamente rpida e, depois de formadas, agem e
desaparecem imediatamente por serem molculas instveis, com meia vida menor
que um segundo. Mesmo com esta curta durao, so capazes de interagir com
componentes

celulares

desencadeando

efeitos

biolgicos

teraputicos

ou

prejudiciais, dependendo da concentrao (BOCCI, 2004a, 2006c).


Os POL so molculas menores, mais estveis e de maior difuso que as
ERO, podendo ser mais txicas, dependendo da concentrao. Devido a esta
estabilidade, os POL distribuem-se facilmente entre os tecidos e so diludos pelos
fluidos corporais. Sua excreo ocorre via urinria e bile e sua metabolizao
regulada principalmente por glutadiona-transferase e aldedos dehidrogenases.
Apenas concentrao micromolar alcana todos os rgos (particularmente o osso
medular,

fgado,

sistema

nervoso

central

glndulas

endcrinas).

Esta

28

farmacodinmica permite minimizar o potencial txico destas molculas e permite


que se tornem mensageiros tardios de longa distncia (BOCCI, 2006a, c).
As ERO tm emergindo como importantes molculas sinalizadoras na
regulao de vrios processos celulares, e incluem todas as molculas
quimicamente reativas derivadas da molcula de oxignio, geradas por fontes
endgenas e exgenas (calor, raios ultravioletas, frmacos teraputicos, radiao
ionizante e poluentes). Todas as clulas vivas, como linfcitos, neutrfilos,
moncitos, plaquetas, fibroblastos e osteoclastos, podem gerar estas molculas
durante seu metabolismo normal. Quando em excesso, as ERO resultam em
alterao do metabolismo das clulas responsveis pela sntese da matriz
extracelular, e em prejuzo a todos os constituintes celulares e aos componentes
extracelulares, podendo induzir a morte celular por apoptose e necrose. Como as
ERO so altamente reativas, produzem principalmente alterao no local da sua
gerao (ANAKI; ICEK; ANAKI, 2005).
Segundo Bocci (2006c), o conceito de que as ERO e os POL so sempre
lesivos tem sido revisto, porque estes em quantidade fisiolgica podem agir como
reguladores bioqumicos.
As reaes com as ERO podem gerar a formao de tomos de oxignio,
dioxignio,

superxido

aninico,

radical

hidroxila,

monxido

de

nitrognio,

peroxinitrato e hipoclorito aninico. A produo dos POL segue a peroxidao dos


cidos gordurosos poliinsaturados presentes no plasma. Estes produtos so
heterogneos e podem ser classificados como lipoperoxidase, radicais alcoxila,
lipohidroperxido, entre outros (BOCCI, 2004a, 2006c).
Entre as ERO, o perxido de hidrognio a espcie principal. Esta molcula
uma oxidante capaz de agir como um mensageiro do oznio e provocar uma srie

29

de efeitos celulares. Aps sua formao, esse perxido difunde-se facilmente para
dentro da clula, sendo capaz de ativar simultaneamente diferentes caminhos
bioqumicos (BOCCI, 2006c).
O perxido de hidrognio gerado pelo oznio uma das mais importantes
molculas sinalizadoras intracelulares que interage com diferentes clulas do
sangue: nos eritrcitos podem alterar a gliclise, aumentando a formao de energia
e o transporte de oxignio para o interior dos tecidos; nos neutrfilos e leuccitos
podem ativar e estimular a sntese de citocina e interleucinas, favorecendo uma
possvel re-ativao fisiolgica do sistema imunolgico deprimido; nas plaquetas
pode proporcionar aumento da atividade destas, e, como conseqncia, aumento da
liberao de autacides e fatores de crescimento, o que pode favorecer a reparao
de feridas teciduais (BOCCI, 2004a, 2006c).
Em baixas concentraes, as reaes com os POL podem ser estimuladoras
e benficas, por gerarem processos oxidativos agudos que funcionam como
sinalizadores ao organismo de outros estresses oxidativos existentes. Este fato
estimula mecanismos antioxidantes, como as enzimas antioxidantes superxido
dismutase,

glutadiona-peroxidase,

glutadiona-reductase,

catalase

heme-

oxigenase-I. Devido s aes dessas enzimas, as clulas da medula ssea podem


aumentar a liberao de clulas tronco (favorecendo a reconstituio de tecidos) e
as clulas endoteliais podem aumentar a produo de vrios compostos, como do
xido ntrico que atua na angiognese. Aquela sinalizao, tambm deve acarretar
na estimulao no sistema endcrino e nervoso central, o que ajuda a compreender
o porqu de alguns pacientes relatarem euforia e bem estar durante o tratamento,
provavelmente devido melhora do metabolismo bem como estmulo hormonal e
liberao de neurotransmisor (BOCCI, 2004a, 2006c, 2008).

30

Segundo Madej et al. (2007), a principal forma de proteo do corpo contra


radicais livres durante um processo sptico envolve mecanismos enzimticos, como
a atividade da dismutase superoxide, catalase e glutadiona-peroxidase. Os autores
comprovaram em estudo experimental que a ozonioterapia promoveu aumento da
atividade dessas enzimas, fato com significncia clnica que representa forte indcio
do efeito estabilizador e regenerador da ozonioterapia.
O termo estresse oxidativo conceituado como a prevalncia de espcies
oxidativas dentro da clula que suscitam atividades sobre as defesas antioxidantes
da mesma. O papel dessas complexas reaes de oxidao e reduo (redox) na
regularizao de mecanismos moleculares pode ter atuao teraputica ou
prejudicial (HERNNDEZ, 2007). Este estresse oxidativo parcialmente ou
totalmente a causa de muitas doenas, como cncer, aterosclerose, catarata,
maculopatia, Alzheimer e Parkinson. Em outras doenas, como diabetes,
insuficincia renal crnica e processos infecciosos, cria-se secundariamente uma
superproduo de ERO, o que piora a evoluo das mesmas (BOCCI, 2006a;
HERNNDEZ, 2007).
Em dose segura e correta, o oznio representa um estresse oxidativo agudo
no deletrio que induz uma reposta celular antioxidante capaz de reverter um
estresse oxidativo crnico existente, ou seja, ajuda a normalizar o balano redox
alterado

em

vrias

doenas.

Essa

atuao

pode

melhorar

circulao

(vasodilatao local e angiognese) e o suporte de oxignio, favorecer o


metabolismo e a liberao de citocinas, autacides e fatores de crescimento, que,
juntamente com a atividade antimicrobiana, representam elementos cruciais no
tratamento de doenas metablicas, inflamatrias, infecciosas ou neoplsicas
(BOCCI, 1996, 2006c). Para Bocci (2006c), a ao da ozonioterapia pode ser

31

interpretada como um choque teraputico atxico, capaz de restaurar a


homeostasia por ser um modificador da resposta fisiolgica.
Segundo Re et al. (2008), o oznio em baixas doses capaz de promover
uma pr-condio oxidativa por meio do aumento e preservao de sistemas
endgenos antioxidante. Os autores encontraram evidncias que este gs promove
a regularizao da concentrao endgena de xido ntrico e mantm um adequado
balano redox. Os mesmos autores relataram que o conceito farmacolgico de uma
droga, no qual h uma interao droga-receptor para promover uma atividade na
funo celular, parece no se aplicar ao oznio, o que acontece tambm com outros
tipos de gases, pois induzem atividade farmacolgica sem aquela interao drogareceptor. O oznio pode ser considerado uma pr-droga, a qual, em doses no
txicas, pode induzir uma reorganizao dos mecanismos bioqumicos com atividade
de segundo mensageiro na cascata de mltiplas aes.
De acordo com Bocci (1996), a ozonioterapia, tanto aplicada de forma local
como sistmica, pode acelerar a reparao tecidual devido ao fato do oznio
interagir em diferentes componentes celulares, como em eritrcitos, leuccitos,
plaquetas e clulas endoteliais.
A reparao tecidual consiste em eventos progressivos e ordenados,
caracterizada por vrias fases concomitantes reguladas por eventos biolgicos
especficos, que se iniciam no momento do trauma e permanecem por perodos
variados (GREGORI et al., 2004; SHAFER; MINE; LEVY, 1987).
Todas as fases da reparao so coordenadas por citocinas e fatores de
crescimento especficos. Por exemplo, na inflamao, atuam prostaglandinas,
interleucinas (IL) e xido ntrico; na re-epitelizao, o fator de crescimento epitelial
(EGF); na angiognese, o fator de crescimento fibroblstico (FGF) e fator de

32

crescimento endotelial vascular (VEGF); e na migrao e proliferao dos


fibroblastos, deposio e remodelao da matriz extracelular (colgeno tipo I, II e III),
o fator de crescimento derivado da plaqueta (PDGF), o FGF, fator de crescimento
tumoral- (TGF-), IL-1 e IL-4 (COTRAN; KUMAR; ROBBINS, 1994; KWON et al.,
2006).
A formao da matriz extracelular depende no apenas da sntese de fibras
colgenas e de outros componentes da matriz, como tambm da degradao deste
colgeno, o que regulado principalmente pelas metaloproteinases, cuja secreo
influenciada por inmeros estmulos, incluindo fatores de crescimento (PDGF e FGF)
e citocinas, IL-1 e fator de necrose tumoral TNF-). Inicialmente so depositados
colgenos tipo III que depois so remodelados para tipo I, conferindo a remodelao
e tenso ao tecido neoformado (COTRAN; KUMAR; ROBBINS, 1994; KWON et al.,
2006).
Os miofibroblastos so essenciais para sntese, remodelao e contrao do
tecido conjuntivo durante o processo de reparao normal ou patolgico. A
proliferao, diferenciao e apoptose dessas clulas envolvem uma seqncia de
fenmenos

complexos, regulados

por

combinaes de sinais moleculares

(GROTENDORST; RAHMANIE; DUNCAN, 2004; HINZ et al., 2007; MOULIN et al.,


2004; TOMASEK et al., 2002). Normalmente, essas clulas aparecem no meio do
processo de reparao e so responsveis por foras de contrao para o
fechamento da ferida e desaparecem nos estgios mais avanados (KWON et al.,
2006).
Em condies normais, os fibroblastos no exibem atividade de contrao e
produzem pouca matriz extracelular. Frente ao dano tecidual, essas clulas, entre
outras, so recrutadas a migrarem para o tecido danificado e proliferarem-se, sendo

33

ativadas por citocinas liberadas pela prpria inflamao ou por clulas residentes.
Os fibroblastos passam a adquirir fibras contrcteis, surgindo os

proto-

miofibroblastos, sendo importante, para este fato, a atuao do PDGF. A


diferenciao deste proto-miofibroblastos para miofibroblastos, que tem capacidade
de sintetizar e remodelar grandes quantidades de matriz extracelular,
caracterizada por nova expresso de -actina msculo liso e aumento da expresso
de fibronectina, que regulada principalmente pelo TGF-. No final do processo de
reparao, os miofibroblastos desaparecem por apoptose, induzida principalmente
pelo xido ntrico (GROTENDORST; RAHMANIE; DUNCAN, 2004; HINZ et al., 2007;
TOMASEK et al., 2002).
Feugate, Li e Martins-Green (2002) identificaram que o aumento de citocinas
atuantes na diferenciao dos miofibroblastos est correlacionado com a maior
expresso de miofibroblastos e acelerao do fechamento da ferida ou formao de
cicatriz.
Kandler et al. (2005) enfatizaram que em todo processo de reparao,
inclusive no tecido sseo e em doenas sistmicas, h necessidade de um equilbrio
entre a produo de ERO e sua neutralizao para se evitar toxicidade.
Exemplificaram a neutralizao dos perxidos de hidrognio realizada pelas
plaquetas, protegendo o tecido de granulao durante a remodelao ssea.
Durante a inflamao, que a primeira reposta reparadora fundamental para
a proteo do organismo e surgimento do novo tecido, na qual ocorre infiltrao de
neutrfilos e macrfagos no local da ferida, oxidantes so produzidos. Entre esse,
encontra-se as ERO, que podem promover ou desfavorecer a reparao tecidual.
Como exemplo, pode ser citado o perxido de hidrognio liberado fisiologicamente
por neutrfilos (SEN et al., 2002).

34

O exato mecanismo pelo qual o perxido de hidrognio interfere na reparao


ainda no bem conhecido. Este pode favorecer a reparao pela sua ao
bactericida direta e pela sua capacidade de estimular a liberao de fatores de
crescimento (como VEGF-4 e TGF-1) e de induzir a proliferao de fibroblastos e a
produo de colgeno. Por outro lado, este mesmo oxidante pode provocar efeitos
negativos, como citotoxidade, inibio da migrao de queratcitos e apoptose
celular, favorecendo a formao de cicatriz (WASSERBACER; PEREZ-MEZA;
CHAO, 2008; WILGUS et al., 2005).
Sen et al. (2002) demonstraram que os perxidos de hidrognio no apenas
induzem a expresso de VEGF nos macrfagos e queratincitos, atuando na
angiognese, como tambm estimulam a produo de colgeno. Esses resultados,
segundo os autores, comprovaram que a reparao tecidual est sujeita ao controle
redox.
De acordo com Wilgus et al. (2005), o potencial do perxido de hidrognio em
induzir proliferao de fibroblastos pode ter efeito positivo em feridas crnicas, ao
contrrio de feridas cirrgicas limpas em pacientes sistemicamente normais sem
risco de infeco, nos quais aquele oxidante poderia afetar esteticamente e
funcionalmente com a produo de cicatriz.
A hipoxia tecidual, causada por vasculopatia perifrica ou interrupo
vascular, representa uma importante limitao para a reparao tecidual. Fatores
que podem aumentar o suplemento de oxignio neste tecido, como a cmera
hiperbrica, podem favorecer e acelerar a reparao. Fries et al. (2005) verificaram
que a aplicao tpica de oxignio sobre feridas drmicas experimentais aumentou
a quantidade de oxignio disponvel no tecido superficial, acelerando clinicamente o

35

fechamento da mesma e favorecendo histologicamente a angiognese, sem feito


txico.
Sen e Roy (2008) lembraram que atualmente sabe-se que o oxignio, alm de
favorecer a desinfeco e gerar energia, so tambm sinalizadores de eventos
oxignio-dependente,

sensveis

ao

redox,

representando

um

componente

fundamental para todos os fatores relacionados reparao tecidual. Todos os


aspectos desta reparao (hemostasia, inflamao, re-epitelizao, vascularizao e
a atuao do xido ntrico) so sensveis ao balano redox. O entendimento da
gerao e da atuao das ERO na reparao de fundamental importncia para a
pesquisa de novos tratamentos. Terapias que atuam no balano redox podem ser de
grande utilidade para a reparao de feridas crnicas, lembrando os autores que
devem ser analisadas e aplicadas com cautela, por serem capazes tambm de
apresentarem potencial para desfavorecer a reparao e remodelao tecidual se
utilizadas em concentraes inadequadas.
O trabalho experimental de Cardoso et al. (2000) verificou que a
administrao oral de gua ozonizada (concentrao de 0,6g ml-1, verificada com
mtodo colorimtrico) pde diminuir a ocorrncia e a gravidade de lceras gstricas
induzidas e pde atenuar o edema de leses drmicas induzidas. Baseados nos
resultados, os autores sugerem que a gua ozonizada participa como modulador
especfico do processo inflamatrio por induo gradual do estresse oxidativo.
Segundo Gracer e Bocci (2005), a aplicao local do oznio em tecido
inflamado pode favorecer a normalizao metablica, a proliferao celular e a
sntese de matriz extracelular, sendo que aumenta a quantidade de leuccitos locais
e a liberao de fatores de crescimentos pelos eritrcitos e plaquetas para a
construo da matriz extracelular e reconstruo tecidual, induzindo sntese de

