A typical cartoon rendering of the effects of freezing at slow to moderate rates is shown in Figure 5, below.

This scenario is accurate in that it correctly shows that under these conditions, ice forms
first outside of cells, and the ice crystals consist of pure water.[30] Ice begins forming outside of cells rather than inside of them for at least two reasons. First, the concentration of dissolved materials in
the water inside cells is much higher than that present in the water outside of the cells (in the extracellular space). These concentrated materials, primarily salts, such as phosphates and potassium
chloride, exert a small amount of antifreeze activity, depressing the freezing point of the intracellular milieu about a degree Celsius (C) below that of the extracellular fluid.[31, 32]

Squashed frozen cells versus those frozen in cryoprotectant

Principios fsico-qumicos de la preservacin en

fro
La preservacin en fro se basa en el hecho de que las reacciones qumicas
(metablicas) ocurren ms lentamente a medida que desciende la temperatura.
Segn esto, a temperaturas por debajo de -140 C toda actividad biolgica se
detiene. Sin embargo, tambin ocurre que antes de llegar a estas temperaturas la
muestra en cuestin es incapaz de resistir el proceso de enfriamiento y muere o
en el caso de las carnes reducen su calidad.
Desde que se iniciaran hace 50 aos los primeros experimentos de preservacin
en fro se ha avanzado mucho en el conocimiento de los procesos que tienen
lugar cuando se enfra una muestra biolgica consistente en un conjunto de
clulas aisladas en suspensin (as como en tejidos y rganos), sobre todo en
clulas reproductoras. Esto ha permitido disear estrategias de conservacin que
consiguen que el fro no resulte particularmente daino a las estructuras internas
de la clula. En este caso, estas estrategias estn basadas en la adicin de agentes

protectores (frente al fro) a la vez que en la optimizacin de las velocidades de

enfriamiento y recalentamiento.
A groso modo, la explicacin ltima de los procesos fsico-qumicos que tienen
lugar en una clula cuando se enfra se basa en la llamada hiptesis de los dos
factores, desarrollada en 1963 por Peter Mazur [P. Mazur, 1963] y que
esbozaremos seguidamente.
Una clula, a efectos de lo que ahora nos ocupa, es bsicamente un pequeo saco
que encierra una disolucin de agua y sales. El "material" del que est hecho este
"saco" es lo que se llama una membrana semipermeable, un tejido especial que
slo deja pasar el agua a travs de l, pero no las sales que tiene disueltas, de ah
su nombre. Por ello, cuando el agua sale o entra en la clula la concentracin de
las sales disueltas aumenta o disminuye.
Bastan dos principios fsicos para explicar lo que le ocurre a la clula mientras se
enfra: el principio de smosis y el principio de descenso del punto de
congelacin.
El principio de smosis nos dice que cuando tenemos un saco (clula)
semipermeable de este tipo sumergido en otra disolucin salina, entonces el agua
empieza a fluir en un sentido tal que tiende a igualar las concentraciones de las
disoluciones. O sea, si sumergimos la clula en una disolucin de sales ms
concentrada que el interior celular, entonces el agua (y slo el agua) sale de la
clula; esta, por lo tanto, se encoge y reduce de volumen. Si, por el contrario,
sumergimos la clula en una disolucin ms diluida que el interior celular,
entonces empezar a entrar agua dentro de la clula intentando diluir tambin la
disolucin salina de su interior; el resultado es que la clula se hincha.
El principio de descenso del punto de congelacin nos dice que si tenemos agua
pura y disolvemos sales en ella, entonces el agua no se congelar a 0 C, sino por
debajo de esta temperatura; a una temperatura tanto ms baja cuanto ms
cantidad de sal hayamos disuelto en ella. Un ejemplo de este fenmeno, por
todos conocidos, es el que se produce cuando evitamos el deterioro del radiador
de nuestro automvil al aadirle anticongelante.
Cuando tenemos un conjunto de clulas que queremos conservar en fro,
inicialmente las clulas se tienen sumergidas dentro de un recipiente que contiene
una solucin salina isotnica, es decir, con la misma concentracin que el interior
celular. Cuando se empieza a enfriar este preparado, el fro alcanza antes la
solucin exterior que el interior celular. Esto trae como consecuencia que se
empiece a formar hielo en el medio extracelular cuando an no se ha formado

