Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
laboratorial laboratrio II
Nesta unidade...
Introduo
Laboratrio e trabalhos microbiolgicos
Mtodos bsicos de trabalho
Meios de cultura utilizados em cervejaria
Microscopia
Classificao e identificao de microrganismos
Exerccios
Chave de respostas
Referncias bibliogrficas
Gerncia de Produto
Produo Editorial
Reviso Tcnica
Srgio Laux
Reviso Pedaggica
Projeto Grfico
Editorao
Edio revista da apostila Operaes Bsicas de Laboratrio II. Vassouras, 2001. (Srie
Cursos de Cervejaria). SENAI. RJ. CETEC de Produtos Alimentares. Coordenadoria de Informao
Tecnolgica.
SENAI
SENAIRio de Janeiro
GEP Gerncia de Educao Profissional
Rua Mariz e Barros, 678 Tijuca
20270-903 Rio de Janeiro RJ
Tel.: (21) 2587-1116
Fax: (21) 2254-2884
GEP@rj.senai.br
http://www.rj.senai.br
Introduo
No Centro de Tecnologia de Produtos Alimentares do SENAI-RJ, as atividades de apoio Indstria
de Alimentos e Bebidas esto centradas em diversos nveis. A Educao Tecnolgica ocupa um lugar
de destaque, seguindo as novas exigncias de qualidade impostas pelo mercado. Dentro desta
perspectiva que apresentamos a presente publicao, que focaliza aquelas atividades e operaes
fundamentais executadas em Microbiologia e Microscopia para a rea de Cervejaria.
O objetivo principal do material aqui apresentado dar suporte ao profissional que atua ou atuar
em laboratrios de microbiologia e microscopia, alicerando-o naquelas operaes fundamentais para
que as atividades sejam executadas dentro dos nveis adequados de segurana, eficcia e confiabilidade
necessrias.
Esperamos que o material cumpra os objetivos para o qual foi idealizado e que seja til aos que o
utilizarem. O CETEC de Produtos Alimentares agradece antecipadamente qualquer crtica ou sugesto
que venha contribuir para a melhoria do material aqui apresentado.
Laboratrio e trabalhos
microbiolgicos
Aspectos gerais
O laboratrio microbiolgico dever estar isolado de outros ambientes, como, por exemplo, do
laboratrio fsico-qumico e dos escritrios.
O piso, as paredes da sala e as reas das mesas de trabalho devero ser fceis de limpar e
desinfetar (cobertura de ladrilhos ou material plstico), pois obrigatrio uma limpeza sistemtica
e sanitizao dos pisos, paredes, balces e mesas de operao.
O ambiente devera ser mantido isento de poeira.
SENAI-RJ 101
Importante!
Para isso, necessrio:
manter fechadas as portas e janelas das salas de trabalhos microbiolgicos; e
ar renovado ou refrigerado, somente atravs de instalaes de ar-condicionado
com filtros apropriados. Os aparelhos de ar-condicionado devero ser mantidos
rigorosamente limpos.
Jamais trazer para o interior do laboratrio microbiolgico, ou manter nele depositados, caixas
para garrafas, garrafas vazias, embalagens de materiais, etc.
Para a guarda e a limpeza de material usado e sujo (pipetas, bastes de vidro, lminas, lamnulas,
esptulas, placas de Petri, etc.), devero existir locais em separado e isolados.
A microscopia e a protocolagem de material no devero ser procedidas na sala de microbiologia
propriamente dita, porm em sala pequena e separada. No caso de uma contaminao (impureza
microbiolgica involuntria), os microscpios e equipamentos de escrita seriam dificilmente limpos
ou desinfectados.
Ao pessoal no autorizado e estranho ao servio dever ser impedido o acesso ao laboratrio
microbiolgico. Um arraste de microrganismos pode trazer conseqncias irreparveis.
Auxiliares inexperientes devero ser orientados sobre possveis perigos de contaminao, instrudos
e supervisionados.
A localizao dos produtos de neutralizao, dos extintores, das caixas dos primeiros socorros e
das instrues de uso dever ser de pleno conhecimento de todos os auxiliares de laboratrio.
Uma lista ou cartaz contendo todas as substncias txicas existentes e dos microrganismos perigosos
deve ser afixado em lugar visvel.
O vesturio de trabalho dever ser confeccionado com material consistente e resistente fervura.
necessria uma troca peridica e no somente em casos de impurezas visveis.
Materiais de anlises e cultura de microrganismos devero ser sempre tratados como se
contivessem m.o. patognicos.
m.o.
Todas as vezes, durante a leitura, que aparecer a abreviatura "m.o."
leia microrganismo.
Manter a ordem e higiene.
Nas salas de trabalho no se deve comer, beber ou fumar.
Evitar, na medida do possvel, um exagerado falatrio, acessos de tosses e espirros.
Evitar caminhadas desnecessrias e movimentao excessiva. Perigo de inalaes.
SENAI-RJ 102
Observao
1. O teor de m.o. do ar ambiente laboratorial em conseqncia da quantidade de
pessoas que trabalham na sala de 500 a 2.000 germens/m3.
2. O teor de m.o. do ar externo conforme local e estao do ano de 100 a 500
germens/m3.
3. Transmisso de m.o. atravs das pessoas:
polpa dos dedos: 20 a 100 m.o./cm3.
palma das mos: 1.000 a 6.000 m.o.
espirro: 104 a 106 m.o.
1ml de escarro/saliva:106 a 108 m.o.
1ml de secreo nasal: 106 a 107 m.o.
SENAI-RJ 103
SENAI-RJ 104
Microscpio biocular para campos claro e escuro, contraste de fase, com os seguintes dispositivos
ticos:
Objetivas:
63 x, para campo escuro
40 x, para contraste de fase 10 x
Ocular:
10 x (ou 12,5 x)
SENAI-RJ 105
Estao de filtrao por membrana para diversas unidades de filtro ou frasco anaerbico
SENAI-RJ 106
SENAI-RJ 107
Estereomicroscopia
Grande armrio e/ou sala apropriada, temperados por lminas e iluminao indireta
Aparelho agitador
SENAI-RJ 108
Potencimetro ou medidor de pH
Armrios de guarda ou depsito de instrumentos, vidraria, materiais diversos, como, por exemplo,
meios nutritivos, pipetas, placas de Petri, etc.
