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Bolsista de Iniciao Cientfica FAPESP discente do curso de Engenharia Qumica Professora da Universidade
3
Federal de So Carlos, Departamento de Engenharia Qumica Ps-doutorando na Universidade Federal do Cear,
Departamento de Engenharia Qumica
1,2
3
RESUMO Neste trabalho, estudou-se a obteno de etanol a partir de derivados do processamento de eucalipto para produo de celulose. Foram empregadas como fonte de biomassa
polpa de celulose branqueada e serragem. Ambos derivados foram submetidos a dois tipos de
pr-tratamentos para remoo de hemicelulose e lignina. A remoo da hemicelulose foi realizada em duas condies: temperatura ambiente ou a 121C, condio na qual foram obtidos
os melhores resultados. Posteriormente, o material foi submetido hidrlise com hidrxido de
sdio para remoo de lignina, a 120C. O meio utilizado nos experimentos SSF (Simultaneous
Saccharification and Fermentation) consistia em extrato de levedura, sais, substratos obtidos
aps pr-tratamentos (5gms/L de meio) e enzimas celulolticas comerciais CELLUCLAST (30 e
60FPU/g de substrato) e NS50010 (20 e 40CBU/g de substrato). Os experimentos foram realizados a 37C e pH inicial 5, sob condies anaerbias. Para os ensaios SSF, a concentrao
de etanol obtida foi de aproximadamente 14g/L com a polpa de celulose (com 60 FPU/g substrato de Celluclast e 40CBU/g de substrato de NS50010) e 3g/L com a serragem (com 30FPU/g
substrato de Celluclast e 20CBU/g substrato de NS50010). Estes valores foram alcanados aps aproximadamente 20 horas de cultivo, devido baixa disponibilidade de glicose.
INTRODUO
A biomassa de origem vegetal , atualmente, a nica fonte sustentvel de carbono orgnico. Assim, apenas os biocombustveis, ie, os
combustveis derivados de biomassa vegetal, so
considerados combustveis lquidos renovveis.
Alm disso, os biocombustveis geram significativamente menos emisses de gases causadores
do efeito estufa do que os combustveis fsseis
(HUBER et al., 2006).
O processo de produo de etanol a partir
de biomassa lignocelulsica basicamente composto por trs etapas (pr-tratamento, hidrlise e
fermentao). As etapas adicionais de tratamento
do material so requeridas devido natureza
recalcitrante dos materiais lignocelulsicos, que
possuem ligaes inter e intramoleculares que
fazem com que a hidrlise da celulose seja centenas de vezes mais difcil do que a hidrlise de
materiais amilceos,
No Brasil, os estudos da produo de etanol a partir da biomassa pela via enzimtica tm
se concentrado quase que exclusivamente na
utilizao do bagao de cana de acar como
Desta forma, o presente estudo teve como objetivo estudar a obteno de hidrolisados a
partir da ao de celulases sobre a frao celulsica de subprodutos do processamento do eucalipto para produo de celulose e papel, concomitantemente com a fermentao do hidrolisado
obtido utilizando a levedura de panificao prensada (Saccharomyces cerevisiae) - processo de
sacarificao e fermentao simultneas (SSF).
MATERIAL E MTODOS
Enzimas
Foram utilizadas preparaes enzimticas
Celluclast 1.5 L e NS50010 (-glucosidase pura)
doadas pela Novozymes A/S (Bagsvaerd,
Denmark).
Meios de cultivo
Dois meios de cultivo foram empregados:
meio de ativao da levedura: 0,5 g/L de
(NH4)2HPO4, 0,25 g/L de MgSO4.7H2O, 1,0 g/L de
extrato de levedura e 10 g/L de glicose; meio dos
experimentos SSF: semelhante ao de ativao,
com substituio da glicose pelo substrato slido
na proporo de 5gms para 125 ml de volume
total. O pH foi ajustado a 5,0 para ambos. Todos
os meios foram esterilizados a 120 oC por 15
minutos
Microorganismo
Foi utilizado o microrganismo Saccharomyces cerevisiae na forma de levedura de panificao comercial prensada, da marca Fleischmann, comercializada em tabletes de 90 g embalados individualmente, dentro do prazo de validade.
