Resistencia Bacteriana - BLEE

1.

Resistencia bacteriana
La utilizacin teraputica de la penicilina y otros antimicrobianos a partir de los aos cuarenta ha sido uno de

los logros ms importantes, desde entonces se han obtenido, comercializado y utilizado una gran cantidad de
antimicrobianos. Al comienzo de la era antibitica se tena la esperanza de que las enfermedades infecciosas
desapareceran, sin embargo, pronto se puso de manifiesto que las bacterias eran capaces de desarrollar
mecanismos de resistencia y, de esta manera, en los aos cincuenta ya se conocan cepas de Staphylococcus
aureus resistentes a penicilina [1]. La resistencia bacteriana es un fenmeno biolgico natural, de manera que cada
vez que se utiliza un nuevo agente antimicrobiano en la prctica clnica, se seleccionan cepas resistentes. Una cepa
resistente se define como aquella que es capaz de multiplicarse en concentraciones mayores que las alcanzadas
con dosis teraputicas; en general, todos los mecanismos de resistencia preexisten o se modifican en la naturaleza,
ya sea por transferencia de genes de resistencia o por mutaciones, que pueden localizarse a nivel cromosomal o
extracromosomal, por esto, se puede suponer que los antimicrobianos tendrn actividad por un tiempo limitado,
segn la presin selectiva que esta droga ejerza sobre la poblacin bacteriana. El problema de la resistencia
bacteriana es complejo y requiere considerar factores relacionados con el paciente, el microorganismo y el frmaco,
variables que inciden en el desarrollo o seleccin de la resistencia [2, 3] (Fig. 1).

Figura 1 | Factores que influyen en la resistencia bacteriana [2]

Las bacterias, por su gran plasticidad gentica, pueden desarrollar mecanismos y hacer frente a la accin
antimicrobiana, existe una resistencia natural o intrnseca en aquellas bacterias que carecen de sitio blanco para un
determinado agente antimicrobiano y una resistencia adquirida que es la realmente importante desde un punto de
vista clnico-epidemiolgico, este ltimo tipo de resistencia se debe a la modificacin de la carga gentica de la
bacteria y puede generarse por mutaciones a nivel cromosomal o por mecanismos de transferencia gentica. La
primera puede ir seguida de la seleccin de mutantes resistentes, pero la resistencia transmisible es la ms
importante, estando mediada por plsmidos, transposones o integrones, elementos genticos que se transfieren
desde una bacteria a otra [1]. Existe la sospecha de que el uso de antimicrobianos est inevitablemente asociado
con un incremento en la resistencia a estos agentes. As, si un antibitico es utilizado por un largo perodo de tiempo
o de manera frecuente, una resistencia neta a ese antibitico emerger, por lo tanto, los antibiticos pueden actuar
no slo como seleccionadores de resistencia, sino que, adems, como promotores de sta [4]. Las razones para la
resistencia antibitica corresponden, principalmente, a aquellas relacionadas al consumo de antibiticos, muy pocos