Instalao de desmineralizao de gua
Cestos de arame
Aparelho coletor de amostras de ar
Aparelho automtico de envases de solues
Materiais reutilizveis
Frascos para meios nutritivos com tampa rosquevel.
Pinas
a) ala de platina;
b
c
b) fio de platina;
c) esptula de Drigalski;
SENAI-RJ 109
f) tubo de Durham;
f
g) tubo de guerra;
g
i
h
SENAI-RJ 110
j) frasco Erlenmeyer;
k) frasco de "Steilbrust";
l) frasco de cultura seg. Fernbach;
m) lmina de vidro;
n) lmina com depresso convexa; e
o) lamnula (essas no so mais lavadas e sim jogadas fora).
E, ainda:
Garrafas de esguicho em polietileno de 500 ml, para lcool e gua.
Pipetas.
Tubos de ensaio de paredes grossas, sem borda.
SENAI-RJ 111
Materiais no-aproveitveis
Lamnula para microscpio.
Placas de Petri de material sinttico.
Tubos com bastonete para SWAB.
SENAI-RJ 112
Calor seco
Ar quente
Calor mido (V
apor)
(Vapor)
ao Rubro
Flambagem
Vapor direto
Em cada forma de esterilizao por ar quente e vapor o produto submetido esterilizao nos
equipamentos atinentes (esterilizados) leva algum tempo para atingir a temperatura de esterilizao. O
andamento de uma esterilizao, com relao ao perodo de durao, divide-se em quatro segmentos:
a) tempo de preaquecimento: tempo necessrio para o aquecimento do prprio esterilizador;
b) tempo de equilbrio: tempo necessrio para que o produto atinja a temperatura de esterilizao;
c) tempo de exterminao: tempo temperatura definida para a extino dos m.o.; e
d) tempo de esfriamento: tempo necessrio para o esfriamento do produto estril.
Equilbrio
Extino
Resfriamento
[C]
120
100
Temperatura
do vapor
80
60
Temperatura no produto a
esterilizar
40
20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
min
SENAI-RJ 113
Temperatura
Durao
160C
180 minutos
170C
120 minutos
180C
30 minutos
Tempos de equilbrio ou de compensao longos devero ser programados. Assim, uma pilha de
placas de Petri, numa estufa de ar quente a 180C, apenas atinge uma temperatura de 160C, nas
posies mais desfavorveis, aps 3,5 horas. Quando o algodo, inserido entre o produto a esterilizar,
ficar levemente amarronzado aps o tratamento pelo calor, um sinal de que havia a temperatura
determinada para a esterilizao.
Importante!
No superaquecer o punho de fixao!
SENAI-RJ 114
Grande cuidado deve-se ter quando, logo aps a inoculao, ainda se agregam grandes quantidades
de m.o. na ala. Nesse caso, a ala dever ser preliminarmente mergulhada numa soluo de lcool a
70%. Evita-se, dessa forma, um salpicar do material de inoculao ainda ativo e uma formao de
aerosol impregnado de germens.
Calcinao da
ala de platina
Esse mtodo considerado pouco seguro e confivel, uma vez que sua eficcia dificilmente pode
ser comprovada e ainda porque esporos de bactrias ambientais sedimentveis podem sobreviver s
breves temperaturas atuantes de 290C.
Uma flambagem nada mais do que uma esterilizao parcial.
SENAI-RJ 115
umectao
Ao de umedecer,
molhar, umectar.
O mosto cervejeiro, para sua esterilizao, submetido, em trs dias consecutivos, a um aquecimento
de 100C, durante 30 minutos em cada dia. Com isso, os esporos sobreviventes do primeiro aquecimento
se liberam e as clulas vegetativas morreriam durante o segundo e terceiro aquecimento.
Esse mtodo, caracterizado como uma esterilizao fracionada ou "tindalizao", somente
apropriado para a esterilizao de mosto ou meios de cultura termolveis.
Composio de um vaso a vapor para uma esterilizao fracionada (tindalizao)
1 . Termmetro
2 . Tampa
3 . Cmara de esterilizao
e carga dos produtos
4 . Direo do fluxo de vapor
5 . Peneiras
6 . Produtos a esterilizar
7 . Indicador do nvel de gua
8 . gua
9 . Fonte de calor
SENAI-RJ 116
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Manmetro
Tampa
Direo do fluxo de vapor
Cmara de esterilizao
e carga dos produtos
Peneiras
Termmetro
Indicador do nvel de gua
Vlvula
gua
Fonte de Calor
Temperatura em C
121
134
144
SENAI-RJ 117
Recipiente
Contedo
Tempo de equilbrio
(em ml)
(em minutos)
At 10
100
10
250
15
500
20
1.000
22
O tempo de extermnio dos m.o. dever ser de 20 minutos a 121C (2 bar) e de 5 minutos a 134C
(3 bar). Aps o trmino do tempo de extermnio, a presso no dever ser evacuada. Deixa-se,
preferencialmente, aps desligamento, resfriar o equipamento para ca. De 80C antes da retirada da
carga de produtos.
Importante!
Durante a esterilizao a vapor, os materiais devero ser protegidos de
uma posterior contaminao.
Importante!
Somente retirar garrafas resfriadas. Perigo de exploso!
Filtraes etreis tambm podero ser processadas atravs do uso de "filtros a membrana". Produtos
qumicos tambm so empregados para a esterilizao e/ou desinfeco. Os mais utilizados so o
lcool a 70% (por exemplo, etanol, isopropanol) e formalina a 10%. Esses componentes provocam a
precipitao das protenas.
Para a eliminao dos m.o. do ar ambiente das salas de trabalho e dos localizados sobre superfcies
so geralmente utilizadas as "radiaes da luz ultravioleta". Os raios U.V. atuam somente sobre as
faixas focalizadas. Danificam o DNA e matam os m.o. A radiao U.V. mais ativa na faixa de
comprimento de onda de 260mm.