36

protenas, particularmente a heme-oxigenase I. A heme-oxigenase tem sido descrita


na literatura como uma das defesas enzimticas antioxidantes mais importantes que,
depois de ser quebrada em heme molcula, parteja muitos componentes teis como
o monxido de carbono e bilirrubina, facilitando a circulao local e neutralizando
compostos oxidantes. A bilirrubina um importante antioxidante lipoltico e, em sinal
com aquele monxido, coopera com o xido ntrico, regulando a vasodilatao
(BOCCI, 2004a, 2006c).
Pesquisando in vitro a toxidade da exposio ao oznio a linhagens de
clulas humanas monoctica, Foucaud et al. (2006) verificaram que esta provocou
aumento na peroxidao lipdica e na expresso da heme-oxigenase I, bem como
modificaes no estado redox e na atividade enzimtica antioxidante. Algumas
dessas mudanas na expresso de marcadores oxidativos puderam persistir por um
tempo prolongado, sugerindo que o oznio pode modificar a funo celular por um
perodo longo aps sua aplicao.
Foi demonstrado in vitro por Valacchi e Bocci (1999), que fatores de
crescimento, como o PDGF, TGF-1 e interleucinas, foram aumentados de modo
dose-dependente, aps a ozonizao de amostras plasmticas ricas em plaquetas.
Esses fatores so essenciais para a reparao tecidual. O aumento tardio da IL-8
permite a sada dos leuccitos da circulao para os tecidos, o que pode exercer
uma funo adicional, favorecendo a fagocitoses de bactrias e de tecido necrtico
presente em lceras e feridas. Esses fatos ajudam, segundo os autores, a explicar o
porqu da melhora na reparao tecidual de lceras crnicas em pacientes tratados
com ozonioterapia sistmica.
A proposio do estudo de Larini e Bocci (2005) foi de esclarecer se clulas
mononucleares do sangue perifricas isoladas, oriundas de 12 doadores saudveis

37

de sangue, quando expostas h 10 minutos ao oznio em diversas concentraes,


modificariam seu padro de proliferao e de produo de citocinas. Nas condies
experimentais, apenas baixas concentraes de oznio (1,0g/ml e 20g/ml de gs
por ml de suspenso de clula) tiveram efeito estimulador na proliferao celular e
na produo de interleucinas, principalmente interferon- (IFN-), TNF- e IL-10.
Atualmente bem conhecido que a bioqumica para a produo das citocinas
modulada por antioxidantes, como glutadiona, cido ascrbico, glutadionaperoxidase e catalase. Os autores lembraram que sempre h diferena na resposta
entre os organismos, havendo muita ou pouca resposta, a qualquer terapia, fato
evidenciado pelos resultados de trs doadores de sangue que no se comportaram
como os demais neste estudo. Esta dis-homegeneidade na produo de citocinas
deve ser lembrada, de acordo com os autores, porque na prtica pacientes
imunodeprimidos podem no ser responsivo a ozonioterapia.
Os autores Schulz e Stechmiller (2006) lembraram que a malnutrio, a
diabetes e que a utilizao de esterides acarretam na menor expresso do xido
ntrico, ao contrrio das feridas infectadas e inflamaes crnicas, fatos que
prejudicam a reparao. Desta forma, terapias para regular a sntese do xido ntrico
pode ser uma nova opo de tratamento para aquelas situaes, principalmente
quando h inflamao crnica que se comporta diferente da aguda, devido ao
desequilibro entre as molculas reguladoras do processo de inflamao.
Shi et al. (2001) identificaram que deficincia de xido ntrico prejudicou a
reparao tecidual, sugerindo que este xido tem um importante papel na sntese do
colgeno, sendo regulador da funo dos fibroblastos. Os autores lembraram que o
excesso deste xido, bem como sua falta, prejudica a reparao, pois este atua na

38

vascularizao, angiognese, inflamao e resposta imune do processo de


reparao.
O prejuzo tecidual em doenas inflamatrias, como na doena periodontal,
pode ser provocado pelas ERO produzidos fisiologicamente pelos neutrfilos. Dessa
forma, o xido ntrico produzido nestes casos pode induzir a apoptose de muitas
clulas, inclusive dos fibroblastos, contribuindo para a destruio tecidual
(ANAKI; ICEK; ANAKI, 2005).
De acordo com Chen et al. (2008a, b), o emprego da ozonioterapia tem sido
fortemente relacionado ao aumento da expresso de xido ntrico. Os autores
observaram experimentalmente efeitos benficos com esta terapia aplicada
previamente a transplantes de rim, atribudos ao seu provvel efeito protetor ao dano
tecidual, que acontece em decorrncia do processo inflamatrio, da isquemia e da
apoptose nestes casos.
Re et al. (2008) enfatizaram que o papel deste xido dbio, porque pode
aumentar o suporte sanguneo em regio isqumica, diminuindo o prejuzo tecidual
nessas regies, como pode tambm induzir a citotoxidade celular e destruio
tecidual via peroxidao lipdica, dependendo da sua concentrao, local de
liberao e durao da ao. Normalmente, em baixos nveis apresentam ao
protetora e em altos, ao prejudicial.
Para Batista et al. (2001) e Veranes et al. (1999), as reaes desencadeadas
pelo oznio podem refletir em: melhoramento do fluxo sanguneo e da circulao de
oxignio; aumento da capacidade de absoro do oxignio pelos eritrcitos e assim
ampliao da transferncia destes para os tecidos; estmulo do processo de
metabolizao do oxignio; ativao do sistema de defesa antioxidante; e aes
bactericidas, fungicidas e virulicida.

39

Com relao ao antimicrobiana, o oznio tem um forte efeito desinfetante


com amplo espectro de ao, por ser um potente oxidante que age na formao de
radicais livres. O gs no atua da mesma forma para todos os microorganismos,
sendo que alguns so mais sensveis que outros. Sua ao antimicrobiana atua
diretamente na destruio dos microorganismos, e pode ser atribuda inibio da
atividade metablica, mudana na cpsula, destruio irreversvel do DNA viral e
produo de anticorpos oznios-produzidos (STBINGER; SABER; FILIPPI,
2006).
A destruio da bactria pelo oznio pode ser realizada de duas maneiras:
reaes desencadeadas direta ou indiretamente (HEMS et al., 2005). Quando os
microorganismos (bactrias, vrus e fungos) esto dentro das clulas, so protegidos
por um potente sistema antioxidante destas, sendo que a ao antimicrobiana do
oznio ocorre por estimulao do sistema imunolgico desencadeada por este
composto (BOCCI, 2006c).
Segundo Bulis (1996) e Bulis et al. (1997), o oznio produz oxidao letal
no protoplasma bacteriano, por produzir alterao dos cidos gordurosos
insaturados da parede bacteriana, tornando-se microbicida, bactericida, fungicida e
parasiticida. Segundo os mesmos autores, o oznio possui ao antiinflamatria e
analgsica, com alvio de forma duradoura da sintomatologia dolorosa, por regular o
metabolismo celular, os mecanismos oxidativos celulares, por favorecer a
oxigenao tecidual e por ser imunomodulador. O aumento de oxignio nos tecidos
seria em decorrncia das reaes de oxidao com os cidos gordurosos
insaturados

da

membrana

fosfolipdica,

que

geram

perxidos

hidroflicos

estimulando a formao de substncias desoxigenantes, as quais atuaro sobre as


oxi-hemoglobina liberando oxignio.

40

Segundo Wentorth et al. (2002), o oznio pode estimular mecanismos de


defesa e alterar o funcionamento das citocinas, pois uma molcula do oznio
gerada fisiologicamente pelos neutrfilos do sistema imunolgico. No estudo in vivo
experimental desenvolvido por estes autores, ficou demonstrado a presena
fisiolgica de um oxidante com caractersticas qumicas similares molcula de
oznio durante o processo de inflamao, cuja molcula foi gerada durante a morte
bacteriana pelos anticorpos da superfcie dos neutrfilos ativados, juntamente com
outros potentes oxidantes, incluindo o oxignio, que um substrato para o processo
de oxidao para ativao de anticorpo. De acordo com os mesmos autores, essas
propriedades fazem do oznio uma molcula efetora ideal por poder estar localizado
no local da inflamao sem nenhum efeito prejudicial.
Os resultados do estudo animal de Torossian et al. (2004), sobre o efeito da
aplicao intra-abdominal do oznio no pr-operatrio de cirurgias para septicemia,
verificaram que essa aplicao aumentou os nveis de citocinas inflamatrias, tanto
no local da infeco como sistemicamente, indicando que o oznio pode estimular
mecanismos de defesa do sistema imune.
Para Hernndez (2007), uma ao oxidativa est fortemente envolvida no
efeito teraputico do oznio, o que acarreta em mudana metablica celular. Dessa
forma, para avaliar os efeitos e certificar a segurana da ozonioterapia seria
necessrio que o estado de antioxidao do paciente (capacidade do organismo de
responder a uma agresso oxidante) fosse pesquisado antes, durante e aps a
terapia. Esta pesquisa extremamente complexa de ser realizada, pois requer a
combinao de vrios testes baseados em mensuraes dos inmeros ndices do
estresse oxidativo existentes na bioqumica sangunea.

41

Quando o sangue ozonizado, o oznio entre em contato com as clulas


sanguneas, a reatividade deste controlada pelos sistemas antioxidantes
plasmticos (como acido rico, acido ascrbico e albumina). Apenas se a dose do
oznio exceder a capacidade desses sistemas podem ocorrer efeitos nocivos, como
hemlise (BOCCI, 2006b; CATALDO; GENTILINI, 2005; TRAVAGLI; ZANARDI;
BOCCI, 2006; TRAVAGLI et al., 2007).
A possibilidade de toxicidade do oznio no deve impedir seu uso teraputico.
Para se evitar efeitos indesejveis, de fundamental importncia o controle e
monitoramento clnico da dose aplicada, o que pode ser alcanado pelo uso correto
e cauteloso de um gerador de oznio de preciso e conhecimento da dose
teraputica correta (BAYSAN; WHILEY; LYNCH, 2000; BOCCI, 2004a, 2006c;
GROOTVELT et al., 2004a, b).
A concentrao de oznio para se alcanar efeitos teraputicos considerada
crtica por apresentar uma estreita variao na sua dose teraputica e baixo ndice
teraputico (definido pela razo da dose mnima de efeito teraputico e da dose
mnima de toxidade) (BAYSAN; WHILEY; LYNCH, 2000; BOCCI, 2004a, 2007;
GROOTVELT et al., 2004a, b; LARINI; BOCCI, 2005). O sucesso da ozonioterapia
depende de uma dose mnima, correta e segura, capaz de estimular inmeros
eventos bioqumicos, finalizando na estimulao da capacidade natural de reparao
tecidual, sem efeitos nocivos (BOCCI, 2006b). Segundo Bocci (2006b, 2007), a idia
de quanto mais, melhor no se aplica ao oznio.
A concentrao teraputica ideal do oznio tem sido determinada por estudos
experimentais e depende do estgio da doena a das condies do organismo
(BOCCI, 2004a, 2006c; GROOTVELT et al., 2004b), e deve ser ajustada em
contraste com estado redox presente (BOCCI, 2006a, b, c; CATALDO; GENTILINI,

42

2005; TRAVAGLI; ZANARDI; BOCCI, 2006; TRAVAGLI et al., 2007). Em pacientes


com deficincias nutricionais, supostamente com menores nveis de plasmticos de
antioxidantes, recomendada a administrao de multivitamnicos previamente ao
tratamento por alguns dias. Dieta rica em vegetais e frutas associada a doses
cautelosas de oznio, evita efeitos indesejveis (BOCCI, 2006a).
Bocci (2007) sugeriu que a ozonioterapia seja iniciada em pequenas doses
que vo sendo aumentadas no transcorrer do tratamento, para que se possa
observar o bem estar do paciente, e, se aparecer algum sintoma de toxidade (como
sonolncia e cansao no caso da ozonioterapia sistmica), o tratamento possa ser
rapidamente modificado.
Como qualquer gs atmosfrico txico, o oznio em contato com a pele
desencadeia uma srie de eventos bioqumicos relacionados a processos oxidativos,
que podem afetar a fisiopatologia deste tecido. Esta exposio da pele ao oznio
pode ser segura ou txica dependendo da dose, da rea de exposio e da
capacidade antioxidante deste tecido. O tecido cutneo protegido contra estresse
oxidativo por uma variedade de antioxidantes, incluindo enzimas antioxidantes
(glutadiona-peroxidase, superperoxidase dismutase, catalases) e antioxidantes no
enzimticos (como vitamina E e C e cido rico). Em geral, a epiderme contm
menos antioxidantes que a derme, mas ambas sofrem ao do oznio (VALACCHI
et al., 2002; VALACCHI et al., 2003; VALACCHI et al., 2004; VALACCHI; FORTINO;
BOCCI, 2005).
Os efeitos prejudiciais gerados por produtos nocivos oriundos da exposio
do oznio pele so capazes de atuar em clulas, matriz extracelular, fibras
elsticas e enzimas, alterando a arquitetura e elasticidade da pele (CARLETTO;
NOCOLAY, 2000).

43

Cotovio et al. (2001) identificou aumento de produtos oxidativos, que podem


levar a alteraes estruturais e elsticas na pele, gerado pela exposio in vitro de
clulas humanas epidrmicas a quantidades variadas de oznio (1-10ppm).
Pesquisando marcadores do estresse oxidativo de relevncia para o processo
de reparao e para capacidade de uma resposta inflamao adaptativa, Valacchi et
al. (2002) e Valacchi et al. (2003) constataram, em situaes experimentais de
exposio da pele ao oznio, que houve aumentou da expresso da hemeoxigenase-1 (envolvida na proliferao e apoptose celular) e das metaloproteinases
(envolvidas no equilbrio entre sntese e reabsoro da matriz extracelular). Nas
mesmas situaes, Valacchi et al. (2004), associaram tambm aumento da
cicloxigenase-2 (citocinas usualmente envolvida na inflamao) e do fator nuclear B
(NFB) (importante regulador da resposta inflamatria, crucial para expresso de
citocinas inflamatrias, que conseqentemente participa do processo de reparao),
bem como correlacionaram induo de proliferao e diferenciao de queratcitos.
Segundo Valacchi, Fortino e Bocci (2005), adicionalmente a estas atuaes, a
aplicao tpica do oznio tambm pode interferir na reparao tecidual por
aumentar a oxigenao do tecido.
Em estudo in vitro para pesquisar a toxidade do oznio na pele, Janic et al.
(2005) identificaram que a exposio das culturas de clulas de moncito/macrfago
ao gs oznio influenciou a atividade do NFB.
Segundo Lim et al. (2006) a idade est relacionada com o aumento do
estresse oxidativo das clulas o que pode representar implicaes prticas na
utilizao do oznio. Esta relao foi comprovada pelo estudo experimental dos
autores, pois foi observado que a exposio de feridas drmicas ao oznio (0,5ppm
por 6hr/dia) retardou o fechamento das mesmas em ratos mais velhos, sendo que,

44

em animais mais jovens esta exposio no teve efeito significativo na velocidade de


fechamento, apenas uma tendncia de acelerao nos primeiros dias. Esta
tendncia foi atribuda s propriedades antibacterianas e/ou ao aumento da tenso
do oxignio pela exposio do oznio na rea da ferida. Este trabalho tambm
constatou que a exposio ao oznio aumentou a atividade do NFB (imunomodulador da inflamao), aumentou a expresso do TGF- (crucial para a
remodelao tecidual) tanto dos animais jovens como dos velhos, sendo modulados
de formas diferentes em decorrncia da idade.
Segundo Ballas e Davidson (2001), a idade pode estar associada
prolongao do tempo da reparao tecidual por interferir em inmeros eventos
bioqumicos, no apenas por alterar a diferenciao e apoptose dos miofibroblastos.
Quanto aos efeitos biolgicos do leo ozonizado, seus compostos (aldedos,
cetonas e perxidos de hidrognio) possuem vrias funes no organismo, que
incluem: estimulao dos sistemas enzimticos de xido-reduo; influncia sobre o
transporte de oxignio aos tecidos e sobre a cadeia respiratria das mitocndrias;
ao antimicrobiana; e efeito sinrgico de estimulao da capacidade fagocitria que
possuem ao germicida (LINCHETA et al., 2000; SIQUEIRA et al., 2000). Por essas
razes, o leo ozonizado pode contribuir de forma benfica na reparao tecidual de
uma ferida cirrgica, sem apresentar intolerncia nem efeitos adversos ( GUERRA et
al., 1997; LINCHETA et al., 2000; RODRGUES; CEPERO; PERDOMO, 1994;
SECHI et al., 2001).
Segundo Rodrigues et al. (2004), alm da excelente ao antimicrobiana, o
leo ozonizado possui tambm ao antiinflamatria e propriedades favorveis
reparao tecidual, que poderiam ser utilizadas em vrias situaes clnicas.
Sakazaki et al. (2007) observaram que a aplicao do leo ozonizado em

45

feridas experimentais inibiu infeco e hemorragia sem atrasar a reparao tecidual.