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estudios han sido dirigidos a investigar y documentar esta situacin; sin embargo, se ha sugerido la influencia de
muchos factores en el consumo de antimicrobianos. Factores genticos pueden ejercer una influencia sobre la
susceptibilidad del hospedador a determinadas enfermedades infecciosas, estudios farmacogenticos han
demostrado que poblaciones humanas pueden diferir en su habilidad para absorber, distribuir, metabolizar y
excretar antibiticos, afectando la farmacocintica de estos antimicrobianos; estas diferencias pueden influenciar la
emergencia y seleccin de microorganismos resistentes. Factores culturales y ciertas actitudes de pacientes en
diferentes poblaciones humanas pueden contribuir a la relacin entre tolerancia de sntomas infecciosos, severidad
de la sintomatologa y uso de antibiticos, y de este modo afectar las tasas de resistencia. Factores sociolgicos
tambin juegan un rol en la diseminacin de la resistencia, por ejemplo, la proporcin de nios en una poblacin
determinada y la frecuencia en el uso de salas cuna o centros de cuidado diario, claramente ejercen una influencia
en la prevalencia de la resistencia en una comunidad. Respecto de factores epidemiolgicos, para entender las
prcticas de prescripcin, es importante considerar cmo la epidemiologa de las infecciones respiratorias de origen
viral, as como, las de origen bacteriano e incluso otros tipos de infeccin, conducen al uso masivo de antibiticos
[5]. No todas las clases de antimicrobianos son igualmente selectivas de resistencia antimicrobiana, incluso en un
grupo de antibiticos bien definido, algunos miembros pueden ejercer un poder selectivo diferente sobre variantes
resistentes particulares. Este fenmeno es consecuencia de los diferentes mecanismos de accin y de la eficiencia
de los mecanismos bacterianos de resistencia. Se debera mencionar adems, que las propiedades
farmacocinticas y farmacodinmicas de las drogas pueden generar antimicrobianos con distintas propiedades
selectivas. La erradicacin de organismos susceptibles, junto con la ausencia de erradicacin total de las variantes
resistentes, conducir a la seleccin de resistencia. Por esto, los antibiticos deberan ser capaces de erradicar
tanto los organismos susceptibles (para prevenir recurrencias) y las variantes resistentes que puedan estar
presentes como parte de la poblacin en el paciente (para prevenir el reemplazo de poblaciones susceptibles por
poblaciones resistentes), ambos fenmenos estn relacionados, el incremento en la resistencia antibitica reduce la
probabilidad de alcanzar la erradicacin y fallas en la erradicacin pueden promover la emergencia y diseminacin
de clones resistentes a antimicrobianos [4, 5]. La frecuencia de infecciones bacterianas graves se encuentra en
aumento a pesar de los notables avances que se han realizado en los ltimos 20 aos en terapia antimicrobiana y
existe gran preocupacin por la incidencia de infecciones causadas por bacterias Gram positivas multirresistentes.
El incremento en la presencia de este tipo de cepas puede ser explicado, en parte, por la concentracin de
investigaciones, entre los aos 1970-1980, particularmente en el desarrollo de drogas activas frente a patgenos
Gram negativos, permitiendo de esta manera una lenta evolucin y seleccin de bacterias Gram positivas
resistentes [6]; en el presente, la cantidad de antimicrobianos disponibles y efectivos frente a infecciones causadas
por bacterias Gram negativas es significativamente mayor al nmero de antibacterianos efectivos frente a bacterias
Gram positivas. Por estos motivos, los investigadores estn realizando cambios importantes para el desarrollo de
drogas efectivas frente a organismos Gram positivos problemticos, incluyendo S. pneumoniae resistente a
penicilina y macrlidos, Streptococcus viridans resistente a antibiticos -lactmicos y aminoglicsidos,
Enterococcus sp. vancomicina y teicoplanina resistente y S. aureus meticilino resistente [7]. Es necesario entender
que los antibiticos son absolutamente necesarios para mantener altos estndares de salud en las sociedades

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modernas, para los casos en los cuales los antibiticos estn indicados, los beneficios compensan por mucho
potenciales riesgos, incluyendo la resistencia antimicrobiana. Por esto, se propone que slo el uso excesivo de
antibiticos constituye una prctica peligrosa para la salud pblica, claramente muchos factores participan en el
desarrollo de la resistencia antibitica y la interaccin de esos factores necesita ser entendida; la clave para
alcanzar un efecto beneficioso en trminos de la curacin de una enfermedad infecciosa, es la capacidad para
determinar exactamente el riesgo de la resistencia antibitica en una poblacin y poder manejar este problema
adecuadamente. El fenmeno de la resistencia bacteriana es dinmico, tiene mltiples causas, donde la ms
importante ha sido el uso y abuso de los antimicrobianos, sin embargo, el debilitamiento en las prcticas de control
de infecciones, el aumento en el uso de dispositivos y procedimientos mdicos invasores y hospedadores ms
susceptibles tambin han jugado un rol importante en el ltimo tiempo. La consecuencia ms importante de la
resistencia bacteriana es el fracaso de la terapia antimicrobiana con el consiguiente aumento de la morbilidad y
mortalidad, y el incremento en los costos de la atencin mdica; para poder contener el problema y evitar las
consecuencias antes mencionadas, el uso prudente de los agentes antimicrobianos y el adecuado control de las
infecciones intrahospitalarias parecen ser las mejores herramientas frente a la diseminacin de la resistencia
bacteriana [2, 3].

2.