Meios de cultura
Os meios de cultura so necessrios para:
a) comprovao da presena de m.o.;
b) cultivo de m.o.; e
c) preservao de m.o.
Todos os meios de cultura tm em comum o fato de, atravs de sua composio apropriada,
possibilitarem o crescimento de m.o.
As substncias componentes dos meios de cultura devero estar balanceadas em funo dos m.o.
a culturas, ou seja, em relao s caractersticas de seus metabolismos. A composio dos meios de
cultura resulta de uma mistura de substncias orgnicas e inorgnicas, como, por exemplo, protenas
hidrolisadas, carboidratos, sais minerais, elemento trao e vitaminas.
Todos os m.o. possuem em comum o poder de assimilar, apenas para sua nutrio e multiplicao,
substncias nutritivas solveis. Alm da gua e dos componentes nutritivos, tambm de grande
importncia o valor de pH do meio de cultura. Com isso estar assegurada uma propagao otimizada
dos m.o.
Conforme o caso exigido, os meios de cultura devero ser solidificados por um produto gelificante.
O produto gelificante Agar-Agar um polisarcardeo obtido a partir de algas. Por uma adio de 1%
ao meio de cultura, pode ser aquecido at 121C. A capacidade de gelificao no fica reduzida e,
alm disso, o Agar-Agar tem a vantagem de no ser degradado pelos m.o. O Agar-Agar fluidifica
acima de 96C e gelifica abaixo de 43C, assumindo novamente a forma consistente, ou seja, solidificada.
O agar dever estar integrado aos meios de cultura slidos nas concentraes de 1% a 2%.
Outro produto gelificante a gelatina, uma protena obtida de ossos e tecido conjuntivo.
Atualmente a gelatina no mais empregada, pois pode ser hidrolisada por m.o. proteolticos.
SENAI-RJ 119
SENAI-RJ 120
Lquidos
Vantagens:
Vantagens:
4. Menores custos.
Desvantagens:
Desvantagens:
4. Maiores custos.
SENAI-RJ 121
SENAI-RJ 122
Agar-mosto
Fungos
28C
2 a 3 dias
aerobiose
Agar Standard I
Bactrias aerbias
28C
1 a 2 dias
aerobiose
NBB-Agar ou
Bactrias danosas
25 a 28C
Ca. 5 dias
anaerobiose
28C
2 a 5 dias
Agar-MRS
cerveja
m.o. danosos
aos refrigerantes
Endo-Agar
Escherichia-coli
37C
2 dias =
aerobiose
5 dias =
anaerobiose
aerobiose
SENAI-RJ 123
de leveduras de cultivo, entretanto, podero se desenvolver leveduras selvagens, como, por exemplo,
Saccharomyces pastorianus ou Sacch. diastaticus, no provocando, porm, uma viragem do indicador.
O meio nutritivo contm o "Indicador Vermelho de Clorofenol".
O cultivo sobre NBB-Agar, alm de permitir a avaliao morfolgica das colnias, tambm possibilita
a determinao da contagem de m.o. e a execuo de testes complementares, como o comportamento
segundo Gram e teste da catalase.
O NBB-Bouillon ou Caldo destaca-se como sendo um meio de deteco com a mais alta sensibilidade.
So utilizados como frascos de cultura, de preferncia, tubos de ensaio com vedantes gs-permeveis
(por exemplo, rolhas de substncia esponjosa).
O NBB-Concentrado tem durao de incubao de apenas 8 dias.
Resultados j podem ser obtidos aps 4 dias, porm a avaliao final se processar aps 10 a 12
dias.
As vantagens adicionais do NBB-Concentrado so o crescimento macio dos m.o. prejudiciais
cerveja e a alta segurana na identificao. Nessas provas, uma contaminao tambm poder ser
avaliada macroscopicamente atravs de formao de uma turvao e sedimentao.
O NBB-Concentrado um meio nutritivo empregado, principalmente, para a detectao de traos
de m.o. nocivos cerveja em provas de cerveja nova, de m filtrabilidade e com suspenso de leveduras.
Agar VLB-S7
Foi desenvolvido pela VLB Berlin. um meio seletivo para lactobacilos.
Geralmente, o meio nutritivo S-7 empregado para a comprovao de m.o. nocivos cerveja. O
referido meio contm Verde Bromocresol como indicador e descolora quando da produo de cidos.
Sua incubao de 7 dias.
SENAI-RJ 124
BSNB
Meio nutritivo especfico lquido para m.o. nocivo cerveja, segundo Kretschmer, no qual tambm
se desenvolvem leveduras e bactrias gram-negativas.
A incubao demora acima de 7 dias. O meio nutritivo pode ser preparado em laboratrio.
Preparao:
1.500ml de cerveja Pilsener;
100ml de leite peptonado;
4.500ml de gua nobre cervejeira;
200ml de levedura cervejeira autolisada;
140g de suco de tomate; e
60g de glicose.
SENAI-RJ 125
Agar-Violeta Cristal
Usado para anlise de leveduras "selvagens" do gnero Saccharomyces. O referido meio de cultura
inibe as leveduras de cultivo e leveduras "selvagens" do gnero no Saccharomyces.
Preparao:
fluidificar o Agar-mosto preparado;
dissolver 20mg de Violeta Cristal em 1 litro do Agar-mosto liquefeito e dosar essa quantidade em
frascos Erlenmeyer esterilizados; e
durante 2 dias esterilizar por 15 minutos a 100C. O Agar-Violeta Cristal no dever ser preparado
antecipadamente.
Agar-Lisina
Para anlise de leveduras no pertencentes ao gnero Saccharomyces. O referido meio de cultura
contm o aminocido lisina como nica fonte nutritiva assimilvel. Esse componente somente pode ser
decomposto pelas leveduras do gnero no Saccharomyces. As leveduras do gnero Saccharomyces
no se desenvolvem.
Pelos meios de cultura ou testes indicados, as leveduras permitem uma classificao conforme o
seguinte esquema:
gnero no
Saccharomyces
Saccharomyces
Agar-mosto
Agar-Acetato
ou (+)
Agar-Violeta Cristal
Agar-Lisina
Importante!
