1

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIRIQUI

Facultad de Medicina
Departamento de Bioqumica
Escuela de Medicina

MANUAL DE LABORATORIO
DE BIOQUMICA HUMANA
Coordinador General:

MSc. Roberto A. Guevara A.

Colaboradores:
Lic. Yolanda A. Tem
Lic. Albertina Montenegro
Lic. Iris Caballero
Mgtra. Vielka C. de Guevara

2008

2
INTRODUCCIN

Al estudiante de bioqumica experimental:

El objetivo de este manual es describir las sesiones de laboratorio que forman parte del
curso de Bioqumica Mdica. Estas sesiones a su vez, se desarrollaron con la idea de
despertar su inters por la bioqumica y entenderla ms plenamente. Para que las
sesiones cumplan con este objetivo, es necesario un esfuerzo adicional por parte del
estudiante, con respecto a orden y disciplina. Primero, el estudiante debe familiarizarse
con la informacin general proporcionada para cada prctica antes de cada sesin. Tres
componentes han sido incorporados en este manual para facilitar este proceso:
1) Una breve introduccin con el fundamento de la prctica a realizar, el cual debe ser
complementado con la materia vista en las clases de teora o texto general de
bioqumica
2) Una descripcin, paso por paso de la preparacin de los materiales a utilizar y de la
prctica en s. Aunque muchos de los reactivos sern suministrados a los estudiantes ya
listos para usar, el conocer sus componentes permitir una mejor comprensin del
experimento y adems se sabr qu medidas de manejo y seguridad se debern aplicar.
3) Una serie de preguntas o ejercicios que se deben contestar ya sea al momento de la
prctica o luego de la misma y que le permitirn desarrollar un mayor inters y
comprensin de un mtodo, tcnica o tema en particular. Segundo, se debe tener
presente que para completar la sesin de laboratorio en el tiempo programado, es
esencial estar familiarizado con el protocolo del experimento a realizarse antes de cada
sesin. Este manual es una gua para ese propsito. El uso eficiente del tiempo dentro
de las sesiones de prctica depender en gran medida de su habilidad para organizarse
y entender los procedimientos. Finalmente, es imperativo que el estudiante mantenga un
registro completo de sus experimentos, incluyendo resultados, clculos, conclusiones,
etc. Este registro se realiza al momento en que se realiza la prctica y debe estar escrito
de manera clara para que cualquiera pueda entender cmo se ejecut el protocolo y
cules fueron los resultados obtenidos. El manual tiene suficiente espacio para hacer las
anotaciones correspondientes, incluso contestar las preguntas que se requieran al
momento de la prctica. O si lo desea, puede utilizar un cuaderno aparte donde realizar
sus anotaciones. Adems, estas anotaciones sern de utilidad para realizar el reporte de
laboratorio, el cual debe incluir lo siguiente:
a) Resumen de un prrafo sobre el fundamento de la prctica que se realiz.
b) Descripcin de los resultados, incluyendo su anlisis y respuestas a las

preguntas planteadas en el manual de laboratorio. Si fuese necesario, aadir

grficos, tablas, figuras o fotografas.
c) Bibliografa

3
Los grficos y cuadros deben estar debidamente rotulados. Ponga especial atencin a
las unidades de medida utilizadas en las abscisas (eje de la x) y las ordenadas (eje de la
y) en los grficos. En algunos casos, por circunstancias fuera de control, es posible que
los resultados obtenidos no sean los esperados o no son particularmente tiles para
demostrar un punto en particular. Sin embargo, eso no quiere decir que los resultados no
se puedan interpretar, es ms, es necesario interpretarlos: discuta en la seccin de
resultados de su reporte cul podra ser la causa por la cual no se dio el resultado
esperado: se hizo una dilucin equivocada de los reactivos? Se confundieron los tubos?
Se omiti accidentalmente algn paso del protocolo o algn reactivo? Discuta adems
cul habra sido el resultado esperado. Su conocimiento del fundamento del experimento
realizado as como del protocolo en s deben ser suficientes para que usted concluya
cules eran los resultados esperados.
Medidas de seguridad:
Durante el desarrollo de las prcticas, los estudiantes estarn en contacto con
sustancias potencialmente peligrosas como lo son cidos y bases fuertes, agentes
mutagnicos, microorganismos, compuestos voltiles e inflamables, electricidad y
objetos punzo cortantes. Como cualquier otra herramienta, los materiales a ser utilizados
en las prcticas de bioqumica son peligrosos cuando no son utilizados correctamente.
Por lo tanto es indispensable el uso de gabacha de manga larga, es absolutamente
prohibido comer, tomar, fumar o usar aparatos electrnicos ajenos a las prcticas
durante las sesiones de laboratorio.
Se aconseja el uso de lentes de seguridad y guantes de vinil o ltex. A lo largo de este
manual, se har nfasis en los posibles materiales peligrosos a utilizar durante cada
prctica y al inicio de la misma se llamar la atencin sobre su uso correcto y forma de
desecho. Sin embargo en caso de accidente, informe inmediatamente al instructor para
tomar las medidas del caso. Existe un pequeo botiqun para emergencias en el
laboratorio y la UNACHI cuenta con una sala de primeros auxilios.
Recuerde que las prcticas son realizadas en forma grupal as que la cantidad de
materiales y sustancias en uso pueden acumularse rpidamente: si por alguna razn
algn lquido no peligroso es derramado, proceda a limpiarlo, no permita que el desorden
prevalezca y luego nadie pueda determinar qu tipo de sustancia se encuentra
derramada sobre la mesa. Cuando sea necesario agitar un tubo manualmente, hgalo
sujetndolo fuerte con la palma de una mano y dando golpes con los dedos de la otra;
nunca dirija la boca del tubo hacia usted o algn compaero. Por ltimo, no olvide
lavarse las manos al salir del laboratorio.
Esperamos que este manual y el curso de Bioqumica despierten su inters por esta
disciplina.

4
Evaluacin del Laboratorio (Primera propuesta)
Asistencia 5%
Informes 25%
Desempeo en el laboratorio 20%
Parciales 30 %
Investigaciones 10%
Quices 10 %
Evaluacin del Laboratorio (Segunda propuesta)
Asistencia 5%
Informes 20 %
Parciales (3) 10 %
Pruebas Cortas. 10 %
Trabajo en el laboratorio. 20 %
Presentacin de trabajos. 15 %

Asistencia: Se evaluar la asistencia a las 16 semanas de cases.

minutos en la llegada al laboratorio se considerar como tardanza.

Informes: Se realizaran en una libreta grupalmente. Deben entregarse una semana

despus de haber realizado el experimento. Su tardanza se penalizar con un 10 %
menos de la nota. Debe ser estructurado de la siguiente forma: Objetivos, introduccin,
materiales y reactivos, procedimiento, cuadro de resultado, discusiones, conclusiones,
cuestionario y bibliografa.

Parciales: El primer parcial incluye los 6 primeros laboratorios y el segundo parcial el

resto de los laboratorios por realizar.

Pruebas Cortas: Sern realizadas antes o despus de periodo de laboratorio.

laboratorio realizado o del que ser realizado, por un periodo de 10 min.

Trabajo en el laboratorio: Ser evaluado el trabajo grupal y el trabajo individual de la

siguiente forma.

Despus de 10

Trabajo individual.
1.
2.
3.
4.
5.

Asistencia puntual a clases.

Uso de la bata de laboratorio.
Participacin en la realizacin del experimento.
Conocimiento adecuado de la prctica de laboratorio.
Permaneca en el laboratorio durante la sesin del experimento.

Trabajo Grupal.
1. Trabajo organizado en la elaboracin del experimento.
2. Materiales necesarios para la realizacin del experimento.
3. Entrega puntual del informe de laboratorio.

Del

5
4. Limpieza del rea de trabajo despus de realizado el laboratorio.
5. Trabajo responsable sin interrupciones.

Proyecto: Consiste en la elaboracin y sustentacin de un mural realizado con los

siguientes temas.
Grupo

Tema

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Sistemas Amortiguadores
Aminocidos
Protenas
Enzimas
Carbohidratos
Lpidos.
Colesterol
cidos Nucleicos
Enfermedades en la sangre
Enfermedades detectadas
en muestras de orina.

Fecha de presentacin

ndice de Experimentos
N

Titulo

Pgina

Flebotoma

Determinacin de pH y la acidez

12

Punto isoelctrico de aminocidos y protenas

17

Pruebas Cualitativas de aminocidos y protenas

20

Fracciones de protenas del suero.

26

Determinacin de la Temperatura y pH ptimo de la

31

alfa-amilasa.
7

Anhidrasa carbnica en sangre

36

Electroforesis de protenas del suero humano

38

Identificacin Cualitativa de Carbohidratos

46

10

Aislamiento del glucogeno.

51

11

ndice de tolerancia de la glucosa.

54

12

Produccin

de

piruvato

acetaldehdo

durante

la

56

fermentacin de la glucosa por levadura

13

Deshidrogenasa Succnica del Hgado.

61

14

Anlisis Cualitativo de lpidos.

63

15

Anlisis Cualitativo de Sales Biliares

67

16

Determinacin del Colesterol

72

17

Aislamiento del ADN en el bazo de cerdo.

74

18

Aislamiento del ARN en levadura.

77

19

Anlisis de sangre (Agentes hemolticos)

81

20

Determinacin del Acido Ascrbico usando

84

2,6-diclorofenoildofenol
21

Anlisis de Orina I (Constituyentes normales)

87

22

Anlisis de Orina II (Orina patolgica)

94

Experimento 1.
Flebotoma
I. Objetivos:
1. Practicar el procedimiento de flebotoma.
2. Obtener una muestra de sangre de manera adecuada para efectuar su anlisis:
Hematolgico, Bioqumico o Microbiolgico.
3. Identificar los diversos mtodos de extraccin de sangre.
INTRODUCCIN
En la sangre venosa se pueden hacer diversos y diferentes estudios analticos, ya sean
desde el punto de vista bioqumico, hematolgico y/o microbiolgico.
La flebotoma, consiste en el procedimiento de extraccin de sangre desde una vena
perifrica. A travs de sistema estril con aguja, equipo y recipiente de colecta.
El sitio de puncin en el paciente vara dependiendo de la edad del paciente, as como
de la accesibilidad de la vena y el volumen de sangre requerida . Para adultos y nios
con venas con espesor adecuado la venopuncin se realiza en de la parte interior del
codo o la parte posterior de la mano. En bebs o en nios pequeos, se puede utilizar un
instrumento puntiagudo llamado lanceta para punzar la piel y hacerla sangrar. La sangre
se recoge en un tubo pequeo de vidrio llamado pipeta, en un portaobjetos o en una tira
reactiva. Puede realizarse la puncin en los dedos o en el taln.
En la actualidad existe un mtodo que evita la contaminacin del personal que realiza la
febotoma. El mtodo se conoce como Vacutainer, en el cual la puncin se realiza
empleando un adaptador con este nombre, al cual se le van adaptando la cantidad de
tubos necesarios para la recoleccin, los cuales estn al vaco. De esta forma se evita
estar depositando la muestra en varios tubos y la posible puncin accidental del
flebotomista.
La extraccin de sangre es un procedimiento mdico muy usual para la deteccin de
posibles enfermedades al realizar los oportunos anlisis a la muestra de sangre
obtenida.
MATERIALES

Guantes desechables/ Guantes estriles

Campana para extraccin por vaco tipo Vacutainer
Tubos de vaco
Jeringa
Algodn /Gasas estriles
Alcohol de 70 / Clorhexidina Acuosa 2%

Torniquete
Etiquetas para rotular
Agujas para Vacutainer

PROCEDIMIENTO

Preparar el material: Seleccionar el tubo segn la prueba a realizar y la jeringuilla

segn el volumen de muestra, tener a mano el algodn con alcohol y el torniquete.
Identificar el tubo con los datos demogrficos del paciente.
Lavarse las manos con agua y jabn.
Colocarse los guantes desechables y bata de laboratorio.
Colocar cmodamente al paciente e inmovilizarlo si se trata de un nio.
Colocar el torniquete por encima del sitio de puncin, para producir ingurgitacin de
la vena.
Seleccionar el vaso mediante el tacto, as determinaremos la profundidad, calibre,
elasticidad, etc. Abrir y cerrar el puo, puede ayudar a distender las venas de los
miembros superiores.
Desinfectar el punto de puncin con algodn impregnado de alcohol de 70.
Para recogida de hemocultivos nos pondremos guantes estriles y utilizaremos gasas
estriles con clorhexidina acuosa al 2%.

Pinchar la piel y posteriormente la vena en direccin contraria al flujo sanguneo, con

un ngulo entre 15 y 30 respecto a la piel, con el bisel de la aguja hacia arriba.

Si se trata de un vacutainer, conectar el sistema de trasvase al tubo para recoger la

cantidad de sangre deseada.

Soltar el torniquete cuando est terminado de recolectar la sangre.

Retirar el material usado.
Lavado de manos.

OBSERVACIONES
Mantener asepsia durante la extraccin.
Provocar el menor traumatismo posible en el sitio de puncin pues se pueden alterar
el contenido de algunos componentes de la sangre.
Cambiar de aguja en caso de fallo en la puncin.
No extraer sangre de una vena donde est canalizado un goteo, ya que la muestra
estara diluida y no dara valores reales.
No pinchar en zonas con infeccin local o hematomas.
No pinchar venas profundas en nios con alteraciones de coagulacin.
La recogida de hemocultivos se realiza con tcnica estril.
Presionar unos 5 minutos hasta hacer hemostasia, en la zona de puncin, tras de la
extraccin.
Vigilar inflamacin, calor o sangrado en el sitio de puncin.
Realizar una puncin certera: e bisel debe introducirse una sola vez, en forma suave
pero segura. Esto evita la ruptura de la vena y la formacin de hematomas.
EXTRACCIN DE MUESTRAS POR PUNCIN CAPILAR
Consiste en la recogida de una muestra de sangre para el anlisis realizado por
micromtodo: bilirrubinemias, glucemias, hematocrito, etc., a partir de la puncin capilar.
Es un procedimiento habitual en recin nacidos y lactantes.
Sitios de puncin
Lateral externo o interno del taln
Caras laterales de las falanges distales de los dedos
de la mano.
MATERIALES
Guantes desechables
Lanceta
Capilares de microhematocrito
Plastilina para sellar los capilares
Tubos microtainer para recogida de muestras
Algodn con alcohol de 70
Apsito/ Gasas

10

Tina con agua caliente

Etiquetas para rotular

PROCEDIMIENTO
Lavado de manos con agua y jabn
Colocarse los guantes
Calentar el pie del cual se va a extraer sangre introducindolo en una tina con agua a
41, con el fin de producir vasodilatacin incrementando as el flujo sanguneo

Sujetar el taln con los dedos pulgar e ndice.