A evoluo histolgica desta aplicao revelou coagulao sangunea mais intensa,
aumento inicial do infiltrado inflamatrio e, posteriormente, proliferao do tecido de
granulao de forma mais evidente. De acordo com os autores, esta aplicao em
favoreceu a reparao tecidual, provavelmente pela liberao de sinais que
promovem a formao do tecido de granulao.

2.4 Formas de administraes da ozonioterapia

O oznio pode ser administrado de diversas formas, exceto da endovenosa


devido ao risco de embolia. A literatura descreve quatro formas principais: autohemoterapia maior e menor (BOCCI, 2006c); insuflao retal, na qual o gs
injetado por meio de um catter anal (GROOTVELT et al., 2004a; VERANES et al.,
1999); bolsa hermtica de oznio, na qual uma regio extracorprea exposta ao
gs (BATISTA et al., 2001; GROOTVELT et al., 2004a); e aplicaes tpicas por
meio da gua e do leo ozonizados (GUERRA et al., 1997; GROOTVELT et al.,
2004b; LINCHETA et al., 2000).
A forma de administrao mais utilizada a auto-hemoterapia maior, na qual
um volume predeterminado de sangue removido do paciente (200-270ml),
misturado a volume equivalente de gs (O3 + O), e reinfundido de forma
endovenosa. A concentrao de oznio deve respeitar a janela teraputica entre 1080g/ml. A auto-hemoterapia menor consiste na injeo intramuscular de pequena
quantidade de sangue ozonizado (5ml) (BOCCI, 2006c; GRACER; BOCCI, 2005).

46

O gs de oznio, misturado com oxignio, tambm pode ser injetado de forma


intramuscular, subcutnea, submucosa, intraperitoneal, intrapleural, periarticular,
intra-articular, miofacial, intradiscal, intraforaminal e intralesional (BOCCI, 2004a,
2006c; BULIS, 1996; BULIS et al., 1997). Esta mistura do gs no deve ter menos
que 95% de oxignio, nem mais de 5% de oznio (BOCCI, 2006c).
Segundo Cardoso et al. (2000), devido alta instabilidade e a toxidade do
oznio na sua forma gasosa, mais seguro que este seja incorporado a fluidos
(sangue, gua, solues isotnicas ou leos) para sua utilizao clnica.
Para Bocci (2006c), o mtodo de administrao deve ser selecionado de
acordo com a doena e com as condies do paciente. Veranes et al. (1999)
lembraram que independente da forma, a ozonioterapia apresenta baixo custo, fato
que deve ser levado em considerao na escolha teraputica.

2.5 Indicaes da ozonioterapia

O oznio possui uma srie de propriedades que o torna muito til na rea da
sade (VERANES et al., 1998; VERANES et al., 1999).
As publicaes de Baysan, Whiley e Lynch (2000), Bocci et al. (1999) e Bocci
(2004a, 2006c) enumeram diversas doenas que podem ser tratadas com a
ozonioterapia, associada ou no a outras teraputicas. So elas: 1) doenas
infecciosas agudas e crnicas causadas por vrus, bactrias, fungos e parasitas; 2)
infeces resistentes a antibitico, como nos casos de osteomielite, peritonite,
abscesso fistuloso, ps diabticos, picada de inseto, queimadura e escaras de

47

decbito; 3) infeces herpticas, herpes-zoster e papiloma vrus, candidose e


coadjuvante no tratamento de infeco por HIV e vrus da hepatite C; 4) doenas
auto-imunes, como esclerose, artrite reumatide e Doenas de Crohn; 5) doenas
com isqumicas crnicas (isquemia cerebral e cardaca); 6) doenas degenerativas
e degenerao macular; 7) doenas pulmonares (enfisema, asma, doena pulmonar
obstrutiva crnica e sndrome da doena respiratria aguda); 8) neuropatias, como
demncia senil, perda auditiva e labirintite; 9) doenas de pele, exemplos psorase e
dermatites; 10) cncer metasttico quimio-resistente, reduzindo a quimiotoxidade e
visando uma melhor qualidade de vida do paciente; 11) doenas ortopdicas; 12)
Sndrome da fadiga crnica e fibromialgia; 13) na crie dental, periodontites e
infeces bucais; 14) em situaes emergenciais, como as que ocorrem aps
extensos traumas, queimaduras e septicemias, que freqentemente levam a falncia
dos rgos e morte; 15) em pr-operatrio de transplantes e de cirurgias eletivas.
Bons resultados tm sido relatados aps a utilizao da ozonioterapia no
tratamento de paciente com doenas circulatrias perifricas, neuropatia diabtica
(BATISTA et al., 2001), doenas oftlmicas (MENNDEZ et al., 2002; VERANES et
al., 1998; VERANES et al., 1999), epidermo-fitoses dos ps (LINCHETA et al.,
2000), exposies sseas ps-trauma (BULIS, 1996), artropatias degenerativas
(BULIS et al., 1997) e doenas respiratrias (GENT et al., 2003).
Como o diabetes uma condio associada ao estresse oxidativo, o emprego
da ozonioterapia pode proteger o sistema anti-oxidante, influenciando a taxa de
glicemia, e pode manter em nveis fisiolgicos marcadores de clulas endoteliais,
cujas alteraes so associadas as complicaes desta doena sistmica (ALDALAIN et al., 2001; MARTNEZ-SANCHES et al., 2005; RE et al., 2008).

48

Tem sido comprovado por estudos experimental (AL-DALAIN et al., 2001) e


clnico (MARTNEZ-SANCHES et al., 2005) que a ozonioterapia em organismos
diabticos melhora o controle glicmico, previne o estresse oxidativo e normaliza os
nveis de perxidos orgnicos e de superxido dismutase ativada, eventos que so
fortemente relacionados com o prejuzo endotelial. Alm destes efeitos, as
propriedades germicidas do oznio e a influncia deste no processo de metabolismo
do oxignio tem sido atribudos aos bons resultados descritos no tratamento de
algumas complicaes diabticas, como diminuio do nmero de amputaes nos
pacientes com gangrena, os ps diabticos.
As caractersticas dos componentes presentes no leo ozonizado o tornam
til no tratamento de feridas infectadas, fstulas e outros processos spticos locais,
como em micose epidrmica dos ps (LINCHETA et al., 2000) e outras leses
fngicas (MENNDEZ et al., 2002).
A ozonioterapia e a terapia da cmara hiperbrica de oxignio possuem
pontos

semelhantes:

atuam

no

estresse

oxidativo,

estimulam

compostos

sinalizadores e as molculas de superxido e perxido de hidrognio e favorecem a


expresso de citocinas e fatores de crescimento. As duas terapias tambm
apresentam diferenas: o aumento da demanda de oxignio induzido pela cmara
ocorre de forma mais transitria, apenas por horas, e de forma mais indireta do que
as mudanas induzidas pela ozonioterapia, que favorecem o transporte de oxignio
por vrios dias (BOCCI, 2006a, 2006c; OTER; KORKMAZ, 2006). Na opinio de
Bocci (2006a), a ozonioterapia mais eficiente, prtica e barata do que a cmara
hiperbrica.
Steinhart, Schulz e Mutters (1999) verificaram em estudo experimental que a
ozonioterapia de grande utilidade nos casos de osteomielite refratrias por atuar

49

principalmente nas reas de necrose, com deficincia de nutrio vascular. Nestas


regies, o tratamento convencional (remoo cirrgica dos seqestros teciduais e a
antibioticoterapia) ou a cmera hiperbrica no teriam atuao adequada.
Segundo Bulis (1996), no h contra indicao para a aplicao da
ozonioterapia e que as complicaes relatadas na literatura devam estar
relacionadas ao inadequado manejo dos mtodos e das doses empregadas. Para
Bulis et al. (1997), a ozonioterapia garante benefcios em diversas doenas sem
riscos sade, por no existir complicaes com o uso do oznio.
Bocci (2004b) enfatizou que, se o oznio for utilizado adequadamente, esse
no causar nenhum efeito adverso agudo ou crnico. Alm disso, devido aos bons
resultados teraputicos em muitas doenas, a ozonioterapia deveria ser aceita e
utilizada por todos os hospitais, o que representaria uma revoluo mdica capaz de
curar ou estabilizar doenas (algumas com tratamento convencional insatisfatrio)
de pacientes em pases ricos ou pobres.
Tylicki e Rutkowski (2004) questionaram os benefcios da ozonioterapia e
relataram que essa tem sido utilizada h algumas dcadas sem atuao teraputica
comprovada, sendo necessrios mais estudos clnicos com mtodos cientficos
confiveis.
Bocci, em 2006c, descreveu que seus resultados tm sido animadores, tanto
quando objetivam efeito germicida como atuao na reparao tecidual, sem nunca
ter observado toxidade aguda ou crnica. Como qualquer droga, esta terapia pode
ser txica ou ser teraputica dependendo da concentrao do gs. De acordo com
este autor, a ozonioterapia no pode curar muitas doenas, como as doenas
degenerativas, mas pode melhorar em muito as condies e a qualidade de vida do
paciente. Pela experincia clnica prpria relatada de milhares nmeros de

50

aplicaes da ozonioterapia em diversas doenas, o autor destacou a importncia


desta terapia principalmente em casos de isquemia vascular crnica, de lceras
cutneas crnicas por isquemia regional e diabetes e de doenas degenerativas
muscular atrfica relacionadas idade.
Segundo Bulis et al. (1997a), a ozonioterapia se revela como uma futura
arma teraputica, necessitando para isso descobrir exatamente seus mecanismos
intrnsecos para que se possa utiliz-la adequadamente, usufruindo as muitas
propriedades que tm sido descritas.

2.6 Aplicaes da ozonioterapia na odontologia

No campo da odontologia, o oznio tem sido explorado para algumas


finalidades teraputicas. Este composto tem sido aplicado na cavidade bucal tanto
na forma de gs como incorporado a fluidos, como a gua ou ao leo ozonizados
(BAYSAN; LYNCH, 2004; BAYSAN; WHILEY; LYNCH, 2000; HOLMES, 2003;
KRASSE, 2004).
A ozonioterapia tem demonstrado resultados favorveis para o tratamento
conservador de cries iniciais de sulcos e fissuras sem cavitao, bem como cries
cervicais e radiculares. Essas leses de crie so expostas ao gs de oznio,
utilizando aparelhos apropriados que se adaptam superfcie do dente, mantendo
vcuo e suco (como o HealOzone, Kavo Dental GmbH, Biberach, Alemanha).
Estudos in vitro e in vivo tm evidenciado que o oznio elimina e reduz intensamente
a quantidade de bactrias da leso de crie e oxida o material orgnico dentro da

51

dentina cariada, o que permite a penetrao de ons de clcio, de fosfato e de flor


para a remineralizao do tecido, favorecida tambm pela utilizao de dentifrcios e
materiais remineralizantes (BAYSAN; LYNCH, 2004; BAYSAN; WHILEY; LYNCH,
2000; HOLMES, 2003; KRASSE, 2004).
De acordo com Krasse (2004), a aplicao do gs de oznio reduz o nmero
de microorganismos cariognicos, como tambm o nmero de microorganismos
totais, pois capaz de elimin-los pelo mecanismo de ruptura da membrana
bacteriana, revertendo as leses de crie, em sua maioria. De acordo com Hodson e
Swift (2007), no h boa evidncia clnica que suporte o uso do oznio para o
tratamento de crie, nem que comprove que este seja superior a outros tratamentos
clnicos convencionais, como controle de placa e dieta e aplicao de selantes.
Devido atuao no sistema imunolgico, no suporte sanguneo e da
atividade antimicrobiana, para Stbinger, Saber e Filippi (2006), a aplicao local do
oznio poderia ser utilizada com benefcios a reparao de feridas teciduais aps a
radioterapia e nos quadros de osteoradionecrose, tanto na pele como na mucosa
bucal. De acordo com esses autores, o uso do gs de oznio intrabucal raramente
encontrado na literatura, provavelmente pelo risco da inalao durante sua
aplicao, o que representaria importante toxicidade pulmonar; fato que poderia ser
evitado pela utilizao correta de um sistema potente de suco.
De acordo com as experincias clnicas relatadas por Agrillo et al. (2006,
2007), a ozonioterapia aplicada como terapia de suporte, em adio terapia
cirrgica/clnica, estimula e preserva o sistema endgeno antioxidante e favorece a
atividade fibroblstica e angiognica na preveno e no tratamento de rea com
osteonecrose, principalmente aquelas decorrentes de exodontias em pacientes
tratados com bifosfonados. Os autores relataram utilizao benfica do gs oznio

52

durante os perodos pr, trans e ps-operatrio destas exodontias, como medida


profiltica de complicaes, evitando tambm superinfeces.
Segundo Mller, Guggnheim e Schmidlin (2007), a ao antimicrobiana do
oznio eficiente contra inmeras espcies bucais. Os autores verificaram que a
aplicao do gs de oznio reduziu mais de 99% da populao bacteriana de
microorganismos cariognicos incubados isoladamente. Quando biofilmes foram
testados, o gs teve efeito mnimo na viabilidade microbiana, indicando que as
bactrias organizadas no biofilme estavam protegidas da ao do oznio.
Aparentemente, segundo Hems et al. (2005), as espcies bacterianas
presentes no biofilme so resistentes ao oznio, fato que deve ser atribudo
composio orgnica da matriz polissacardea. Os autores comprovaram que o
oznio, tanto se aplicado na forma de gs ou incorporado em gua, teve efeito
antibacteriano nas espcies Enterococcus faecalis, mas pouco efeito quando estas
foram embebidas no biofilme.
De acordo com Filippi (1997b, 1999a), a utilizao do oznio para desinfeco
da unidade de gua dos equipamentos odontolgicos tem sucesso estabelecido
desde a dcada de 90. Em 1997b, j com oito anos de monitoramento, comparando
vrios sistemas para esta desinfeco, o autor confirmou que h boa evidencia
sobre a eficincia da desinfeco desta gua pelo oznio. Em 2001, Filippi enfatizou
que esta ozonizao o mtodo de desinfeco que tem vantagens superiores em
relao a outros, principalmente pelo fato de proporcionar rapidamente a
esterilizao. Mesmo assim, o autor lembrou que nenhum mtodo pde manter o
equipamento livre de contaminao durante seu uso, sendo necessrias mais
pesquisas.
No estudo realizado por Walker et al. (2003), a utilizao do oznio no foi