Mecanismos bacterianos de resistencia antimicrobiana

Para conseguir destruir o inhibir a los microorganismos, los antibiticos deben atravesar la barrera superficial

de la bacteria y despus fijarse sobre su sitio blanco [8], es decir, sobre alguna de las estructuras o mecanismos
bioqumicos que le son necesarios para multiplicarse o para sobrevivir. Los mecanismos de accin de los
antibiticos son diversos y a veces mltiples, pero todos operan en alguno de los siguientes puntos, impidiendo la
sntesis de cidos nucleicos, de protenas o de la pared celular o bien alterando la membrana celular de la bacteria
sobre la que actan. Las bacterias, por su tremenda capacidad de adaptacin se hacen resistentes a los antibiticos
desarrollando mecanismos de resistencia que impiden al antibitico ejercer su mecanismo de accin. Los
mecanismos de resistencia bacterianos son fundamentalmente tres: inactivacin del antibitico por enzimas,
modificaciones bacterianas que impiden la llegada del antibitico al punto diana y alteracin por parte de la bacteria
de su sitio blanco. En la inactivacin enzimtica del antibitico, la bacteria produce enzimas que inactivan al
antibitico, las ms importantes son las -lactamasas y muchas bacterias son capaces de producirlas, en bacterias
Gram positivas suelen ser plasmdicas, inducibles y extracelulares y en bacterias Gram negativas de origen
plasmdico o por transposones, constitutivas y periplsmicas. Tambin hay enzimas modificantes de
aminoglucsidos y aunque no es ste su principal mecanismo de resistencia, tambin el cloranfenicol, las
tetraciclinas y los macrlidos pueden ser inactivados por enzimas. Respecto de las modificaciones bacterianas que
impiden la llegada del antibitico a su sitio blanco, las bacterias producen mutaciones en las porinas de su pared
que impiden la entrada de ciertos antibiticos (-lactmicos) o alteran los sistemas de transporte (aminoglucsidos
en los anaerobios). En otras ocasiones pueden provocar la salida del antibitico por un mecanismo de expulsin

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activa, impidiendo que se acumule en cantidad suficiente para que acte eficazmente. En el caso de la alteracin
por parte de la bacteria de su sitio blanco o diana, impidiendo o dificultando la accin del antibitico, las alteraciones
y cambios se producen a nivel de la ADN girasa (resistencia frente a quinolonas), ARNr 23S (macrlidos), enzimas
PBPs (protenas de unin a penicilina) necesarias en la sntesis de la pared celular bacteriana (resistencia a lactmicos). Una misma bacteria puede desarrollar varios mecanismos de resistencia frente a uno o ms antibiticos
y del mismo modo un antibitico puede ser inactivado por distintos mecanismos de diversas especies bacterianas,
todo lo cual complica sobremanera el estudio de la resistencia bacteriana a los distintos agentes antimicrobianos
(Fig. 2, 3) [1].

Figura 2 | Sitio de accin de antibiticos y mecanismos de resistencia [9]

Figura 3 | Mecanismos de accin antimicrobiana

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3.

Resistencia de bacilos Gram negativos frente a antibiticos -lactmicos

La resistencia de bacilos gram negativos a los antimicrobianos -lactmicos se basa, fundamentalmente, en la

sntesis de -lactamasas. La actividad de -lactamasas est dirigida especficamente a la hidrlisis de la unin lactama del anillo -lactmico, provocando la produccin de un compuesto cido carente de actividad antibacteriana.
El uso de una importante cantidad de nuevos antibiticos -lactmicos contribuy, a travs de varias dcadas, a la
seleccin de bacterias Gram positivas y Gram negativas que producen una o ms de estas enzimas, una importante
proporcin de las -lactamasas descritas hasta este momento es codificada por genes de ubicacin plasmidial [9,
11]. Especficamente, en bacilos Gram negativos, las -lactamasas de los grupos TEM (especialmente en
Escherichia coli) y SHV (especialmente en Klebsiella pneumoniae) son las ms frecuentes. Las enzimas originales o
parentales que han dado origen a ambos grupos corresponden a las -lactamasas TEM-1, TEM-2 (grupo TEM) y
SHV-1 (grupo SHV). Estos tres tipos de -lactamasas pueden hidrolizar bencilpenicilina, aminopenicilinas (ampicilina
y amoxicilina), carboxipenicilinas (carbenicilina y ticarcilina) y ureidopenicilinas (entre ella piperacilina) pero no
manifiestan accin hidroltica importante sobre cefalosporinas, sin embargo, el uso de estos ltimos compuestos ha
favorecido la seleccin de cepas bacterianas que producen nuevas variedades de -lactamasas de los grupos TEM
y SHV pero que, ahora, tienen la propiedad de hidrolizar cefalosporinas de tercera generacin (CF3G), estas
novedosas e importantes -lactamasas han sido denominadas -lactamasas de "espectro extendido" (BLEE) [10,
12-13] (Fig. 4, 5). Desde el punto de vista estrictamente clnico, se tiende a considerar que Acinetobacter baumannii
y Pseudomonas aeruginosa producen principalmente -lactamasas de codificacin cromosomal, conocidas como
cefalosporinasas del tipo AmpC o -lactamasas del grupo 1 [14]. Estas enzimas son capaces de inactivar en forma
eficiente aminopenicilinas, ureido-penicilinaspenicilinas, cefalosporinas de distintas generaciones y cefamicinas.
Otras especies bacterianas, que junto con las anteriores se encuentran agrupadas con el acrnimo SPACE (S:
Serratia; P: Pseudomonas; A: Acinetobacter; C: Citrobacter; E: Enterobacter), tambin producen en forma prioritaria
-lactamasas de codificacin cromosomal, es as que Enterobacter constituye el gnero arquetpico en la produccin
de este tipo de enzimas. Desde un enfoque eminentemente prctico, los aislados de Klebsiella pneumoniae y
Escherichia coli producen, fundamentalmente, -lactamasas de codificacin extracromosomal, capaces de hidrolizar
adecuadamente cefalosporinas de distintas generaciones, pero particularmente, molculas de tercera generacin
(metoxi-imino aminotiazolil cefalosporinas) y tambin aztreonam [15, 16].