Secar con una compresa y desinfectar con torundas impregnadas en alcohol de 70.
Puncionar con una lanceta enrgica y perpendicularmente al lateral externo o interno
del taln.

Presionar de forma intermitente el taln para favorecer la formacin de la gota de

sangre.

Rellenar los capilares de microhematocrito (evitando burbujas de aire), tubo de

micromuestra, tomando sangre de la gota que se forma espontneamente

11

Limpiar y comprimir el sitio de puncin

Colocar apsito o gasa anudada al taln.

Retirar el material usado

Lavado de manos

Observaciones
Evitar zonas fras de puncin.
No pinchar en la curvatura posterior del taln, la distancia entre el hueso y la piel es
mnima pudindose lesionar el hueso.
No pinchar en zonas con infeccin local o hematomas.
No pinchar con vasoconstriccin perifrica o cianosis.
No pinchar en nios edematosos.
En preescolares y escolares se elegir preferentemente los laterales de los dedos
como zona de puncin.
Si la zona de puncin es el dedo, se recomienda mantenerlos hacia abajo, ya que
esta posicin favorece la circulacin y por ende la recoleccin de la muestra.
No presionar junto a la puncin, al producirse hemlisis se mezclan fluidos
intersticiales e intracelulares con la sangre alterando los resultados.
No existen diferencias significativas entre la glucemia capilar despreciando o no la
primera gota.
Evitar la entrada de aire en el capilar, ya que podra falsear resultados.
Utilizar capilares heparinizados para evitar la coagulacin de la muestra.
Evitar el uso de esparadrapo en nios prematuros y sustituir por una gasa anudada,
para no producir agresiones en la piel.

12

Experimento 2.
Determinacin del pH y la Acidez

I. Objetivos:
6. Determinar el pH en diferentes muestras mediante el uso de indicadores.
7. Determinar la acidez total en una muestra de jugo gstrico.

II. Marco Terico:

Solucin amortiguadora es aquella que se opone a los cambios de pH cuando se agrega

cido o lcali. Tales soluciones se utilizan en muchos experimentos bioqumicos en los
cuales se necesita controlar exactamente el pH.

De la ecuacin de Henderson - Hasselbalch, se puede deducir que el pH de una solucin

amortiguadora depende de dos factores: uno es el valor de pKa y el otro es la proporcin
de sal a cido. Esta proporcin se considera igual a las cantidades de sal y cido
mezcladas en el intervalo de pH entre 4 y 10, donde la concentracin de hidrogeniones e
hidroxilos del medio acuoso es muy baja y se puede ignorar.

pH = pKa

Log10 [sal] / [cido]

Tomemos por ejemplo los amortiguadores de acetato que estn compuestos por una
mezcla de cido actico y acetato de sodio:
CH3COOH

CH3COO- + H+

CH3COONa

CH3COO- + Na+

Puesto que el cido actico est tan solo dbilmente disociado, la concentracin de
cido ser casi la misma que se agreg a la mezcla; en la misma forma la concentracin
de iones acetato pude ser considerada como igual a la concentracin de acetato de

13
sodio aadido a la mezcla, ya que la sal estar completamente disociada. La mxima
capacidad amortiguadora de la solucin se cumple cuando la concentracin de la sal es
igual a la concentracin del cido, en este punto pH = pKa. Si el pKa del cido actico
es 4.8, en la prctica las soluciones amortiguadoras se usan en el intervalo de pH entre
3.8 y 5.8, es decir 1 unidad alrededor del pKa. Esto se cumple generalmente para
todas las soluciones amortiguadoras.

Algunas de las soluciones amortiguadoras que se usan ms frecuentemente en el

laboratorio se muestran en la Tabla 1. Como se dijo anteriormente, el intervalo til para
la mayora de los amortiguadores es de una unidad de pH por encima o por debajo del
valor de pKa.

El amortiguador que se escoja en un momento dado debe seleccionarse con cuidado, ya

que los resultados experimentales pueden deberse a efectos especficos de los iones
utilizados y no al pH. Algunos amortiguadores que producen reacciones desfavorables
son: boratos, citratos, fosfatos y tris.

Tabla 1. Amortiguadores usados en investigaciones biolgicas.

cido o base

pKa

PKa

PKa

cido fosfrico

2.1

7.2

12.3

cido ctrico

3.1

4.8

5.4

cido Carbnico

6.4

10.3

Glicil glicina

3.1

8.1

cido Actico

4.8

Tris

8.3

Hepes

7.6

14
El pH y la vida.

La mayora de las clulas pueden trabajar nicamente dentro de limites estrechos de pH

y requieren por lo tanto sistemas amortiguadores que se opongan a los cambios de pH
que de otra forma ocurrira a causa del metabolismo. Los tres principales sistemas
amortiguadores en los materiales vivos son las protenas, el bicarbonato y el fosfato. La
importancia relativa de cada uno depende del tipo de clula y del organismo.

El sistema amortiguador mas importante en los mamferos es el bicarbonato:

H2CO3

----------

HCO3-

+ H

Por lo tanto, el pH del plasma depende de la relacin de bicarbonato a cido carbnico y

no de sus concentraciones absolutas.

Cualquier tendencia a cambiar el pH es

amortiguada y se puede corregir ajustando esta relacin.

Por ejemplo, los cidos

formados durante el metabolismo normal reacciona con el bicarbonato para formar cido
carbnico dbilmente disociado, en forma tal que los hidrogeniones son prcticamente
removidos. Al mismo tiempo, el cido carbnico es eliminado en los pulmones en forma
de dixido de carbono manteniendo constante el pH del plasma. Los riones tambin
juegan un papel importante en el mantenimiento del balance cido-base, regulando la
excrecin de cido o base en la orina y por esto en los humanos el pH de la orina vara
normalmente de 4.8 a 7.5.

El fluido extracelular es ligeramente alcalino (pH 7.4), mientras que el pH citoplasmtico

promedio de muchas clulas animales es aproximadamente 6.8 y a 37 C es neutro. Es
casi seguro que el pH en las organelas es diferente a 6.8 y el pH en la superficie de la
mayora de las membranas es mas bajo debido a la absorcin de H sobre la superficie
cargada negativamente.

15
La importancia de controlar el pH se ilustra muy bien en la sangre humana que debe
mantenerse dentro de limites muy estrechos para que se conserve la vida y aun mas
estrechos para mantener la salud.

III.

Materiales y Reactivos:

Indicadores (solucin en etanol acuoso de los indicadores fenolftaleina, rojo de metilo,

azul de timol).
Muestra de saliva, jugo de naranja, limonada, clara de huevo diluida 1 a 10.
Jugo gstrico o muestra simulada preparada mezclando 40 mL de cido clorhdrico
0.1 mol/L, 1.15 mL de cido actico 0.1 mol/L y 45 mL de agua.
Hidrxido de potasio 0.1 mol /L.
Azul de timol (0.1 % p/v en etanol 20 % v/v).
Micro buretas 10 mL.

IV. PROCEDIMIENTO
Determinacin del pH mediante el uso de indicadores.
En un tubo de ensayo pipetee 1-2 mL de cada muestra, agregue dos gotas de
indicador de rojo de metilo y observe el color. Repita el experimento con otros
indicadores hasta obtener el pH aproximado comparando los colores de las
muestras con las formas cidas, intermedia y bsica del indicador.
En un tubo de ensayo pipetee 2 mL de agua destilada y determine el pH usando los
indicadores tal como se describi previamente.

Titulacin de una mezcla de un cido fuerte y un cido dbil.

El jugo gstrico consta de una mezcla de HCl libre y cidos dbiles, tales como
fosfato, protena y cidos orgnicos. Una prueba cuantitativa de ambos tipos de acidez
puede ser de gran valor en el diagnostico clnico. Las cantidades relativas de HCl y de
cidos dbiles se determinan por titulacin usando un indicador que tenga dos limites de

16
pH tal como el azul de timol. Los limites de pH y los cambios de color que los
acompaan para el azul de timol son:
pH 1.2 2.8 rojo naranja amarillo.
pH 8.0 9.6 amarillo verde azul.
Cuando se titula hasta obtener el primer cambio de color, este indica la cantidad de
HCl libre, mientras que titulando hasta pH 9.6 se determina la acidez total.
Si no se puede conseguir jugo gstrico, se puede preparar una muestra simulada
mezclando cidos clorhdrico y actico.

En un tubo pequeo coloque 10 mL de la muestra, aada cuatro gotas de

indicador azul de timol, titule con hidrxido de potasio 0.1 mol /L, hasta que el
color rojizo-naranja cambie a naranja amarillo; anote cuidadosamente el
volumen de hidrxido de potasio usado.

Continu la titulacin hasta que se forme un color azul estable y anote de

nuevo el volumen de lcali usado.

Calcule el HCl libre y la acidez total de la muestra en trminos de mL de 0.1

mol /L de cido / 100 mL de muestra.

Los valores normales para jugo gstrico son:

HCl libre 20 30 mL 0.1 mol /L de cido / 100 mL.
Acidez total 30 70 mL 0.1 mol/L de cido / 100 mL.

Compare los resultados obtenidos en la muestra simulada con los esperados segn los
clculos tericos.

V. Cuestionario.

1. Cul es el pH de una mezcla de 5 mL de acetato de sodio 0.1 M y 4 mL de cido

actico 0.1 molar?
2. Cul es el cambio que ocurre en el pH al agregar a la mezcla anterior 1.0 mL de
HCl 0.1 M
3. Explique el sistema de amortiguamiento del pH en el plasma

17

EXPERIMENTO 3
Punto Isoelctrico de aminocidos y protenas
1. Objetivos:
1.1. Determinar los pKa de un aminocido polar con carga y un aminocido no polar,
mediante titulacin con lcali.
1.2. Estimar el punto isoelctrico de los aminocidos polares y no polares del grfico de
pH vs volumen de base.
1.3. Determinar el punto isoelctrico de una protena mediante
precipitacin.

la tcnica de

2. Introduccin:
El punto isoelctrico se define como el pH en el cual el nmero de cargas positivas
se iguala al nmero de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una
molcula. En el punto isoelctrico la carga neta de la molcula es cero (0). En los aminocidos los grupos ionizables corresponden a grupos carboxilos, amino, fenlicos y tilicos.
Aminocido
Glicina
Alanina
Valina
Leucina
Isoleucina
Metionina
Prolina
Fenilalanina
Triptofano
Serina
Treonina
Asparragina
Glutamina
Tirosina
Cistena
Lisina
Arginina
Histidina
Acido aspratico
Acido glutmico

Abrev

Letra

PKa
alfa-COOH

Gly
Ala
Val
Leu
Ile
Met
Pro
Phe
Trp
Ser
Thr
Asn
Gln
Tyr
Cys
Lys
Arg
His
Asp
Glu

G
A
V
L
I
M
P
F
W
S
T
N
Q
Y
C
K
R
H
D
E

2.35
2.35
2.29
2.33
2.32
2.13
1.95
2.20
2.46
2.19
2.09
2.14
2.17
2.20
1.92
2.16
1.82
1.80
1.99
2.10

PKa
alfa-NH3

9.78
9.87
9.74
9.74
9.76
9.28
10.64
9.31
9.41
9.21
9.1
8.75
9.13
9.21
10.7
9.06
8.99
9.33
9.90
9.47

pKaR

10.46 Fenol
8.37 Sulfhidrilo
10.54-Amino
12.48 Guanidinio
6.04 Imidazol
3.90 -COOH
4.07 -COOH

TABLA 1: Valores de pKa de los grupos ionizables de los -aminocidos. Fuente:

Bioqumica de Harper

18

El pI de los -aminocidos monoamino-monocarboxlicos, siempre est cercano a

pH = 6. Este valor lo podemos calcular con la siguiente ecuacin:

pl =

pKa1 + pKa 2
2

El pI de los -aminocidos monoamino-dicarboxlicos se encuentra a un pH

intermedio entre los valores de pKa de los grupos carboxlicos y en el caso de los aminocidos diamino-monocarboxlicos entre los valores de pKa de los grupos amino.
Los puntos isoelctricos proporcionan informacin til para razonar sobre el
comportamiento de los aminocidos y protenas en solucin. As, la presencia de grupos
ionizables en stas molculas tiene importantes consecuencias sobre la solubilidad.
Los aminocidos y las protenas son menos solubles en su punto isoelctrico si las
dems condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones dipolares no
presentan carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles a ese pH.
3. Materiales y reactivos:
3.1. Buretas, soportes, pinzas de bureta, matraces de 125 mL y 250 mL, pipetas de 25
ml, potencimetro de pH.
3.2. Soluciones de c. glutmico y glicina al 0.5% en HCl 0.1M; NaOH 0.2M; HCl 2%;
leche de vaca, de cajita; etanol 95%; ter.
4. Procedimiento:
4.1. Titulacin de aminocidos:
Coloque una alcuota de 25 ml de la solucin de aa. en un vaso qumico de 250 mL
y proceda a titular con NaOH 0.2 M, con adiciones de 1.0 mL cada vez, midiendo el pH
antes de cada adicin con un potencimetro de pH, hasta alcanzar el pH de 10. Grafique
sus resultados y reporte los valores de pKa de los aminocidos analizados y calcule el pI en
cada caso.

4.1.1. Punto isoelctrico y solubilidad: Verifique la solubilidad de varios aminocidos

en medio acuoso. Prepare varios tubos de ensayo con 3 ml de agua y aade una pequea
cantidad del aminocidos. Anote sus observacines.

