Sie sind auf Seite 1von 16

Ao de la consolidacin del Mar de Grau

Facultad de Medicina Humana


Fernando Cabieses Molina
BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR
PRCTICA N 8, 9,10
EXTRACCION DE ADN, FUNDAMENTOS DE LA REACCION EN
CADENA DE LA POLIMERASA (PCR), FUNDAMENTOS DE
ELECTROFORESIS

Integrantes:
STEFANY HUAPAYA
SANDRA TRUJILLO
DUNIA CARDENAS
Profesor encargado:
Francesca Falconi Agapito
Turno:
Martes de 1:10 a 3:00 pm

2016

1. Introduccin:
Extraccin:
La extraccin de ADN de las clulas y su purificacin son de
primordial importancia para el campo de la biotecnologa y
de la medicina forense. El ADN se encuentra en el ncleo de
las clulas de nuestro cuerpo, en cada ncleo podemos
encontrar aproximadamente 2 metros de ADN.
La aplicacin de tcnicas moleculares inicia con la
extraccin de ADN ya que es una importante parte del
proceso debido a que el
ADN primero necesita ser
purificado alejndolo de otros compuestos como las
protenas y otras sustancias contaminantes
Es casi siempre el primer paso en muchos casos de
diagnstico clnico usado para detectar virus y bacterias en
el ambiente molecular sirve tambin para el diagnstico de
enfermedades y desordenes genticos
El objetivo de la extraccin de ADN es obtener ADN
relativamente purificado que se puede utilizar para futuras
investigaciones: PCR, secuenciacin, etc. (1)
PCR:
La PCR es una tcnica para la sntesis "in vitro" de
secuencias especficas de ADN. Es una forma simple y muy
rpida de multiplicar el ADN presente en diferentes
muestras biolgica, obtenindose millones de copias de una
determinada secuencia de ADN. En poco tiempo esta
tcnica ha conseguido ser ampliamente utilizada no slo en
el campo de la gentica molecular, sino en otras muchas
ciencias. Las siglas PCR significan "Polimerase Chain
Reaction", Reaccin en Cadena de la Polimerasa.
El inventor de esta interesante tcnica fue Kary Mullis por la
cual se le adjudic el Premio Nobel de Qumica en 1993.
Utiliz la PCR para la amplificacin del gen de la b-globina
humana (Mullis y cols., 1986; Mullis y Faloona., 1987) y el
diagnstico prenatal de la anemia falciforme (Saiki y cols.,
1985; Saiki y cols., 1986; Embury y cols., 1987), desde

entonces la PCR ha revolucionado todos los campos que


estudian y manipula los cidos nucleicos.
Mullis se bas en la replicacin del ADN en los organismos
eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas
realizan la sntesis de una cadena complementaria de DNA
en el sentido 5-> 3 usando un molde de cadena sencilla,
pero a partir de una regin de doble cadena. Para crear esta
regin doble cadena se usan los denominados cebadores
(primers). Son una pareja de oligonucletidos sintetizados
de manera que sean complementarios a cada uno de los
extremos 3 del fragmento de DNA que se desea amplificar.
Partiendo de este principio, la reaccin en Cadena de la
Polimerasa se basa en la repeticin de un ciclo formado por
tres etapas:
1.

Desnaturalizacin del ADN doble cadena

2.
Hibridacin de los cebadores a la zona 3especfica de
cada una de las hebras
3.
Extensin del cebador por actuacin de la DNA
polimerasa
En la primera etapa (desnaturalizacin) la doble hlice de
ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una
incubacin de la muestra a altas temperaturas (93-97C).
La renaturalizacin se producir cuando la temperatura
disminuya. En el segundo paso (hibridacin) los cebadores
se unen a las zonas 3 complementarias que flanquean el
fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la
bajada de la temperatura (50-65C).En la tercera etapa
(elongacin) se produce la sntesis de una cadena sencilla
(producindose un fragmento de doble cadena por la
complementariedad) .mediante la enzima DNA polimerasa,
la cual incorpora los deoxinucletidos fosfato presentes en
el medio siguiendo la cadena molde (2)
Electroforesis:
Es una tcnica para la separacin de molculas segn la
movilidad de estas en un campo elctrico. La separacin
puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte

slido (por ejemplo la electroforesis en papel o en acetato


de celulosa), o bien a travs de una matriz porosa
(electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis
libre). Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin
obedece en distinta medida a la carga elctrica de las
molculas y a su masa. La variante de uso ms comn para
el anlisis de mezclas de protenas o de cidos nucleicos
utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de
poliacrilamida. Los cidos nucleicos ya disponen de una
carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo,
mientras que las protenas se cargan al unirse con
sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas
negativas de una manera dependiente de la masa
molecular de la protena. Al poner la mezcla de molculas y
aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir
pasando por la malla del gel (una red tridimensional de
fibras cruzadas), por lo que las pequeas se movern
mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn
ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida
(3).