Esterilizar significa, para o processo de elaborao dos meios nutritivos
de cultura, que esses meios so autoclavados, geralmente, durante 20
minutos, a 121C (= 2 bar).
SENAI-RJ 126
As placas de Petri plsticas esto contidas em sacos de polietileno fundidos. O referido conjunto foi
esterilizado pelo fabricante por raios gama ou xido de etileno.
As placas de Petri de vidro devero ser, aps cada uso, rigorosamente limpas e, como j observado
anteriormente, esterilizadas em autoclaves.
Como as placas de Petri devem ser dosadas com 15 a 20ml de Agar fluidificado e, como essa
quantidade torna-se difcil de ser estimada a partir de um Erlenmeyer, evidenciou-se como oportuno, a
princpio, despejar o Agar em tubos de ensaio. Pode-se ento armazenar, na geladeira, uma grande
quantidade de tubos contendo pores do meio de cultura previamente esterilizados. Para sua
reutilizao, conforme a necessidade, procede-se fluidificao por aquecimento em banho-maria,
vertendo-se o Agar lquido nas placas estreis. Essas so as chamadas "placas de cultura".
Quando, durante a moldagem das placas, aparecerem pequenas bolhas na superfcie do Agar, as
mesmas podero ser removidas, antes da completa solidificao do meio, atravs de uma rpida
flambagem.
Antes de verter o Agar fluidificado em placas ou tubos de ensaio esterilizados, imprescindvel
flambar a borda da boca do frasco Erlenmeyer.
Todas estas operaes devero ser processadas no interior da capela fluxo-laminar, junto chama
de um bico de Bunsen (ar ascendente), quando ento a tampa da placa dever ser levantada somente
a uma altura estritamente necessria.
SENAI-RJ 127
d) Placas fechadas, com o fundo normal para cima, so armazenadas embaladas at o uso para
inoculao. Devem ser preparadas placas para um abastecimento semanal, considerando que
meios nutritivos velhos ressecam e fissuram.
Para a maioria dos meios de cultura, comprovou-se como positivo guardar em geladeira a 4-6C.
Muito importante resguardar os meios da ao da luz. Poucas horas antes de seu uso, os meios de
SENAI-RJ 128
cultura devero ser retirados da geladeira e aquecidos numa estufa de incubao. Por esse procedimento
evitado um retardamento do crescimento dos m.o. por um eventual meio nutritivo muito frio.
6
5
Os tubos de cultura podem receber meios nutritivos slidos, semi-slidos ou lquidos. Os tubos a
seguir so guardados em copos Becher, com o fundo almofadado com algodo, ou em suportes de
armao metlica gradeada. Para um posicionamento seguro, tambm
servem tacos de madeira com perfuraes de 6cm de profundidade e ca.
de 18mm de dimetro.
Os tubos de cultura so subdivididos em:
tubos de cultura com camada profunda vertical; e
tubos de cultura com meio de Agar inclinado.
Antes de explicar suas aplicaes, vamos descrever o que vem a ser
"Tcnicas de culturas".
SENAI-RJ 129
Tcnicas de culturas
A cultura de m.o. engloba duas etapas:
1 Etapa
inoculao dos meios de cultura esterilizados com uma pequena poro microrgnica denominada
"inculo" ou "semeadura".
2 Etapa
reparao dos requisitos necessrios ao crescimento. Junto com a temperatura, o abastecimento
do oxignio fundamental. Os processos de culturas podem ser diferenciados como sendo:
culturas aerbias e anaerbias.
As culturas aerbias servem para o cultivo de m.o. estritamente aerbicos ou facultativamente
anaerbicos, assim como para os m.o. que crescem na superfcie dos meios nutritivos onde h oxignio
suficiente disponvel.
As chamadas culturas de superfcie so procedidas sobre meios de cultura slidos (placas, Agar
inclinado) e as chamadas culturas suspensas, sobre a superfcie de solues nutritivas, que servem,
especialmente, para o crescimento de fungos ou bolores.
Enquanto o oxignio nas culturas de superfcie pode atingir facilmente o interior das clulas, a
difuso fica fortemente entravada quando as clulas crescem numa soluo nutritiva. Nessas culturas,
ditas submersas, em conseqncia do empobrecimento em oxignio abaixo da superfcie lquida, resultam
imediatamente condies anaerbicas. Micrbios aerbicos, conseqentemente, deixam-se cultivar
em meios submersos somente quando for providenciado um suprimento suficiente e constante de
oxignio.
Para tanto, pode-se empregar as seguintes tcnicas:
a) cultura em camada fina (figura A);
b) cultura por agitao, o que provoca uma constante renovao da superfcie limtrofe (figura
D); e
c) insuflao de ar estril na soluo nutritiva, ou seja, aerao submersa (figura E).
SENAI-RJ 130
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Chumao de algodo
Suspenso de bactrias
Rolha de borracha
Suspenso de bactrias
Tampa frouxa
Fixadores de frascos
Mesa agitadora
Nos procedimentos de culturas anaerbicas ocorre o cultivo de m.o. numa atmosfera quase isenta
de oxignio. Nestas condies, em que se tratando dos rigorosos e facultativamente anaerbicos, a
energia necessria ganha no transcorrer da fermentao.
Microrganismos facultativamente anaerbicos so geralmente cultivados em tubos cheios com
soluo nutritiva at 2/3 de seu volume. Acima do pequeno limite de fase, entre o meio e o ar, somente
pode penetrar um mnimo de oxignio. Dessa maneira, existem condies anaerbicas no fundo do
tubo.
A
1. Grampo de tubo de
borracha
2. Entrada para a bomba
de aqurio
3. Tubo de borracha do
aqurio
4. Chumao de algodo
5. Tubo de silicone
(dimetro interno 6mm
e dimetro externo
8mm)
6. Tubo de vidro com
ponta estirada,
(dimetro 6mm)
7. Cultura
1. Canal de picada
2. Crescimento bacteriano
3. Agar ou leo de parafina
estril
SENAI-RJ 131
Um tubo de cultura com Agar inoculado pode ainda receber uma sobrecarga de Agar ou leo de
parafina estril, como barreira adicional contra o oxignio (figura d).