hielo dentro de la clula. A medida que se forma el hielo extracelular el agua

lquida va desapareciendo (va convirtindose en hielo!). Al disminuir la cantidad
de agua exterior, en base al principio de smosis antes enunciado, empezar a
salir agua de la clula para compensar la posible diferencia entre las
concentraciones intra y extracelulares.
Al salir agua de la clula, la sal que estaba disuelta en su interior empezar a
estar ms concentrada: tanto ms concentrada cuanto ms agua salga. Y es aqu
cuando interviene el segundo principio, el principio de descenso del punto de
congelacin. Y es que al estar ms concentrada la disolucin salina intracelular,
la temperatura a la que se formar hielo desciende: ser ms difcil que el agua de
dentro de la clula se congele y dae sus estructuras. As, mientras enfriemos
poco a poco, el proceso continuar indefinidamente: crecer el hielo extracelular,
saldr agua de la clula para compensar las concentraciones salinas dentro y
fuera, se concentrar la sal dentro de la clula y descender an ms la
temperatura necesaria para que se forme hielo dentro. Por ello, con una velocidad
de enfriamiento suficientemente lenta podemos evitar por completo la formacin
del daino hielo intracelular.
La no formacin de hielo mediante este procedimiento no es sinnimo de
supervivencia celular. Y es que aunque no se forme hielo aparecen dos nuevos
factores que perjudican gravemente a la clula. Por una parte est el hecho de que
en cierto instante la concentracin de sales dentro de la clula llega a ser tan alta
que resulta muy txica. Por otra parte, al salir tanta agua de la clula su volumen
disminuye peligrosamente, produciendo deformaciones estructurales
irreversibles. Estos dos factores son tanto o ms perjudiciales que la formacin
de hielo intracelular. En la Fig. 1 se muestran de forma esquemtica los tipos de
daos segn la velocidad de enfriamiento. Por ello, en los protocolos de
preservacin de clulas aisladas hay que enfriar a una velocidad que sea lo
suficientemente lenta como para evitar en lo posible la formacin de hielo
intracelular, pero a su vez, lo suficientemente rpida como para no producir una
deshidratacin excesiva que conlleve una destruccin irreversible de la estructura
celular. Esto da lugar a que el perfil que aparece cuando representamos el
porcentaje de clulas que sobreviven a un proceso de preservacin en fro frente
a la velocidad de enfriamiento sea tpicamente el de una U invertida, tal como se
muestra en la Fig. 2.

Fig. 1. La formacin de hielo comienza en el exterior celular (de -2 C a -5 C).

Tras ello, dependiendo de la velocidad de enfriamiento, se pueden producir
distintos resultados. A) Si el proceso de enfriamiento es suficientemente lento,
entonces NO se forma hielo dentro de la clula. Sin embargo las causas de la
muerte celular vienen provocadas por una excesiva deshidratacin de esta, que
da lugar a una reduccin de su volumen (en algunos casos irreversible). B) Si se
enfra a una velocidad intermedia entonces s se produce hielo intracelular, ya
que la clula no se deshidrata suficientemente y por tanto el descenso del punto
de congelacin no llega a ser el necesario. C) Cuando se enfra a velocidades
muy altas se produce vitrificacin.

Figura 2. Supervivencia de los distintos tipos de clulas en funcin de la

velocidad de enfriamiento. Se observa el tpico comportamiento de U invertida
en todas ellas. Como se explica en el texto, esto es debido a la llamada hiptesis
de los dos factores (toxicidad-sobreenfriamiento) que hacen que sea necesario un
compromiso entre la velocidad de enfriamiento y el grado de deshidratacin
celular..
Por ltimo, y como hablamos al principio, hemos de aclarar que aunque la
mayora de los experimentos se han hecho en el rgimen de velocidades de
enfriamiento antes sealado, a veces existe la posibilidad de velocidades de
enfriamiento de decenas de miles de grados por segundo. Estas velocidades tan
altas consiguen la vitrificacin, lo que conlleva la no formacin de hielo a la vez
que la no deshidratacin celular. Aun cuando esta tcnica no es en principio
aplicable a un rgano (dada la conductividad trmica finita de este), si que ha
podido ser implementada en unos casos muy concretos, comprobndose la
validez de dicha hiptesis. El ejemplo por antonomasia es el del Saccharomyces
Cerevisiae [F. Dumont et al., 2001]. En la Fig. 3 se muestra cmo a velocidades
de enfriamiento del orden de 50.000 C/min se recobra de nuevo un alto
porcentaje de supervivencia celular.