Pr-tratamento
serragem
da
polpa
de
celulose
A
e
B
C
e
D
E
Material
Quantidade de
substrato (g)
FPU
Celulase
CBU
glicosidase
PB
150
100
150
100
PB
300
200
RESULTADOS E DISCUSSES
Pr-tratamentos
Foram realizados 4 experimentos em triplicata, cujos resultados foram avaliados em termos
da massa perdida das amostras aps cada prtratamento (Tabela 2) e da composio dos hidrolisados obtidos (Tabela 3). Os dados apresentados nas Tabelas 2 e 3 so as mdias das triplicatas realizadas nos experimentos com o desvio
padro correspondente.
A Figura 1 ilustra as mudanas que ocorrem
nos materiais aps o pr-tratamento. Nas Figuras
1.b e c, amostras de material seco antes e aps
os pr-tratamentos podem ser comparadas. Visivelmente, a serragem de madeira perde cor em
conseqncia da remoo da lignina, um dos
principais responsveis pela colorao na madeira. Esta constatao confirmada pela Figura
1.a, a qual mostra a intensa cor escura adquirida
pelo hidrolisado resultante do pr-tratamento para
remoo de lignina da serragem. A colorao da
polpa branqueada no foi modificada por se tratar
de material j processado industrialmente.
(a)
Mtodos analticos
As atividades em celulase e glucosidase dos preparados enzimticos Celluclast 1.5 L e NS50010 foram determinadas de
acordo com a metodologia empregada em ADRIANO, 2008. A concentrao de glicose foi determinada pelo mtodo enzimtico (NOCENTINI e
ZANGIROLAMI, 2007); a concentrao de etanol
foi quantificada por cromatografia lquida de alta
eficincia (CLAE), utilizando-se uma coluna Shodex KS-801 lonpak e gua Milli-Q como eluente,
nas seguintes condies: 80C e 1 mL/min, com
detector ndice de refrao. J a concentrao
celular CX (em gms/L) foi estimada a partir da
leitura da densidade tica a 610 nm utilizando-se
uma curva de calibrao (Eq. 1) e multiplicandose por fator de correo (11,7 para a madeira e
6,5 para a polpa), o qual foi introduzido para compensar a reteno de massa celular pelos slidos
durante o procedimento de filtrao.
CX (gms/L) = 0,4799 *ABS(610 nm)
(1)
(c)
(b)
Figura 1 (a) Aspecto da suspenso aps a
reao para remoo de lignina da serragem
(b) Serragem antes (esquerda) e depois
(direita) dos pr-tratamentos. (c) Polpa
branqueada antes (esquerda) e aps (direita)
os pr-tratamentos.
Tabela 2: Resultados de porcentagem em
massa perdida aps pr-tratamentos.
% em massa perdida nas amostras
aps tratamento
Tratamento Polpa branqueada
Serragem
1,7 0,6
2,0 1,1
PT1A
8,1 0,3
12,06 0,05
PT1B
0
32,0 0,1
PT1A+PT2
0
40,2 0,5
PT1B+PT2
(a)
(b)
(c)
(d)
30
35
Concentrao (g/L)
etapa de sacarificao e fermentao simultneas. Aps constatarmos que a produo do lcool ocorria principalmente nas primeiras 20 horas, diminuiu-se o tempo de cultivo para 48 horas
(ltimo experimento).
30
25
20
15
10
Concentrao (g/L)
5
25
0
20
10
20
30
40
50
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
(e)
Figura 3: Resultados de concentrao celular,
de etanol e de glicose para cada um dos
experimentos (a) A, (b) B (c) C (d) D (e) E
(a)
Concentrao (g/L)
30
25
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
(b)
9
Concentrao (g/L)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
20
Conc. Etanol (g/l )
40
60
80
100
(c)
8
Concentrao (g/L)
Crescimento celular: Os dados para crescimento celular so reprodutveis quando comparados com suas duplicadas porm houve significativa disperso nos dados de concentrao celular devido s dificuldades na metodologia proposta.