Aps a solidificao do Agar o inculo transferido para o meio nutritivo, atravs da picada de
uma agulha ou fio de platina. O m.o. correspondente se desenvolve na parede da coluna vertical, onde
predominarem as condies mais favorveis de oxignio (figuras a-d). Isto reconhecvel pelo
distanciamento da zona de turvao (zona de crescimento) da superfcie do substrato (figuras a-d).
Os tubos de cultura de picadas so mais vantajosos do que os tubos de cultura com meio Agar
inclinados, porque o meio de cultura no resseca to rapidamente e o desenvolvimento mais fraco.
Conseqentemente, so consumidos menos nutrientes e formadas menores quantidades de produtos
metablicos prejudiciais.
Os m.o. podem ser mantidos disponveis na forma de "culturas de base".
Garantia das "culturas de base" e preparao de culturas de uso.
Importante!
Culturas-base podem ser guardadas por vrias semanas em geladeira, a
4-6C. Entretanto, as mesmas devero ser renovadas, seguindo um rgido
plano de execuo, aps cada 4 semanas, com reinoculao sobre meios
nutritivos recm-preparados. Vez por outra, por estriamento, devero ser
testadas as culturas quanto presena de m.o. estranhos.
SENAI-RJ 132
100-2.000ml
50-200ml
1.800ml
Culturas lquidas de m.o. aerbios devem ser preparadas, preferencialmente, em frascos Erlenmeyer
(1), em frascos verticais de peito escarpado com bocal esmerilado (= Freudenreich, antigo (2)) e
frasco de cultura Fernbach (3) de fundo largo.
Uma grande superfcie divisria entre o meio de cultura e o ar facilita o intercmbio gasoso e
favorece o desenvolvimento da cultura.
Esses frascos de cultura podem ser vedados com buchas de algodo e de material celulsico, ou
com cpsulas metlicas apropriadas.
SENAI-RJ 133
Tcnicas de inoculao
Em microbiologia, entende-se por "inocular" a transferncia de m.o.vivos sobre ou em um
determinado meio de cultura. Para isso, utilizam-se diferentes instrumentos de inoculao, conforme
figura abaixo.
1.
2.
3.
4.
5.
Ala de platina
Fio de platina
Esptula
Ala, olhal
Comprimento da ala de
platina
6. Rosca de fixao da ala de
platina
7. Cabo metlico de
manipulao
8. Comprimento total da haste
coletora
9. Punho metlico com
cobertura de borracha
10. Fio de platina
11. Articulao da esptula
7,5
Com ala de platina so inoculados, principalmente, meios de cultura de Agar e pequenas quantidades
de meios nutritivos. A ala de platina dever ser, antes ou aps seu uso, levada ao rubro na chama de
um bico de Bunsen (procedimento j referido anteriormente).
SENAI-RJ 134
A esptula (denominada Ala de Drigalski) serve para a distribuio homognea de inculo (por
exemplo, suspenso de bactrias), sobre a superfcie de um meio de cultura slido.
Importante!
O instrumento de inoculao no dever ser largado sobre as mesas de trabalho,
e sim guardado verticalmente nas perfuraes de um suporte de madeira.
SENAI-RJ 135
Material: tubos de cultura, placas de Agar, bico de Bunsen, ala de platina, suporte de tubos de
ensaio e suporte do instrumental de inoculao.
SENAI-RJ 136
Material: tubos de cultura, por exemplo, tubos de cultura Agar inclinados, bico de Bunsen, ala de
platina, suporte para tubos de ensaio, suporte para instrumentos de inoculao.
SENAI-RJ 137
Microscopia
Composio do microscpio
1
.
2
3
4
5
15
.
6
7
8
9
10
11
14
12
13
SENAI-RJ 138
Importante!
As objetivas so lentes de vidro encaixadas em suportes metlicos.
Chamam-se objetivas porque objetivam a observao do objeto sobre
a platina do microscpio. As objetivas constituem as partes mais sensveis
do microscpio.
Dever ser observado para que as objetivas no batam jamais sobre o preparado ou lmina, quando
da ajustagem do foco.
Importante!
As lentes de vidro devero ser regularmente limpas, com esmero e cautela.
SENAI-RJ 139
a. Olho
b. Ocular
c. Objetiva
d. Lmpada
AB.
A capacidade de resoluo de uma objetiva do microscpio depende de suas caractersticas fsicoticas e, particularmente, de uma maneira decisiva, de sua abertura numrica, identificada atravs da
seguinte frmula:
An = n x sem.
Onde:
An = abertura numrica (est gravada na guarnio da objetiva).
n = ndice de refrao (do meio entre o objeto e a objetiva do ar, quando da utilizao do sistema
"seco", ou do leo de imerso, quando da observao atravs de uma objetiva de imerso).
Sem . = metade do ngulo de divergncia ou de abertura, da lente frontal da objetiva.
Observao
A abertura numrica em sistema seco pode atingir, no mximo, o valor
1 (= ar). Na prtica, entretanto, alcana-se apenas um valor
equivalente a 0,95.
Nos sistemas de imerso, para eliminar a reflexo total, intercalado um meio lquido que possua o
mesmo ndice de refrao que o do vidro.
SENAI-RJ 140
Somente aps a introduo da "tcnica de imerso", na qual o espao entre a lente e o objeto
preenchido com um "leo de imerso" (n = 1,5), pode ser melhorada a abertura numrica.
A finalidade do "leo de imerso" reduzir a refrao dos raios luminosos, permitindo que sejam
dirigidos diretamente para a objetiva. Quando no se usa o leo de imerso, parte dos raios luminosos
desviada ou refratada ao atravessarem a lmina de vidro onde se encontra a preparao a ser
visualizada. Esse desvio ocorre devido ao ndice de refrao do vidro. Por isso os raios sofrem um
desvio menor, permitindo uma imagem mais clara e ntida.
Lente
Lente
leo de
imerso
Lmina
de vidro
Raios
perdidos
Fonte
de luz
Observao
Quanto menor a distncia entre os pormenores do objeto, que propicia o
discernimento pela objetiva, maior a sua capacidade de resoluo.
d =
A
Onde:
d = distncia entre duas particularidades ainda distintas do objeto.