2. Objetivos:
Extraccin:
Extraer ADN a partir de muestras biolgicas
Conocer las diferentes tcnicas de aislamiento de ADN
Analizar cada proceso de la tcnica de aislamiento de ADN
PCR:

Conocer los fundamentos en los que se basa la tcnica de


PCR.
Conocer su importancia del uso de la tcnica de PCR para
el diagnstico de enfermedades en los seres humanos.
Explicar cmo se genera un fragmento especifico de ADN
genmico humano utilizado la tcnica de PCR.
Electroforesis:
Apreciar la tcnica de electroforesis en gel.
Comprender los conceptos que estn involucrados en la
separacin
de
cidos
nucleicos
en
una
corrida
electrofortica.
Observar la muestra de ADN aislada de la prctica
anterior.
3. Materiales
EXTRACCIN, PCR Y ELECTROFORESIS
Kit de extraccin de ADN
Micro pipetas de 20-100,100-1000ul
Puntas de 10-1000ul y de 100-1000ul
Tubos ependorff de 1,5 Ml
Micro pipetas de 20-100, 100- 1000
Puntas de 10 -100ul y de 100-1000ul
Tubos ependorf de 1,5 mL
Microcentrifuga 16000 rpm
Tubos ependorf
Termociclador
Agua estril
Muestra de ADN
Mix de PCR (taq polimerasa, dNTPs, primer, Mg, agua)
Primers Alfa tubiluna y beta actina

Marcador de peso molecular.


Cmara de electroforesis y accesorios (peines, soporte,
tabla niveladora, etc).
Fuente de poder.
Micropipetas para volmenes de 0,5 - 20 l
Guantes.
Gradilla para tubos de 1,5 mL.
Procedimiento
Extraccin de ADN usando kit de extraccin Purelinkgenomic (invitrogen)
EXTRACCIN DE ADN DE SANGRE TOTAL
1. A un tubo ependorff, adicionar una muestra de 20 ul de
sangre fresca o congelada.
2. Transferir 20ul de clulas o sangre a un tubo
contiene 20 ul proteinasa K

que

3. Aadir 20 ul de RNasa a la muestra. Someter a vrtex por


15 segundos e incubar a temperatura ambiente durante 2
min.
4. Aadir 100 ul de buffer lisis y homogenizar utilizando
vrtex por 15 segundos e incubar a temperatura ambiente
durante 2 minutos.
5. Incubar a 550 C durante 10min.
6. Aadir 100ul de etanol 96-100%. Mezclar en el vrtex por
15 segundos.
7. Incubar la lisis por 5 min a temperatura ambiente.
PROCESO DE PURIFICACIN:
1.

Colocar la lisis (260 ul) en la columna de extraccin.

2.
Centrifugar la columna a 8500 rpm por 1 minuto,
descartar el filtrado por la columna y colocarla en un nuevo
tubo de lavado.
3.
Lavar la columna con 200ul de buffer de lavado,
centrifugar a 8500 rpm por 1 min y eliminar el filtrado.
4.
Colocar la columna en un nuevo tubo de lavado,
adicionar 200ul de buffer de lavado y centrifugar la
columna a velocidad mxima por 3 minutos para poder
filtrar cualquier residuo del buffer de lavado.
5.
Colocar la columna en un nuevo tubo de recoleccin
(1,5ml)
6.

