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Un cuento de patch-clamp
Corra el ao 1991 cuando me encontraba paseando por una cntrica
calle de Montevideo. Al pasar por un kiosko de peridicos vi las fotos de los
profesores Erwin Neher y Bert Sakmann. Era la noticia de que haban ganado
el Premio Nobel de Medicina por el descubrimiento de las tcnicas
electrofisiolgicas de patch-clamp. Casualmente, antes de emprender mi viaje
a Amrica de Sur, haba enviado a don Adolfo Berzosa, director de la revista
Noticias Mdicas, un artculo para mi columna Farmacoterapia. Se titulaba
Erwin Neher y el patch-clamp y vio la luz coincidiendo con la noticia de la
concesin del galardn.
El Premio Nobel no cambi la aficin de Erwin por el laboratorio, que
sigui trabajando con sus doctorandos y postdoctorandos, actividad que
contina a da de hoy. No cabe duda de que en aquellos aos que siguieron a
1991 sufri las consecuencias de la fama, pero ello no le ha apartado un pice
de la ciencia y de sus amigos. Esos dos ingredientes, ciencia y amistad, han
trado a Erwin Neher y a su esposa Eva Neher a Madrid y Molina de Segura.
Su estancia con nosotros durante la primera semana de mayo de 2009 ha sido
muy intensa e interesante.
Uno de los motivos de la visita a Madrid de Erwin fue tomar posesin de
su silln como Acadmico de Honor de la Real Academia Nacional de
Farmacia, en un solemne acto que presid la profesora Mara Teresa Miras
Portugal, la Real Academia Nacional de Farmacia celebr un vistoso acto
acadmico. En su discurso de recepcin record las circunstancias que le
condujeron al descubrimiento de la tcnica de patch-clamp. Con su habitual
brillantez expositiva, el profesor Juan Tamargo hizo una laudatio rigurosa y
objetiva, destacando el impacto que tuvieron estas tcnicas: la publicacin
original en la revista Pflgers Archives European Journal of Physiology ha
recibido casi 16.000 citaciones en el periodo 1981-2009. Por otra parte se ha
pasado de 3 artculos que incluan la palabra channel en su ttulo en 1970 a
ms de 1000 en 1990 y a 118.500 en mayo de 2009. Hoy es habitual encontrar
los esquemas de la tcnica de patch-clamp junto a las fotografas de Erwin
Neher y Bert Sakmannn en los ms variados textos de farmacologa, fisiologa
y neurociencias.
La tcnica
Para registrar la corriente que flua a travs de un solo canal se
necesitaba aislar elctricamente un pequeo parche de membrana. Para ello,
Neher y Sakmann pulieron con calor una micropipeta de vidrio de 0,5-1
micrmetros de dimetro rellena de una solucin salina. Al contactar con la
limpia superficie de una clula aislada de msculo esqueltico de rana,
observaron que se formaba un sello entre la membrana celular y la punta de la
pipeta. Cuando intentaron por vez primera este experimento, Neher y Sakmann
encontraron una grave dificultad tcnica: el parche de membrana no estaba
bien aislado de su entorno, por lo que la corriente que flua a travs de la
pipeta se escapaba en parte; la seal obtenida por el amplificador no reflejaba
toda la corriente generada en el parchecito de membrana incluido en el circulito
de la punta de la micropipeta. Sin embargo, fueron afortunados en la seleccin
de la clula y del canal inico. La clula proceda de un msculo esqueltico
denervado de rana, cuyo nmero de receptores nicotnicos para la acetilcolina
estaba incrementado drsticamente, cosa que saba Sakmann, ya que haba
hecho un postdoctorado de 3 aos junto a Bernard Katz, en el londinense
University College. El canal inico asociado a ese receptor conduce una
cantidad elevada de corriente. Por ello, a pesar de que el sello era laxo,
pudieron obtener los primeros registros de corrientes a travs de canales
inicos individuales, registros que vieron la luz en la revista Nature, en 1976.
Cinco aos despus, los esfuerzos de Neher por mejorar la tcnica se
vieron compensados por dos innovaciones tan simples como espectaculares en
sus resultados. La firmeza del sello pipeta-membrana se mejor en un factor de
100 a 1000 veces utilizando una pipeta nueva para cada sello bien pulida y
limpia, y por la aplicacin de una ligera succin a travs de la pipeta, una vez
que su punta contacta la superficie celular. As, un pequeo parche de la
membrana se introduce en el interior de la punta de la micropipeta, formado
una semivescula en forma de omega. Erwin obtuvo este sello tras muchos
meses de intentarlo en largos das de experimentos. Y una tarde de sbado, en
marzo de 1980, segn me cont, estaba terminando de utilizar las pipetas que
le quedaban, pues no poda dejarlas para el da siguiente. La punta de la pipeta
pulida al fuego deba estar limpia y si se guardaba para das sucesivos, una
simple motita de polvo poda impedir la formacin de un sello de alta
resistencia (gigasello). De esta manera se instaura un sello firme, que muestra
una elevadsima resistencia al paso de la corriente, quedando as el parche de
membrana aislado elctricamente del resto de la membrana celular y del medio
extracelular. Este gigasello ha permitido el registro de corrientes en canales
nicos en casi todos los sistemas celulares explorados; ello se debe a la
drstica disminucin del ruido de fondo que tanto perturbaba los registros de
corrientes en los primitivos sellos ms laxos. Estas modificaciones tcnicas se
publicaron en 1981 en la revista alemana Pflgers Archives European Journal
of Physiology figurando como coautores Neher, Hamil, Marty, Sakmann y
Sigworth; 27 aos despus, este trabajo es probablemente uno de los ms
citados en la literatura cientfica de todos lo tiempos.