Figura 4 | -lactamasas comunes en especies de la familia Enterobacteriaceae

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Figura 5a-5b | Esquemas de clasificacin de -lactamasas [17, 18]

4.

Betalactamasas de espectro extendido (BLEE)

Las -lactamasas de espectro extendido (BLEE) son enzimas que fenotpicamente se caracterizan por conferir

resistencia a penicilinas y cefalosporinas, incluyendo las de tercera y cuarta generacin, y pueden ser inhibidas por
el cido clavulnico u otros inhibidores de -lactamasas como el tazobactam y el sulbactam. Las BLEE clsicas
derivan de las -lactamasas con actividad fundamentalmente penicilinasa e inhibidas por el cido clavulnico, como
TEM-1, TEM-2 y SHV-1, enzimas del grupo 2b de la clasificacin de Bush, Jacoby y Medeiros. Debido a mutaciones
en su centro activo, han extendido su efecto hidroltico a las cefalosporinas de espectro extendido y a los
monobactmicos. Las BLEE, por lo tanto, se engloban dentro del grupo 2be de la clasificacin antes mencionadas.
Las cepas que producen BLEE, en su mayora enterobacterias, y en particular Klebsiella pneumoniae y Escherichia

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coli, son resistentes a todos los antibiticos -lactmicos con la excepcin de los carbapenmicos, las cefamicinas y
las combinaciones de -lactmicos con inhibidores de -lactamasas. Adems de las BLEE clsicas, de naturaleza
plasmdial, existe una serie de microorganismos que producen -lactamasas cromosmicas que, en el caso de una
hiperproduccin, confieren fenotipos de resistencia similares al que determinan las BLEE, esto es, resistencia a las
cefalosporinas de espectro extendido e inhibicin por el cido clavulnico. Entre las enterobacterias que producen
de forma natural este tipo de -lactamasas se encuentran Yersinia enterocolitica, Klebsiella oxytoca, Citrobacter
diversus y distintas especies del gnero Kluyvera. Por lo general, cuando hablamos de BLEE nos referimos
nicamente a las enzimas de codificacin plasmdica ya que son stas las que suponen un mayor problema
epidemiolgico debido a su elevada capacidad de diseminacin. Sobre epidemiologa de enterobacterias
productoras de BLEE, es posible mencionar que la primera BLEE (SHV-2) fue descrita en una cepa de Klebsiella
ozaenae en Alemania en 1983, desde entonces se ha publicado una gran cantidad de brotes epidmicos de
enterobacterias con BLEE, sobre todo en unidades de cuidados intensivos (UCI), siendo K. pneumoniae la especie
ms frecuentemente involucrada. Las BLEE se encuentran codificadas en plsmidos conjugativos, lo cual permite la
diseminacin de este mecanismo de resistencia no slo entre distintas cepas de la misma especie sino tambin
entre distintas especies bacterianas. Adems de su codificacin plasmdica, las BLEE forman parte frecuentemente
de transposones o integrones lo cual determina su asociacin con otros determinantes genticos de resistencia
transferibles, como los que confieren resistencia a los aminoglucsidos o al cotrimoxazol. Durante la dcada de los
aos 80 y principios de los 90, la inmensa mayora de las BLEE encontradas eran del tipo TEM o SHV, habindose
descrito hasta la fecha ms de cien variantes distintas derivadas de las -lactamasas TEM-1 o TEM-2 y ms de
cincuenta derivadas desde SHV-1, lo que da la idea de la gran diversificacin evolutiva que han sufrido estas
enzimas en un corto periodo de tiempo, debido esencialmente, a la presin selectiva de los antibiticos. En 1989 se
describi un nuevo tipo de BLEE, las cefotaximasas o CTX-M, prcticamente de forma simultnea en una cepa de
E. coli en Alemania y en una cepa de Salmonella en Argentina. Estas enzimas se caracterizan por conferir
resistencia de alto nivel a la cefuroxima, cefotaxima y cefepima, prcticamente sin incrementar las CMI de la
ceftazidima, ya que la actividad hidroltica frente a este ltimo antibitico es mnima comparada con la de las otras
cefalosporinas. Estas BLEE, de naturaleza plsmidica al igual que las TEM o SHV, derivan de la -lactamasa
cromosmica de distintas especies del gnero Kluyvera [14-17].
5.