4.2. Determinacin del pI de la casena de la leche.

Mida 50 mL de leche y colquelos en un vaso qumico de 400 mL. Diluya con 150
mL de agua destilada. Titule con HCl al 2% hasta alcanzar el pH de 4.8 contra un
potencimetro de pH. Si se tiene cuidado, se observa fcilmente el punto en el cual

19
empieza a precipitar la protena de la leche (casena). Se agita durante 10 minutos, se deja
sedimentar media hora y se anotan los resultados.
4.2.1. Separacin de la casena : (opcional) Se decanta el sobrenadante de la
leche precipitada en el punto 4.2. El precipitado se lava dos veces por suspensin con 100
mL de agua destilada y nueva decantacin. Se succiona toda el agua por filtracin en
embudo Bchner. El residuo hmedo se pasa a un vaso qumico y se prepara una
suspensin final de casena en 50 mL de etanol al 95% y se agita con fuerza durante 5
minutos y se decanta. Se repite otra vez el extracto con alcohol y luego se extrae dos veces
con 30 mL de ter. NOTA: descarte el ter en un recipiente para residuos orgnicos.
Se filtra la suspensin y se deseca sobre una placa porosa. Se debe obtener un polvo
blanco muy ligero.
4. Cuestionario:
4.1. Por qu no se alcanza el pH 1 con HCl 0.1M en las soluciones en las que se
prepararon los aa.?
4.2. Compare los puntos isoelctricos de la glicina y los pptidos glicil-glicina y glicil-glicilglicina. Qu concluye sobre estos resultados?
4.3. Por qu las molculas con grupos ionizables se hacen menos solubles en el punto
isoelctrico.
4.4. En la precipitacin de la casena qu pasara si se aade muy rpido el cido y se
alcanza un pH ms bajo que 4.8. Qu se debe hacer en este caso?
4.5. Por qu es necesario lavar la casena precipitada con alcohol (Etanol 95%) y ter.

20

Experimento 4
Pruebas Cualitativas de aminocidos y protenas
I. Objetivos:
1. Aplicar pruebas cualitativas generales y especficas que permitan reconocer grupos
qumicos de los aminocidos y protenas.
2. Someter soluciones de protenas a desnaturalizacin con agentes fsicos y qumicos.

II. Marco Terico:

1. Reaccin con la Ninhidrina: Los grupos amino libres de los - aminocidos, de los
pptidos y las protenas reaccionan con la Ninhidrina a un pH entre 4 y 8, para dar un
compuesto de intenso color azul prpura. La prueba tambin es positiva con aminas
primarias y amoniaco pero sin desprendimiento de CO2. Los iminocidos prolina e
hidroxiprolina dan un color amarillo en lugar del color prpura con la Ninhidrina. La
reaccin es muy sensible y es ideal para la deteccin de aminocidos en
cromatogramas y para su cuantificacin mediante tcnicas espectrofotomtricas de
las fracciones que se obtienen de columnas cromatogrficas.
2. Reaccin Xantoproteica.

Los aminocidos que contienen un ncleo aromtico

forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con cido ntrico

concentrado. Las sales de estos derivados son de color naranja intenso en medio
alcalino. La Fenilalanina, la Tirosina y en cierto grado el Triptfano, as como todas
las protenas que lo contienen, dan positiva la prueba.
3. Reaccin del cido glioxlico para Triptfano: El grupo indlico del Triptfano
reacciona con cido glioxlico en presencia de cido sulfrico concentrado dando un
complejo de color prpura, El cido actico glacial que ha sido expuesto a la luz
contiene cido glioxlico.

21
4. Reacciones para Cistena y cistina: Cuando los aminocidos y las protenas que
contienen grupos tilicos se calientan en medio fuertemente alcalino, el azufre
presente reacciona para formar sulfuros.

Este sulfuro puede detectarse por la

formacin de un precipitado negro de sulfuro de plomo por adicin de acetato de

plomo. Los grupos tioles tambin reaccionan con el nitroprusiato de sodio en
presencia de un exceso de amoniaco para dar un complejo rojo.

Pruebas generales para protenas.

1. Prueba de Biureth: Los compuestos que tienen dos grupos carbamidos (-CONH-),
ya sea unidos directamente o a travs de un tomo de carbono o nitrgeno, dan un
color violeta con el sulfato de cobre alcalino (reactivo de Biureth). Los tripptidos son
las molculas ms pequeas capaces de dar una prueba de Biureth positiva,
mientras que estos no ocurre con los aminocidos. La prueba de Biureth es una
buena prueba para la protenas y la intensidad del color violeta es una medida del
numero de enlaces peptdicos.

Algunas sustancias como la oxamida puede dar

falsos resultados positivos en ensayos cualitativos de protenas.

2. Desnaturalizacin por calor y pH extremos: La desnaturalizacin es cualquier

proceso por el cual el arreglo espacial de una protena cambia de la estructura
ordenada de la molcula nativa a una forma tridimensional desordenada. Durante la
desnaturalizacin se pierden las estructuras de orden superior de las protenas, con
perdida de la actividad biolgica. Las enzimas por ejemplo, que realizan trabajos
catalticos en las clulas, tienen una temperatura y un pH ptimo en el cual presentan
un mximo de actividad, pero la actividad disminuye significativamente hacia valores
extremos de pH y a bajas o elevadas temperaturas.

3. Precipitacin con cationes y aniones y sales concentradas. Los cationes de

metales pesados y los aniones de elevado peso molecular son muy usados en la
separacin de protenas y en la precipitacin de filtrados libres de protenas. A pH
neutro por lo general las protenas tienen carga negativa y se combinan fcilmente

22
con iones de metales pesados que, al neutralizar la carga producen la precipitacin.
A pH por debajo del punto isoelctrico en cambio, se combinan con aniones porque
presentan carga neta negativa. Soluciones concentradas de sales, de sulfato de
amonio por ejemplo, reducen en gran medida la solubilidad de las protenas, porque
compiten por las molculas de agua disponibles para la solvatacin

y las

interacciones protena protena se hacen ms importantes.

III. Materiales y Reactivos.

Reactivos: Soluciones al 1% de glicina, Tirosina, Triptfano, Cistena, Fenilalanina en

HCl 1M, Ninhidrina, cido ntrico concentrado, Hidrxido de sodio 10M, cido actico
glacial, cido sulfrico concentrado, Acetato de plomo al 2%, Reactivo de Biureth,
Soluciones de albmina y Casena al 1%, HCl 1M, NaOH 1M.

Materiales:
Tubos de ensayo, Gotero, Plancha, Bao mara, Vasos qumicos, Papel indicador,
Probeta 10 mL.

23

V. Procedimiento.

24

25
V. Cuadro De Resultados:
Coloque el signo (+) cuando la reaccin es positiva y el signo () cuando es negativa.
Cuadro 1: Identificacin de aminocidos.
Muestra

Ninhidrina

Xantoproteica

P. cido glioxlico

Rnx. Cistena

Glicina
Tirosina
Triptfano
Cistena
Fenilalanina

Cuadro 2: Pruebas para protenas.

Coloque el signo (+) cuando la reaccin es positiva y el signo () cuando es negativa.
Muestra

Prueba de

Desnaturalizacin

Desnaturalizacin por

Biureth

por pH y calor

metales pesados

Albmina
Casena
Anote comentarios y posibles explicaciones en los resultados negativos.

VI. Cuestionario.
1. Describa la reaccin de la Ninhidrina con cido asprtico, lisina y glutamina.
2. Se tienen cuatro frascos sin rotular, que se sabe contienen soluciones de los
siguientes aminocidos: glicina, arginina y tirosina y otro con el tripptido Gli- Arg- Gli.
Como los identificara.
3. Enumere cuatro agentes fsicos y agentes qumicos que pueden desnaturalizar las
protenas.
4. Investigue como afecta la fuerza inica del medio la solubilidad de las protenas.

26

Experimento 5.
Fracciones de protenas del suero

I. Objetivos:
1. Aplicar la tcnica de precipitacin salina selectiva para separar las diferentes
fracciones de protena presentes en una mezcla.
2. Determinar el porcentaje de composicin de una mezcla de protena mediante
anlisis colorimtrico.

II. Marco Terico:

El suero es el liquido de color mbar que se obtiene por centrifugacin y o decantacin
de la sangre que se ha coagulado. En el proceso de coagulacin se separan todas las
protenas de la coagulacin (fibringeno), conjuntamente con las clulas plasmticas. La
viscosidad del suero de debe en gran parte a la albmina., que constituye el 55% de las
protenas totales. Junto con los electrolitos, la albmina participa en la regulacin del
volumen sanguneo, al evitar que el agua que forma parte de la sangre difunda hacia los
espacios intersticiales; tambin participa en el transporte de cidos grasos.

Las

globulinas comprenden el 38% de las protenas plasmticas y corresponden a los

anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) que liberan las clulas plasmticas.

La funcin

anticuerpo representa un crucial mecanismo de defensa contra infecciones virales y

bacterianas de los animales y el hombre. Tres fracciones de globulinas (alfa, beta y
gamma) se pueden cuantificar y caracterizar por fraccionamiento con soluciones salinas.

III. Materiales y Reactivos.

Reactivos: Suero sanguneo, Cloruro de sodio 0.9 %, Reactivo de Biureth, Solucin
patrn de albmina, Sulfato de sodio 15.75%, 19.9% y 27.2%, celita.

27
Materiales:
Tubo de ensayo, Gotero, Pipetas 2, 5 y 10 ml, Colormetro, Esptula, Centrifugadora.

IV. Procedimiento.
1. Determinacin de las Protenas Totales

A.1

A.2

2.0 mL de NaCl 0.9% + 8.0 mL de Biureth

(blanco)

0.1 mL de suero + 1.9 mL de NaCl 0.9% + 8.0 mL de Biureth (muestra)

0.1 mL de albmina + 1.9 mL de NaCl 0.9% + 8.0 mL de Biureth (patrn)

Tape los tubos y homogenice por inversin lenta cuatro veces.

Reposar los tubos por 10 min. / Leer a 540 nm.

28

2. Separacin de las fracciones de protenas.

B
0.5 mL de suero + 10 mL Na2SO4 15.75 % + celita
C
0.5mL de suero + 10 mL Na2SO4 19.9 % + celita

0.5 mL de suero + 10 mL Na2SO4 27.2 % + celita

Deje reposar por 1 hora. Centrifugue por 5 min. a 3000 r.p.m. Decante el sobrenadante
de cada tubo por separado y gurdelo para la siguiente parte.

3. Cuantificacin de las fracciones de protenas.

2 mL del sobrenadante de B + 8 mL Biureth

biureth 2 mL del sobrenadante de B + 8 mL biureth

2 mL del sobrenadante de C + 8 mL Biureth

2 mL del sobrenadante de D + 8 mL Biureth

biureth 2 mL del sobrenadante de B + 8 mL biureth
Tape los tubos y homogenice por inversin lenta cuatro veces.

Interpretacin
de los
Agite y deje reposar
porresultados.
10 min.

Determine la lectura en el colormetro a 540 nm

29
La solucin de sulfato de sodio al 27.2 % que se adiciona al tubo D, precipita todas las
globulinas y deja en solucin las albminas. La solucin al 19.9% (tubo C) precipita a las
beta y gamma globulinas y deja en solucin a la albmina y las alfa globulinas. La
solucin al 15.75% (Tubo b), precipita a las gamma globulinas y deja en solucin a las
albminas y a las alfa y beta globulinas. Los resultados esperados para la cuantificacin
de las diferentes fracciones de protenas en el suero, se resumen en el siguiente cuadro.

Tubo A

Protena total

Tubo D

Albmina

Tubo C - D

Alfa globulinas

Tubo B - C

Beta globulinas

Tubo A B

Gamma globulinas

V. Cuadro De Resultados:
Cuadro 1: Determinacin de las protenas totales
Tubo

Lectura

g/dl. de protena = Am /Ap x [ M ]

A
A.1
A.2
Donde: Am = absorbancia de la muestra, Ap = absorbancia del patrn,
[ M ] = concentracin de la muestra
Cuadro 2: Separacin de las fracciones de protenas.
Tubo

Lectura

g/dl. de protena = Am /Ap x [ M ]

B
C
D
Recuerde presentar en el informe los clculos correspondientes.

30
VI. Cuestionario.
1. Que diferencia hay entre suero y plasma.
2. Cuales son las globulina (Inmunoglobulinas o anticuerpos) mas abundantes en el
plasma. Describa algunas de sus caractersticas.
3. Seale la diferencia de solubilidad de las protenas del suero.

31

Experimento 6
Determinacin de la temperatura y pH ptimo de la
alfa amilasa
I.

OBJETIVOS:
1.

Determinar la temperatura ptima para la reaccin entre el almidn y la

amilasa.

2.

Determinar el pH ptimo para la accin de la alfa amilasa sobre el almidn,

3.

Aplicar un mtodo colorimtrico para la determinacin de parmetros

enzimticos.

II.

MARCO TERICO:

Las amilasas son enzimas que pertenecen al grupo de las hidrolasas y al subgrupo de
las glicosidasas. Las hidrolasas rompen enlaces con la incorporacin de agua.

La beta amilasa se ha aislado en forma cristalina de la papa, cebada y avena. Hidroliza

tanto a la amilasa como a la amilopectina en un extremo no reductor, en el enlace alfa 1,4, formando maltosa; por ello la actividad de esta enzima puede ensayarse por un
aumento en las propiedades reductoras de la muestra hidrolizada in vitro.

Se ha reportado que la amilolisis ocurre hasta un 70-80%.

La beta amilasa es incapaz de pasar por el punto de ramificacin de una cadena
amilopectnica (enlace alfa 1,6); por ello la amilopectina slo se hidroliza parcialmente
dando una beta dextrina lmite.

Esta dextrina es no dializable, posee un alto peso

molecular y retiene intacta la estructura interna.

Esto significa que slo las cadenas

externas de la molcula de amilopectina son atacadas por la beta amilasa.

32
La alfa amilasa, tambin presente en muchas plantas fue cristalizada del endosperma de
la cebada en germinacin.

Esta es una enzima dependiente de Ca 2+, para la activacin

y estabilizacin ante la destruccin proteoltica y desnaturalizacin trmica.

La alfa amilasa ataca tanto a la amilosa como a la amillopectina. En la fase inicial de la

amilosis, se liberan grandes cantidades de oligosacridos (dextrinas).

En una segunda

fase, se da la formacin de maltosa y una pequea cantidad de glucosa y maltotriosa.

La Beta dextrina lmite, la cual no es susceptible al ataque de la beta amilasa, puede ser
hidrolizada por la alfa amilasa, en la porcin interna de la cadena, y dejando intactos los
puntos de ramificacin.

La accin de la alfa - amilasa puede seguirse por medio de un viscosmetro.

Estos

mtodos se refieren a la alfa amilasa como enzima dextrinozenica o licuante.