SENAI-RJ 141
10X
40X
16mm
100X
4mm
1,8mm
As lentes objetivas geralmente so em nmero de 4, com aumentos de 10x, 40x, 60x a 63x e 100x.
A objetiva de 100x denominada "lente de imerso", porque para ser usada necessrio que fique
imersa em um leo mineral (leo de imerso).
Na parte externa da guarnio das objetivas esto gravadas a marca de fbrica e nmero de
fabricao, assim como diversos valores que caracterizam as propriedades da objetiva.
As gravaes, por exemplo, representam o seguinte:
40 = unidade numrica da imagem intermediria.
0,65 = abertura numrica.
160 = comprimento mecnico do tubo, em mm.
0,17 = espessura da lmina necessria, em mm.
SENAI-RJ 142
Observao
O comprimento do tubo dever ser mantido para assegurar a correo da
objetiva.
fundamental que se evite uma combinao de acessrios de diferentes fabricantes, pois existem
microscpios e objetivas com diferentes comprimentos de tubos (160, 170, 250, etc.).
Tambm devero ser utilizadas lamnulas com especificaes adequadas no interesse de obteno
de uma boa qualidade de imagem.
Objetivas que so sensveis s oscilaes na espessura das lamnulas esto identificadas pela
indicao "-".
Objetivas com a indicao para lamnulas "0" so destinadas, exclusivamente, para preparados sem
uso de lamnulas. Ao lado das unidades gravadas nas objetivas ainda h indicao do "tipo da objetiva",
o qual se refere ao modo ou grau de correo em funo do erro de imagem.
Ocular
Sua funo aumentar a imagem real aumentada e projetada pela objetiva, como a de uma lupa.
Sua composio tem, no mnimo, duas lentes ou grupo de lentes: lente de campo, lente ocular e,
intermediariamente, o diafragma visual.
Unidade de iluminao
Uma boa imagem microbiolgica necessita de uma boa iluminao.
A iluminao direta composta de:
Fonte luminosa geralmente uma lmpada, localizada na base do microscpio.
Diafragma-ris dispositivo que permite regular a intensidade da luz que passa atravs do objeto
focalizado. Quanto maior for o aumento da objetiva, mais aberto deve estar o diafragma-ris.
Condensador localizado abaixo da platina. Atua convergindo os raios luminosos para o objetivo
focalizado.
Importante!
de suma importncia a boa qualidade de um "condensador".
SENAI-RJ 143
SENAI-RJ 144
Abaixo do condensador encontra-se o comutador seguro por meio de um parafuso. Ele permite um
acionamento em duas posies:
alavanca em posio para a direita significa: passagem livre; a ser utilizado para objetiva 10x; e
alavanca em posio para a esquerda significa: comutada a lente adicional; a ser utilizado para
objetiva < 10x.
O diafragma-ris tambm acionado por alavanca para dois posicionamentos:
girando para a direita significa: o diafragma est sendo aberto; e
girando para a esquerda significa: o diafragma est sendo fechado.
Esse comutador de condensador pode ser substitudo por um comutador com diafragma anular Ph2
ou comutador de condensador com diafragma de campo escuro D 0,7. Para tanto:
desaparafusar a porca serrilhada, puxar para baixo o comutador a ser substitudo, encaixar o
outro comutador para a posio de descanso e fixar com a porca serrilhada;
colocar a lmina com o preparado e a lamnula sobre a platina e fix-la sobre a mesa-coaxial com
o grampo de reteno com mola;
Observao
Como preparar a lmina ser descrito posteriormente.
SENAI-RJ 145
com o revlver das objetivas, escolher a objetiva com a escala desejada, girando-a at encaixe de
descanso; com o parafuso micromtrico, ajustar a nitidez da imagem;
com o revlver das objetivas, escolher a objetiva seguinte com a escala desejada final, girando-a
at encaixe de descanso; e
Importante!
Nesse momento, deve-se observar, no nvel da viso, se a objetiva, durante
o giro, eventualmente, j est golpeando o preparado.
Condensador AS 0,9.
Diafragma para campo escuro D 0,7
para objetivas de 10x a 40x.
Alavanca do comutador do
condensador.
Ajustagem:
ajustar o objeto, primeiramente, em campo claro, com a objetiva de menor aumento; para isso,
comandar por giro a alavanca para a posio esquerda (= passagem livre);
para a focagem, escolher uma rea do objeto que apresenta a menor estrutura (em caso excepcional,
numa rea perimetral do preparado);
encaixar o diafragma de campo escuro sobre o comutador do condensador, acionando a alavanca
para a posio direita, e abrir o diafragma-ris do condensador;
durante a observao, deslocar o diafragma de campo escuro numa determinada altura, at que o
preparado se apresente o mais claro e o fundo o mais escuro possvel; e
regular o reostato da lmpada (AM) para o mximo de luminosidade.
SENAI-RJ 146
Importante!
A soluo KOH a 5% dissolve as protenas coloidais dispersas no
meio e que poderiam ser, eventualmente, confundidas por operadores
inexperientes como sendo Pediococcus.
SENAI-RJ 147
Classificao e identificao de
microrganismos
Aspectos gerais
Na prtica fabril, o questionamento bsico para a avaliao microbiolgica consiste de duas perguntas:
1. O m.o. evidenciado ou no um contaminante tpico de cervejas?
2. Sendo um contaminante de cervejas, obrigatoriamente ou potencialmente danoso cerveja?
Entende-se por microrganismos danosos aqueles que, atravs da produo de produtos
metablicos, alteram as propriedades organolpticas da cerveja quanto ao paladar e aroma, ou, atravs
da formao de turvao e sedimentos, alteram as propriedades visuais do produto.
Contaminantes obrigatoriamente danosos cerveja so microrganismos que, penetrando em
qualquer cerveja, tornam-se rigorosamente prejudiciais.
Os principais contaminantes obrigatoriamente danosos so os Lactobacillus e Pediococcus.
Contaminantes potencialmente danosos cerveja so microrganismos que se tornam
prejudiciais cerveja somente sob determinadas condies.
Microrganismos potencialmente danosos apenas se desenvolvero quando os fatores inibidores da
cerveja estiverem reduzidos.