Deteccin de -lactamasas de espectro extendido

La resistencia que determinan estas enzimas no es elevada y las cepas productoras pueden, incluso, aparecer

susceptibles o medianamente resistentes a estos antimicrobianos en los exmenes de laboratorio. Sin embargo,
pueden ocurrir fallas teraputicas durante el empleo de CF3G en infecciones causadas por estos microorganismos.
Por esto, la constatacin de la presencia de una de estas enzimas obliga al microbilogo a informar resistencia a
cefalosporinas de tercera generacin. Las BLEE, como enzimas plasmdicas, son eficientemente inhibidas por cido
clavulnico (AC), propiedad que ha llevado al diseo de metdicas para detectarlas por la produccin de un
fenmeno sinrgico entre una CF3G, por ejemplo ceftazidima o cefotaxima y AC en ensayos por difusin en agar

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usando discos con estos compuestos [12, 19]. En los ltimos aos se han descrito tambin bacilos Gram negativos
que producen -lactamasas refractarias a la inhibicin por AC, enzimas que han sido denominadas, en su conjunto,
-lactamasas IRT (inhibitor resistant TEM). Otro problema adicional relacionado con la pesquisa de BLEE en el
laboratorio es la presencia de cepas de bacilos Gram negativos que producen -lactamasas del tipo AmpC, estas
son enzimas con carcter de cefalosporinasas, originalmente descritas como de origen cromosomal y con sntesis
inducible, pero que ahora aparecen codificadas por genes plasmidiales; es importante tambin que estas lactamasas sean investigadas en el laboratorio. Las principales propiedades de las cepas bacterianas que producen
estas novedosas enzimas son la resistencia a cefalosporinas, incluyendo las de primera generacin y la
refractariedad de esta resistencia a AC [12] (Fig. 6, 7).

Figura 6 | Propiedades de -lactamasas ms frecuentes en bacilos Gram negativos [12]

Figura 7 | Deduccin de las -lactamasas ms probables en bacilos Gram negativos, de acuerdo a la expresin fenotpica de
la resistencia de las cepas [12]

6.

Generalidades sobre mtodos de deteccin de BLEE

Las BLEE son el resultado de mutaciones puntuales que ocasionan cambios en un aminocido en las clsicas

-lactamasas TEM y SHV, funcionalmente la modificacin en un aminocido produce un cambio en el punto

isoelctrico de la enzima y la capacidad de hidrolizar las cefalosporinas de tercera generacin y aztreonam (oximino

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-lactmicos); sin embargo, la expansin del sitio activo de la enzima tambin le confiere aumento en la
susceptibilidad a los inhibidores de -lactamasas. La deteccin de este tipo de enzimas es muy importante en el
laboratorio, ya que la presencia de BLEE confiere resistencia a todos los -lactmicos incluyendo aztreonam,
aunque sean susceptibles in vitro. Clnicamente se ha asociado con un aumento de la permanencia hospitalaria y
mayor costo en antimicrobianos; si bien la presencia de una BLEE le confiere a la bacteria resistencia a uno o ms
oximino -lactmicos, no siempre producen un aumento de la CIM como para ser clasificada como resistente. Esto
ocasiona problemas con la sensibilidad de la deteccin de BLEE, lo que es muy importante desde el punto de vista
clnico, ya que independiente de los resultados in vitro, la deteccin de BLEE lleva a informar como resistentes todas
las cefalosporinas de tercera generacin [2].
Mtodos de screening, tamizaje o presuntivos
A la fecha no se ha descrito ningn mtodo de laboratorio que sea 100% sensible ni 100% especfico en la
deteccin de BLEE y en general, los mtodos microbiolgicos dependen de la cefalosporina utilizada para realizar
los ensayos de susceptibilidad. Los laboratorios de microbiologa deben sospechar que una cepa de E. coli, K.
pneumoniae o K. oxytoca es productora de BLEE cuando se observe una reduccin en los halos de inhibicin o un
aumento en las CIM para cefalosporinas de tercera generacin, sin llegar a ser considerados dentro de la categora
resistente, lo que significa una especial atencin de los laboratorios en la sospecha de BLEE. Una cepa productora
de BLEE podra hidrolizar uno o ms de estos agentes, se recomienda ensayar varios de estos agentes, esto
incrementar la sensibilidad de deteccin de la variedad de BLEEs que podran encontrarse. La interpretacin que
se debe realizar es que si un aislamiento produce un halo de inhibicin menor o igual al dimetro del halo
especificado en la tabla para uno o ms de los agentes, se considera como potencial productor de BLEE, y si la CIM
es 8g/mL para cefpodoxima y/o la CIM es 2g/mL para uno o ms de los otros cuatro agentes que se deben
ensayar (ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona y aztreonam), la cepa se considera como potencial productora de
BLEE (Fig. 8) [2, 20].