Estudios sobre el sitio de origen y actividad de las amilasas realizadas sobre el

endospermio del maz en germinacin, encontraron que la alfa-amilasa, es reponsable
por el 9% de la actividad amiloltica diez das despus de la germinacin, se origina en el
escutelum y se secreta el endospermio. Por otro lado, la beta amilasa, responde por el
1% de la actividad amiloltica y se forma exclusivamente en el endospermio.

En el presente experimento, se va a determinar la temperatura ptima y el pH ptimos

para la hidrlisis del almidn por medio de la alfa - amilasa.

Efecto de la Temperatura:
Las reacciones enzimticas, como reacciones qumicas que son, presanten sensibilidad
a los cambios de temperatura.

Debido a su naturaleza proteica, la desnaturalizacin

de las enzimas, causada por elevacin de la temperatura hace que disminuya su

concentracin efectiva y por tanto la velocidad de reaccin. Hasta los 45 C el efecto se

33
explica por la cintica qumica; arriba de los 45 C la desnaturalizacin predomina sobre
la activacin y a ms de 55 C se destruye la funcin cataltica.

Las molculas deben poseer cierta energa de activacin (E) para que puedan
reaccionar, y las enzimas actan como catalizadores disminuyendo esta energa
permitiendo que la reaccin sea ms pequea. Al final el cambio total no se altera a.

El efecto de la temperatura sobre la protena cataltica se puede determinar

experimentalmente exponiendo la enzima a temperaturas altas y midiendo luego la
actividad a una temperatura a la que la enzima es estable. Esto indica la cantidad de
enzima que no ha sido destruida.

Se construye un grfico del cambio de la actividad enzimtica en el tiempo de cada una

de las temperaturas. La velocidad inicial v, se obtiene a partir del grfico. Entonces, la
energa, y el calor de la inactivacin se obtiene de un grfico log.10v versus 1/T.
El pH y la Actividad Enzimtica:
Precisamente debido a su naturaleza proteica, los cambios de pH afectan el carcter
inica de los grupos amino y carboxilo de las enzimas, lo que a su vez modifica el sitio
cataltico y su conformacin. Puede causarse una desnaturalizacin si el pH del medio
es muy alto o bajo por insolubilizacin de la protena.

El pH al cual se obtiene una actividad mxima, se conoce como el pH ptimo de la

enzima y es caracterstico de ella siempre y cuando sea estable en las condiciones
estudiadas.

La estabilidad de una enzima puede verificarse, exponindola a diferentes valores de pH

en un tiempo dado, ajustando la solucin al pH que provee estabilidad y midiendo luego
la actividad.

34

Determinacin del pH ptimo:

Se emplean los materiales y el mtodo de la temperatura ptima excepto que se vara el
pH con soluciones de fosfato que vayan desde pH 5,8 hasta 8,0.

Se grafican los datos de actividad enzimtica versus el pH y se obtiene el pH ptimo a

partir del mximo de la curva.

III.

MATERIALES Y REACTIVOS:

Materiales y Reactivos
1.

Amortiguador de fosfato de sodio o potasio 0,1M pH = 6.7

2.

Amortiguador de fosfato de sodio 0,1M pH = 5,8 hasta 8,0.

3.

Solucin de almidn 5mg/ml. en amortiguador de pH 6,7.

4.

NaCl 10mg.

5.

alfa- amilasa diluida convenientemente.

6.

NaOH 2M.

7.

Reactivo dinitrosalicilato.

8.

Colormetros / Celdas.

9.

Baos de agua a diferentes temperaturas.

Procedimiento
Determinacin de la temperatura ptima:
Prepare 8 tubos que contengan lo siguiente:

Reactivo

Cantidad en mL

Almidn 5 mg/L

2,5

Amortiguador pH 6,7

1,0

NaCl 10 mg/mL

0,5

35

Coloque los 8 tubos y un tubo que contenga enzima en un bao de agua a una
temperatura dada. Despus de 10 minutos agregue 0,5 mL de la enzima a siete de los
tubos anteriores y 0,5 mL de agua al blanco. Incube los tubos durante 0 a 40 minutos y
detenga la reaccin aadiendo 0,5 mL de NaOH 2M a todos los tubos. Agregue 0,5 mL
del reactivo de dinitrosalicilato y caliente los tubos en un bao de H2O hirviendo. Enfre
y lea las absorbancias a 540nm contra el blanco.

Este procedimiento se repite para cada temperatura elegida por diferentes grupos de
trabajo.

Haga un grfico de Absorbancia en funcin del tiempo y compare con los grficos de las
otras temperaturas, as como la cantidad de sustrato transformada por minuto a los 10 y
40 minutos en funcin de la temperatura. Compare los grficos.

Grafique log 10v moles/s en funcin de 1/T y determine el calor de activacin.

IV.
1.

CUESTINARIO:
Investigue las caractersticas bioqumicas y el pH ptimo para las siguientes
enzimas:
a) Papana

2.

b) Lipasa cida

c) Ureasa.

Cules son las hidrolasas que junto con las amilasas son responsables del
catabolismo del almidn.

36

Experimento 7
Anhidrasa Carbnica en Sangre.
I.

Objetivos:

1.

Determinar la Anhidrasa carbnica en sangre.

II.

Marco Terico.

Esta enzima se encuentra en los glbulos rojos y es esencial para el transporte de

CO2. En los tejidos aumenta la velocidad de formacin del H2CO3 por hidratacin del
CO2, mientras en los pulmones acelera la reaccin inversa. La accin de la enzima
sobre la formacin del cido carbnico a partir del CO2, se puede demostrar a baja
temperatura, burbujeando CO2 en una solucin de NaHCO3 que contenga un indicador,
de esta manera se acelera la formacin el cido carbnico y entonces el viraje del
indicador ocurre, mas rpidamente en presencia que en ausencia de la enzima.

III.

Materiales y Reactivos.

Muestras de sangre, NaHCO3 5%, azul de bromotimol al 0.02%.

Vasos qumicos, probetas, tubos de ensayos.

IV.

Procedimiento.

Diluya 0.5 mL de la sangre desfibrinada con 2.0 mL de agua destilada.

Coloque 2 tubos de ensayo en una gradilla adecuada, rotlelos

Anhidrasa carbnica y testigo negativo.

A cada uno de los tubos agregue 20 mL de agua destilada y 5 mL de

NaHCO3 al 5 %.

Luego aada 1 mL de solucin de azul de bromotimol al 0.02 % a cada

tubo.

37

Al tubo rotulado Anhidrasa carbnica agrguele 0.2 mL de la dilucin de

sangre.

El tubo testigo sirve como control de la velocidad de hidratacin del CO2

no catalizada por enzima.

Coloque ambos tubos en un bao de hielo (suficiente hielo y agua para

enfriar todo el contenido de los tubos) durante 15 minutos.

Saque del bao el tubo rotulado testigo negativo y rpidamente sumerja

hasta el fondo de este tubo el tubillo de un aparato generador de CO 2.

Al mismo tiempo, marque en su reloj la posicin del segundero.

Anote el nmero de segundos requeridos para que la solucin vire de

su color azul a verde amarillento.

Sin que cambie la velocidad de burbujeo del CO2 repita el mismo

procedimiento con el tubo rotulado Anhidrasa Carbnica.

Anote y explique sus resultados.

Aparato generador de CO2

38

Experimento 8
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS DEL SUERO HUMANO
EN GEL DE POLIACRILAMIDA BAJO CONDICIONES
DESNATURALIZANTES (SDS-PAGE)
INTRODUCCIN
Electroforesis
Electroforesis es la migracin de molculas cargadas en solucin como respuesta a la presencia
de un campo elctrico. La velocidad de migracin depende principalmente de la fuerza del
campo, de la carga, forma, masa y tamao de la molcula, as como de la fuerza inica,
viscosidad y temperatura del medio en el que las molculas se estn moviendo. Como
herramienta analtica, la electroforesis es rpida, sensible y simple. La electroforesis es
ampliamente usada para estudiar propiedades de especies cargadas en solucin, y como una
tcnica de separacin.
Matrices de soporte
Generalmente la muestra es corrida en matrices como papel, acetato de celulosa, geles de
almidn, agarosa poliacrilamida. La matriz inhibe la difusin osmtica, as como el mezclado
producido por conveccin trmica., adems proveee un registro del proceso electrofortico ya
que puede marcarse y usarse para mediciones, autoradiografa almacenamiento. Las matrices
de soporte ms ampliamente usadas (agarosa y poliacrilamida) proveen adems, un medio para
separar molculas por tamao, ya que son geles porosos y pueden actuar como tamices
moleculares.
Separacin de protenas
Las protenas son compuestos anfotricos, por lo tanto su carga neta est determinada por el pH
del medio en el que estn suspendidas. En una solucin con un pH por encima de su punto
isoelctrico, una protena tiene una carga neta negativa y en un campo elctrico migra hacia el
nodo, mientras que migrar hacia el ctodo a pHs por debajo de su punto isoelctrico. La carga
presente en una protena es independiente de su tamao y vara de una protena a otra, por lo
tanto, la separacin electrofortica de protenas bajo condiciones no desnaturalizantes se realiza
en virtud de su carga y tamao.
Separacin de protenas bajo condiciones desnaturalizantes
El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aninico que desnaturaliza protenas
envolviendo el esqueleto polipeptdico, la unin presenta una relacin de masas 1,4:1. El SDS
confiere carga negativa al polipptido en relacin a su longitud. Usualmente es necesario reducir
los puentes disulfuro de las protenas para permitir la unin cuantitativa del SDS, esto se lleva a
cabo en caliente con 2-mercaptoetanol. En SDS-PAGE, la migracin no es determinada por la
carga elctrica del polipptido, sino por su peso molecular.

39
Sistemas de amortiguador continuos y discontinuos
Un sistema continuo tiene un gel de separacin sencillo y usa el mismo amortiguador en los
tanques y en el gel, en un sistema discontinuo, un gel de poro grande y no restrictivo, llamado gel
de apiamiento, es colocado en la parte superior del gel de separacin, llamado gel de
resolucin. Cada gel est hecho con un amortiguador diferente, y el amortiguador de los tanques
es diferente al de los geles. La mayor ventaja de los sistemas de amortiguador discontinuos
sobre los continuos es que pueden agregarse volmenes relativamente grandes de muestras de
protena diluda a los geles sin comprometer la resolucin, esto se debe a que las protenas son
concentradas en zonas extremadamente estrechas durante su migracin en el gel de
apiamiento. La resolucin alcanzada con un sistema discontinuo es muy superior a la obtenida
con sistema continuo.
La justificacin terica de proceso electrofortico en los sistemas discontinuos ser discutida en
la sesin de laboratorio.
Geles de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se obtiene polimerizando monmeros de acrilamida
(CH2=CHCONH2) en cadenas largas y entrecruzndolas con un compuesto bifuncional como
N,N-metilenbisacrilamida ( CH2(NHCOCH=CH2)2, usualmente llamada bisacrilamida). La
polimerizacin es iniciada mediante la adicin de persulfato de amonio riboflavina, y se usa
N,N,N,N-tetrametilenetilendiamina (TEMED) como acelerador del proceso de polimerizacin.
Ambos iniciadores de polimerizacin generan radicales libres, el persulfato de amonio
espontneamente en solucin (enlace perxido), y la riboflavina mediante fotodescomposicion.
El tamao de poro efectivo de los geles de poliacrilamida depende inversamente de la
concentracin de acrilamida, y se usan geles con concentraciones de acrilamida desde 2.5%
(molculas con peso mayor de 106) hasta 30% (polipptidos con peso de ~2000). Para una
concentracin de monmero dada, las propiedades del gel varan con la proporcin de agente
entrecruzador usado, al aumentar ste el tamao de poro decrece, alcanzando un mnimo
cuando representa un 5% de la cantidad total de monmero.
pH
Los lmites prcticos de pH para realizar PAGE estn entre pH 3 y 10, ya que algunas reacciones
hidrolticas (como desaminacin) ocurren a pHs extremos. La eleccin del pH para PAGE
depende de dos consideraciones opuestas, a pHs cercanos al punto isoelctrico de las protenas
a separar, la diferencia de carga entre ellas es grande, aumentando la posibilidad de separacin,
sin embargo, al ser pequea la carga, los tiempos de corrido son largos, llevando a un aumento
en el ensanchamiento de banda. En SDS-PAGE los complejos polipptido-SDS estn
negativamente cargados en un rango amplio de pH, por lo tanto el pH no es crtico.
Marcaje de las bandas
Las bandas pueden ser evidenciadas mediante diferentes mtodos como tincin con colorantes,
revelado fotogrfico, autorradiografa con marcaje fluorescente. En la presente aplicacin se
usar marcaje con plata, mtodo altamente sensible y rpido. Las bandas de protena son fijadas
en la posicin final despus de la electroforesis precipitando las protenas con metanol y cido
actico, las bandas son sensibilizadas con tiosulfato de sodio, que mejora el contraste entre las
bandas teidas y el fondo del gel, posteriormente el gel se trata con nitrato de plata, los iones

40
plata se complejan con la proteina, y en un paso posterior, similar al revelado fotogrfico, los
iones plata complejados sufren una reduccin mucho mas rpida que los iones plata libres,
formando partculas coloidales de plata en las dos superficies del gel, preferencialmente sobre
las bandas de protena, hacindolas visibles. Los lmites de deteccin son del orden de ng de
proteina.
Electroforesis de protenas del suero humano
Las protenas presentes en el suero humano pueden agruparse en 4 fracciones dependiendo de
su mobilidad electrofortica: Albminas, alpha, beta y gamma globulinas. La mayora de las
alpha y beta globulinas son sintetizadas en el hgado, mientras que las gamma globulinas son
producidas por linfocitos y clulas plasmticas.
Las albminas del suero pertenecen a una familia multignica de protenas que conforman la
mayor fraccin de protenas solubles en el sistema circulatorio, estas desempean diversas
funciones fisiolgicas, como regulacin de la presin osmtica, transporte y distribucin de un
gran nmero de ligandos endgenos y exgenos que incluyen cidos grasos, aminocidos,
esteroides, metales como calcio, cobre y zinc y frmacos. Las alpha1 globulinas incluyen a-1antitripsina, a-1-antiquimotripsina y a-1-lipoprotena (LDH), entre otras. Entre las alpha2
globulinas estn la a-2-macroglobulina (inhibidor de proteasas), haptoglobulina (se une a
hemoglobina libre), protena C (inhibidor de factores de coagulacin), ceruloplasmina
(transportador de cobre) y a-2-lipoprotena (VLDL). Las beta1 globulinas incluyen
transferrina(capta hierro) y hemopexina. Las beta2 globulinas incluyen plasmingeno, b-2lipoprotena (LDL) y alguna proporcin de IgA. El fibringeno tambin migra en esta regin. Las
gamma globulinas consisten en las inmunoglobulinas IgM, IgA e IgG.
La electroforesis es usada para separar las globulinas de las albminas, ya que los niveles de
cada fraccin son de importancia en diagnstico clnico. La muestra preferida es el suero, ya que
el fibringeno contenido en el plasma a menudo obscurece cambios en los niveles de las beta y
gamma globulinas. Otras muestras usadas son el fluido peritoneal u orina.
Mediante la electroforesis pueden separarse y cuantificarse unas 100 protenas presentes en el
suero, los niveles obtenidos son tiles para diagnosticar gamopatas monoclonales (asociadas al
cncer), cirrosis, hepatitis autoinmune, artritis reumtica, osteomielitis, bronquitis, leishmaniosis,
lepra, leucemia, enfermedades inmunolgicas, SIDA, mielomas , desrdenes renales,
carcinomas, infecciones agudas, diabetes, embarazo, estrs, dao celular y desnutricin entre
otros estados clnicos.