53

capaz de reduzir eficientemente as bactrias constituintes do biofilme presente no


sistema da unidade de gua do equipamento odontolgico.
Garduo et al. (1995) salientaram bons resultados teraputicos na reduo da
placa bacteriana pelo emprego da gua ozonizada aps seu estudo in vivo, que
comparou a quantidade de Streptococcus mutans depois de bochechos com gua
ozonizada e com gua no ozonizada por sessenta segundo.
Velano et al. (2001) mostraram, in vitro, que o tempo mximo para a
inativao total de Streptococos aureus tratados com gua no ozonizada foi muito
superior quando comparado com a utilizao de gua ozonizada (0,6mg/ml),
indicando efeito mais rpido desta.
Os resultados do estudo in vitro de Nagayoshi et al. (2004a) demonstraram
que, a gua ozonizada, na concentrao de 2 a 4mg/L, foi eficiente para matar
bactrias bucais gram-positivas e gram-negativas e a Cndida Albicans em culturas
puras. Os autores consideraram que esta gua apresentou forte efeito contra
bactrias do biofilme e teve potencial de inibir o acmulo experimental de placa
bacteriana. Assim, sugeriram que esta gua tem potencial de ser utilizada na
reduo de infeces causadas por microorganismos bucais.
Segundo Estrela et al. (2006), o emprego da gua ozonizada tambm pode
ser uma opo para os aparelhos de ultra-som para lavagem de instrumental
odontolgico. Os autores constataram in vitro a efecincia deste sistema de lavagem
com ao antimicrobiana comprovada contra Stafilococcos aureus.
Segundo Filippi (1997a), a gua ozonizada pode ter propriedades
teraputicas, como favorecer a hemostasia, promover a reparao de feridas e
estimular a vascularizao. Este fato associado atividade antimicrobiana desta
gua deveria ser explorado visando utilizao desta forma de aplicao do oznio

54

em cirurgia bucal como alternativa ao soro fisiolgico estril, sendo que este no
possui nenhuma propriedade teraputica. A gua ozonizada, mesmo sendo
isotnica no apresentaria desvantagens em relao ao uso do soro. De acordo com
esse autor, a gua ozonizada utilizada nas unidades de gua dos equipamentos
odontolgicos durante os procedimentos cirrgicos poderia alcanar concentraes
adequadas (acima de 4gO3/ml de gua) para terem atividade antimicrobiana e
desinfeco da rea operada. Lembraram que no h conhecimento da
concentrao ideal para se alcanar efeitos teraputicos, sendo necessrio mais
pesquisas.
Pesquisando o potencial teraputico da utilizao no trans-operatrio da gua
ozonizada diretamente dos equipamentos odontolgicos, Filippi (1999b) constatou
que a concentrao do oznio na gua diminua conforme o aumento da
temperatura (a concentrao diminua aproximadamente 40% quando a temperatura
passava de 20C para 37,5C). O gerador utilizado nesta pesquisa produziu gua
ozonizada na concentrao inicial de 12,48gO3/ml. Quando amostras desta gua
sada de irrigadores foram analisadas, a concentrao encontrada foi de
5,52gO3/ml e, quando aquecida a 37,5C, de 2,64gO3/ml. O autor pde observar
que a utilizao da gua ozonizada na concentrao de 2,5 a 3,5gO3/ml no
produziu nenhum efeito positivo ou negativo na reparao ps-operatria de
exodontias de terceiros molares com osteotomia quando comparados irrigao
com soro fisiolgico estril. Esse estudo tambm constatou que no foi encontrado
oznio em nenhuma concentrao quando a gua ozonizada foi utilizada na alta
rotao, micromotor e aparelhos de ultra-som.
Um estudo envolvendo 250 pacientes, comparando a aplicao da gua
ozonizada com o soro fisiolgico durante a osteotomia para cirurgia de exodontia de

55

terceiros molares, verificou idntica reparao ps-operatria com as duas irrigaes


e, quando a gua ozonizada foi utilizada, observou-se reduo da ocorrncia de
infeces aps as cirurgias (BRAUNER2, 1992, apud STNBINGER; SADER;
FILIPPI, 2006).
De acordo com Ebensberger, Pohl e Filippi (2002), a gua ozonizada pode
ser til na limpeza de dentes acidentalmente avulsionados, previamente ao
reimplante, devido suas caractersticas antimicrobianas e bioqumicas que poderiam
ter algum efeito benfico nos cementoblastos e fibroblastos remanescentes.
Pesquisando esta possibilidade, os autores descobriram que aquelas clulas de
dentes extrados e irrigados por dois minutos com gua ozonizada (2,5-3,5 g ml-1)
mostraram um discreto aumento da marcao do Antgeno nuclear de proliferao
celular, em relao a outro grupo irrigado com soro fisiolgico. De acordo com os
mesmo autores, os resultados evidenciaram que a gua ozonizada pde ter efeito
estimulador na proliferao dos cementoblastos e fibroblastos periodontais, melhorar
o metabolismo celular e oferecer desinfeco adicional, no apenas pelos
mecanismos mecnico da irrigao. Alm disso, a gua ozonizada no apresentou
efeito prejudicial na viabilidade dos remanescentes celulares da superfcie radicular.
Segundo Stbinger, Saber e Filippi (2006), a gua ozonizada representa um
importante agente teraputico na regenerao periodontal, para tratamento de
gengivites e periodontites, devido a seu possvel estmulo na proliferao celular e
suas propriedades antimicrobianas.
Em estudo in vitro, de acordo com Krozer, Hall e Ericsson (1999), o uso da
gua ozonizada na implantodontia pode ser til para descontaminao da superfcie

Brauner AW. Periodontology: New methods. Ozone Sci Eng 1992;14:165-76.

56

do implante no tratamento da perimplantite, pois proporcionou a remoo de


microorganismos sem deixar resduos que prejudicasse a osseointegrao, fato que
ocorreu quando outros produtos qumicos foram utilizados.
Erdsi, Filippi e Meyer (2005) pesquisaram a possibilidade de utilizar gua
ozonizada na desinfeco do osso coletado em sugador apropriado durante cirurgias
bucais, visando a utilizao deste procedimento antes de enxertos autgenos na
implantodontia. Os autores verificaram que a gua ozonizada no atingiu o efeito
antimicrobiano

(concentrao

aproximadamente

de

12mgO3/L).

Os

autores

justificaram que a ao antimicrobiana da gua ozonizada foi impossibilitada pela


presena de protenas orgnicas na mistura coletada, composta de fragmentos
sseos, sangue, saliva e bactrias. Sugeriram que pesquisas viabilizassem a coleta
isolada dos fragmentos sseos, nos quais a gua ozonizada poderia ter melhor
efeito antimicrobiano.
O uso da gua ozonizada como agente anti-sptico foi sugerido por Huth et
al. (2006), uma vez que o oznio tem alto poder antimicrobiano e no tem sido
notado desenvolvimento de resistncia farmacolgica com sua utilizao na
purificao de gua de abastecimento e preservao de alimentos.
Pesquisando a citotoxidade da aplicao do gs oznio por um minuto em
culturas de clulas epiteliais e em fibroblastos gengivais, Huth et al. (2006),
verificaram que nas concentraes de gs utilizadas (6x106 a 2x102 g m3) houve
reduo da viabilidade celular, com ntido aumento no nmero de morte celular. Os
autores lembraram que em muitos trabalhos, concentraes inferiores so utilizadas.
Em contraste com o gs, quando utilizaram soluo de tampo fosfato tamponado
ozonizado (1,25 a 2,0 g ml-1), nenhum efeito txico foi revelado, demonstrando sua
alta biocompatibilidade com clulas bucais, melhor do que outros produtos testados

57

(digluconato de clorexidina, hipoclorito de sdio e gua oxigenada). Sendo assim,


segundo os autores, a alta biocompatibilidade do oznio aquoso permite que este
seja utilizado em irrigaes de dentes e alvolos, sem nenhum efeito negativo para
as clulas bucais.
Nagayoshi et al. (2004b), em estudo experimental, verificaram baixa
citotoxidade da gua ozonizada em fibroblastos de ratos, fato atribudo rpida
degradao do oznio quando entra em contato com os compostos orgnicos. Os
autores verificaram que a viabilidade de Enterococcus faecalis e Streptococcus
mutuans, presentes em tbulos dentinrios, diminuiu significativamente aps
irrigao com gua ozonizada (4mg/L), resultados que sugeriram a indicao do uso
desta gua na endodontia. Para eles as vantagens do uso da gua ozonizada
incluem seu potencial antimicrobiano, sua rpida ao antimicrobiana, sua fcil
aplicao e ausncia de mutagnese.
Nas condies in vitro analisadas por Estrela et al. (2007), nenhum dos
metodos testados foi adequado para inativar a Enterococcus faecalis dos canais
radiculares de dentes humanos, bactria freqentemente associada a leses
persistentes ao tratamento endodntico. Os autores testaram as irrigaoes por 20
minutos com gua ozonizada (4mg/L-1), hipoclorito de sdio (2,5%) e clorexidina
(2%) ou a aplicao do gs oznio.
Tanto a gua como o gs pode ser utilizado para limpeza de prteses totais
(STBINGER; SABER; FILIPPI, 2006). O estudo de Arita et al. (2005) verificou que
a imerso de prteses totais com base de resina acrlica em gua ozonizada (2 ou
4mg/L) foi til na eliminao da Candida albicans.
Aps reviso sistemtica da literatura sobre o uso da ozonioterapia na
odontologia, Azarpazhooh e Limeback (2008) constataram que: h evidncias

58

conflitantes para uso na endodontia e como agente antimicrobiano; h resultados


positivos comprovados para a desinfeco da unidade de gua e para limpeza de
prteses totais; e que os relatos do uso do oznio na cirurgia bucal so escassos.
Segundo os autores, as aplicaes clnicas do oznio em odontologia no tm
alcanado forte nvel de evidncia nem boa relao custo benefcio (devido ao alto
custo de aparelhos com sistemas de vcuo), sendo necessrias pesquisas clnicas
melhores conduzidas do que as encontradas na literatura atual.
Com finalidades teraputicas na odontologia, o leo ozonizado j foi testado,
e tm sido relatados bons resultados quando empregado em gengivo-estomatite
herptica aguda (RODRGUES; CEPERO; PERDOMO, 1994), estomatite prottica
(LOPZ et al., 2003; PILOTO; URRUTIA, 2000), alveolites (GUERRA et al., 1997) e
como medicamento intracanal (PEREIRA, 2002; SIQUEIRA et al., 2000) e agente
antimicrobiano (SECHI et al., 2001),

59

3 PROPOSIO

A proposio desta pesquisa foi avaliar in vivo os efeitos biolgicos do oznio


diludo em gua, em duas concentraes diferentes, na reparao tecidual de
feridas drmicas induzidas em ratos, aps irrigaes cirrgicas trans e psoperatrias, por meio de avaliao macroscpica e microscpica.

60

4 MATERIAL E MTODOS

4.1 Amostra experimental

Foram utilizados 48 ratos (Rattus novergicus albinus Wistar), machos, com


peso entre 350mg-450mg e idade entre 3-6 meses. Durante todo o perodo da
pesquisa, os animais foram mantidos, em condio padro de alimentao com
rao e gua ad libitum.

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comit de tica em

Pesquisa da Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo (FOUSP),


que emitiu parecer favorvel sua realizao, protocolo n 26/05 (Anexo A).

4.2 Procedimentos realizados

Os procedimentos realizados seguiram o seguinte protocolo:

Anestesia geral pela aplicao do anestsico via intramuscular na dose de


1ml/kg (cloridrato de cetamina, Dopalen - Vetbrands) e do relaxante
muscular via intramuscular na dose de 0,3mg/kg (cloridrato de xilazina,
Rompum - Bayer SA).
Realizao de tricotomia no dorso do animal, em rea dimensionada para a
realizao das feridas cirrgicas e para as instalaes dos apsitos;
Anti-sepsia no dorso do animal, com digluconato de clorexidina a 2%.

61

Execuo do procedimento cirrgico que compreendeu a realizao de


inciso no dorso do animal, com formato de circunferncia de 5mm de dimetro
e 5mm de profundidade, e exciso da derme e subcutneo, expondo a fscia
muscular subjacente. Para padronizao dessas feridas foi utilizado punch
metlico de 5mm de dimetro, estril e com cursor de borracha para delimitar
sua profundidade durante a aplicao (Figuras 4.1 e 4.2).

Figura 4.1 - Utilizao do punch

Figura 4.2 - Exciso do tecido

Aps a realizao das feridas cirrgicas, os animais foram divididos em 4


grupos (12 animais para cada grupo), de acordo com o tratamento realizado:
o GO3> - Grupo que foi irrigado com gua ozonizada na concentrao de
4ppm - 47,7 mgO3/L (maior concentrao);
o GO3< - Grupo que foi irrigado com gua ozonizada na concentrao de
1ppm - 13,0 mgO3/L (menor concentrao);
o Ggua - Grupo que foi irrigado com gua no ozonizada, gua MilliQ
(Millipore), controle positivo;
o Gnada - Grupo que no recebeu irrigao, controle negativo.

62

As irrigaes, nos trs grupos indicados, foram realizadas com fluxo


constante, de intensidade e velocidade regulares, e foram realizadas por meio
de seringas (20ml) e agulhas (0,7x30mm) estreis descartveis, com aspirao
concomitante. Foram realizadas imediatamente aps a cirurgia, de modo que se
perdurasse por 10 minutos o contato dos tecidos cruentos com o lquido, e
foram repetidas diariamente por 5 minutos no ps-operatrio at o dia do
sacrifcio do animal.
Aps a realizao das feridas e irrigaes, o tecido cruento foi protegido pela
colocao de apsito individual, diariamente at o segundo dia de psoperatrio. Foram utilizados Band-aid (Johnson & Johnson) adaptados no
formato das leses e esses recobertos por esparadrapo impermevel (Cremer
S. A ).
Para realizao das irrigaes e/ou troca dos apsitos, os animais foram
sedados pelos mesmos frmacos utilizados para os procedimentos cirrgicos
(anestsico e relaxante muscular) em doses reduzidas, suficientes para a
execuo dos procedimentos.
Os animais foram sacrificados no perodo de 2 dias, 7 dias e 14 dias de psoperatrio, por inalao de dixido de carbono. Em cada perodo foram
sacrificados 16 animais, que corresponderam a 4 amostras de cada um dos 4
grupos, totalizando 48 animais.
Aps o sacrifcio, cada ferida foi fotografada e, em seguida, uma pea
cirrgica foi obtida da regio submetida cirurgia. Quando necessrio, no
segundo e terceiro perodo do sacrifcio, foi realizada nova tricotomia na regio
em torno da leso, para facilitar o acesso fotogrfico e a obteno do material
para fixao.

63

Os espcimes removidos foram fixados em formol 10% por no mnimo 24


horas e, posteriormente, processados histologicamente para incluso em
parafina, cortes semi-seriados em seu longo eixo de 5 m e colorao em
Hematoxilina-Eosina (HE) e reaes de imunoistoqumica.