Figura 8 | Criterios de screening para la deteccin de -lactamasas de espectro extendido en cepas de E. coli, K. pneumoniae,
K. oxytoca [20]

Existen diferentes tcnicas mediante las cuales se puede deducir la presencia de una BLEE, las que se basan
en la capacidad del AC para incrementar la actividad de una CF3G gracias al efecto inhibitorio que este compuesto
ejerce sobre las BLEE. En el ao 1998, el NCCLS recomendaba el mtodo de difusin y su aplicacin al estudio de

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sinergia entre CF3G y AC descrito por Jarlier y col., que consiste en efectuar una prueba de susceptibilidad a CF3G
(ej. cefotaxima y/o ceftazidima) colocando discos conteniendo estos antimicrobianos y un disco con AC (en su
defecto, un disco con amoxicilina/cido clavulnico) conteniendo 10 g de inhibidor, a una distancia razonable (2030 mm centro a centro, el espacio ptimo vara entre cepas). Si la cepa ensayada resulta ser productora de una
BLEE, se produce incremento del halo de inhibicin en la zona de interconexin entre la cefalosporina y el AC, en
ocasiones puede ser un tanto difcil visualizar este efecto sinrgico. En aquellos casos en los que se observa
resistencia a una CF3G y la prueba de sinergia resulta ser negativa, puede encontrarse presente una -lactamasa
del tipo IRT (realmente muy infrecuentes en nuestro medio) o, en su defecto, la cepa bacteriana ensayada puede
poseer otro mecanismo de resistencia, por ejemplo, impermeabilidad. Esta prueba requiere del uso de ampicilina
(Amp) (10 g), cefradina (CFR) (30 g) o cefazolina (CFZL) (30 g), cefotaxima (CFTX) (30 g), ceftazidima (CFZD)
(30 g), AC (10 g), se recomienda ensayar tambin discos de AC de 20 g. El disco de AC debe colocarse de tal
forma que mantenga una distancia adecuada con los discos de Amp, CFTX y CFZD, con el objeto de visualizar
zonas de sinergia antibacteriana entre ellos [12] (Fig. 9, 10).

Figura 9 | Resultados positivos en test de difusin con doble disco (DD). Se demuestra la deformidad en el halo de inhibicin
en la cercana al disco con cido clavulnico [21]

Figura 10 | Deteccin de BLEE mediante test de aproximacin por difusin con doble disco (DD). (A). Cepa K.pneumoniae
productora de enzima SHV-5 y (B), cepa de K. pneumoniae productora de enzima SHV-2. Se muestra la
expansin y distorsin de las zonas de inhibicin alrededor de los discos de cefpodoxima (CPD), ceftazidima
(CAZ), cefotaxima (CTX) y cefepime (FEP) adyacentes a un disco de amoxicilina/clavulnico (AMC) [20]