As concentraes celulares representadas na Figura 3 foram obtidas a partir da leitura
dos dados de densidade tica alimentados a uma
curva de calibrao. Porm, no resultado original
de leitura de densidade tica, baixos valores de
concentrao celular foram alcanados. Suspeitou-se que parte da levedura estava ficando retida
no material slido coletado durante a filtrao das
amostras retiradas dos experimentos SSF. Assim,
um experimento de verificao desta hiptese foi
realizado e indicou que aproximadamente 91% da
massa total de levedura presente na amostra
permanecia retida juntamente com o material
slido para a serragem e 85% para a polpa de
celulose. A partir desta informao, estimou-se
um fator de correo, multiplicando os valores de
concentrao celular por 11,7 para a madeira e
6,5 para a polpa. No entanto, importante ressaltar que como a consistncia da suspenso muda
muito ao longo dos experimentos devido ao
das enzimas, este fator de correo no constante. Por isso, os resultados apresentados na
Figura 3 so mais qualitativos do que quantitativos quanto concentrao celular presente.
6
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
80
(d)
100
Liberao e consumo de glicose: Os resultados apresentados na Figura 3 mostram claramente que as maiores concentraes de glicose
presentes no incio dos experimentos e originadas
na etapa de pr-sacarificao foram consumidas
em aproximadamente 10 horas de fermentao. A
partir deste ponto, as concentraes de glicose se
mantiveram em valores inferiores a 300 mg/L
para todos os experimentos, com exceo do
experimento E, no qual a menor concentrao
medida foi de 970 mg/L. Este resultado mostra
que a concentrao residual de glicose dependente da carga enzimtica utilizada, o que por sua
vez determina o stress devido limitao por
glicose ao qual as clulas so expostas. Na Tabela 4 esto relacionados as concentraes residuais mximas de glicose atingidas em cada um dos
experimentos.
Tabela 4: Concentraes residuais mximas
de glicose em cada experimento
Concentrao
residual de
Experimento glicose (g/L)
A
0,330
B
0,122
C
0,126
D
0,109
E
0,970
Produo de etanol: Em todos os ensaios
observou-se produo de etanol. Um fator importante a se destacar referente ao perfil de formao do produto. Em todos os ensaios pode-se
notar que a produo de etanol atinge um mximo, normalmente alcanado em torno de 20 horas de experimento. Este perodo coincide com a
exausto da glicose liberada durante a prsacarificao. Assim, o consumo da glicose acumulada durante a pr-sacarificao juntamente
com a glicose gradativamente liberada durante o
processo SSF leva maior produo de etanol e
ao crescimento mais acentuado. Aps esse perodo, a glicose presente no meio proveniente
apenas do processo SSF, no sendo suficiente
para manter o ritmo de crescimento anterior. Provavelmente nesta fase, a glicose disponvel no
suficiente nem para atender s necessidades de
manuteno celular. .
Comparando-se os experimentos realizados
em diferentes condies, houve maior produo
de etanol para o ensaio realizado com o dobro da
carga enzimtica. A produo ficou em torno de
14 g/L no experimento E, 11 g/L no experimento A
e 3 g/L no experimento C. Estes resultados permitem concluir que a liberao de glicose o fator
determinante da produo de etanol, j que com o
aumento da carga enzimtica, maior produo de
etanol foi alcanada.
Outra constatao importante sobre o
papel do pr-tratamento no processo de produo
de etanol via hidrlise enzimtica e fermentao
simultneas. A polpa de celulose, utilizada como
experimento controle, praticamente celulose
pura, com estrutura totalmente aberta (experimentos A e B) e por isso alcana-se uma produo de etanol 3 vezes superior a dos experimentos C e D, realizados com serragem.