Aadir 100 ul de buffer de elucin a la columna

7.
Incubar a temperatura ambiente durante 1 min.
Centrifugar la columna a velocidad mxima durante 1 min a
temperatura ambiente
8.
Para recuperar ms ADN, realizar una segunda etapa
de elucin utilizando el mismo volumen de buffer de elucin
(opcional).
9.
Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto.
Centrifugar a velocidad mxima por 1 minuto (opcional).
10. El tubo contiene ADN genmico purificado.
11. Almacenar el ADN purificado a -80oC para otras
aplicaciones.
Cuantificacin de cidos nucleicos (Qubit)
1. En un tubo ependorf de PCR colocar 1 ul de la muestra
en 199 ul de buffer
2. Calibrar el Qubit segn se indique al manual
3. Medir todas las muestras y anotar los resultados y
comparar los resultados
PCR:

Procedimiento de electroforesis:
1. Se prepar 50 ml de agarosa al 2% y se adiciono 20 ul de
colorante Sybr Green, se dej polimerizar por 10 min
aproximadamente. Luego se sumergi el sistema
conteniendo los geles polimerizados en su tanque (cmara
electrofortica) con el buffer TBE IX para ADN. Al momento
de sumergir los geles en el tanque, se asegur que los
pocillos del gel estn totalmente saturados de buffer.
2. Sobre un pedazo de lmina extensible de parafilm, se
prepar una mezcla de 5 ul ADN con 1 ul de buffer carga
repartida en alcuotas de acuerdo al nmero de muestras
que se colocaran en los pocillos (se consider el uso de un
marcador de peso molecular estndar de ADN)
3. Con el uso de puntas de 20 ul se proces a cargar
cuidadosamente la muestra en los pocillos del gel de
agarosa evitando la contaminacin del pocillo contiguo.

4. Finalizada la colocacin de las muestras ADN en los


pocillos, se cubri el tanque con la tapa y se conect los
cables de los electrodos en la fuente de poder. Se encendi
la fuente de poder y se procedi a seleccionar el voltaje
adecuado (puede estar comprendido entre 75 a 120 voltios)
5. Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, se inici
el proceso de la electroforesis. Durante el proceso se
evidencio dos frentes de corrida de diferente color y
distancia de migracin. Ambos colores, azul oscuro y azul
claro corresponden a los colorantes azul de bromofenol y
xilenecianol, que conforman el buffer de la muestra. El
xilenecianol en geles de agarosa al 2% migra de manera
similar a un fragmento de ADN de 1670 pares de base (pb),
mientras que el azul de bromofenol a esta misma
concentracin de agarosa es equivalente a un fragmento de
45pb.
6. Transcurrido el tiempo de corrida de la electroforesis, se
procedi al desmontaje del equipo empezando con la
desconexin de los electrodos de la fuente de poder,
removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa.
7. Se removi el gel del soporte, para realizar este proceso
se requiri tener mucho cuidado, pues el gel es muy frgil y
puede romperse con facilidad.
8. Se desplaz el gel hacia el transiluminador para el
revelado, se encendi el equipo y se verifico que este a una
longitud de onda de 420 nm.
9. Se dej hasta que empiece a aparecer las bandas y se
registr el resultado final.
4. Resultados
EXTRACCION DE ADN
Estudiante
Salmon
Crdenas
Filio
PCR

Sangre total
100 ul
200 ul
200ul

ADN recuperado
4.2 ug*ml
12.1 ug*ml
7.36 ug * ml

El ADN lo usamos para realizar reacciones de PCR


(reaccin en cadena de la polimerasa), con lo cual
obtendremos muchas copias del ADN.
La profesora se encarg de colocar las muestras en el
termociclador y una vez acabado el proceso ya tendramos
nuestras muestras listas para el proceso de electroforesis.
ELECTROFORESIS
En el resultado de PCR en la
electroforesis no se pudo
obtener lo que buscbamos
al parecer hubo problemas
en la composicin de las
muestras. Tambin hay que
recordar que una de las
muestras de ADN
no se
obtuvo la necesaria sangre y
se le agrego agua destilada
para que no afectara la
muestra. Cabe recalcar que tambin la mesa 1, 2 y 3 no
tuvieron la misma cantidad de ADN, esto tambin puede
explicarse con que no hubo una buena homogenizacin
antes de realizar la electroforesis por ello la concentracin
de ADN fue escasa y no se coloreo igual
Existe tambin la posibilidad de que las otras muestras se
puedan contaminar con ANDasas que se encuentran en el
cabello, las uas. A pesar de que se us guantes (4)
Como se puede observar en la imagen ninguno de los tres
grupos obtuvo resultados positivos
Esta es una imagen del resultado que se esperaba de la
amplificacin por PCR del fragmento del gen citocromo B.
Una banda de 270 pb (nucletidos)