Todos os procedimentos experimentais foram criteriosamente realizados


dentro dos princpios gerais e fundamentais de cirurgia, junto ao Laboratrio de
Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia Prtese e Traumatologia da
FOUSP. O ato operatrio transcorreu sem contaminao e com o menor trauma
possvel e foi realizado por um nico cirurgio. As peas cirrgicas obtidas aps o
sacrifcio dos animais foram processadas, pelo mesmo profissional, junto Disciplina
de Patologia Bucal e Disciplina de Patologia Geral, do Departamento de
Estomatologia da FOUSP.

4.3 Produo da gua ozonizada

A gua ozonizada foi produzida por meio do gerador de oznio (Ozone & Life
3.0), utilizado nas potncias de 10 e 5. A fonte de oxignio empregado foi
proveniente de cilindro de oxignio medicinal com fluxo de 1mL/min ajustado e
regulado por fluxmetro de preciso (Rotarex, USA). Nestas condies, a
quantidade de oznio produzida pelo gerador era de 47,7mgO3/L e 13,0mgO3/L,
respectivamente para aquelas duas potncias. O oznio gerado era transportado por
mangueira de silicone para 2 litros de gua Milli-Q (Millipore), contida em um

64

lavador de gs em vidro com 1,58m de altura. O tempo de ozonizao foi


cronometrado e padronizado em 10 minutos.
A concentrao final de O3 na gua foi monitorada imediatamente aps sua
produo e previamente sua utilizao, emoregando o analisador colorimtrico
pelo kit ChemetsTM (Chemetrics, INC-USA) (modelo GM6000), garantindo uma dose
precisa e conhecida. Estas concentraes aferidas correspondiam a 4,0ppm
(quando o gerador foi utilizado em 10 de potncia com produo de 47,7mgO3/L) e a
1,0 ppm (quando o gerador foi utilizado em 5 de potncia com produo de
13,3mgO3/L).
Previamente a cada produo da gua ozonizada que seria utilizada na
pesquisa, o lavador de vidro empregado era submetido a ozonizao de 2 litros de
gua Milli-Q em potencia mxima do gerador com fluxo de oxignio de 1ml/min por
5 minutos, para proporcionar a limpeza daquele vidro.
As temperaturas ambientes da sala e a umidade relativa do ar foram
monitoradas em todos os dias durante a produo da gua ozonizada, e
correspondiam aproximadamente a 26C e 66% de umidade.
Aps a produo da gua ozonizada, esta era coletada por meio de
mangueiras de silicone estreis e acondicionada em recipientes de vidros com
tampa de Teflon tambm estreis, que foram mantidos sob refrigerao, entre 8 a
10C, at o momento do seu uso, que ocorreu no mximo em at uma hora da sua
ozonizao. Para o preenchimento das seringas utilizadas para a irrigao, a gua
era acondicionada em recipientes de vidros estreis.

65

4.4 Anlise das leses induzidas

4.4.1 Avaliao macroscpica anlise morfomtrica

Imediatamente aps o sacrifcio dos animais, as feridas foram fotografados


por meio de cmera digital (Sony Cybershot, 5 megapixels) afixada de forma a
manter a padronizao de distncia focal, utilizando sempre aumento tico de 3X.
As imagens das feridas foram submetidas ao software Adobe Photoshop
Elements 6.0, e transferidas para o software de morfometria digital (ImageLab2000)
utilizando computador Pentium IV, 512MHz, monitor HP Pavillion, 800X600 dpi.
Essa avaliao foi realizada pelo mesmo examinador que no teve conhecimento da
identificao das amostras e que foi submetido a um perodo de padronizao para
esta avaliao.
As feridas foram analisadas pelo software quanto porcentagem de permetro
(Figura 4.3) e rea (Figura 4.4), medidas em pixels, bem como quanto relao
entre essas duas dimenses, obtendo-se o fator de forma (fator de forma =
3rea/permetro2). A mesma anlise foi realizada em quatro feridas no momento da
sua confeco, cuja mdia foi utilizada como referncia inicial.

66

Figura 4.3 - Delimitao do permetro.

Figura 4.4 - Clculo da rea.

Com essas dimenses obtiveram-se dados quanto ao processo de contrao


da ferida nos diferentes tempos experimentais. A contrao tecidual foi considerada
mais regular quanto mais prximo o valor do fator de forma estivesse do valor de
referncia, e irregular, quanto mais inferior do mesmo.
Os dados obtidos por esta anlise foram objeto de estudo quantitativo e, os
referentes rea e ao fator de forma, tambm de estudo estatstico.
Para estudo estatstico foi utilizado o Teste de Hiptese Wilcoxon, que pertence
a uma categoria estatstica de procedimentos chamados de no paramtricos ou
livres de distribuio. O nvel de significncia () utilizado foi de 5%, com intervalo
de confiana de 95% e com 3 graus de liberdade . Em funo das caractersticas
especficas das amostras, essas foram distribudas em pares e pela associao dos
grupos que empregaram gua ozonizada (GO3> e GO3<) e dos grupos controles
(Ggua e Gnada), para testar a hiptese de semelhana ou diferena na comparao
das distribuies dos grupos. Foi utilizado para tal estudo o software estatstico
SPSS (Statistical Package for Social Sciences), para Windows em verso 13.0.

67

4.4.2 Avaliao microscpica

4.4.2.1 anlise histomorfolgica

Os cortes corados com HE foram analisados em microscpio de luz


convencional (Olimpus CH2 Olimpus Optical Co. Ltd Japan), sob foco fixo e
clareza de campo, com aumento final de 400X. Esta anlise foi realizada em duplo
cego, por dois observadores independentes que no conheciam os dados das
amostras. Empregou-se uma escala arbitrria de expresso classificada de 0 a 3
(0=ausente;

1=pouco;

epitelializao,

infiltrado

2=moderado;
inflamatrio,

3=intenso)
presena

para
de

identificao

necrose,

de:

edema,

re-

vasos

neoformados, populao de fibroblastos jovens, sntese de colgeno e deposio e


distribuio de fibras da matriz extracelular (matriz colagnica). Com esta anlise foi
possvel avaliar de forma quantitativa as diferenas histomorfolgicas entre os
grupos.

4.4.2.2 anlise histomorfomtrica

Foi realizada anlise de histomorfometria digital, que seguiu protocolo


estabelecido por Matos et al. (1994) no Laboratrio de Informtica Dedicado
Odontologia (LIDO) da FOUSP. Essa avaliao foi realizada pelo mesmo avaliador

68

que no teve conhecimento da identificao das amostras e que foi submetido a um


perodo de padronizao para esta avaliao.
Para o estudo de histomorfometria digital, as imagens das lminas
histolgicas coradas com HE foram capturadas por cmera tipo CCD (Sony)
acoplada a microscpio Jeol e placa de digitalizao de imagens (Captivator) e
transferidas para software de morfometria digital (ImageLab2000), utilizando
computador Pentium IV, 512MHz, monitor HP Pavillion, 800X600 dpi. As imagens
do campo histolgico (aumento de 400X), na regio da leso induzida, foram
digitalizadas e analisadas (em porcentagem de pixels) quanto celularidade
(quantidade dos elementos celulares presentes, tais como clulas inflamatrias e
fibroblastos, medida pela presena de tons roxos indicativas de ncleos celulares),
ao espao branco (podendo ser interpretado por edema, vasos sanguneos, artefato
e/ou espaos entre fibras colgenas dentro da matriz organizada) e quanto s fibras
colgenas e matriz colagnica (medida pela porcentagem de tons rseo indicativas
de tais fibras e matriz). Esses elementos teciduais forneceram uma estimativa da
evoluo do processo inflamatrio/reparativo em cada tempo experimental.
Para cada animal foram analisadas trs imagens histolgicas, sendo que, no
perodo de 2 dias, foram quantificados 12 campos consecutivos para cada imagem
(seis em cada borda da ferida), e nos perodos de 7 e 14 dias, esse nmero foi de 9
campos,

conforme

ilustrao

esquemtica

nas

figuras

4.5,

4.6

4.7,

respectivamente, obtendo-se uma mdia final.


Todos os dados obtidos por esta histomorfometria foram analisados de forma
quantitativa e foram objetos de estudo estatstico, seguindo a metodologia descrita
anteriormente.

69

Figura 4.5 - Esquema dos campos escolhidos para histomorfometria no perodo de 2 dias

Figura 4.6 - Esquema dos campos escolhidos para histomorfometria no perodo de 7 dias

Figura 4.7 - Esquema dos campos escolhidos para histomorfometria no perodo de 14 dias

70

4.4.2.3 anlise imunoistoqumica

Para as reaes imunoistoqumicas foi utilizada a tcnica de estreptoavidinabiotina-peroxidase e foram utilizados os anticorpos colgeno tipo-I (20141NOVOTEC) e anti-actina (KO609 DAKO), sendo que as diluies, o tempo de
incubao e a recuperao antignica foram otimizados para cada anticorpo
seguindo o protocolo estabelecido pelo Laboratrio de Imunoistoqumica da
Disciplina de Patologia Bucal da FOUSP, descrito resumidamente a seguir:
1. Desparafinizao dos cortes de 5 m de espessura em dois banhos de xilol,
temperatura ambiente por 20 minutos;
2. Reidratao em srie de etanol em concentraes decrescentes, com passagem
em etanol absoluto por trs vezes, etanol 95% e 85%, durante 5 minutos cada;
3. Remoo de pigmentos formlicos por imerso em soluo de hidrxido de
amnia a 10%, em etanol 95%, durante 10 minutos;
4. Lavagem em gua destilada, 2 banhos de 5 minutos cada;
5. Recuperao dos stios antignicos em soluo de cido ctrico monoidratado,
pH 6,0 em banho-maria a 95C por 30 minutos, para as lminas que receberam
os anticorpos anti-actina;
6. Lavagem em gua destilada, 2 banhos de 5 minutos cada;
7. Bloqueio da peroxidase endgena tecidual com imerso do material em soluo
de perxido de hidrognio 20 volumes (6%) e lcool metlico na proporo 1:1,
em dois banhos de 15 minutos cada;
8. Lavagem em gua destilada, 2 banhos de 5 minutos cada;

71

9. Trs banhos de soluo tampo de TRIS (Tri-hidroxi-metil-aminometano, Sigma


Chemical Co., St. Louis, MO, USA), pH 7,4 por 5 minutos cada.
10. As etapas seguintes foram realizadas automaticamente, com o auxilio do
sistema de colorao universal Autostainer DAKO (Corporation, Glostrup,
Denmark). Aps serem acopladas no equipamento, as lminas contendo os
cortes foram submetidas incubao com os anticorpos primrios diludos em
soluo TRIS, pH 7,4, acrescido de albumina a 1%, contendo azida sdica a
0,1% (BSA Biotest S/A So Paulo, Brasil). A diluio de trabalho para o
anticorpo primrio colgeno tipo-I foi 1:300 com tempo de incubao de 30
minutos, e para o anti-actina de 1:200 por 40 minutos. Em seguida, as lminas
foram lavadas em gua destilada e em soluo tampo de TRIS, pH 7,6. Como
soro secundrio e complexo tercirio foi utilizado o kit Envision Dako- LSAB
(Corporation, Glostrup, Denmark) por 30 minnutos. A revelao da reao foi
feita por imerso em soluo de cromgeno diaminobenzidina (DAB, 3,3
diaminobenzidina, Sigma Chemical CO., St Louis, MO/USA) por 10 minutos. Os
cortes foram ento lavados em TRIS pH 7,6 e gua destilada, e contra-corados
com Hematoxilina de Mayer por 10 minutos. Posteriormente, lavados novamente
por 10 minutos em gua destilada.
11. Concluda as etapas automticas, as lminas foram retiradas do equipamento e
foram desidratadas manualmente em uma srie de etanol em concentraes
crescentes (80%, 95% e 100%) e diafanizados em xilol seguindo para montagem
em Permount (Fisher Scientific, Fair Law, NJ/USA).
Como controle positivo foi utilizado fragmento da pele normal do dorso do
animal, e o controle negativo foi obtido com a suspenso do anticorpo primrio
durante a realizao da reao.

72

As lminas coradas pela imunoistoqumica foram analisadas em microscpio


de luz convencional (Olimpus CH2 Olimpus Optical Co. Ltd Japan), sob foco
fixo e clareza de campo, com aumento final de 400X. Este estudo foi realizado em
duplo cego, por dois observadores independentes que no conheciam as
identificaes das amostras. Os dados desta anlise foram avaliados de forma
quantitativa.
A anlise da marcao dos anticorpos colgeno tipo-I, foi baseada na
distribuio da expresso antignica e na intensidade de matriz formada,
classificada em escala arbitrria de expresso de 0 a 3 (0=ausente; 1=pouco
expressivo; 2=expresso moderada; 3=expresso intensa). Para esta classificao,
no perodo de 2 dias foi observada a regio da borda da ferida; no perodo de 7 dias
a regio do centro da ferida; e no ltimo perodo foram classificados tanto o centro
como a borda da ferida. A reao foi considerada positiva quando houve colorao
castanha, e negativas para as lminas que no apresentaram tal colorao.
Para anlise imunoistoqumica comparativa entre os grupos com relao
colorao do anticorpo anti-actina, no perodo de 7 dias, foi utilizado um sistema de
contagem de miofibroblastos, sendo que foram considerados clulas positivas,
aquelas com citoplasma de colorao castanho escuro. Considerou-se 100% da
populao de miofibroblastos dividida pelo nmero de campos presentes no corte da
leso, obtendo-se uma mdia. Nas lminas correspondentes aos perodos de 2 e 14
dias foi realizado a verificao da ausncia da marcao.

73

5. RESULTADOS

5.1 Avaliao macroscpica anlise morfomtrica

Os resultados da anlise morfomtrica com relao porcentagem de


permetro, rea e fator de forma esto demonstrados nas tabelas 5.1, e ilustrados
pela figura 5.1. Os mesmos valores calculados no momento da confeco da ferida,
como referncia inicial, foram: 1134,61 de permetro; 93180,12 de rea; e 0,87 de
fator de forma.

Tabela 5.1- Dados da anlise morfolgica com relao porcentagem de permetro, rea e fator
de forma
_Permetro_
Perodos

2 dias

7 dias

14 dias

Grupos

Mdia pixels
%

______ rea ______


Mdia- pixels
%

Desvio Padro
+/-

__Fator de forma__
Mdia

Desvio Padro
+/-

GO3>

639,22

29178,86

6691,59

0,83

0,04

GO3<

704,42

32587,42

4017,32

0,83

0,06

Ggua

605,39

24753,06

3850,75

0,85

0,02

Gnada

628,49

26794,03

3272,82

0,85

0,02

GO3>

566,68

21910,34

1275,87

0,86

0,02

GO3<

537,84

20030,61

5817,55

0,86

0,02

Ggua

546,74

20568,68

20568,68

0,86

0,02

Gnada

474,21

14824,70

8296,04

0,77

0,09

GO3>

239,75

3869,15

3768,09

0,76

0,11

GO3<

206,81

2306,74

939,13

0,67

0,08

Ggua

235,77

3301,00

2285,36

0,70

0,15

Gnada

185,70

2444,38

1800,28

0,81

0,05

74

Perodo
Grupo

2 dias

7dias

GO3>

GO3<

Ggua

Gnada

Figura 5.1 - Fotografias das feridas de acordo com os grupos e perodos

15dias

75

Com relao ao estudo quantitativo da rea, no primeiro perodo, a maior


mdia encontrada foi no GO3<, seguido em ordem decrescente pelos GO3>, Gnada e
Ggua. No perodo de 7 dias, os grupos que receberam irrigao (GO3>, GO3< e
Ggua) apresentaram rea maior do que o grupo no irrigado (Gnada), sendo que a
mesma ordem foi GO3>, Ggua, GO3< e Gnada. No perodo de 14 dias, a rea se
tornou similar entre todos os grupos (Grfico 5.1).