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Otra alternativa adecuada para detectar BLEE es el mtodo descrito por Ho y col. [12, 22]; estos autores han
demostrado, con mucha claridad, que la sensibilidad en la investigacin de la sinergia (y por lo tanto, de BLEEs)
puede incrementarse notablemente con la siguiente metodologa: se preparan placas de agar Meller-Hinton
conteniendo AC (4 g/ml) y placas sin AC, se efecta el antibiograma en estas placas (con y sin AC) usando
solamente discos con C3G, se compara el dimetro de los halos de inhibicin producidos por las cefalosporinas en
las placas sin y con AC. El aumento de los halos en ms de 10 mm en aquellas placas con AC sugiere la presencia
de una BLEE, este mtodo alcanza una sensibilidad superior al 95%, siendo actualmente la mejor alternativa para
detectar estas enzimas [12].
Mtodos confirmatorios
Los mtodos confirmatorios fenotpicos se basan en la capacidad del cido clavulnico para inhibir las
-lactamasas, de modo que para los mtodos de CIM se considera confirmatorio una disminucin de la CIM en tres
o ms diluciones, cuando se evala cefotaxima individualmente versus cefotaxima con cido clavulnico o
ceftazidima individualmente versus ceftazidima con cido clavulnico. Del mismo modo, para la difusin en agar se
considera confirmatorio un aumento de ms de 5 mm en el halo de inhibicin cuando se evala cefotaxima
individualmente versus cefotaxima con cido clavulnico o ceftazidima individual versus ceftazidima con cido
clavulnico. Se han buscado alternativas de ms bajo costo, que no requieran utilizar cuatro discos para el test
confirmatorio (por ejemplo el uso de slo un par de discos: cefpodoxima individual y cefpodoxima con cido
clavulnico); sin embargo, la sensibilidad del mtodo disminuye. La interpretacin que se hace de la prueba es la
siguiente: la presencia de un incremento 5 mm en el dimetro del halo para cefotaxima o ceftazidima cuando se
prueban en combinacin con cido clavulnico, comparado con el dimetro del halo cuando se prueba sin cido
clavulnico, confirma la produccin de BLEE para la cepa ensayada [2] (Fig. 11-13).

Figura 11 | Mtodo confirmatorio (CLSI) para la presencia de BLEE (test de discos combinados). Aumento de 5 mm en el halo
de inhibicin si se utiliza un disco con la combinacin cefalosporina + cido clavulnico en relacin al uso de un
disco con la cefalosporina sin inhibidor. CTX: cefotaxima (30 g), CTX/CLAV: cefotaxima (30 g) con cido
clavulnico (10 g); CAZ: ceftazima (30 g), CAZ/CLAV: ceftazima (30 g) con cido clavulnico (10 g) [2]

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Figura 12 | Dependiendo de la ubicacin de los discos es posible visualizar un resultado caracterstico de un test presuntivo
de aproximacin con doble disco dentro de un test confirmatorio (test de discos combinados), que es indicativo de
la presencia de una cepa productora de BLEE [21]

Figura 13 | Deteccin de BLEE utilizando el mtodo del disco combinado. Los microorganismos son: (A) K. oxytoca productora
de enzima CTX-M-1 y (B) E. coli productora de enzima TEM-52. Es posible apreciar el aumento en el dimetro de
la zona de inhibicin alrededor de los discos de cefotaxima (CTX), ceftazidima (CAZ) y cefpodoxima (CPD) cuando
son ensayados en presencia de cido clavulnico (CLV) versus los dimetros de las zonas para los
antimicrobianos no combinados con el inhibidor. Un incremento > 5 mm en el dimetro de al menos una
combinacin (de las dos recomendadas) es indicativa de la produccin de BLEE [20]

Se han descritos otros mtodos confirmatorios fenotpicos como el E-test (epsilometra), en que la tira est
impregnada por un extremo slo con ceftazidima y en el otro extremo con ceftazidima ms cido clavulnico (4
g/ml). Despus de la incubacin, la lectura de la CMI se determina en la interseccin entre la elipse de inhibicin y
la tira reactiva. La presencia de BLEE se confirma por la presencia de una zona de deformacin de la elipse o
cuando se determina una disminucin en el valor de la CMI > 3 diluciones en presencia de cido clavulnico. Cintas
similares conteniendo cefotaxima/cido clavulnico estn tambin disponibles y se recomienda utilizar ambos test

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(ceftazidima y cefotaxima ms cido clavulnico). En estudios comparativos el E-test fue igualmente sensible o
mucho ms sensible que los mtodos con discos, sin embargo su uso, a pesar de ser ms conveniente se ha visto
limitado por la generacin de resultados indeterminados frente a enzimas particulares (enzimas dbiles) [2, 20].
Existen sistemas automatizados con tarjetas confirmatorias como Vitek (Biomerieux), que poseen pocillos para la
cefalosporina y un segundo espacio para la cefalosporina ms el cido clavulnico; en general, estos mtodos son
fciles de usar pero probablemente de mayor costo para ser utilizados rutinariamente en nuestro pas [2] (Fig. 1416).