50bp: indica el marcador de peso molecular empleado,


cada banda es de un tamao diferente.
5. Discusin
Extraccin:
Una vez que obtuvimos los tubos de ensayo con las
muestras de sangre se le agrega protenasa k que funciona
como facilitador de la lisis y para degradar las protenas
que se encuentran en la sangre obteniendo as una muestra
mucho ms pura, luego se le agrego RNasas son enzimas
que cortan las cadenas de ARN para su posterior
degradacin esta igual que la proteinasa k nos ayudara a
conseguir una solucin ms purificada para solo poder
examinar el ADN. Seguidamente incubamos a alta
temperatura y aadimos buffer lisis y lo sometemos a
vortex para cumplir con el paso de la homogenizacin.
El buffer lisis es un mtodo qumico que permite la ruptura
de las clulas este est formado por un detergente que
funciona solubilizando los lpidos y para disolver la
membrana celular y romper la membrana nuclear , un
agente quelante que se encarga de inactivar las nucleasas
de penden del ion magnesio y sustancias cautropicas que
cambian las cargas de las protenas o de la molcula para

evitar que otras molculas interaccionen con la matriz de


silica .Continuamos aadiendo etanol que ayuda a
incrementar la carga del ADN para que tenga mayor
afinidad a la matriz de silica , luego dejamos incubar
0nuestra muestra durante cinco minutos para dejar actuar
el etanol y as concluimos con la parte de la extraccin
dando paso al siguiente paso que es la purificacin .
Para iniciar la purificacin se coloca la mezcla en una
columna de silica que funciona como un filtro y tiene carga
positiva y se centrifuga, aplicando este procedimiento dos
veces para seguidamente aadir el buffer de lavado para
eliminar sustancias que quedan y luego el buffer de elucin
que permitir que se libere el ADN de la columna de silica y
seguidamente lo centrifugamos para obtener el producto
que sera el ADN genmico purificado.
Cuantificacin
La obtencin de los datos de ADN total de la muestra de
sangre de cada uno de nuestros compaeros fue gracias al
uso del mtodo de fluorometria que tiene un alto grado de
sensibilidad y nos permite medir pequeas cantidades de
ADN, este funciona usando un flurometro donde se va a
colocar 1ul de la muestra + 199ul fluorocromo que se va
unir al ADN de la muestra
Las concentraciones son diferentes debido a la cantidad de
glbulos blancos que tena en la sangre cada persona
debido a eso las diferentes concentraciones de ADN
recuperado ya que el ADN se encuentra en las clulas
nucleares en este caso como los linfocitos de la sangre de
cada estudiante (4)
Tambin puede ser debido al manejo de la muestra, al
traspar la muestra a otro recipiente
PCR
Gracias a la ayuda de los productos utilizados como
Dntps,cebadores,ADN polimeraza ,ADN molde ,
Solucin Tampn o Buffer y Iones divalentes (Mg++)
logramos obtener copias de fragmentos de ADN ,

el cebador dan especificidad y se unen de forma


especfica a la regin de inters
El que se encarg de polimerizar el ADN fue el ADN
polimeraza que es una enzima que necesita la ayuda
de los cofactores iones mg ++ para que pueda formar
la enzima
Electroforesis
Las muestras de la protena suelen disolverse en una
solucin de sacarosa cuya densidad impide que la muestra
se mezcle con el amortiguador y luego se carga en los
pozos con una pipeta fina. En el paso 2 se aplica una
corriente directa al gel, lo que ocasiona que las protenas se
muevan en la poliacrilamida en carriles paralelos. Cuando
se realiza en el detergente SDS, las protenas se mueven
como bandas a velocidades inversamente proporcionales a
su masa molecular. Una vez que la electroforesis se
completa, el gel se retira del marco de vidrio y se tie. (5)
Nosotras pudimos observar que en los carriles uno, siete y
once del gel de poliacrilamida se encontraban los
marcadores de peso molecular, se lo adicion ya que es
necesario tener una gua para saber cuntos pares de bases
miden cada uno. Luego observamos que en los carriles dos
y diez en la parte superior, casi al inicio, se encontraba el
patrn de banda del ADN total; pudimos notarlo ya que s
funcion la extraccin de ADN debido a que realizamos
todos los pasos necesarios y la extraccin de sangre fue la
adecuada. En los carriles tres (donde se aadi el PCR
amplificado del grupo I) y cuatro (el PCR amplificado del
grupo II) no observamos ningn patrn de banda. Esto se
debe a que la extraccin de sangre tena poca cantidad de
glbulos blancos, tal vez se pudo contaminar con ADNasas
de los guantes contaminados, o la concentracin de ADN no
fue suficiente para realizar un buen PCR y por consiguiente
no se pudo realizar un buen proceso de electroforesis, u
otra opcin fue que en el momento de trasvasar la muestra
de un tubo a otro tubo colector se pudo quedar la mayor
concentracin en unos de los ellos. En los carriles cinco