MATERIALES Y EQUIPOS
Cmara de electroforesis
Fuente de voltaje
Enfriador a 4C
Solucin stock monmero (Acrilamida 29,2%, bisacrilamida 0,8%)
Amortiguador Tris-HCl 1,5M pH 8,8
Amortiguador Tris-HCl 0,5M pH 6,8
Amortiguador Trisbase-glicina pH 8,3 (5X)
Solucin stock SDS 10%
Persulfato de amonio al 10% (recin preparado)

41
TEMED
Amortiguador reductor para las muestras : SDS, 2-mercaptoetanol, Glicerol, Azul de
bromofenol, Amortiguador pH 6,8
Fijador A (Metanol 50%, cido actico 5%)
Fijador B (Metanol 50%)
Sensibilizador (Tiosulfato de sodio 0,02%)
Marcador (Nitrato de plata 0,1%)
Revelador (Formaldehdo 0,04%, carbonato de sodio 2%)
Enjuage (Acido actico 5%)
Agua desionizada

SECCIN EXPERIMENTAL

1.- Preparacin de reactivos:

a.

Acrilamida/bisacrilamida (30%, 0.8%):

29.2 g acrilamida
0.8 g bisacrilamida
Aforar hasta 100 mL con agua destilada.
Filtrar y guardar a 4 C en frasco mbar (30 das)

b.

Tris-base 1.5 M, pH 8.8

27.23 g de Tris-base en 80 mL de agua destilada.
Ajustar el pH a 8.8 con HCl 1N y aforar a 150 mL.
Guardar a 4 C

c.

Tris-base 0.5 M, pH 6.8

6 g Tris-base en 60 mL de agua destilada
Ajustar el pH a 6.8 con HCl 1N y aforar a 100 mL
Guardar a 4 C

d.

Sodio dodecilsulfato (SDS) 10%

10 g de SDS en 80 mL de agua destilada
Agitar suavemente hasta disolucin
Aforar a 100 mL
Guardar a temperatura ambiente

e.

Buffer Muestra:
Agua destilada
Tris-base 0.5 M, pH 6.8
Glicerol
SDS 10%
2--mercaptoetanol
Azul de bromofenol 0.05 %

4.0 mL
1.0 mL
0.8 mL
1.6 mL
0.4 mL
0.2 mL

42
Diluir la muestra con el buffer muestra en la proporcin 1:4, y calentar en bao a 100 C durante 4
minutos.
f.

Buffer electrodo 5X (Amortiguador de corrida):

Tris-base
15.0 g
Glicina
72.0 g
SDS
5.0 g

Disolver en agua destilada, aforar a 1 litro y guardar en refrigeracin. Calentar a 37 C si algo de

precipitacin ocurriera durante el almacenamiento.
Diluya 60 mL del buffer electrodo 5X con 240 mL de agua destilada para colocar en la cmara
electrofortica.
2. Preparacin del gel separador
El volumen total requerido para preparar un gel con espesor de 0.75 milmetros es de 4.2 mL.
Dejar polimerizar la mezcla durante 35 minutos en el soporte para preparar geles, con adicin de una
capa de 4 mm de butanol saturado con agua destilada.

Agua destilada

12%
2.3 mL

10%
2.85 mL

7.5%
3.40 mL

Tris-base 1.5 M, pH 8.8

1.8 mL

1.75 mL

1.75 mL

SDS 10%

70 uL

70 uL

70 uL

Acrilamida/Bis 30%

2.8 mL

2.3 mL

1.75 mL

TEMED

6 uL

6 uL

6 uL

Persulfato de amonio 10%

(preparado el mismo da)

24 uL

24 uL

24 uL

3. Preparacin del gel espaciador 4 %:

Agua destilada
Tris-base 0.5 M, pH 6.8
SDS 10%
Acrilamida/Bis 30%
TEMED
Persulfato de amonio 10%

2.9 mL
1.4 mL
50 uL
670 uL
6 uL
24 uL

43

Eliminar la capa de butanol del gel separador y agregar la mezcla del gel espaciador. Colocar el peine
sin dejar burbujas de aire y permitir la polimerizacin durante 35 minutos.

4.

Condiciones para la corrida:

a. Se puede cargar un mximo de 20 microgramos (20 g) de protena por pozo, para obtener una
resolucin ptima de las bandas.
b. El voltaje mximo recomendado para una corrida sin el problema de distorsin de bandas por
efecto del calor es de 200 v . La corrida completa dura de 40 a 50 minutos.

5. Proceso de revelado:
a. Sacar el gel de la cmara y con mucho cuidado pasarlo a una recipiente con 50 Ml de solucin
fijadora de metanol al 50% en agua destilada. Agitar suavemente por 30 minutos.
b. Decantar la solucin fijadora y agregar 50 ml de solucin de teir que contiene azul coomassie al
0.1%, disuelto en metanol al 40% y cido actico al 10%. Agitar suavemente durante 30 minutos.
c. Desteir mediante dos lavados con solucin de metanol al 40%, c. actico al 10%. 30 minutos de
agitacin por cada lavado.
d. Efectuar un ltimo lavado con etanol 50% durante 20 minutos.
6. Proceso de secado:
a. Colocar el gel entre dos capas de papel celofn previamente sumergido en agua por 15 minutos,
utilizando como soporte un vidrio cuadrado grueso. Procurar que no queden burbujas de aire
dentro del papel plstico, porque pueden daar el gel.
b. Fijar los extremos del papel celofn con prensas y dejar el vidrio inclinado para que escurra el
agua, durante 24 horas.
c. Despus de las 24 horas, retire las prensas y recorte el exceso de papel celofn.

Mtodo Alternativo para la Preparacin del gel

Precaucin: La acrilamida es un potente neurotxico de carcter acumulativo, sus soluciones
no deben pipetearse con la boca!. Para preparar el gel de resolucin mezcle 1,75ml de agua
desionizada, 1,25 ml de amortiguador pH 8,8 , 2,0 ml de solucin de monmero, 50 l solucin
de SDS, degasifique al vaco por 15 minutos y agrege 50ml de solucin de persulfato de amonio
y 5 l de TEMED. Vierta la solucin resultante al portaplacas como se discute en

44
ELECTROFORESIS VERTICAL, agregue cuidadosamente un poco de agua sobre la mezcla
anterior para evitar deshidratacin del gel y deje polimerizar por 40 minutos. Retire el agua, y
vierta en el portaplacas manteniendo el peine inclinado como se aconseja en
ELECTROFORESIS VERTICAL el gel de apiamiento preparado con 3,0ml de agua
desionizada, 1,25ml de amortiguador pH 6,8 , 0,67ml de solucin de monmero, 50 l de
solucin de SDS, 50 l de persulfato de amonio y 10 l de TEMED. Deje polimerizar por 40
minutos.
Preparacin de la muestra
La muestra de suero centrifugada y dializada (Opcional) se diluye hasta unas cuatro veces en el
amortiguador reductor y se calienta a 95C por 4 minutos.
Sembrado de la muestra y corrido de la electroforesis
Despus de armada la celda se agrega el amortiguador de corrido (vase ELECTROFORESIS
VERTICAL) y se siembran unos 4ml de muestra en cada reservorio, se tapa la celda y se hace el
corrido a 200V por 42 minutos.
Revelado de la placa
La placa se coloca en los siguientes baos por el tiempo especificado:
- Fijador A, 20min
- Fijador B, 10min
- Agua, 10min
- Sensibilizador, 1min
- Agua, 1min (2 veces)
- Marcador, 20min, 4C
- Agua, 1min (2 veces)
- Revelador. Se lleva a la intensidad deseada (Usar fondo blanco)
- Enjuage, 1min

PREGUNTAS
1. En electroforesis suelen preferirse los amortiguadores de baja fuerza inica, ya que
siendo menos conductores llevan la produccin de calor a un mnimo, esto es deseable
ya que el calentamiento suele distorsionar las bandas; sin embargo, la fuerza inica no
debe ser tan baja que precipiten las protenas. Afectar la fuerza inica del amortiguador
la separacin en condiciones desnaturalizantes? Y en condiciones no desnaturalizantes?
2. Por qu para asegurar la unin estequiomtrica del SDS a las protenas es necesario
reducir sus puentes disulfuro tratndolas con 2-mercaptoetanol?
3. Discuta la influencia del pH del gel de apiamiento sobre la calidad de las bandas. El
voltaje sobre el tiempo de corrido y la generacin de calor.
4. La cuantificacin de las bandas suele realizarse densitomtricamente. Consulte en qu
consiste el mtodo.

45

Visite el simulador que se encuentra en: http://www.rit.edu/%7Epac8612/Electro_Sim.html

REFERENCIAS
- Pginas con informacin introductoria a la tcnica.
http:/www.uct.ac.za/microbiology/sdspage.html
http://member.aol.com/neskander/Electro.html
- Manejo de la celda de electroforesis, receta del fabricante.
Bio-Rad. Mini-PROTEAN II Electrophoresis cell instruction manual

Hames, B. D. and Rickwoon, D. Gel electrophoresis of proteins. A practical approach.IRL press

Ltd. 1981
- Acerca de la tcnica usada para marcar las bandas.
Scherchenko, A. et al. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained
polyacrylamide gels. Analytical chemistry, Vol. 68, No. 5, 1996

46

Experimento 9.
Identificacin Cualitativa de Carbohidratos.

I. Objetivos:

1. Realizar pruebas qumicas para la identificacin de carbohidratos.

2. Estudiar algunas propiedades qumicas y fsicas de los carbohidratos.

II. Marco Terico:

Los carbohidratos son los constituyentes prominentes de reino vegetal, que tambin
forman parte de los animales, ya sea en estado libre o como componentes de ciertas
protenas, lpidos y otros compuestos. Se les llama carbohidratos porque contienen C, H
y O, encontrndose generalmente el Hidrgeno y el Oxgeno en una proporcin
semejante al agua.

Los carbohidratos se clasifican en monosacridos, oligosacridos y polisacridos de

acuerdo con el nmero de grupos simples que contengan. Los monosacridos como la
ribosa, fructosa, glucosa y galactosa son aquellos que no pueden ser hidrolizados para
dar molculas ms simples que sean catalogadas como carbohidratos. A su vez son
clasificados de acuerdo con el nmero de tomos de carbono que tienen en triosas,
penosas, hexosas, etc.
Los monosacridos son buenos agentes reductores, por lo que fcilmente reducen a los
reactivos de Benedit, Fehling, Tollens, etc. La glucosa y la fructosa son fermentadas por
la enzima zimasa de la levadura formndose alcohol etlico como producto principal.

Los disacridos (Oligosacridos) como la sacarosa, maltosa, lactosa son aquellas que al
ser hidrolizados liberan dos molculas de carbohidratos. La maltosa y la lactosa son
azcares reductores. Debido a que la molcula de sucrosa se forma mediante la unin

47
de grupo aldehdo de la glucosa con grupo cetnico de la fructosa, la sacarosa no es un
azcar reductor.

Los polisacridos son considerados polmeros, por estar formados por muchas unidades
de monosacridos. El almidn, el glucgeno y la celulosa son ejemplos de polisacridos.
La glucosa es la unidad monomrica de estos polisacridos por lo que es el producto
final de las respectivas hidrlisis. La hidrlisis del almidn se desarrolla por etapas
primero se forma dextrinas, luego maltosa y por ltimo glucosa como producto final de la
hidrlisis. Algunos polisacridos forman complejos con el yodo, cuyo color es tpico y
caracterstico para cada polisacrido.

Los carbohidratos experimentan una variedad de reacciones, las cuales permiten

desarrollar pruebas que se utilizan para detectarlos o para distinguirlos.
Entre estas pruebas se encuentran:
1. Prueba de Molish: Es una prueba general para carbohidratos. En presencia de
cidos no oxidantes, los carbohidratos experimentan deshidratacin y forman
furfural y sus derivados.

Estos productos se combinan luego con alfa naftol

sulfonato originando un color prpura.

2. Prueba de Benedict: Es una de las pruebas mas importantes para la
identificacin de azucares reductores. La prueba es positiva cuando el grupo
carbonilo se encuentra libre como en la glucosa y negativa cuando el grupo
carbonilo se encuentra combinado en unin glicosdica como en el caso de la
sacarosa y el almidn. En esta prueba la aparicin de un precipitado verdoso,
amarillo, anaranjado o rojo ladrido, significa que un azcar reductor esta presente.
3. Prueba de Yodo (Lugol): Es una prueba especfica para la identificacin de
polisacridos. La prueba es positiva cuando se obtiene un color azul intenso
cuando el carbohidrato reacciona con el lugol.
4. Prueba de Seliwanoff: Esta prueba se basa en la reaccin del resorcinol con el
4- hidroximetilfurfural, el cual es rpidamente producido a partir de las cetosas,
pero se obtiene en forma ms lenta en las aldohexosas. Puesto que la diferencia
entre lo dos grupos de azucares es una cuestin de velocidad de reaccin, la

48
rapidez con la cual aparece un color rojo, es importante para distinguir una prueba
positiva.
5. Prueba de Bials. Sirve para diferenciar las pentosas y las hexosas. Se basa
esta prueba en la formacin de productos de condensacin entre el furfural o el
hidroximetilfurfural y el orcinol, en presencia de iones frricos para dar un color
azul verdoso.