Os m.o. obrigatoriamente danosos toleram as propriedades seletivas da cerveja em especial, o
valor do pH baixo, a atmosfera anaerbica, as substncias amargas do lpulo, o teor alcolico, a
deficincia de determinados elementos nutritivos e de crescimento (em decorrncia da fermentao
principal anterior), assim como as baixas temperaturas, podendo se desenvolver sem necessitarem de
longos perodos de adaptao na cerveja.
A contaminao por esses m.o. dever ser evitada por todos os meios.
Menos perigosos so os m.o. potencialmente danosos cerveja. Os mesmos, como j foi visto,
apenas se desenvolvem na cerveja sob determinadas circunstncias. O risco prevalece apenas em
cervejas com um valor de pH muito alto, concentraes de substncias amargas do lpulo extremamente
baixas, insuficiente grau de fermentao, altos teores em oxignio ou baixo teor alcolico.
Contaminantes danosos indiretos para a cerveja so m.o. que no provocam especificamente
qualquer alterao nas caractersticas da cerveja, porm podem se desenvolver nas fases iniciais do
processo de produo afetando indiretamente as qualidades do produto final.
Exemplo: contaminao do mosto j resfriado.
Microrganismos indicadores so m.o. que no constituem perigo quanto estabilidade biolgica
da cerveja, mas que podem aparecer em razo de medidas insuficientes de limpeza e sanitizao ou
SENAI-RJ 148
quando da ocorrncia de falhas operacionais. A comprovao desses m.o. fornece uma importante
informao ao setor de controle fabril, que, de imediato, dever providenciar as medidas corretivas
necessrias.
Como estes m.o. podem ser mais prematuramente e mais facilmente detectados, constituem um
alerta para se evitar posteriores problemas microbiolgicos.
Devemos diferenciar os termos classificao e identificao.
Pela identificao determinada tanto a espcie como tambm o tipo de microrganismo.
Na prtica, normalmente suficiente uma classificao para avaliar as propriedades danosas ao
produto.
Para uma anlise de gua potvel torna-se imprescindvel, pela legislao pertinente, a identificao
da Escherichia coli, assim como de grupo de coliformes.
Tambm para os contaminantes danosos ao produto desejvel uma identificao quando se tratar
de um m.o. com caractersticas especiais, como, por exemplo, indicando uma resistncia contra
determinado produto desinfetante.
Para a identificao de m.o., so utilizados inmeros parmetros:
macroscpicos:
microscpicos:
disposio celular.
mobilidade.
testes:
formao de esporos.
SENAI-RJ 149
Cultura por
membrana
filtrante
Enriquecimento
em meio nutritivo
lquido
Suspenso diluda
microrgnica
Estriamento
em Agar
Lminas com
preparados
Provas
Comprobatrias
Estriamento
fracionado para
obteno de
cultura pura
(meio coletivo)
Preparado de GRAM
ou
Teste de KOH
Teste da Catalase
Teste da Oxidase
Prova de verificao
de cultura pura
(meio coletivo)
Cepa-Matriz
Teste adicional
Set de Testes
Manual de cdigo
e identificao,
informaes
sobre ordenao
estatstica
Incubao
Avaliao
Elaborao
do n de
cdigo
Identificao
atravs de um
set de testes,
ou seja,
espectro
Tabelas
de
Determinaes
Espectro de Acar
Colorao de Gram
Esse mtodo de colorao, introduzido por GRAM em 1884, divide as bactrias em dois grupos.
SENAI-RJ 150
Resultados:
Bactrias gram-positivas ficam coloridas em violeta.
Bactrias gram-negativas ficam coloridas em vermelho.
SENAI-RJ 151
Fatores de erro:
1. Bactrias envelhecidas no mais reagem de forma inequvoca (gram-variveis).
2. "Supercolorao" ou "descoramento total" so possveis de acontecer por falta de prtica.
Auxlio: colorao, em paralelo, de bactrias gram-positivas e negativas conhecidas.
Teste de KOH
O referido teste no substitui o mtodo da "colorao de GRAM", entretanto, poder servir de teste
de apoio para os casos de dvida operacional desse ltimo.
Teste da catalase
Este teste utilizado para diferenciar bactrias aerbias
de anaerbias.
As bactrias aerbias possuem a enzima catalase, a qual
desdobra o H2O2, produzido pelo metabolismo, em H2O e
oxignio.
Bactrias anaerbias no possuem a enzima catalase.
Princpio de trabalho:
Com uma ala de platina, espalhar uma colnia sobre uma lmina, a seco, sobre a qual se goteja
uma soluo H2O2 a 3-5% (em frascos marrons, armazenados em geladeira). Com produo de gases
e espuma, a bactria catalase-positiva e, com isso, aerbica (ou, tambm, facultativa). No havendo
qualquer reao, a bactria catalase-negativa e anaerbica.
Um falso resultado aparece quando h mistura de colnias ou presena de leveduras.
SENAI-RJ 152
Teste da oxidase
Esse teste serve para diferenciar bactrias gram-negativas.
As Pseudomonas (Pseudomonadaceae) possuem a enzima citocromoxidase. Conseqentemente,
so oxidase-positivas.
As Enterobactrias (Enterobacteriaceae) no possuem essa enzima e so, portanto, oxidasenegativas.
Utilizam-se tiras ou solues prontas para a realizao do teste. Uma colnia colocada sobre a
tira e espera-se a reao de cor.
Quando a colorao se torna azul, os m.o. so oxidase-positivos. Ausncia de colorao indicam
m.o. oxidase-negativos.
Erros podem acontecer com meio de cultura com pH abaixo de 5,5, e com colnias mais velhas.