(donde se aadi el PCR amplificado del grupo III) y seis (el


PCR amplificado del grupo IV) si se pudo evidenciar los
patrones de bandas, esto se debe a que la extraccin de
ADN fue la correcta por consiguiente se hizo un buen PCR y
tambin se realiz el proceso de electroforesis de manera
correcta. Por ltimo en los carriles ocho y nueve (donde se
les agreg ADN total + ECOR I) pudimos observar que si se
formaron los fragmentos; debido a que la extraccin de
ADN fue buena, adems que las enzimas de restriccin
funcionaron de la manera correcta cumpliendo con su
trabajo.
Las posibles causas por la que no se obtuvo resultados
positivos fueron.
Degradacin del ADN: esto puede ocurrir cuando se
manipula la muestra en condiciones subptimas o cuando
se hace una autopsia, por ejemplo, y resulta en ausencia de
amplificacin o resultados parciales. Un caso particular es el
"allele dropout", o bien prdida de un alelo, que se puede
llegar a confundir con ser homocigtico para dicho alelo.
Inhibicin de la PCR: puede haber agentes que interfieran
en el correcto transcurso de la PCR. Requerir un
procesamiento adicional de la muestra para eliminar estos
compuestos del medio antes de preparar la mezcla de PCR.
Tanto la sangre como el semen contienen este tipo de
inhibidores, por lo que es necesario una purificacin previa.
Modificacin del ADN: las sustancias como el formol
(empleado en conservacin de tejidos) o la luz ultravioleta
modifican el ADN, alterando as los resultados de la
amplificacin (6).
6. Conclusiones:
Extraccin del ADN:
Para lograr obtener ADN genmico purificado se debe de
seguir una serie de procedimientos como los ya realizados,
comprobando que cada sustancia agregada cumple con una
funcin determinada

PCR
Se debe de realizar cada paso mencionado en el
procedimiento para lograr obtener ADN amplificado y que
cada uno de ellos requiere de mucho cuidado y debe de
desarrollarse con cantidades exactas para obtener el
resultado deseado.
Electroforesis:
El tampn sirve como conductor de la electricidad y
controla el pH , lo cual es importante para la
estabilidad de las molculas biolgicas
Las muestras evidenciaron sus grados de pureza y
estados de conservacin (nativo o degradado) , la
mayora estaban en su estado degradado , lo que
indica una mala calidad del ADN extrado
Para lograr una electroforesis exitosa , es necesario
elegir un buen gel , el cual permitir lograr una
separacin eficiente de las molculas , con su friccin
que dan las macromolculas y reducir al mnimo la
difusin

Bibliografa:
1. http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/ext
raccion.pdf
2. Mas E , Poza J , Ciriza J , Zaragoza P , Osta R
.Fundamento de la Reaccin en cadena de la
polimerasa.Aquiatic[Revista
en
lnea
]
2001.
[Consultado el 14 noviembre 2016].Disponible en :
www.revistaaquatic.com/ojs/index.php/aquatic/article/d
ownload/139/128
3. Morales I. Electroforesis [Internet]. 1st ed. Mxico D.F;
[Consultado
el14noviembre2016].Disponibleen:http://depa.fquim.u
nam.mx/amyd/archivero/Exposicion_electroforesis_508
7.pdf

4. Lpez P, Gonzlez M, Urquidi N. Extraccin;


cuantificacin de ADN en leucocitos [Internet].
prezi.com. 2016 [Consultado 14 noviembre 2016].
Disponible
en:
https://prezi.com/bsdbqklxvvti/extraccion-ampcuantificacion-de-adn-en-leucocitos/
5. Karp G. Biologia Celular y molecular. 7th ed. McGrawHill; 2014.
6. Reaccin de cadena de Polimerasa - Laboratorios
Geneti K [Internet]. Laboratorios Geneti K. 2016
[Consultado 14 noviembre 2016]. Disponible en :
http://www.laboratoriosgenetica.com/reaccion-decadena-de-polimerasa/