Mdia em porcentagem de pxels

rea da Ferida

GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

2dias

7dias

14dias

Perodos

Grfico 5.1 - Morfometria - representao da rea da ferida

Nos trs perodos, o estudo estatstico de distribuio da rea verificou que


houve diferenas significantes entre o GO3> em relao aos Ggua, Gnada e GO3<, e
entre o GO3< e Ggua. As demais distribuies analisadas revelaram-se
estatisticamente pouco significantes (Anexo B).

No perodo de 2 dias, pelo estudo quantitativo, a mdia do fator de forma


entre os grupos irrigados com gua ozonizada foi igual, da mesma forma para os
outros grupos controles No perodo de 7 dias, os valores desta caracterstica para os
grupos que receberam irrigao foram iguais e superiores ao grupo controle

76

negativo. No perodo de 14 dias, o GO3> e Gnada revelaram fatores de forma


semelhantes e superiores com relao aos outros, que tambm foram similares
entre si (Grfico 5.2).

Fator de Forma

Mdia
Mdia

GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

2dias

7dias

14dias

Perodos

Grfico 5.2 - Morfometria - representao do fator de forma

Nos trs perodos, o estudo estatstico de distribuio do fator de forma


verificou que houve diferenas significantes entre o GO3> em relao ao Ggua e ao
Gnada, e semelhanas entre o GO3< e o Ggua. A comparao do grupo irrigado com
gua ozonizada na menor concentrao com o controle negativo foi estatisticamente
diferentes nos dois primeiros perodos e semelhante no ltimo. As demais
distribuies analisadas revelaram-se estatisticamente pouco significantes (Anexo
C).

77

5.2 Avaliao microscpica

5.2.1 Anlise histomorfolgica

Os dados da anlise histomorfolgica dos cortes corados com HE, de acordo


com a escala arbitrria de expresso, esto demonstrados na tabela 5.2.

Tabelas 5.2 - Dados da anlise histomorfolgica de acordo com escala arbitraria de expresso
Perodos Grupos

Re-

Infiltrado

Necrose

Edema

epitelializao inflamatrio

Vasos neo- Fibroblastos Sntese de


formados

Matriz

jovens

colgeno

colagnica

Mdia

Mdia

Mdia

Mdia

Mdia

Mdia

Mdia

Mdia

2dias

GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

1
0
0
1

2,7
2,3
1,7
2,5

1,3
1,8
1,3
1,5

2,0
2,5
1,0
2,3

1,7
2,3
1,0
1,0

1,0
1,3
0,3
0,8

2,0
1,0
0,7
0,5

2,0
2,3
2,0
1,0

7dias

GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

2,3
2,3
1,3
2,0

2,3
1,8
2,8
2,0

2,0
1,5
2,0
1,5

1,0
1,0
1,3
0,5

1,3
1,5
1,8
1,5

2,8
2,5
2,0
2,0

1,0
0,5
1,3
1,5

2,3
1,8
2,0
1,5

14dias

GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

3,0
3,0
3,0
3,0

1,0
1,0
1,0
1,0

0,0
0,0
0,0
0,0

0,3
0,7
1,0
0,3

1,0
1,7
1,3
1,0

2,3
2,7
2,7
3,0

2,0
1,3
1,3
1,7

2,7
3,0
2,3
2,7

Os principais aspectos histolgicos analisados de forma quantitativa em


microscpio de luz convencional de acordo com escala arbitrria de expresso esto
ilustrados pelas figuras 5.2 a 5.4 e descritos a seguir:

78

-no perodo de 2 dias: discreta proliferao epitelial apenas nos GO3< e Ggua; menor
expresso de infiltrado inflamatrio, de necrose e de edema no grupo Ggua, seguido
em ordem crescente pelos GO3<, Gnada e

GO3>; expresso mais intensa da

neoformao vascular, fibroblastos jovens e de sntese de colgeno para os grupos


GO3> e GO3<; e matriz menos expressiva para o grupo no irrigado.

-no perodo de 7 dias: menor expresso da proliferao epitelial para os Ggua e


Gnada; caractersticas do processo inflamatrio mais expressivas no grupo Ggua,
seguido em ordem decrescente pelos GO3>, GO3< e Gnada; pouca diferena entre os
grupos com relao a neoformao vascular; expresso mais marcante de
fibroblastos jovens em ambos grupos que foram irrigados com gua ozonizada;
formao de matriz colagnica mais expressiva nos grupos que receberam irrigao,
principalmente para o GO3>; e relao inversa para a sntese de colgeno.

-no perodo de 14 dias: epitlio sempre contnuo sobre a ferida em todos os cortes
analisados; pouca expresso de infiltrado inflamatrio e edema e ausncia de
necrose em todos os grupos; vascularizao mais evidente no grupo GO3<; menor
expresso de fibroblastos jovens para o GO3>; expresso intensa de sntese de
colgeno mais evidente nos GO3> e Gnada; expresso intensa de matriz colagnica
nos grupos irrigados com gua ozonizada e no grupo controle positivo com relao
ao grupo controle positivo.

79

Figura 5.2 - Fotomicrografia dos cortes histolgicos de cada um dos grupos no perodo de 2 dias. Em
a (GO3>), b (GO3<), c (Ggua) e d (Gnada) foram observados: discreta re-epitelializao das
bordas (principalmente em a e c), infiltrado inflamatrio (maior expresso em a), edema
(menor expresso em c), necrose, aberturas de espaos vasculares, fibroblastos jovens,
sntese de colgeno e deposio de matriz colagnica desorganizada (menos
expressivas em d) (HE, aumento 200X)

80

Figura 5.3 - Fotomicrografia dos cortes histolgicos de cada um dos grupos no perodo de 7 dias. Em
a (GO3>), b (GO3<), c (Ggua) e d (Gnada) foram observados: re-epitelializao da ferida
(menos expressivo em c e d), infiltrado inflamatrio mais expressivo em c, aberturas de
espaos vasculares, fibroblastos jovens (principalmente em a e b), sntese do colgeno
(maior expresso em c e d) e deposio de fibras colgenas (maior expresso em a e b)
(HE, aumento 200X)

81

Figura 5.4 - Fotomicrografia dos cortes histolgicos de cada um dos grupos no perodo de 15 dias.
Em a (GO3>), b (GO3<), c (Ggua) e d (Gnada) foram observados: re-epitelializao
completa sobre o local da feridas aberturas, espaos vasculares, fibroblastos jovens,
sntese do colgeno (maior expresso em a e d), sntese de colgeno e intensa
expresso da deposio de fibras da matriz extracelular, de forma mais organizada em a
e d (HE, aumento 200X)

82

5.2.2 Anlise histomorfomtrica

Os dados da anlise histomorfomtrica digital, com relao s porcentagens


de celularidade, espao branco e matriz colagnica, esto descritos na tabela 5.3.

Tabela 5.3 - Dados da anlise histomorfomtrica digital

Perodo

2 dias

7dias

14dias

Grupo

Celularidade

Espao Branco

Matriz Colagnica

Mdia
%

Desvio
padro
+/-

Mdia
%

Desvio
padro
+/-

Mdia
%

Desvio
Padro
+/-

GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

9,4
13,0
11,0
10,5

8,6
8,8
7,7
9,3

13,1
17,8
15,8
17,8

6,8
5,7
4,8
11,2

77,5
69,2
73,2
71,7

7,2
8,9
8,0
9,0

GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

6,7
8,3
7,6
6,9

2,3
4,3
3,2
5,0

6,3
9,3
9,2
8,2

3,2
5,6
4,9
3,5

87,0
82,4
83,2
84,9

4,2
9,2
5,6
5,0

GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

5,6
4,1
4,4
5,3

2,5
1,5
2,2
1,9

14,7
12,6
12,1
15,7

8,4
7,0
9,0
9,0

79,7
83,3
83,5
79,0

7,7
6,5
7,7
8,4

Pelo estudo quantitativo, tanto no primeiro como no segundo perodo, o GO3<


apresentou maior porcentagem de celularidade, seguido em ordem decrescente
pelos Ggua, Gnada e GO3>. No ltimo perodo, esta relao se inverteu (Grfico 5.3).
Pelo estudo estatstico, no foram encontradas diferenas ou semelhanas
significantes (Anexo D).

83

Mdia em porcentagem de pxels

Histometria Celularidade

GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

2dias

7dias

14dias

Perodos

Grfico 5.3 - Histomorfometria - representao da celularidade

Com relao porcentagem de espao branco pelo estudo quantitativo, no


perodo de 2 dias, o valor desta porcentagem foi menor para o GO3>, seguido
crescentemente pelos valores dos Ggua, GO3< e Gnada. Os dados desta
caracterstica para os GO3< e Gnada, em comparao aos outros dois grupos, foram
superiores no perodo de 7 dias e inferiores no de 14 dias, sendo a diferena maior
neste ltimo perodo (Grfico 5.4).

Mdia em porcentagem de pxels

Espao em Branco

GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

2dias

7dias

14dias

Perodos

Grfico 5.4 - Histomorfometria representao do espao branco

84

O estudo estatstico da porcentagem do espao branco verificou que: com


relao ao GO3> houve diferenas significantes em comparao aos Ggua e Gnada,
exceto com relao a este ltimo grupo no segundo e terceiro perodos, nos quais
foram semelhantes; com relao ao GO3< existiram semelhanas significantes em
comparao aos Ggua e Gnada, exceto com relao a este ltimo grupo no primeiro
perodo, no qual foram diferentes. As demais distribuies analisadas mostraram-se
estatisticamente pouco significantes (Anexo E).

No perodo de 2 e 7 dias pelo estudo quantitativo, a porcentagem de matriz


colagnica foi maior para o GO3>, havendo pouca diferena entre os demais grupos.
No perodo de 14 dias, a porcentagem desta matriz foi menor para os grupos GO3>
e Gnada, e maior para os outros dois grupos (Grfico 5.5). Pelo estudo estatstico, no
foram encontradas diferenas ou semelhanas significantes (Anexo F).

Mdia em porcentagem de pxels

Matriz Colagnica
GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

2dias

7dias

14dias

Perodos

Grfico 5.5 - Histomorfometria representao da matriz colagnica

O grupo GO3< se comportou de forma similar com o Ggua, principalmente


para as anlises das porcentagens de celularidade no ltimo perodo e de espao

85

em branco e de matriz colagnica no segundo e terceiro perodo de observao.


Nas mesmas ocasies, os dados identificados para o grupo GO3> se comportaram
de forma mais semelhante dos observados para o grupo Gnada do que com relao
aos demais grupos.

5.2.3 Anlise imunoistoqumica

As informaes obtidas pela anlise quantitativa dos cortes corados pelas


reaes imunoistoqumicas para colgeno tipo-I esto ilustradas pelas figuras 5.5 e
5.6. A disposio das fibras colgenas em alguns campos observados se
apresentou ora em feixes finos e paralelos, ora de forma densa ou enovelada, no
sendo possvel correlacion-la com o tipo de tratamento realizado. Os resultados da
classificao em escala arbitrria da expresso de intensidade de matriz formada
esto representados na tabela 5.4, a seguir:

Tabela 5.4 Dados da anlise da imunoistoqumica para colgeno


tipo-I de acordo com escala arbitrria de expresso
Colgeno
Tipo I

_2dias_

_7dias_

Borda
Mdia

Centro
Mdia

Borda
Mdia

Centro
Mdia

GO3>
GO3<
Ggua
Gnada

2
1,6
1,3
2

3
3
3
3

2
2,5
2,5
2

1
1,6
1

___14dias__

86

Os resultados quantitativos da contagem de miofibroblastos nos cortes


corados pelas reaes imunoistoqumicas para anticorpos anti-actina, no perodo de
7 dias, foram: para o GO3> de 0,61 (clula/campo); para o GO3< de 0,90; para o
Ggua de 0,38; e para o Gnada de 0,57. As diferenas na forma de distribuio e de
localizao dessas clulas no foram consideradas relevantes, bem como a
presena das mesmas no perodo de 2 e 14 dias.

87

Figura 5.5 - Fotomicrografia dos cortes histolgicos corados pela reao de imunoistoqumica para
anticorpo colgeno tipo-I de cada um dos grupos no perodo de 7 dias. Em a (GO3>), b
(GO3<), c (Ggua) e d (Gnada) foram observados: forte expresso para este anticorpo, ora
em feixes finos e paralelos, ora de forma densa e enovelada (aumento 400X)

88

Figura 5.6 - Fotomicrografia dos cortes corados pelas reaes de imunoistoqumica para anticorpo
colgeno tipo-I de cada um dos grupos no perodo de 14 dias. Em a (GO3>), b (GO3<), c
(Ggua) e d (Gnada) foram observados: forte expresso para este anticorpo no estroma,
com disposio das fibras colagnicas em feixes finos (principalmente em a, b e d) e em
forma mais densa (principalmente em c) (400X)

89

6 DISCUSSO

O oznio, quando em contato com o organismo, capaz de desencadear


respostas biolgicas por influenciar no balano redox, pois, devido suas
caractersticas bioqumicas, desencadeia reaes oxidantes que originam molculas
sinalizadoras de vrios processos celulares (ERO e LOP) (BOCCI, 2004a, 2006c,
2007).
Porquanto no h duvidas que o estado redox modula a reparao tecidual
(KANDLER et al., 2005; HERNNDEZ, 2007; SEN et al., 2002; SEN; ROY, 2008) e
est envolvido no desenvolvimento de muitas doenas (BOCCI, 2006a; ANAKI;
ICEK; ANAKI, 2005; HERNNDEZ, 2007; SCHULZ; STECHMILLER, 2006). De
tal modo, a ozonioterapia pode ter papel teraputico para a reparao tecidual
(SCHULZ; STECHMILLER, 2006; SEN; ROY, 2008).
Nos acreditamos que o oznio, tanto na forma de gs como diludo em gua,
pode ser capaz de interferir na reparao tecidual quando em contato com tecidos
cruentos, uma vez que alguns autores tm comprovado in vitro que a exposio
celular a este oxidante suscita performance sobre as ERO (HERNNDEZ, 2007; RE
et al., 2008). Lembramos tambm que tm sido descritas boas evidncias da
interao do oznio com diferentes componentes celulares (BOCCI, 1996), seja
aplicado local ou sistemicamente (BOCCI, 1996, 2006c; RE et al., 2008).
Enfatizamos que tm sido pesquisados e comprovados efeitos biolgicos na
epiderme e derme da exposio ao gs oznio (JANIC et al., 2005; LIM et al., 2006;
VALACCHI et al., 2002, 2003, 2004; VALACCHI; FORTINO; BOCCI, 2005), citando
a capacidade desta exposio de alterar a arquitetura e a elasticidade desses