Finalmente, deve-se levar em considerao que as concentraes de etanol podem estar
subestimadas, pois muito provvel que tenha
havido perda significativa de etanol por evaporao durante o experimento, j que os mesmos
foram realizados a 37C em reatores sem condensador e tiveram longa durao.
0,45
4,55
0,33
4,67
3,73
1,27
4,12
0,88
0,33
4,67
CONCLUSES
O presente trabalho teve um carter exploratrio e considerando as condies experimentais
investigadas, as seguintes concluses preliminares podem ser extradas:
1) O pr-tratamento tem grande influncia no
desempenho do processo. Para as condies
empregadas, a remoo de hemicelulose por
hidrlise cida a quente, seguida por prtratamento alcalino para remoo de lignina apresentou os melhores resultados.
2) A reprodutibilidade observada nos experimentos realizados foi boa, garantindo confiabilidade
metodologia empregada;
3) Houve produo de etanol para todos os ensaios e a quantidade de enzima adicionada tem
influncia nos resultados;
4) Nos ensaios com polpa branqueada de celulose e maior carga de enzimas, atingiu-se a concentrao de 14 g/L de etanol em apenas 12 horas de cultivo. Esta produtividade superior aos
valores relatados na literatura.
5) A metodologia analtica proposta para a determinao da concentrao celular no apresentou
resultados satisfatrios pelo fato de haver reteno significativa de clulas na massa de polpa de
celulose ou serragem separada por filtrao.
6) Vrios resultados obtidos (concentrao de
acares nos hidrolisados, perda de massa durante os pr-tratamentos, produo de etanol e
massa consumida durante os experimentos SSF)
demonstraram que a serragem no foi efetivamente hidrolisada. Isso uma clara indicao da
necessidade de incluir uma etapa de exploso a
vapor no processo proposto, de forma que subprodutos como a serragem possam ser efetivamente convertidos em etanol
A partir das concluses preliminares,
possvel identificar alguns aspectos que requerem
estudos mais aprofundados para que seja possvel definir condies timas para o processo SSF
a partir de resduos da indstria de papel e celulose, tais como a definio do tempo necessrio
para a etapa de pr-sacarificao, a influncia da
temperatura adotada nos experimentos SSF na
produo de etanol e a utilizao de mtodos
indiretos (produo de CO2, por exemplo) para o
acompanhamento do crescimento celular.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ADRIANO, W. S. Preparao e Caracterizao de
Derivados de Enzimas Industriais em Quitosana. 2008. Tese (Doutorado em Engenharia
Qumica) Curso de Ps-Graduao em
Engenharia Qumica, Universidade Federal
de So Carlos, So Carlos, 2008.
CARVALHO, G.B.M.; Ginoris, Y.P; Cndido, E. J.;
Canilha, L.; Carvalho, W.; Silva, J. B. A.; Estudo do Hidrolisado de Eucalipto em Diferentes Concentraes Utilizando Evaporao a
Vcuo para Fins Fermentativos. Revista Analytica, n. 14, Dezembro/Janeiro 2005
DOWE, N.; McMILLAN, J. (2008) SSF Experimental Protocols Lignocellulosic Biomass Hydrolysis and Fermentation, National Renewable Energy Laboratory.
HUBER, G.W., IBORRA, S., CORMA, A. (2006),
Synthesis of Transportation Fuels from Biomass: Chemistry, Catalysts, and Engineering,
Chemical Reviews, pg. 1 51, 2006.
NOCENTINI, N.C., ZANGIROLAMI, T.C. (2007)
Produo de etanol em meio suplementado
com vinhaa utilizando levedura adaptada.
In: VII CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA QUMICA EM INICIAO CIEN-
AGRADECIMENTOS
FAPESP pela bolsa, NOVOZYMES
pelos preparados enzimticos, Aracruz Celulose
pela serragem e polpa de celulose e ao tcnico
Amadeus pelas anlises em HPLC.