Posibilidades de la tcnica
Hasta la aparicin de las tcnicas de patch-clamp, el registro de la
actividad elctrica de una clula poda hacerse solo por expertos
electrofisilogos y en un nmero limitado de clulas de suficiente tamao. Hoy,
los equipos de patch-clamp se ven en laboratorios de bioqumicos,
farmaclogos y fisilogos como si de una tcnica ms se tratara. Erwin Neher
dot a esos equipos de una elevada automatizacin, as como de programas
de ordenador que permiten el anlisis de los datos obtenidos por cualquier
investigador medianamente familiarizado con la metodologa. As pues, el
mrito de Neher no es solo la ideacin de equipos y metodologas para estudiar
la actividad de un solo canal inico, sino el haberlos simplificado a fin de
hacerlos asequibles a cualquier clula, por pequea que sta sea.
Otra ventaja de la tcnica es el acceso directo al interior celular.
Rompiendo mediante succin el parche de membrana, el interior de la pipeta
se comunica con el interior celular. De esta manera pueden medirse corrientes
inicas en clulas tan pequeas como los eritrocitos y plaquetas, clulas
cromafines, clulas adenohipofisarias y neuronas de varios tipos. A travs de
la pipeta pueden introducirse tambin sondas fluorescentes en la clula, o
anticuerpos, pptidos, frmacos o enzimas cuyo mecanismo de accin sobre
un determinado canal inico se desea explorar. En suma, con esta metodologa
puede manipularse con facilidad la composicin del medio intracelular.
Otra ingeniosa estrategia consiste en el estudio simultneo de corrientes
inicas, de los cambios en la concentracin de calcio citoslico y de la
liberacin de catecolaminas en una sola clula cromafn. Para ello, con una
micropipeta de patch-clamp Neher inyect fura-2 (una sustancia que emite
fluorescencia al combinarse con calcio) en una sola clula cromafn de la
glndula suprarrenal. Con la misma micropipeta pudo estimular la clula, que
genera una corriente de calcio hacia el interior celular al abrirse los canales de
calcio dependientes del voltaje. El calcio que entra se combina con el fura-2,
cuya seal fluorescente es captada por un equipo de microfluorometra
acoplado a un microscopio invertido y al sistema de patch-clamp. Finalmente,
la misma micorpipeta puede medir la capacidad elctrica de la membrana
celular, que es proporcional a la superficie celular. Las vesculas que
almacenan catecolaminas se fusionan con el plasmalema y su membrana se
incorpora transitoriamente a la membrana plasmtica, incrementando la
superficie de la clula as como su capacidad elctrica; esta capacidad es
directamente proporcional a la intensidad del fenmeno secretor. El registro
simultneo de estos tres parmetros ha permitido a Neher y colaboradores el
esclarecimiento de cmo los niveles de calcio citoslico regulan la liberacin de
neurotransmisores y hormonas en varios tipos de clulas secretoras.
El cliz de Held
En su preciosa conferencia en la Real Academia Nacional de Farmacia,
Erwin dej bien claro que no iba a hablar solo del descubrimiento de la tcnica
patch-clamp y de sus implicaciones para el conocimiento de las propiedades
biofsicas y farmacolgicas de los canales inicos. Ya mencion antes que la
concesin del premio Nobel a Erwin, cuando tena solo 42 aos, no merm su
entusiasmo por la investigacin. Al contrario, ahora que tena la herramienta
quiso sacarle el mximo partido. He escuchado a Erwin impartir conferencias y
seminarios de investigacin y siempre sorprende a la audiencia con resultados
recientes y novedosos. Eso ocurri tambin en la Real Academia Nacional de
Farmacia. Se refiri a sus experimentos de los ltimos aos en una sinapsis
grande, con una terminacin que rodea la neurona postsinptica, y que a modo
de cliz, fuera descrita por Held en 1893 en el bulbo olfatorio. Erwin mencion
que Cajal estudi en profundidad esta sinapsis porque encajaba en su teora
neuronal. Erwin y sus colaboradores colocaron un electrodo de patch-clamp
presinpticamente y otro postsinpticamente en el cliz de Held del tronco del
encfalo de la rata. De esta manera pudieron estudiar la liberacin rpida de
neurotransmisor (medida en forma de corrientes postsinapticas) inducida por la
fotoliberacin de calcio en la terminacin presinptica, en una escala de tiempo
de microsegundos. Con esta elegante preparacin ha demostrado por primera
vez, en una sinapsis de mamferos, que la liberacin de neurotransmisores se
debe a la gnesis de un transiente citoslico de calcio de 10-20 micromolar,
que tiene una vida media de tan solo 500 microsegundos. Esta rapidez solo es
posible con una localizacin muy prxima de los canales de calcio y de la
maquinaria de la exocitosis en la terminacin nerviosa presinptica. Erwin
continu la charla comentado otras funciones del calcio, particularmente una
que ha perseguido durante ms de dos dcadas, primero en la clula cromafn
de la suprarrenal y ahora en el cliz de Held: el transporte e incorporacin de
nuevas vesculas sinpticas est controlado por pequeas elevaciones de la
concentracin de calcio libre en el citosol. Este proceso es vital para mantener
la neurotransmisin de forma prolongada, as como para asegurar la eficacia
sinptica y los fenmenos de facilitacin y depresin de dicho proceso. Finaliz
con algunos apuntes farmacolgicos, para hacer honor al ambiente
farmacutico en que se encontraba.