90

tecidos (CARLETTO; NOCOLAY, 2000; COTOVIO et al., 2001). Acreditamos que


este tecido representa um apropriado modelo de estudo para pesquisar a reparao
tecidual.
Outras caractersticas do oznio indicadas na literatura poderiam contribuir
para torn-lo til na resposta biolgica, como o fato de ser uma molcula produzida
fisiologicamente durante o processo de inflamao (WENTORTH et al., 2002) e de
atuar via sistemas endgenos de antioxidante (RE et al., 2008), estimulando a
capacidade natural de reparao tecidual (BOCCI, 2006b).
As anlises macroscpicas e microscpicas dos resultados encontrados nesta
pesquisa demonstraram que houve diferenas no processo de reparao tecidual
entre os mtodos propostos, o que pde indicar alguma interao do oznio neste
processo.
Com relao aos resultados da anlise morfolgica quantitativa, no perodo
de 7 dias, todos os grupos que receberam irrigao apresentaram rea maior do que
o grupo no irrigado; diferena justificada parcialmente pela ao mecnica exercida
pela lavagem diria. Detalhamos que entre esses grupos irrigados, os que
empregaram gua ozonizada apresentaram uma reduo maior da rea entre o
primeiro e segundo perodo de observao, principalmente o GO3<. Adicionalmente,
no perodo de 14 dias, a menor rea encontrada entre todos os grupos foi para o
GO3<, e a maior para o GO3>.
Complementarmente,

estudo

estatstico

da

rea

dos

resultados

morfolgicos revelou que ambos os grupos irrigados com gua ozonizada


apresentaram diferenas significantes em comparao ao grupo controle positivo.
Dessa forma, os resultados com relao rea puderam sugerir atuao do
oznio diludo em gua na reparao das leses teciduais, com possvel

91

favorecimento

ao

fechamento

tecidual,

evidenciaram

importncia

da

concentrao.
Embora tenha sido possvel identificar pelo estudo quantitativo e estatstico
diferenas significantes dos dados morfolgicos da rea entre os grupos testados
(GO3> e GO3<) e os controles, ponderamos que no houve retardo no processo de
reparao tecidual em nenhuma situao, sendo que todas as leses apresentaram
fechamento condizente com o processo normal de reparao.
Foi possvel constatar que a diminuio da rea entre os perodos teve
correlao com o fenmeno de contrao tecidual da ferida, avaliada por meio do
fator de forma. Durante o intervalo de tempo entre o primeiro e segundo perodo de
observao, todos os grupos irrigados apresentaram menor diminuio da rea em
relao ao grupo no irrigado, o que provavelmente possibilitou uma contrao mais
lenta e conseqentemente mais regular, fato comprovado pelos valores dos seus
fatores de forma que foram superiores em relao ao outro grupo; esses dados
puderam ser interpretados como uma ferida de formato mais regular. Do mesmo
modo, o grupo no irrigado, teve uma reduo maior da rea e conseqentemente
um formato mais irregular, constatada pelo seu valor do fator de forma, que foi o
menor. Neste momento, ambos os grupos irrigados com gua ozonizada
apresentaram fator de forma estatisticamente diferente com relao ao controle
negativo.
No ltimo intervalo de tempo, aquela correlao entre velocidade de
fechamento e formato da leso pde ser identificada de maneira inversa, na qual os
grupos que foram irrigados tiveram maior reduo da rea acarretando em uma
contrao e formato mais irregulares (fator de forma inferior), e o grupo no irrigado
apresentou menor reduo e conseqentemente as mesmas caractersticas mais

92

regulares. Contudo, entre os grupos irrigados, o que utilizou gua ozonizada na


maior concentrao apresentou maior fator de forma. Isto nos permitiu sugerir que o
oznio diludo em gua na concentrao de 4ppm teve efeito na contrao tecidual
durante o processo de reparao, contribuindo para um fechamento mais regular da
ferida. Especificamente, neste ltimo perodo, apenas o GO3> apresentou diferena
estaticamente significante do fator de forma com relao ao grupo controle positivo e
negativo.
Assim,

os

resultados

encontrados

pela

avaliao

macroscpica

demonstraram que supostamente a utilizao contnua da gua ozonizada por meio


de irrigaes cirrgicas, dependendo da concentrao, possa implicar possivelmente
em uma reduo mais rpida da rea da ferida e em alteraes da contrao
tecidual no processo de reparao. Na prtica, dependendo da situao clnica,
essas alteraes podem representar benefcios reparao tecidual, principalmente
em feridas que necessitam de auxlio para o fechamento tecidual, por exemplo,
feridas crnicas, como mencionou Schulz e Stechmiller (2006) e Valacchi e Bocci
(1999).
O processo de contrao tecidual modulado principalmente pelos
miofibroblastos. A aplicao do oznio j teve efeito demonstrado em muitos
mediadores bioqumicos que participam da diferenciao, proliferao, atuao e
apoptose dessas clulas (FEUGATE; LI; MARTINS-GREEN, 2002; KWON et al.,
2006). Podemos citar, por exemplo, sua interferncia comprovada in vitro no PDGF,
TGF- (VALACCHI; BOCCI, 1999) e in vivo na expresso direta do xido ntrico
(CHEN et al., 2008a, b).
A identificao dos miofibroblastos por meio das reaes de imunoistoqumica
para anticorpos anti-actina foi adequada com relao ao perodo de atuao destas

93

clulas no transcorrer do processo de reparao, sendo que normalmente aparecem


em perodos intermedirios e desaparecem nos estgios mais avanados (KWON et
al., 2006). A despeito destes achados, no foi possvel correlacionar a quantidade de
miofibroblasto com a contrao da ferida. Contudo, o fato da contagem de
miofibroblastos ter sido maior para os grupos irrigados com gua ozonizada em
relao aos grupos controles subsidiou a hiptese de que o oznio pode interferir na
atividade dessas clulas e conseqentemente no processo de contrao tecidual.
Neste ponto, ressaltamos a importncia da concentrao do oznio na gua,
pois variaes da dose podem representar efeitos favorveis ou prejudiciais, uma
vez que o oznio interfere na quantidade de componentes bioqumicos, cujas
expresses tambm so determinantes para o desempenho dos mesmos.
Lembrando que, dependendo da concentrao de oznio, este pode induzir ou
desfavorecer a expresso de xido ntrico, um dos reguladores da apoptose dos
miofibroblastos, sendo que tanto o excesso como a falta deste xido pode acarretar
em dano tecidual (SHI et al., 2001; RE et al., 2008). Este fato poderia explanar o
porque do GO3< ter apresentado na anlise imunoistoqumica menor quantidade de
miofibroblasto em relao ao GO3>.
A anlise histomorfolgica revelou que, no incio, o processo inflamatrio foi
evidentemente menos expressivo no grupo controle positivo do que no negativo.
Esta evidncia demonstrou que irrigaes de tecidos cruentos podem inicialmente
contribuir para a diminuio da inflamao, provavelmente pelo fato de remover
resduos e restringir a presena de microorganismos. J nos grupos irrigados com
gua ozonizada, principalmente para o GO3>, a expresso das caractersticas
histolgicas da inflamao foi mais intensa e semelhante ao controle negativo,

94

sugerindo que, neste primeiro momento, o oznio diludo em gua foi capaz de
aumentar a resposta inflamatria.
A presena inicial de um processo inflamatrio mais intenso para os grupos
que empregaram gua ozonizada pde ser facilmente visualizado nos resultados da
anlise histomorfomtrica para o GO3<, por ter revelado para este grupo maior
porcentagem de celularidade e de espao em branco (respectivamente interpretados
como infiltrado inflamatrio e edema), mesmo sem diferenas aos outros grupos
estatisticamente relevantes. Em especial para a interpretao dos dados desta
anlise para o GO3>, que contrariamente apresentou menores porcentagens
daquelas caractersticas, devemos observar que este grupo apresentou maior
porcentagem de matriz colagnica, o que pode indicar uma formao de colgeno
maior no perodos iniciais e explicar as porcentagens anteriormente citadas.
Confirmando aquela interpretao de maior formao de matriz colagnica
para o grupo irrigado com gua ozonizada na maior concentrao no primeiro e
segundo perodos estudados, os resultados histomorfolgicos revelaram expresso
mais intensa da sntese de colgeno para o grupo em questo. Esses fatos
indicaram que o oznio diludo em gua possa ter favorecido uma produo de
matriz colagnica mais precoce. Citamos tambm que, que nos mesmos perodos, o
estudo

quantitativo

da

marcao

do

colgeno

tipo-I

pelas

reaes

de

imunoistoqumica indicou maior expresso deste colgeno para o mesmo grupo.


A associao encontrada entre o uso da gua ozonizada com aumento inicial
do processo inflamatrio, no condiz com a crena encontrada na literatura de que o
oznio teria ao antiinflamatria (BULIS, 1996; BULIS et al., 1997). Acreditamos
que este tipo de citao reflita outras propriedades deste composto que podem
causar diminuio clnica da inflamao.

95

Todavia, no perodo de sete dias, a correlao entre resposta inflamatria e


irrigao se modificou: o Ggua apresentou de forma mais expressiva o processo
inflamatrio do que Gnada. Provavelmente, aps vrios dias de irrigao, o trauma
mecnico dificultou a reduo do processo inflamatrio no grupo controle positivo.
Por outro lado, a utilizao da gua ozonizada deve ter contribudo tal reduo, uma
vez que ambos grupos irrigados com esta gua apresentaram menor resposta
inflamatria,

muito

prxima

ao

do

controle

negativo

(tanto

na

anlise

histomorfolgica como na histomorfomtrica), fatos estaticamente comprovados para


o GO3>. Dessa forma, em um segundo momento, a atuao do oznio diludo em
gua na reparao possivelmente contribuiu para uma reduo do processo
inflamatrio.
Corroboramos com autores, os quais mencionam o oznio como modulador
do processo inflamatrio (BOCCI, 2006c; CARDOSO et al., 2000; MADEJ et al.,
2007) e/ou estimulador do sistema imune (TOROSSIAN et al., 2004), sendo que
desta forma sua utilizao acarrete em efeito estabilizador e conseqentemente
regenerador (VALACCHI; BOCCI, 1999). Pode estar envolvido tambm um estmulo
inflamatrio como mecanismo de proteo em conseqncia da exposio ao
oxidante oznio, representando uma resposta adaptativa do organismo (VALACCHI
et al., 2002, 2003, 2004). Essas hipteses ajudam a compreender do porque da
observao de uma menor resposta inflamatria nos grupos que empregaram gua
ozonizada no segundo perodo.
Como a resposta inflamatria a primeira reao do organismo frente a um
dano, esta influencia todas as fases da reparao tecidual (KWON et al., 2006;
WASSERBACER; PEREZ-MEZA; CHAO, 2008; WILGUS et al., 2005). Verificamos
que, no incio do processo de reparao em relao aos controles, os grupos

96

irrigados com gua ozonizada (que apresentavam maior resposta inflamao)


demonstraram de forma mais expressiva as caractersticas histolgicas do tecido de
granulao em formao, como maior expresso de vasos neoformados, de
fibroblastos jovens, de sntese de colgeno e de matriz extracelular. No entanto, o
grupo controle negativo, mesmo apresentando inflamao semelhante aos grupos
ozonizados, no demonstrou dados histolgicos do tecido de granulao similares a
estes, mas, muito inferiores; igualmente para o grupo controle positivo que
apresentou menor resposta inflamatria. Assim, esses fatos iniciais em conjunto
levam a supor que o oznio diludo em gua possa ter produzido estmulos
inflamatrios e reparadores que favoreceram a sntese de tecido.
Durante o transcorrer dos perodos, foi possvel identificar caractersticas
histomorfolgicas do tecido neoformado de forma mais expressivas nos grupos que
empregaram a gua ozonizada. O GO3> foi se tornando histologicamente
semelhante ao Gnada, sendo que, no final do perodo de observao, foram estes
dois grupos que apresentaram as caractersticas microscpicas do processo
evolutivo da reparao de forma mais evidente, com expresso intensa de sntese
de colgeno e formao de matriz colagnica. Alm disso, no perodo de 14 dias,
pela avaliao histomorfomtrica, pudemos interpretar que aqueles dois grupos
apresentaram uma matriz colagnica mais organizada em comparao aos demais,
pelo fato de terem revelado uma baixa porcentagem de matriz juntamente com alta
porcentagem de espao em branco (identificado neste caso como espaos entre as
fibras colgenas), semelhanas estatisticamente significantes.
Curiosamente, a anlise histomorfomtrica identificou que, em vrias
situaes, o grupo GO3< foi estatisticamente semelhante ao Ggua, como no ltimo
perodo de observao em relao a porcentagens de celularidade e no segundo e

97

terceiro perodo de espao em branco e de matriz colagnica. Devemos lembrar que


os resultados desta anlise devem ser interpretados pela associao da fase
inflamatria e da fibro-produtiva da reparao tecidual.
A colorao do colgeno tipo-I pelas reaes de imunoistoqumica foi regular
e bem marcada, com forte expresso em todos os grupos. A disposio das fibras
colgenas em alguns campos observados se apresentou ora em feixes finos e
paralelos, ora de forma densa ou enovelada, no sendo possvel correlacion-la com
o tipo de tratamento realizado. Outros estudos so necessrios para se determinar
possveis diferenas de deposio da matriz extracelular, empregando mtodos
adicionais de avaliao, como a identificao dos outros tipos de colgenos.
Contudo, pudemos afirmar que em nenhum dos grupos ocorreu prejuzo na
produo colagnica.
Os aspectos histolgicos demonstrados neste estudo nos levam a supor que,
em feridas limpas de organismo saudveis, a presena de irrigao, embora
inicialmente favorvel devido limpeza da ferida, pode ao longo dos dias prejudicar
o processo de reparao pelo trauma mecnico local, por acarretar na permanncia
da inflamao e na diminuio da formao da matriz extracelular; contrariamente a
no irrigao, embora esta situao seja inicialmente desfavorvel por aumentar a
inflamao. No entanto, quando se empregou gua ozonizada, principalmente na
maior concentrao, a formao tecidual no foi prejudicada, mesmo apresentando
aumento inicial da resposta inflamatria. Esses achados sugeriram atuao do
oznio no arranjo tecidual
Existem inmeras hipteses de como o oznio poderia interferir de forma
favorvel reparao tecidual, quase todas relacionadas possibilidade deste
oxidante representar o estmulo antioxidante para o organismo (BOCCI, 2004a,

98

2006c, 2008; LARINI; BOCCI, 2005; RE et al., 2008). Podemos lembrar que j foi
comprovada experimentalmente in vivo a atuao do oznio na forma de gs na
expresso de citocinas inflamatrias (TOROSSIAN et al., 2004), de enzimas
antioxidantes (MADEJ et al., 2007), da heme-oxigenase I, das metaloproteinases
(VALACCHI et al., 2002, 2003, 2004), do NFB e do TGF- (JANIC et al., 2005; LIM
et al., 2006), e in vitro do IFN-, do TNF- e interleucinas (LARINI; BOCCI, 2005).
Independente das hipteses bioqumicas de como o oznio em gua pode
interagir com a resposta celular, a simples presena da maior quantidade de
oxignio, nas feridas irrigadas, proveniente da gua ozonizada, com certeza, pode
ser favorvel reparao tecidual das mesmas e, provavelmente, pde estar
relacionada aos efeitos teraputicos observados (FRIES et al., 2005; LIM et al.,
2006; OTER; KORKMAZ, 2006; VALACCHI; FORTINO; BOCCI, 2005).
Acreditamos que suplementos adicionais de oxignio interfiram na induo de
alguns oxidantes, porque podem ser sinalizadores para eventos oxigniodependente, sensveis ao estado redox, representando um componente fundamental
para todos os fatores relacionados reparao (SEN; ROY, 2008). Lembramos do
oxidante perxido de hidrognio, cujas aes benficas j foram comprovadas no
processo de reparao e so extremamente dependentes da concentrao (SEN et
al., 2002; WASSERBACER; PEREZ-MEZA; CHAO, 2008).
O fato da aplicao local da gua ozonizada representar aumento na
quantidade de oxignio disponvel no tecido superficial pode ter grande utilizada em
situaes que apresentam dficit daquele composto, como tecido com hipoxia, em
feridas crnicas (WILGUS et al., 2005), osteomielite (STEINHART; SCHULZ;
MUTTERS, 1999) e em paciente diabtico (AL-DALAIN et al., 2001; MARTNEZSANCHES et al., 2005; RE et al., 2008). Talvez, estas situaes e/ou outras que

99

apresentem algum prejuzo da funo celular possam interagir de forma diferente


com o oznio e conduzir a resultados mais favorveis e mais evidentes, do que no
tecido saudvel.
Mesmo atuando em animais saudveis e feridas no infectadas, os nossos
resultados demonstraram que a realizao diria de irrigao com gua ozonizada
foi capaz de atuar no processo de reparao, de forma depende da concentrao
utilizada. Os motivos bioqumicos responsveis por esta atuao devem ainda ser
elucidados por outras pesquisas, bem como se as alteraes produzidas
representam, na clnica, aes favorveis ou no quele processo.
Tambm no pudemos avaliar se os efeitos biolgicos induzidos pelo oznio
diludo em gua foram apenas de forma local ou se alcanaram atuaes sistmicas,
como j foi comprovado para aplicao do gs oznio (TOROSSIAN et al., 2004).
Igualmente, no pudemos determinar se aqueles efeitos ocorreram apenas durante
os minutos da irrigao, quando havia contato da gua ozonizada com o tecido
cruento, ou se esta pode modificar a funo celular por um perodo longo aps sua
aplicao, como os relatados por Foucaud et al. (2006).
No h dvidas que os efeitos da ozonioterapia esto relacionados dose do
oznio utilizada, bem como as condies do equilbrio redox do organismo
(BAYSAN; WHILEY; LYNCH, 2000; BOCCI, 2004a, 2006a, b, c; CATALDO;
GENTILINI, 2005; GROOTVELT et al., 2004a, b; TRAVAGLI; ZANARDI; BOCCI,
2006; TRAVAGLI et al., 2007). Embora Bocci (2006c, 2008) relate, apesar das
controvrsias, que uma dose segura j esteja estabelecida com relao aplicao
do gs, no h referncia na literatura com relao concentrao teraputica
adequada do oznio na gua.