SENAI-RJ 153
SENAI-RJ 154
Micrococcus
Sarcina
Bacillus
sem
esporos
formam
esporos
aerbios
a
facultativos
refratam
fortemente
a luz
refratam
fracamente
a luz
aerbios
a
facultativos
Pediococcus
Lactobacillus
sem
esporos
sem
esporos
anaerbios
(microaeroflicos)
refratam
fortemente
a luz
sntese de
diacetil
anaerbios
(microaeroflicos)
refratam
fortemente
a luz
imveis
imveis
cocos
imveis
bastonetes
cocos
bastonetes
flagelos
pentrquios
sintetizam
cido ltico
no sintetizam
cido ltico
catalase
negativo
catalase
positivo
Teste de catalase
Gram positivo
COLORAO DE GRAM
sem
esporos
facultativos
Streptococcus
Leuconostoc
bastonestes
curtos a
cocides
Pseudomonas
Klebslella
Citrobacter
E. coll
Enterobacter
fermenta
lactose
lactose
negativo
Hafnia
Zymomonas
Pectinatus
Acetobacter
(flagelos
peritrquios)
Megasphae
sem esporos
refratam
fracamente a luz
imveis
cocos
(levemente
ovais)
catalase
negativo
sem esporos
glucanobacter
(flagelos polares)
sem
esporos
flagelos
peritrquios
aerbios
bastonetes
ou
espirillos
refratam
fracamente
a luz
sntese de
cido actico
Teste de catalase
Gram negativo
COLORAO DE GRAM
no
coliformes
Enterobacteraceae
aerbios a facultativos
sem
esporos
sem
esporos
geralmente
flagelos
peritrquios
refratam
fracamente
a luz
geralmente
flagelos
polares
no sintetizam
cido actico
bastonetes
curtos a
cocides
oxidase
negativo
oxidase
positivo
teste de
oxidase
catalase
positivo
SENAI-RJ 155
Kloeckera apiculata
Pichla membranaefaciens
A levedura inoculada em tubos "Durham", contendo cada tubo uma soluo de cada acar
isoladamente.
Observaes:
1. Geralmente quando uma levedura fermenta, a mesma tambm fermenta a glicose.
2. Quando a levedura fermenta a glicose, ento tambm fermentar a frutose e a manose.
3. Uma levedura nunca fermenta, simultaneamente, a maltose e a lactose.
4. Leveduras que fermentam a sacarose podem fermentar a rafinose, porm no obrigatoriamente.
5. Os mesmos acares assimilados (respirados) tambm so fermentados, podendo alguns, s
vezes, serem somente assimilados.
SENAI-RJ 156
Glicose
Sacarose
Maltose
S. uvarum
3/3
S. cerevisae
1/3
S. bavanus
3/2
1/3
Hansenula
anomala
Kloeckera
apiculata
Onde:
+ = fermentao positiva (produo de gs).
= fermentao negativa (sem produo de gs).
SENAI-RJ 157
1
2
3
5
6
7
9
10
11
12
1. Membrana
2. Esporos (esporngios)
3. Columela (parede de separao)
4. Hifa
5. Apfise (engrossamento da Hifa)
6. Condios
7. Esterigma
8. Medula
9. Hifa conidial
10.
10.Miclio areo
11.
11.Miclio vegetativo
12.
12.Meio de cultura
SENAI-RJ 158
Exerccios
1.
2.
b) (
c) (
d) (
e) (
f) (
b) (
c) (
) O calor mido menos eficiente do que o calor seco, pois seu mecanismo de ao
de baseia na oxidao dos componentes celulares, enquanto o calor seco se
fundamenta na coagulao prottica, sendo essa reao catalisada pela gua.
d) (
e) (
f) (
g) (
h) (
i) (
j) (
k) (
l) (
) O leo mineral diminui o ndice de refrao da luz, devendo ser usado somente na
objetiva de imerso.
m) (
n) (
SENAI-RJ 159
3.
4.
Correlacione as colunas:
a) Colorao de Gram
) Lacctobacillus e Pedococcus.
b) Bactrias Gram+
c) Bactrias Gram
d) Lugol
e) lcool
Complete as lacunas:
SENAI-RJ 160
Chave de respostas
Exerccio 1
b) (X) Esterilizao significa destruio de clulas viveis e esporos.
e) (X) Toda substncia termolbil deve ser esterilizada por filtrao.
f) (X) Tindalizao consiste na destruio de esporos e clulas vegetativas.
Exerccio 2
a) (V)
b) (V)
c) (F)
d) (V)
e) (V)
f ) (V)
g) (F)
h) (V)
i) (F)
j) (F)
k) (F)
l) (V)
m) (V)
n) (V)
Exerccio 3
a) (B)
b) (E)
c) (D)
d) (A)
e) (C)
SENAI-RJ 161
Exerccio 4
a) O Agar-MRS um meio de cultura seletivo para m.o. danosos cerveja, devendo ser
incubado em condies anaerbias.
b) So exemplos de fontes de nutrientes para o crescimento dos m.o.: glicose e peptona.
c) O Agar-mosto permite o crescimento de: leveduras cervejeiras e selvagens.
d) A actidiona um agente inibidor do crescimento de leveduras.
e) O Agar STANDARD permite o desenvolvimento de bactrias aerbias.
f) No Agar NBB, os m.o. danosos cerveja metabolizam a glicose modificando o pH do
meio de cultura; assim, o indicador vermelho de clorofenol vira para amarelo.
SENAI-RJ 162
Referncias bibliogrficas
PELCZAR, Michael; REID, Roger; CHAN, E; C. S. Microbiologia. So Paulo: McGrawHill do Brasil, 1980. v.1 il.
SENAI R.J. CENATEC de Produtos Alimentares. Garantia da Qualidade Microbiolgica
em Cervejaria. Vassouras, 1996. 124p. Material Didtico do Curso Tcnico Especial de
Cervejaria.
SENAI R.J. CENATEC de Produtos Alimentares. Microbiologia. Vassouras, 1996. 1.v.
Material Didtico do Curso Tcnico Especial de Cervejaria.
SOARES, Juarez Braga; CASIMIRO, Antonio Renato S. de; ALBUQUERQUE, Laurencia
Maria B. de. Microbiologia Bsica. Fortaleza: EUFC, 1991. 180 p. il. tab. Inclui bibliografia.
SENAI-RJ 163
FIRJAN
CIRJ
SESI
SENAI
IEL
FIRJAN
SENAI
Federao
Servio Nacional
das Indstrias
de Aprendizagem
Rio de Janeiro RJ
do Estado do
Industrial do
Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Central de Atendimento:
0800-231231