III. Materiales y Reactivos.

Reactivos: Soluciones de carbohidratos: glucosa, fructosa, ribosa, sacarosa al 1%,

Reactivo de Molish, Reactivo de Benedict, Reactivo de Seliwanoff, Reactivo de Bials,
cido sulfrico concentrado.

Materiales: Tubos de ensayo, gradillas, vasos qumicos 250 mL, 400 mL, probetas 10
mL, bao maria, plancha, vidrio reloj, goteros.
Muestras de: jugo de caa, agua de pipa, jugo de naranja, leche, papa nueva, papa
vieja.

49

IV. Procedimiento.
Pruebas
Molish

Benedict

Lugol

Seliwanoff

Bials

Coloque 1
mL de la
solucin a
ensayar en
un tubo de
ensayo

Agregue 5
gotas de la
solucin a
ensayar en
un tubo de
ensayo

En un
vidrio reloj
coloque 2
gotas de la
solucin a
ensayar

Coloque 2
mL del
reactivo de
Seliwanoff
en un tubo
de ensayo

Coloque 2
mL del
reactivo de
Bials en un
tubo de
ensayo

Adicione 7
gotas de
Molish en
el tubo

Adicione al
tubo 1.5
mL del
Reactivo
de Benedit

Coloque
sobre la
muestra 1
gota de
lugol.

Agregue al
tubo 3
gotas de la
solucin a
ensayar

Agregue al
tubo 1 mL
de la
solucin a
ensayar

Coloque
los tubos
en un bao
de agua
hirviendo

Observe si
hay cambio
de color

Caliente en
bao Maria
hasta la
aparicin
de un color
rojo
intenso.

Caliente en
bao Maria
hasta la
aparicin
de una
coloracin
azul
verdosa.

Agregue
por las
paredes del
tubo 20
gotas (poco
a poco) de
H2SO4
conc. No
agite el
tubo.
Coloque
los tubos
en la
gradilla y
espere
hasta que el
color
violeta se
desarrolle

Observe
cualquier
cambio de
color durante
el
calentamiento

50

V. Cuadro De Resultados:
Coloque el signo (+) cuando la reaccin es positiva y el signo ()

cuando es

negativa.

Cuadro 1: Identificacin de Carbohidratos.

Muestra

Molish

Benedict

Lugol

Seliwanoff

Bials

Glucosa
Fructosa
Ribosa
Sacarosa
Almidn
Agua de pipa
Jugo de caa
Jugo de naranja
Papa nueva
Papa vieja
Leche

VI Cuestionario:
1. Cual de los carbohidratos o muestras exhibe poder reductor?
2. Qu grupo qumico es responsable del poder reductor que tienen algunos
carbohidratos?
3. Cuales carbohidratos no tienen poder reductor?
4. Cual de los carbohidratos utilizados es clasificado como una cetosa?
5. De los azucares usados cuales son monosacridos y cuales son disacridos?
6. Que pentosa forma parte de la estructura de los cidos nucleicos?
7. Que indica una prueba de Benedit positiva.
8. Que indica una prueba de Lugol negativa

51

Experimento 10.
Aislamiento del Glucgeno.
I. Objetivos:
1. Extraer el glucgeno presente en una muestra de hgado de pollo.
2. Caracterizar mediante pruebas qumicas el glucgeno extrado.

II. Marco Terico:

El glucgeno es un polisacrido de la clula animal, que se encuentra en el hgado
(10%) y msculos (2%). La estructura del glucgeno y los polisacridos similares se
puede describir como una ramificacin en forma de abanico de molculas de
gucopiranosa, por medio de enlaces 1-6 en los puntos de ramificacin.
Estructura ramificada de glucgeno.

Presenta
ramificaciones cada 8-12 glucosas con una cadena muy larga (hasta 300.000 glucosas).
Se requiere dos enzimas para su hidrlisis (Glucogenofosforilasa) y alfa (1-6)
glucosidasas, dando lugar a unidades de glucosa. Dado que los seres vivos requieren
una parte constante de energa, una parte importante de metabolismo de los azucares
esta relacionado con los procesos de formacin de almidn y glucgeno y su posterior
degradacin.

52

III. Materiales y Reactivos.

Reactivos;
KOH al 50 %, Etanol al 95 %, Reactivo de Molish.
Materiales:
50 de hgado de pollo, cuchillo, 1 matraz erlenmeyer de 250 mL y 500 mL, probetas de
25 mL, 50 mL, 100 mL, bao maria, plancha, centrifugadora, vasos qumicos, tubos de
ensayo.
IV.Procedimiento.
Aislamiento del Glucgeno

Corte en trozos
pequeos 50 g de
hgado de pollo

Caliente en el
erlenmeyer de 250 mL
con mucha precaucin
y usando lentes de
seguridad 20.0 mL de
KOH al 50 %

Caliente en bao
mara durante 45 min.
Agite el matraz de ser
necesario

Despus del
calentamiento adicione
30 mL de agua.

Adicione 70 mL de
etanol. Agite
Adicione
inmediatamente los
trozos de hgado en el
erlenmeyer que contiene
el KOH

El floculado formado
es principalmente
glucogeno.
tape y deje reposar por
10 min.

Adicione la mezcla en
los tubos de
centrifugacin.

Centrifugue por 5
min. a velocidad
mxima

Recoja el
precipitado y ensaye
la prueba de Molish

53

V. Cuadro De Resultados:

Cuadro 1: Aislamiento del glucgeno.

Procedimiento

Observacin

54

Experimento 11.
ndice de Tolerancia de la Glucosa.
I. Objetivos:
1. Determinar el ndice de tolerancia de la glucosa en diversos estudiantes.

II. Marco Terico:

La Diabetes Millitus se caracteriza por la disminucin de la tolerancia a la glucosa
debida a la disminucin de la secrecin de insulina en respuesta a la carga de glucosa.
Esto se manifiesta por el aumento de la glucosa sanguneas (hiperglucemia) y por
glucosuria; puede acompaarse con cambios en el metabolismo de las grasas.

La

tolerancia a la glucosa disminuye en la diabetes tipo 1, en trastornos relacionados con

lesin heptica; en algunas infecciones; en la diabetes tipo 2 la cual frecuentemente se
acompaa de obesidad y aumento de las concentraciones plasmticas de cidos grasos
libres; tambin disminuye la tolerancia bajo la influencia de algunos frmacos; y algunas
veces en la arteriosclerosis.

Cabe esperar esta declinacin por la hiperactividad

hipofisaria o corticosuparrenal a consecuencia del antagonismo de las hormonas de

estas glndulas endocrinas a la accin de la insulina.

La insulina incrementa la tolerancia a la glucosa; su administracin disminuye el

contenido sanguneo de glucosa e incrementa la utilizacin y el almacenamiento
heptico de esta. Un exceso de insulina puede producir hipoglucemia intensa y esta
resultar en convulsiones e incluso la muerte, a menos que se administre glucosa de
inmediato.

En las insuficiencias hipofisaria y corticosuprarrenal se incrementa la

tolerancia a la glucosa debido a la disminucin del antagonismo de la accin de la

insulina a cargo de las hormonas secretadas normalmente por estas glndulas.

III. Materiales y Reactivos.

Medidor de glucosa

55

IV. Procedimiento.

1. Ingestin de una fuente de glucosa.

Seleccione un estudiante de ambos sexos los cuales deben presentarse en
ayuna.
Medir la glucosa sangunea en ayuna.
Tomar 200 cc de una bebida que contenga 50% de glucosa (ejm.
Gatorade al 50% en glucosa preparada en el laboratorio).
Medir cada media hora la glucosa sangunea durante dos horas.
Confeccionar un grfico de mg/dl de glucosa vs tiempo en horas para
evaluar el perfil glicmico.

2. Como medir la glucosa sangunea en el glucmetro:

Coloque 1 gota
de la muestra
en el
glucometro
Determine la
lectura de acuerdo
a las instrucciones

Realice el mismo
procedimiento con el
resto de las muestras

Preguntas:
1. Que es la intolerancia a la glucosa?
2. Defina glucosa posprandial
3. Qu es el ndice glicmico de los alimentos?
4. Investigue y confeccione una tabla sobre valores de ndice glicmico de los
alimentos.

56

Experimento 12.
Produccin de piruvato y acetaldehdo durante la
fermentacin de la glucosa por levadura

I. Objetivos:
1. Comprobar la produccin de piruvato en la fermentacin de la glucosa por levadura.
2. Comprobar la produccin de acetaldehdo en la fermentacin de la glucosa por
levadura.

II. Marco Terico:

La primera etapa del metabolismo de glucosa en levadura es la produccin de piruvato.
Este proceso, que se efecta mediante una serie de reacciones que involucran un
nmero considerable de intermediarios, se conoce como fermentacin o gliclisis. La
reaccin total podra considerarse como la transferencia de dos pares de tomos de
hidrogeno de la glucosa al NAD. Puesto que la coenzima se encuentra solo en
cantidades catalticas, es necesario reoxidarla para que el proceso no se suspenda, y
as, el NADH2 formado es reconvertido a NAD por oxigeno molecular a travs de la
cadena respiratoria. Esto no es posible en condiciones anaerobias y en este caso la
reoxidacin se efecta cuando el piruvato se convierte en acetaldehdo, y luego en
alcohol.

Los metabolitos de piruvato y acetaldehdo se encuentran presentes normalmente en

muy bajas concentraciones, por tanto, para demostrar su existencia como intermediarios
en el camino metablico, es necesario impedir que sean transformados en otros
compuestos.

Este procedimiento se usa mucho cuando se investigan caminos

metablicos y se hace bloqueando la enzima que cataliza la conversin del compuesto,

que se esta investigando mediante inhibidores.

Tambin se puede cambiar las

condiciones fisiolgicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo de

57
su actividad mxima, o se puede usar un agente que atrape el intermediario y que forme
un compuesto que no pueda metabolizarse.

La piruvatodescarboxilasa (2oxocido carboxi-liasa, 4.1.1.1) no es activa en soluciones

ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede
demostrarse por la reaccin con nitroprusiato de sodio o 2,4 Dinitrofenilhidracina.
En el segundo experimento se aade a la mezcla de incubacin sulfito de sodio, que
atrapa el acetaldehdo. La presencia de acetaldehdo puede demostrarse por el color
azul producido por la reaccin con nitroprusiato de sodio y piperidina.
Oxidacin Aerbica y Anaerbica de Glucosa en la Levadura

1/2 O2

H2O
Cadena respiratoria
aerbica

Gliclisis

2 NAD+ + C6H12O6

2NADH + H+ + 2CH3COCOOH
Pirvico
descarboxilasa

anaerbico
(Deshidrogenasa alcohlica)

2 C2H5OH

2 CH3CHO

CO2

III. Materiales y Reactivos.

Reactivos: Fosfato de sodio dibsico 0.5 M (Na2HPO4), Fosfato de potasio monobsico

0.5 M (KH2PO4), Suspensin de levadura en Na2HPO4, Suspensin de levadura en
KH2PO4, Suspensin de levadura en agua, Glucosa 10%, Nitroprusiato de sodio,

58
Hidrxido de amonio, Sulfato de amonio, Sulfito de sodio, Hidrxido de sodio,
Hidrocloruro de 2,4 Dinitrofenilhidracina, Piperidina, cido tricloroactico.

Materiales: Tubos de ensayo, Vasos qumicos, Probetas 10 mL, Centrifugadora,

Balanza, Pipetas 5 mL

IV. Procedimiento.

1. Preparacin de las soluciones de levadura:

o Pese por triplicado 2.5 g de levadura fresca y coloque en vasos de 200
mL
o Adicione al primero 25 mL de solucin de Na 2HPO4 0.5 M. Caliente por
dos minutos directamente en la plancha. (Solucin A)
o Adicione al segundo 25 mL de solucin de KH 2PO4 0.5 M. Caliente por
dos minutos. (Solucin B)
o Al tercer vaso, aada 25 mL de agua caliente. (Solucin C)

2. Formacin de piruvato

Tubo

Levadura

5 ml Sol. A 5 mL

Glucosa

5 ml Sol. B 5 mL

Agitar

Reposo

Acido TCA Centrifugar

Por

1 hora a 2 mL

inversin

37 C

3500 rpm

Por

1 hora a 2 mL

inversin

37 C

3500 rpm

min

min

o Decante los sobrenadantes de ambos tubos y aplique calor hasta ebullicin.

Utilice estos decantados para determinar el piruvato en la siguiente forma:

59
Tubo

Sobrenadante

Sulfato de

Nitroprusiato

Amoniaco

hervido

amonio

de sodio

concentrado

2 mL

1 gramo

5 gotas

1 gotero por las

paredes del tubo

2 mL

1 gramo

5 gotas

1 gotero por las

paredes del tubo

Si hay piruvato se formar un anillo de color azul o verde en la interfase de

los lquidos. Una coloracin rosada transitoria indica la presencia de grupos
tilicos, que puede aparecer antes del color azul o verde del piruvato.

3. Formacin del acetaldehdo:

Tubo

Levadura

Glucosa

Sulfito de

Agitar

Reposo

Centrifugar

Por

1 hora a

5 min a

inversin

37 C

3500 rpm

Por

1 hora a

5 min a

inversin

37 C

3500 rpm

sodio
1

5 ml Sol. C

5 mL

____

(en agua)
2

5 ml Sol. C 5 mL

0.5 gramos

(en agua)

o Separe el sobrenadante de cada tubo y selo para determinar el acetaldehdo

de la siguiente forma

Tubo

Sobrenadante

Nitroprusiato de sodio

Piperidina

2 mL

10 gotas

2 mL

2 mL

10 gotas

2 mL

Si hay acetaldehdo se observar una coloracin azul

60

V. Cuadro De Resultados:
Cuadro 1: Produccin de piruvato
Tubo

Observacin

A
B

Cuadro 2: Produccin de acetaldehdo.

Tubo

Observacin

C
D
Anote comentarios y posibles explicaciones en los resultados negativos.