Figura 14 | Deteccin de BLEE mediante E-test. La CMI de ceftazidima frente a E. coli (productora de TEM-52) es de 32 g/ml
en ausencia de cido clavulnico y de 0.125 g/ml en presencia de cido clavulnico; como la razn de
ceftazidima con y sin cido clavulnico es > 8, se infiere que la cepa es productora de BLEE [20]

Figura 15 | Ejemplo de un test de deteccin de BLEE mediante E-test de cefepime (PM) sin cido clavulnico y en asociacin.
Este test puede ser cualitativo y cuantitativo; es cuantitativo al considerar que la CMI para cefepime es de 2 g/ml
y la CMI del antibitico ms el inhibidor es <0.064 g/ml, lo que se interpreta como una disminucin de la CMI
mayor a 3 diluciones dobles. Se aprecia la generacin de una zona de inhibicin intermedia (phantom zone), lo
que conduce a una interpretacin cualitativa en donde la recomendacin del fabricante de la cinta ensayada, es
que aquellos aislados que desarrollen una elipse intermedia deben ser reportados como productores de BLEE [21]

Resistencia Bacteriana - BLEE

Resistencia Bacteriana - BLEE

Figura 16 | Screening y pruebas confirmatorias para determinacin de BLEE en cepas de K. pneumoniae, K. oxytoca, E.coli y Proteus
mirabilis por mtodo de difusin con doble disco [23]

Resistencia Bacteriana - BLEE

7.

Mtodo confirmatorio de la presencia de carbapenemasas en gneros de la familia Enterobacteriaceae

(Test de Hodge Modificado)

Resistencia Bacteriana - BLEE

NDM-type, New Delhi metallo--lactamase-type

Figura 17| Test de Hodge Modificado desarrollado sobre una placa pequea de agar Mller-Hinton. (1) K. pneumoniae
ATCCBAA-1705, resultado positivo; (2) K. pneumoniae ATCCBaa-1705, resultado negativo; (3) aislado clnico,
resultado positivo [23]

Figura 18 | Ejemplo de un resultado indeterminado. (1) Aislado clnico con resultado indeterminado; (2) aislado clnico con
resultado negativo para un test realizado en placa de mayor tamao [23]

Resistencia Bacteriana - BLEE

8.

Test de difusin con disco de penicilina para deteccin de produccin de -lactamasa en cepas de
Staphylococcus aureus

Resistencia Bacteriana - BLEE

Notas:
A. Las bacterias productoras de BLEE a veces aparecen como susceptibles a algunas cefalosporinas, penicilinas y
aztreonam cuando se utilizan los lmites tradicionales para la interpretacin de resultados, sin embargo, los datos
clnicos sugieren que las infecciones causadas por aislamientos productores de BLEE no responden a estos
agentes. El CLSI menciona que para las bacterias productoras de BLEE la prueba de interpretacin debe ser
reportada como resistente a todas las penicilinas, cefalosporinas [excepto cefamicinas (cefoxitina y cefotetan)] y
aztreonam.
B. Una desventaja del mtodo de aproximacin con doble disco (DD) es que la sinergia entre el disco de
amoxicilina/cido clavulnico y la cefalosporina puede ser pasado por alto si el inculo es demasiado grande o si
los discos estn ubicados demasiado lejos uno de otro. Algunos autores han propuesto, para alcanzar una
mayor sensibilidad, la ubicacin de los discos a una distancia de 15 mm borde a borde en lugar de los 20-30 mm
citados (medidos desde el centro de un disco al centro del otro).
C. Existe un error al considerar que los test confirmatorios de la presencia de BLEE son test de doble disco; los
test presuntivos de aproximacin con doble disco (DD) slo permiten una interpretacin cualitativa, mientras que
los ensayos confirmatorios mediante discos combinados permiten realizar una interpretacin cualitativa y
cuantitativa de los resultados.
D. El test de difusin con disco de penicilina para la deteccin de la produccin de -lactamasa en S. aureus
parece ser ms sensible que el test de hidrlisis de nitrocefina, sin embargo, este ensayo (test del borde de
zona) se encuentra recomendado en el caso de que solo un test sea utilizado. Algunos laboratorios pueden
elegir desarrollar en primer lugar, un test de nitrocefina, y si este resulta positivo, reportar el resultado como
positivo para -lactamasa; si el test de nitrocefina es negativo, el test de difusin con disco de penicilina debera
ser desarrollado antes de reportar el aislamiento como susceptible a penicilina, particularmente en casos donde
la penicilina puede ser utilizada en terapia (endocarditis). Se recomienda no utilizar este mtodo para
S. lugdunensis.

Resistencia Bacteriana - BLEE

9.

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