100

Acreditamos que realmente seja de extrema dificuldade o estabelecimento de


uma dose ou janela teraputica, sendo o balano redox regulado por inmeros
eventos bioqumicos (HERNNDEZ, 2007) e alterado por condies especficas de
cada organismo (BALLAS; DAVIDSON, 2001; BOCCI, 2006a; LIM et al., 2006).
Enfatizamos que a concentrao de oznio sempre responsvel pela
existncia ou no de atuao bioqumica do mesmo, e se esta ser benfica ou
prejudicial (BOCCI, 2006b). Conquanto os efeitos tenham sido dependentes da dose
de oznio utilizada, foi possvel verificar, analisando os resultados obtidos pela
avaliao macroscpica e microscpica, que a gua ozonizada nas concentraes e
da forma empregadas, no apresentou efeito txico ou prejudicial reparao
tecidual.
Embora seja a quantidade de oznio diludo em gua determinante para os
efeitos biolgicos do mesmo, impressionante o nmero de trabalhos cientficos que
utilizam a gua ozonizada sem elucidar o monitoramento da sua concentrao
(EBENSBERGER POHL; FILIPPI, 2002; ERDSI; FILLIP; MEYER, 2005; ESTRELA
et al., 2006; ESTRELA et al., 2007; GARDUO et al., 1995; KROZER; HALL;
ERICSSON, 1999; VELANO et al., 2001). Este fato acarreta em contestao sobre
as metodologias empregadas, o que colabora para o no desenvolvimento e para
ceticismo da tcnica, como j muito citado na literatura (BOCCI, 2004a, 2006c,
2008).
Algumas publicaes, como de Arita et al. (2005), Hems et al. (2005), Huth et
al. (2006) e Nagayoshi et al. (2004a), especificaram utilizao de testes fotomtricos
ou colorimtricos para determinao da concentrao do oznio na gua. Embora
estes autores tenham descrito estas concentraes por medidas diferentes, essas
variaram entre 0,5 e 5 ppm, intervalo no qual nossas concentraes utilizadas se

101

encontraram. O teste colorimtrico por ns utilizado revelou-se ser fundamental para


o controle desta concentrao, uma vez que apenas uma pequena quantidade de
oznio produzido mantido e incorporado ao fludo. Alm disso, este teste
apresentou fcil execuo, boa preciso e baixo custo.
Em nossa opinio, a aplicao da gua ozonizada na boca no apresenta
risco relacionado toxidade do oznio quando respirado, fato que seria de difcil
controle se o gs fosse empregado, visualizando a segurana do paciente e do
profissional. Duvidamos da possibilidade de mecanismo de suco suficiente para a
aplicao do gs de oznio durante procedimentos cirrgicos e/ou sob tecido mole e
sseo, como proposto por Stbinger, Saber e Filippi (2006) e realizado por Agrillo et
al. (2006, 2007). Acreditamos que para estas aplicaes, seria necessrio o
desenvolvimento de dispositivos capazes de garantir simultaneamente vcuo e
suco naquelas circunstncias, como propostos para o tratamento de cries no
dente, que um tecido mineralizado de fcil isolamento e acesso (BAYSAN;
LYNCH, 2004; BAYSAN; WHILEY; LYNCH, 2000; HOLMES, 2003; KRASSE, 2004).
A alta biocompatibilidade da gua ozonizada com os tecidos bucais,
necessria para sua utilizao clnica, j foi comprovada (EBENSBERGER; POHL;
FILIPPI, 2002; HUTH et al., 2006), inclusive em ambas concentraes empregadas
nesta pesquisa. Estamos de acordo com Filippi (1997a) e Ebensberger, Pohl e Filippi
(2002) que a isotonia desta gua no representaria desvantagem em comparao
ao uso do soro fisiolgico.
O oznio incorporado em gua tambm oferece facilidade de uso clnico
devido a sua maior estabilidade quando se apresenta desta forma, o que permiti seu
armazenamento at vrios dias, desde de que corretamente manipulado (BOCCI,
2004a, b, 2006c; BULIS et al., 1997). importante explanar que, durante o

102

exerccio do mtodo proposto, a produo da gua ozonizada por meio do gerador


confivel a partir de oxignio medicinal mostrou-se segura, simples e econmica,
no requerendo espao fsico ou instalaes adicionais (BOCCI, 2004a, 2006b)
Lembramos ainda que para esta produo no h contra indicao relacionada ao
risco de oznio liberado no ar (FILIPPI, 1998).
A ao antimicrobiana do oznio tem sido seguramente referendada na
literatura desde os primrdios da utilizao da ozonioterapia (BULIS, 1996; BULIS
et al., 1997; GROOTVELT et al., 2004a; STBINGER; SABER; FILIPPI, 2006). A
efetividade desta ao do oznio, na forma de gs e diludo na gua, contra muitas
bactrias bucais j foi comprovada (ESTRELA et al., 2006; GARDUO et al., 1995;
NAGAYOSHI et al., 2004a; VELANO et al., 2001), enquanto, contra bactrias
organizadas em biofilme ainda questionada (HEMS et al., 2005; MLLER;
GUGGNHEIM; SCHMIDLIN, 2007; WALKER et al., 2003).
Como a cavidade bucal acometida por inmeras doenas infecciosas,
julgamos, como Nagayoshi et al. (2004a) e Velano et al. (2001), que o efeito
antimicrobiano da gua ozonizada, a torna de grande utilidade em muitas prticas da
odontologia. Devido aos mtodos empregados, que utilizou feridas limpas de
animais jovens e saudveis, no pudemos analisar ou comprovar tal efeito.
Se alm das caractersticas j referendadas, como efeito antimicrobiano,
ausncia de toxidade e facilidade de uso, a gua ozonizada apresentasse tambm
atividades pr-inflamatrias e reparadoras favorveis reparao tecidual em
determinadas situaes clnicas, acreditamos que esta apresentaria importantes
indicaes no campo de cirurgia buco-maxilo-facial, como havia sugerido Filippi
(1997a e 1999b). Porm, divergimos deste autor, quando aconselha, para
procedimentos cirrgicos, o uso da gua ozonizada diretamente da unidade de gua

103

do equipamento odontolgico, pois, segundo Walker et al. (2003), a desinfeco


desta unidade pela ozonizao no garante a esterilidade da mesma.
So inmeras as possibilidades do emprego da gua ozonizada no campo da
cirurgia, como as j citadas na literatura: para osteotomia durante a exodontia de
dentes inclusos (FILIPPI, 1999b), em reimplantes de dentes (EBENSBERGER;
POHL; FILIPPI, 2002), na regenerao tecidual guiada, no tratamento de
perimplantite (KROZER; HALL; ERICSSON, 1999), em procedimentos para enxertos
autgenos (ERDSI; FILIPPI; MEYER, 2005) e para anti-sepsia (HUTH et al., 2006).
Visualizamos seu uso tambm em irrigaes cirrgicas e no tratamento de muitas
afeces bucais.
importante lembrar que o emprego do leo ozonizado na odontologia
apresenta caractersticas de uso e efeitos semelhantes ao da gua ozonizada, como
demonstrou os resultados da pesquisa experimental de Sakazaki et al. (2007), que
foram muito similares aos nossos.
Diante da pesquisa explanada, nossos resultados puderam identificar que a
aplicao do oznio diludo em gua por meio de irrigaes cirrgicas trans e psoperatrias interferiu no processo de reparao tecidual de organismos saudveis,
de forma dependente da dose, sem produzir efeito txico ou prejudicial.
Consideramos que esta interferncia possa atuar de forma favorvel reparao
tecidual dependendo da situao clnica.
Devidos aos indcios da atuao do oznio diludo em gua na reparao
tecidual, acreditamos que a utilizao da gua ozonizada deva ser pesquisada com
relao a vrios aspectos bioqumicos e clnicos da reparao. Os mecanismos que
acarretam em seus possveis efeitos biolgicos, com embasamento na sua
concentrao, precisam ser elucidados para que a gua ozonizada possa ser

104

utilizada com segurana e para que suas inmeras indicaes teraputicas possam
ser aproveitadas.

105

7 CONCLUSO

Esta pesquisa permitiu concluir que o oznio diludo em gua, aplicado por meio
de irrigaes cirrgicas:

no apresentou efeito txico ou prejudicial reparao tecidual;

interferiu no processo de reparao tecidual, de forma dependente da


concentrao;

possibilitou maior reduo da rea, principalmente quando a concentrao de


1ppm foi utilizada, e contribuiu para uma contrao tecidual mais regular, quando a
concentrao empregada foi de 4ppm;

contribuiu para o aumento inicial da resposta inflamatria e posterior


diminuio da mesma, e favoreceu a formao tecidual, principalmente quando a
concentrao de 4 ppm foi empregada.

106

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117

ANEXO A Parecer do Comit de tica em Pesquisa

118

ANEXO B Anlise Estatstica

Anlise estatstica com relao rea da morfometria.


Teste de Wilcoxon
Nvel de significncia: 5%
Intervalo de confiana: 95%
Grau de liberdade: 3%

Comparao entre GO3> e Ggua

Comparao entre GO3> e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

22

24

12

18

14

19

14

20

14

11

14

14

12

14

Comparao entre GO3< e Ggua

Comparao entre GO3< e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

16

22

13

12

13

17

11

14

12

15

14
15
12
(estatisticamente pouco significante)

Comparao entre GO3> e G3<

Comparao entre GO3< e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

12

15

11

12

16

22

12

14

14

18

14
11
19
(estatisticamente pouco significante)

Comparao entre GO3>/GO3< e Ggua/Gnada


Dias

Tcalculado

Tcrtico

14

19

11

19

14

15

17

(estatisticamente pouco significante)

119

ANEXO C Anlise Estatstica

Anlise estatstica com relao ao fator de forma da morfometria.


Teste de Wilcoxon
Nvel de significncia: 5%
Intervalo de confiana: 95%
Grau de liberdade: 3%

Comparao entre GO3> e Ggua

Comparao entre GO3> e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

10

15

10

15

14

20

19

20

14

22

14

14

22

24

Comparao entre GO3< e Ggua

Comparao entre GO3< e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

23

15

12

15

25

20

13

18

14

27

24

14

24

20

Comparao entre GO3> e G3<

Comparao entre GO3< e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

11

15

11

15

14

17

22

14
23
24
(estatisticamente pouco significante)

14
17
24
(estatisticamente pouco significante)

Comparao entre GO3>/GO3< e Ggua/Gnada


Dias

Tcalculado

Tcrtico

20

20

26

30

14

35

32

(estatisticamente pouco significante)

120

ANEXO D Anlise Estatstica

Anlise estatstica com relao porcentagem de celularidade de histomorfometria.


Teste de Wilcoxon
Nvel de significncia: 5%
Intervalo de confiana: 95%
Grau de liberdade: 3%

Comparao entre GO3> e Ggua

Comparao entre GO3> e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

11

17

11

13

18

19

20

21

14
19
23
(estatisticamente pouco significante)

14
23
22
(estatisticamente pouco significante)

Comparao entre GO3< e Ggua

Comparao entre GO3< e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

19

18

10

10

25

21

15

16

14
29
31
(estatisticamente pouco significante)

14
23
23
(estatisticamente pouco significante)

Comparao entre GO3> e G3<

Comparao entre GO3< e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

11

13

11

12

16

14

10

14
19
20
(estatisticamente pouco significante)

14
19
20
(estatisticamente pouco significante)

Comparao entre GO3>/GO3< e Ggua/Gnada


Dias

Tcalculado

Tcrtico

21

20

27

30

14

33

31

(estatisticamente pouco significante)

121

ANEXO E Anlise Estatstica

Anlise estatstica com relao porcentagem de espao branco da histomorfometria.


Teste de Wilcoxon
Nvel de significncia: 5%
Intervalo de confiana: 95%
Grau de liberdade: 3%

Comparao entre GO3> e Ggua

Comparao entre GO3> e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

12

18

12

14

16

22

21

18

14

15

24

14

24

22

Comparao entre GO3< e Ggua

Comparao entre GO3< e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

21

18

11

14

23

22

15

18

14

28

26

14

24

22

Comparao entre GO3> e G3<

Comparao entre GO3< e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

12

13

10

14

16

11

12

14
15
12
(estatisticamente pouco significante)

14
17
23
(estatisticamente pouco significante)

Comparao entre GO3>/GO3< e Ggua/Gnada


Dias

Tcalculado

Tcrtico

10

14

12

14

14

20

(estatisticamente pouco significante)

122

ANEXO F Anlise Estatstica

Anlise estatstica com relao porcentagem de matriz colagnica de histomorfometria.


Teste de Wilcoxon
Nvel de significncia: 5%
Intervalo de confiana: 95%
Grau de liberdade: 3%

Comparao entre GO3> e Ggua

Comparao entre GO3> e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

11

14

10

15

18

15

14

14
13
12
(estatisticamente pouco significante)

14
12
10
(estatisticamente pouco significante)

Comparao entre GO3< e Ggua

Comparao entre GO3< e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

11

10

11

10

14
11
10
(estatisticamente pouco significante)

14
14
12
(estatisticamente pouco significante)

Comparao entre GO3> e G3<

Comparao entre GO3< e Gnada

Dias

Tcalculado

Tcrtico

Dias

Tcalculado

Tcrtico

12

14

12

14
11
16
(estatisticamente pouco significante)

14
14
18
(estatisticamente pouco significante)

Comparao entre GO3>/GO3< e Ggua/Gnada


Dias

Tcalculado

Tcrtico

14

12

16

(estatisticamente pouco significante)