Preguntas:
1. Que estrategias bsicas experimentales se utilizan para estudiar metabolitos?
2. Explique la funcin de cada reactivo en las diferentes pruebas
3. Describa la fermentacin alcohlica y la fermentacin lctica y qu organismos la
utilizan

61

Experimento 13.
Deshidrogenasa succnica del hgado
I. Objetivos:
o Detectar la actividad enzimtica de la deshidrogenasa susccnica en extractos de
hgado utilizando indicadores redox como aceptores artificiales de electrones
o Establecer qu sustancias pueden actuar como inhibidores de la deshidrogenasa
susccnica

2. Marco Terico
La deshidrogenasa succnica es una enzima especial de la mitocondria, porque participa en
dos procesos metablicos a la vez, el ciclo de Krebs y la cadena de transporte electrnico.
En el ciclo de Krebs, la enzima convierte el succinato en fumarato en presencia de FAD
como coenzima:
O

E
l

C
O

CH2
CH2

+ FAD
(unido a la enzima)

CH
HC

SUCCINATO

+ FADH2
(unido a la enzima)

C
O

2
,

FUMARATO

El 2,6-diclorofenolindofenol (DICPIP) y el azul de metileno resultan ser indicadores redox

apropiados para funcionar como aceptores artificiales de electrones y establecer la
actividad de la deshidrogenasa succnica en los homogenizados de tejidos. Se trata de
sustancias de color azul en su forma oxidada, que al aceptar tomos de hidrgenos del
sustrato originan la forma leuco, la cual es incolora. Con este cambio de color del indicador
redox se comprueba que la enzima est transformando el sustrato.

3.

Reactivos:
a) Solucin amortiguadora de fosfato monobsico de sodio 0.1M de pH 7.4: se
disuelven 1.38g de NaH2PO4 .H2O en 100 mL de agua destilada y se ajusta el pH a
7.4 mediante la adicin de hidrxido de sodio 0.1N

62
b) Solucin de 2,6-diclorofenolindofenol de al 0.02% en agua.
c) Solucin de azul de metileno al 0.02% acuoso (disuelva primero en 5 cc de alcohol
de 95%)
d) Solucin de malonato de sodio 0.1M .
e) Solucin de succinato de sodio 0.2M.
f) Solucin de azida de sodio 0.1M
g) Solucin de cianuro de sodio 0.1M
h) Hgado fresco.
i) Acetona
4. Procedimiento
Se corta una porcin apropiada de hgado fresco en trozos pequeos y se homogeniza en
una licuadora con 100 mL de agua. Luego se toman 40 mL del homogenizado y se diluyen
hasta 200mL con agua destilada. Se agita la mezcla vigorosamente y la preparacin
resultante se emplea en las siguientes pruebas. Esta etapa ser realizada por el grupo de
laboratorio entero (1).
A continuacin se disponen dos juegos de 6 tubos de centrfuga debidamente calibrados y
se les adicionan los reactivos en la forma como se indica a continuacin (1):
Rect
A
B
C
D
E
F
G
H

Solucin
Tubo:
ml de amortiguador
ml de sustrato
ml de agua destilada
ml de homogenizado
ml de indicador DICPIP o Azul de metileno
ml de malonato de sodio
ml de azida de sodio
ml de cianuro de sodio

1
0.5
0.0
1.0
1.0
1.0
-

2
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
-

3
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
-

4
0.5
0.5
0.0
1.0
1.0
0.5
-

5
0.5
0.5
0.0
1.0
1.0
0.5
-

6
0.5
0.5
0.0
1.0
1.0
0.5

Se debe dejar la adicin del homogenizado de ltimo. El homogenizado que se adiciona al

tubo 3 se deber calentar previamente la temperatura de 52C, por espacio de 15 minutos.
Se agitan todos los tubos y se ponen en un bao de agua a la temperatura de 37C por
espacio de 30 minutos. Observe en qu tiempo desaparece el color en los tubos. Si es
necesario, a los 30 minutos centrifugue a 3000 rpm por 3 minutos. Decante el lquido en
tubos de ensayo limpios. Observe y anote los cambios en cada tubo.
Preguntas:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

En qu tiempo desaparece el color en el tubo 2

Por qu no desaparece el color en los tubos 1 y 3
Presente las reacciones correspondientes en los tubos donde hubo actividad enzimtica
Clasifique los inhibidores como efectivo, parcialmente efectivo o no efectivo.
Investigue qu tipo de inhibidor es el malonato. Presente el esquema de inhibicin
Qu papel desempea la succinato deshidrogenasa en el Ciclo de Krebs y en la Cadena de
Transporte Electrnico?

63

Experimento 14.
Anlisis Cualitativo de Lpidos.
I. Objetivos:
1. Realizar pruebas qumicas para la identificacin de lpidos.
2. Estudiar algunas propiedades de los jabones.

II. Marco Terico:

Las grasas y aceites de animales y vegetales son esteres de glicerol esterificado con tres
molculas de cidos grasos. A estos esteres se le conoce como triglicridos. Al calentar
las grasas y aceites a altas temperaturas, se hidrolizan algunas molculas del triglicrido
liberando glicerol que se deshidrata posteriormente convirtiendo en acrolena. Por esta
razn la prueba de la acrolena se emplea para identificar al glicerol o para determinar si
una sustancia es un glicrido.

Los cidos grasos que forman parte de los glicridos pueden ser saturados o
insaturados, por lo que el grado de insaturacin de una grasa o aceite depende del
numero de cidos grasos insaturados presentes en el triglicrido. Las grasas y aceites
insaturados presentan dobles enlaces carbono-carbono por lo que absorben halgenos
como el yodo y bromo. La cantidad de halgeno que puede absorber un aceite o una
grasa es tpica y caracterstica para ese triglicrido y constituye una propiedad qumica
de la misma, la cual puede conocerse mediante la determinacin de su ndice de yodo.

La reaccin ms importante de las grasas y aceites, por ser esteres, es la hidrlisis. La

hidrlisis alcalina (llamada saponificacin) de una grasa produce glicerol y jabones. Los
jabones son sales de sodio o de potasio de los cidos orgnicos presentes en las
grasas. Los jabones reducen la tensin superficial de agua y tienen un gran poder
emulsivo, lo que explica su gran efectividad como agentes empleados para lavar y
limpiar. Los jabones son solubles en agua pero precipitan en presencia de soluciones
salinas. Los metales pesados como el Ca, Mg y Fe forman sales insolubles con los

64
cidos grasos, razn por la cual los jabones precipitan en aguas que contienen iones o
estos elementos (aguas duras).

III. Materiales y Reactivos.

Reactivos:
Etanol 95 %, Tetracloruro de carbono, cloroformo, Hidrxido de potasio 10 %, Etanol 50
%, Solucin saturada de cloruro de sodio, Cloruro de calcio 0.5 M, Sulfato de magnesio
0.5 M, Fenolftalena, Solucin de bromo en tetracloruro de carbono al 5 %, Aceite animal,
aceite vegetal, mantequilla, manteca.

Materiales:
Tubo de ensayo, Probeta 10 mL, 50 mL, Vasos qumicos, Plancha, Balanza, Policial,
Gotero.

IV. Procedimiento.

65
Identificacin de lpidos

Solubilidad de
Lpidos en diferentes
solventes

Preparacin de jabn

Pese en un erlenmeyer 15 g de
manteca o aceite.
Adicione 15 mL de KOH
En 4 tubos de ensayo
coloque una muestra
pequea de grasa o 5 gotas
de aceite

Coloque en tubos de
ensayo 20 gotas de agua
de bromo

Caliente la mezcla en bao mara

con agitacin constante por 45
min.

Al primer tubo adicione 3

mL de alcohol al 95 %
Al segundo tubo adicione
3 mL de cloroformo.

cidos grasos
saturados e
insaturados.

Mezcle en un vaso qumico 20 mL

de etanol con 20 mL de agua y
utilcela en caso que la mezcla
anterior se este secando.

Al tercer tubo adicione 3

mL ter
Al cuarto tubo adicione 3
mL de agua.
Anote sus resultados en
cada caso.

La saponificaron se ha completado
cuando el olor y los glbulos de grasa
estn ausentes. De no ser as caliente
por 15 min. mas.

Repita el mimo
procedimiento
cambiando de muestra

Agite la mezcla y virtala en 100 mL

de solucin saturada de cloruro de
sodio.

Adicione a cada tubo

las muestras de aceite
o grasa

Agite

Observe si la coloracin
del agua de bromo
permanece, es atenuada o
desaparece.

Agite y filtre la mezcla.

Jabones insolubles
Coloque 5 mL de jabn en dos tubos.
Adicione al primer tubo Cloruro de
calcio 0.5 M y al segundo Sulfato de
magnesio 0.5 M. Observe la
formacin de precipitado

Alcalinidad

Disuelva una porcin de jabn en 5

mL de agua, agregue 2 gotas de
fenolftalena. Observe la coloracin

66
V. Cuadro De Resultados:
Coloque el signo (+) cuando la reaccin es positiva y el signo () cuando es negativa.
Cuadro 1: Solubilidad de Lpidos en diferentes solventes
Muestra

Etanol

Tetracloruro

de Cloroformo Agua

ter Etlico

carbono
Aceite vegetal
Aceite animal
Manteca
Mantequilla
Aceite de oliva
lecitina
Cuadro 2: Preparacin de jabn
Procedimiento

Observacin

Cuadro 3: cidos grasos saturados e insaturados.

Coloque el signo (+) cuando la reaccin es positiva y el signo () cuando es negativa.
Muestra
Agua de Bromo
Aceite vegetal
Aceite animal
Manteca
Mantequilla
Aceite de oliva
Lecitina
VI. Cuestionario.
1. Cuales son los mejores disolventes de grasa y aceites.
2. Cuales son los productos de la saponificacin de las grasas o aceite.
3. Que son aguas duras.
4. Que nos indica la decoloracin de la solucin de bromo.
5. Que otra solucin de halgeno se emplea para determinar la insaturacin de las grasas y aceites.

67

Experimento 15.
Anlisis Cualitativo de sales biliares.
OBJETIVOS:
1. Aplicar algunos ensayos para la deteccin de pigmentos y sales biliares.
2. Reconocer las propiedades emulficantes de las sales biliares.

MARCO TERICO:
La bilis esta compuesta principalmente por sustancias de naturaleza lipidica. Sus
componentes mayoritarios son los pigmentos biliares (bilirrubina y biliberdina), sales
biliares y colesterol. El termino sales biliares se refiere a los cidos biliares (clicos y
quenodesoxiclico principalmente) derivados del colesterol, los cuales se conjugan en el
hgado con glicina y taurina para facilitar sus solubilizacin y poder cumplir con sus
funciones de emulsificacin. Al pH en que se encuentra la bilis los cidos se encuentran
en forma ionizada por lo que se les denomina sales biliares.

La bilis se esta formando continuamente en el hgado. La vesicular biliar, que es

un rgano unido al conducto heptico, almacena cierta cantidad de bilis que es ms
concentrada que la que proviene del hgado. La vesicular biliar descarga su contenido en
el intestino delgado cuando es estimulada por las hormona colecistoquinina
pancreozimina. La interrupcin de este proceso por el mal funcionamiento del hgado o
de la vescula, o por la obstruccin de algunos de los conductos de descarga, origina
una mala absorcin de los lpidos intestinales y de las vitaminas liposolubles tales como
la vitamina A y la K. Por otro lado, el cido litoclico (sin sal biliar) que se va acumulando
en ese estado anormal, es relativamente toxico Al hgado, lo cual contribuye a su
deterioro.

Funciones de la bilis:

1. Emulsificacin: Las sales biliares tienen la propiedad de disminuir enormemente la

tensin superficial. Esto les permite emulsionar las grasas en el intestino, con el

68
propsito de que las lipasas puedan catalizar la hidrlisis de estas a los
componentes de fcil absorcin.
2. Neutralizacin de cidos: Adems de las funciones digestivas antes mencionadas,
la bilis tiene la importante funcin de ayudar a neutralizar (ya que es ligeramente
bsica) el quimo cido del estomago, con el objetivo de preparar el pH optimo
para las dems enzimas digestivas.
3. Excrecin: La bilis es un vehculo importante para la excrecin de colesterol, pero
tambin elimina una gran cantidad de medicamentos,, toxinas, pigmentos biliares
e iones metlicos como el cobre, el zinc y el mercurio.
4. Solubilizacin del colesterol: La lecitina es el fosfolpido predominante en la bilis.
Es insoluble en los sistemas acuosos, pero se disuelve fcilmente en la bilis por
accin de las sales biliares, formndose miscelas.

Estas miscelas mixtas

hidrosolubles disuelven las grandes cantidades de colesterol presentes en la bilis,

permitiendo que este sea transportado normalmente hasta el intestino a travs de
los conductos biliares. En condiciones anormales, las proporciones relativas de
sal biliar, lecitina y colesterol pueden alterarse. Esto trae como consecuencia la
formacin de una bilis saturada de colesterol. Varios factores, como la infeccin,
sirven como medio de distribucin, haciendo que en la bilis sobresaturada
precipite el exceso de colesterol en forma de cristales. Si estos cristales no se
excretan rpidamente en el intestino, ellos crecern y formarn clculos.
5. Metabolismo de los pigmentos biliares: La hemoglobina, que proviene del recambio
diario de los eritrocitos es degradada secuencialmente en el organismo. Uno de
tales metabolitos es la bilirrubina, la cual es finalmente conjugada con cido
glucoronico principalmente, y excretada en la bilis para su posterior excrecin en
el intestino. En condiciones anormales, la concentracin de bilirrubina en la
sangre excede de 1 mg/100 mL, conduciendo al trastorno clnico conocido como
ictericia.

La bilirrubina es un pigmento amarillo con un mximo de absorcin a

50 nm, propiedad que se utiliza para medirla directamente en el suero. Sin embargo, los
carotenos tambin adsorben cerca de la misma longitud de onda, por lo que limitan

69
seriamente la medida espectofotomtrica de bilirrubina en suero de adultos. En sueros
de recin nacidos esta medida es de valor en casos de urgencia.

La bilirrubina es el pigmento mas abundante en la bilis humana y en la bilis de

cerdo. En soluciones concentradas, la bilirrubina es un pigmento de color amarillo rojizo.
La oxidacin progresiva de la bilirrubina resulta en la produccin de una serie de
pigmentos de varios colores bilifuccina, bilicianina, coletelina, etc.

Aunque no es normal encontrar bilirrubina en la orina los mtodo de ensayo (para

bilirrubina en la orina) se basan en la oxidacin de bilirrubina o biliberdina (verde) o
bilicianina (azul).

El mas antiguo ensayo es el de Gmelin, en donde el I 2 es el agente oxidante,.

como este mtodo es relativamente insensible, en la actualidad se utilizan ensayos
modificados de la prueba de Harrison, que utiliza el reactivo de Fouchet (FeCl3 al 1% en
cido tricloroacetico al 25%). En este caso, la adicin del reactivo a la orina ( quien
contiene BaCl2) produce un color verde y la concentracin de bilirrubina puede
determinarse espectrofotometricamente hasta concentraciones de 0.05 mg/ 100 mL. La
prueba de Gmelin para pigmentos biliares es un procedimiento modificado (modificacin
de Rosenbach), que se aplica al anlisis de laboratorio.