Figura 3. Resultados de la supervivencia de Saccharomyces Cerevisiae en funcin de las

distintas velocidades de enriamiento. Se observa cmo, para muy altas velocidades es
posible llegar a impedir la formacin de hielo mediante vitrificacin.
Comprendidos, al menos cualitativamente, los mecanismos que acompaan el enfriamiento
de una clula, el siguiente reto es intentar aprovechar este conocimiento para disear
estrategias de conservacin que eviten la formacin de hielo, y la toxicidad y las
deformaciones extremas. Las estrategias diseadas hasta la fecha y que han dado muy buen
resultado en ciertos casos notables (vulos, esperma, piel, huesos, etc...) se basan en la
adicin de crioprotectores (anticongelantes). Su funcin es doble. Por un lado al ser
aadidos a la clula hacen que la solucin interior est ms concentrada y por tanto sea ms
difcil de congelar (principio de descenso del punto de congelacin). Por otro lado, las sales
intracelulares no estarn tan concentradas, ya que ahora, adems de estas, tendremos
anticongelantes disueltos y por tanto las concentraciones salinas no llegan a niveles tan
txicos como si estos anticongelantes no estuvieran presentes.
El xito del proceso de preservacin en fro depende de la capacidad para optimizar todos
los parmetros puestos anteriormente de relieve: la velocidad de enfriamiento, la
concentracin de crioprotectores, el tipo de crioprotector a utilizar, el tiempo de
almacenamiento, la temperatura ltima de almacenamiento, la forma de recuperacin
(recalentamiento), etc. Y para ello es fundamental explorar ciertos detalles relacionados
tanto con la fisiologa celular (permeabilidad al agua, a los crioprotectores, resistencia de la
membrana celular, control del tamao de sus poros, etc...) como con las propiedades fsicoqumicas de los crioprotectores (punto de congelacin, viscosidad, toxicidad, etc...) .
En lo tocante a clulas aisladas, la situacin actual es que se ha podido preservar con xito
un conjunto importante de tipos de celulares, pero an existen otros muchos en los que por
desconocimiento de parmetros tan importantes como la permeabilidad de la membrana,
por ejemplo, los resultados son an escasos.
En lo que se refiere a la conservacin de tejidos y rganos, los principios de conservacin
en fro son los mismos que los aplicables al caso de clulas aisladas. Sin embargo, desde el
punto de vista tcnico aparece una dificultad aadida que hace que esta empresa sea an

ms complicada: el hielo extracelular. El hielo extracelular, del que nos despreocupbamos

en el caso de clulas aisladas, es ahora el principal problema. En el caso de clulas aisladas,
cuando los cristales de hielo extracelular van creciendo, van desplazando a las clulas hacia
los lugares que an se encuentran libres de hielo. En el caso de un rgano, las clulas que lo
componen no estn libres, de forma que no se pueden reubicar. As, estos cristales de hielo
hacen las veces de autnticas lanzas que al crecer van rompiendo y des-estructurando todo
el tejido u rgano en cuestin, destruyndose irremisiblemente.
Por lo dicho en el prrafo anterior, lo conservacin de tejidos y rganos en fro requiere
eliminar la formacin de hielo extracelular. Podra ingenuamente pensarse que la solucin
al problema est en la adicin de agentes crioprotectores, tal y como se hace en el caso de
clulas aisladas. Sin embargo aqu el problema es mucho ms complejo, debido sobre todo
a la conductividad trmica finita del rgano. Cuando se calcula la concentracin de
crioprotector necesaria para evitar la formacin de hielo en el rgano se encuentra que est
entorno a 8 molar, cantidad que resulta prohibitivamente txica para el caso de los
crioprotectores convencionales. Pensamos que el problema debe ser atacado por distintos
flancos. Por otro lado hemos de evitar los fuertes gradientes de temperatura cuando se
enfra el rgano, lo que conlleva una perfusin por su sistema vascular. Adems habr que
introducir el crioprotector de forma controlada, ya que este es tanto menos txico cuanto
ms fro est el rgano. Para hacer un diseo ptimo de este protocolo resulta fundamental
conocer de antemano el campo de temperaturas que presentar el rgano, ya que de otra
forma la gran cantidad de parmetros experimentales hara imposible optimizar el proceso.
Adems, parece lgico que el diseo de crioprotectores de baja toxicidad, gran penetracin
y elevada temperatura de vitrificacin ayudara enormemente.
En el resto de esta memoria se desarrolla el proyecto que queremos elaborar.

Revisado: 14/02/2002 .
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