Se puede hacer un ensayo cualitativo de sales biliares con la prueba de

Pettenkofer. Esta prueba depende de la formacin de furfural a partir de la sacarosa por
la accin del H2SO4 concentrado. El furfural se condensa luego con los grupos fenolicos
de los cidos biliares.

Los cidos biliares son agentes que reducen la tensin superficial. En esto se basa
la prueba de Hay, para la bsqueda de cidos biliares y sus sales en la orina de
pacientes con algn desorden, como por ejemplo: la ictericia.

70
As entonces podemos hablar sobre el poder Emulsificacin de la bilis y nos
encontramos con otra posibilidad de ensayo.

Materiales y Reactivos.
Bilis vesicular de cerdo o de res, papel filtro, HNO3 concentrado, vidrio reloj, reactivo de
oxidacin, solucin de sacarosa al 5%, cido sulfrico concentrado, azufre en polvo,
aceita de oliva y tubos de ensayo.

PROCEDIMIENTO
a. Prueba de Gmelin: Filtrar uno o dos mililitros de bilis vesicular diluida.
Quitar el papel filtro del embudo y colocarlo invertido sobre la mesa.
Cuidadosamente colocar media gota de HNO3 concentrado sobre el vrtice
del cono. Doble el papel filtro y observar los crculos concentrados
coloreados que rodean al centro del papel filtro.
b. Prueba de Pettenkofer. A 2mL de bilis diluida aadir 5 gotas de solucin al
5% de sacarosa. Agregar una pequea porcin de esta mezcla sobre una
pequea cantidad de cido Sulfrico concentrado, de tal manera que se
formen dos capas. No agitar. La aparicin de un anillo rojo indica sales
biliares.
c. Prueba de Hay. Espolvorear un apequea cantidad de azufre sobre la bilis
diluida. Si el azufre se deposita en el fondo del tubo, hay presencia de
cidos biliares.
d. Poder de emulsificacin de la bilis: Aadir una gota de aceite de oliva a
3 mL de agua contenidos en cada uno de los tres tubos de ensayo. Aadir
5 gotas de bilis al tubo # 1; 5 gotas de solucin de sales biliares al tubo # 2
y 5 gotas de bilirrubina al tubo # 3. Agitar bien cada tubo. Observar cuando
se forma la emulsin en cada tubo.

Resultado:
1. Preparar tablas de resultados para los anlisis cualitativos realizados.

71
Cuestionario.
1. En que consiste la pruba de Liebermann Burchard para el colesterol.
2. Que otro ensayo o ensayos conocidos por usted es semejante a la prueba de
Pettenkofer. A que se aplica.
3. Investigar cuales son los efectos que ocasiona en los recin nacidos la
acumulacin de bilirrubina.

72

Experimento 16.
Ensayo enzimtico para la determinaron de colesterol
sanguneo.

I. Objetivos:
1. Determinar en una muestra de suero el contenido de colesterol.

II. Marco terico:

El colesterol es hidrolizado por la colesterol esterasa. El colesterol libre
es oxidado

a colest-4-en-3-ona por la colesterol oxidasa con la consiguiente

formacin de peroxido de hidrogeno el cual reacciona con el 4-aminoantipirina y

fenol en presencia de POD (peroxidasa) producindose, de esta forma un
cromgeno de quinonimina que tiene su mxima de absorbancia a 500 nm.
III. Materiales y reactivos:

Materiales y Reactivos
Vasos qumicos, plancha, micro pipetas, guantes,
Kit para la determinacin de colesterol.

IV: Procedimiento

Rotule 3 tubos de ensayo como, blanco, patrn y muestra.

Al primer tubo adicione 3 mL del reactivo y 30 L de agua.

Al segundo tubo adicione 3 mL del reactivo y 30

L del

patrn.

Al tercer tubo adicione 3 mL del reactivo y 30 L de muestra.

73

Incube los tubos por 5 minutos a 37 0 C o 20 minutos a

temperatura ambiente.

Realice las lecturas en el espectrofotmetro a 505 nm

Realice los clculos correspondientes.

Colesterol mg/L = Absorbancia de la muestra x Concentracin del patrn.

Absorbancia del patrn.

74

Experimento 17
Aislamiento del ADN en el bazo de cerdo
II.

Objetivos:

1. Extaer muestras del ADN presente en el bazo de credo.

III.

Marco terico:
Casi todas las clulas contienen ADN, pero la cantidad presente en algunos

tejidos es pequea y por lo tanto no son buen material para su extraccin.

Adems,

algunos tejidos contienen actividades altas de la enzima desoxiribonucleasa (Dnasa), la

cual fragmenta el ADN.

Una fuente adecuada para la extraccin de ADN debe, por lo

tanto, contener cantidades altas de este material y tener muy baja actividad de
desoxiribonucleasa.

El tejido linfoide muy bueno; el timo es la mejor fuente, pero el

bazo puede usarse con menos resultados.

El ADN se desnaturaliza fcilmente y debe trabajarse con cuidado para tener un

producto estructuralmente semejante al encontrado en la clula, debe evitarse la tensin
mecnica y condiciones fsicas y qumicas extremas y deben inhibirse las nucleasas.
Se puede agregar citrato de sodio para ligar Mg2+, los cuales son cofactores de las
Dnasa.

Aquellas etapas del procedimiento anterior a la separacin de las protenas

deben hacerse tan rpidamente como sea posible y en fro.

Las nucleoprotenas son solubles en agua y soluciones de alta concentracin

inica, pero son insolubles en soluciones de baja concentracin inica y esta propiedad
es usada en su extraccin. Primero el tejido homogenizado en solucin salina isotnica
amortiguada con citrato de sodio, pH 7, en la que se solubilizan la mayora de las otras
molculas mientras que las desoxiribonucleoprotenas permanecen insolubles pero
pueden solubilizarse luego en solucin salina 2 mol/L.

75
La protena se separa tratando la solucin con una mezcla de cloroformo / alcohol
amlico y el ADN se precipita con etanol. El producto se disuelve en amortiguador salino
diluido y se guarda congelado. De esta manera es estable por varios meses.

IV.

Materiales

Bazo de cerdo

Amortiguador salino (NaCl 0,15 mol/L amortiguador con citrato de sodio 0,015
mol/L, pH 7).

Cloruro de sodio 2 mol/L

Cloroformo / alcohol amlico (6:1).

Alcohol absoluto.

ter

Licuadora.

V. Procedimiento.

Picar en pedazos muy pequeos el bazo de cerdo y mezclar con

200ml de amortiguador salino durante un minuto.

Centrifugar la suspensin a mxima revolucin por 15 minutos.

Homogenice el precipitado con 200 ml de amortiguador salina.

Deseche el sobrenadante; combine y suspenda los sedimentos

con NaCl 2 mol/L hasta obtener un volumen final de 200 ml, en la
cual la mayora del material debe disolverse.

Remueva los sedimentos por centrifugacin durante 15 minutos.

Agite la solucin continuamente con un policial aadiendo al

mismo tiempo un volumen de agua destilada.

Envuelva el precipitado fibroso en el extremo del social y djela

secar en un vaso qumico por 30 minutos. Durante ese tiempo el

76
grumo se deshidratar parcialmente y el lquido remanente se
debe secar con papel filtro.

Disuelva la desoxiribonucleoprotena en aproximadamente 100 mL

de NaCl 2 mol/L.

Agregue un volumen igual de la mezcla de cloroformo / alcohol

amlico (6:1); homogenice por 30 minutos.

Centrifugue la emulsin a mxima revolucin durante 15 minutos y

recoja la capa superior acuosa (opalescente).

La recoleccin debe hacerse por succin cuidadosa en forma tal

que no se agite la protena presente en la interfase de los dos
lquidos.

Repita dos veces ms el tratamiento con solvente orgnico y

recoja el sobrenadante en un vaso qumico.

Precipite el ADN agitando lentamente el sobrenadante con dos

veces el volumen de alcohol (enfriado en un bao de hielo con
anterioridad) y rote el policial hasta que las fibras se enrollen.

Saque el policial y presione cuidadosamente el ADN fibras contra

las paredes del vaso de qumico para exprimir el solvente.

Lave finalmente el precipitado introduciendo el policial en una serie

de solventes exprimiendo el exceso en la forma descrita.

Los cuatro solventes utilizados son etanol al 70%, etano al 80%,

etano absoluto y ter.

77

Experimento 18

Aislamiento del ARN en levadura

I.

Objetivos:

1. Aislar muestras de ARN provenientes de levadura.

II.

Marco terico:
El ARN se distribuye por toda la clula, a diferencia del ARN que se encuentra

casi exclusivamente en el ncleo. La mayora del ARN se encuentra en el citoplasma

como ARN soluble y ARN ribosomal, pero aproximadamente el 10% se encuentra en el
ncleo y otro tanto se halla en las mitocondrias.

EL ARN de la levadura se obtiene

extrayendo un homogenizado de clulas con fenol al 90%.

La solucin de fenol rompe

los enlaces de hidrgeno en la macromolcula, causando desnaturalizacin de la

protena. La suspensin turbia se centrifuga y aparecen dos fases:

la fase inferior del

fenol contiene ARN. La protena desnaturalizada se encuentra en ambas fases y puede

removerse por centrifugacin en fro.

El ARN de la fase acuosa se precipita luego con

etanol. El producto obtenido no contiene ARN pero generalmente est contaminado con
polisacridos, por lo tanto se purificar tratando la preparacin con amilasa la cual se
encargar de hidrolizar a los carbohidratos presentes.

III.

Materiales:

Levadura seca y fresca.

Solucin de fenol al 90%

Acetato de potasio al 20% (pH 5)

Etanol al 95%

ter etlico.

78
IV.

Procedimiento

Disuelva 30g de levadura seca en 120 ml de agua a 37 C y

coloque la solucin en un bao a 37 C por 15 minutos.

Luego agregue 160 ml de solucin de fenol (tenga precaucin con

el fenol es muy corrosivo).

Agite la suspensin durante 30

minutos a temperatura ambiente (use un agitador magntico).

Luego enfre la solucin en bao de hielo (5 C) y proceda a

centrifugar por 5 minutos, para romper la emulsin.

Luego decante la capa superior acuosa con cuidado, enfrela en un

bao de hielo y centrifugue nuevamente durante 5 minutos, esto
ayudar a separar la protena desnaturalizada.

Agregue 12 ml de acetato de potasio fro al sobrenadante acuoso

del centrifugo, esto permite eliminar el ARN que haya quedado en
la fase acuosa.

Luego se precipita el ARN aadiendo dos volmenes de etanol.

Enfre la solucin en hielo y djela all por 1 hora.

Luego centrifugue por 5 minutos y recoja el precipitado.

Lave el precipitado que contiene ARN con 10 ml de una mezcla

etanol agua (3:1), luego con 10 de etanol y finalmente con 10 ml
de ter; deje secar al aire y pese la muestra obtenida.

Nota:

El contenido de ARN en levadura es alrededor de 4% de su peso seco.

Calcule el porcentaje de rendimiento de ARN obtenido.

Guarde su muestra para usarla en otro experimento.

Pruebas de Caracterizacin de los cidos Nucleicos:

Los cidos nucleicos son polianiones que poseen propiedades fsicas y qumicas
parecidas a las de las protenas.

Se disuelven en soluciones salinas diluidas, fijan

poderosamente los cationes polivalentes, en particular las protenas bsicas (como las

79
histonas y protaminas) y los detergentes catinicos con los que forman agregado o
precipitados. A semejanza de las protenas los polinucleridos pueden precipitarse por
efecto de soluciones salinas concentradas, (en particular sulfato de amonio) y por efecto
de alcoholes en presencia de sales. Sin embargo, son solubles en soluciones de cido
tricloroactico, lo que permite separarlos de las protenas.

La presencia de cidos nucleicos se puede evidenciar al hacer reaccionar las pentosas

que los componen con reactivos especficos.

En el caso de la desoxirribosa del ARN,

se logra un complejo de color azul verdoso, despus de hidrolizar en medio cido y

calor el polinucletido, y en presencia de Difenilamina. Por su parte la ribosa del ARN
reacciona con Orcinol para dar un complejo de color verde, aunque la desoxirribosa
tambin contribuye a la formacin de color.

V.

MATERIALES:

Solucin de cidos nucleicos 0.4 mg/ml.

Reactivo fresco de Difenilamina (disolver 3.0 g en 300 ml de c. actico glacial

y 8.25 ml de H2SO4 conc.)

Reactivo de Orcinol (disolver 2.5 g del reactivo en 250 ml del HCl conc.,
contenido 1.25 g de cloruro frrico hexahidrato); solucin saturada de sulfato
de amonio.

VI.

cido percldico 1M; TCA al 5% v/v.

PROCEDIMIENTO

Prepare tres tubos de ensayo y adicione las cantidades de reactivos que se indican:

a)

Precipitacin con sulfato de amonio:

Mezclar 1 ml de extracto de cido

nucleicos con 1 ml de solucin saturada de sulfato de amonio.

80
b)

Pruebas de Difenilamina:

0.5 ml de extracto de cido nucleico, ms 1.0 ml de

cido perclrico 1M y 2.0 ml del reactivo de difenilamina.

Calentar en bao de

agua hirviente por 15 minutos.

c)

Prueba de Orcionol:

0.5 ml del extracto de cidos nucleicos, ms 2 ml del

cido tricloroactico al 5% y 2 ml del reactivo de orcinol.

Calentar en bao de

agua hirviente por 10 minutos.

Nota: Para las pruebas b) y c), realice un control con agua destilada en lugar del
extracto de cido nucleico.

81

Experimento 19.
Anlisis de sangre
Agentes hemolticos
OBJETIVOS:
1.

Estudiar los efectos de los cambios en la presin osmtica del medio circundante
sobre los glbulos rojos.

2.

Estudiar diversos medios qumicos que producen hemlisis de los eritrocitos.

3.

Reconocer la importancia de los efectos osmticos en la administracin de

soluciones por va intravenosa.

Marco terico:
El eritrocito humano es una clula en forma de disco bicncavo que no posee ncleo y
con un dimetro de 6 a 9 micrmetros, y un grosor de aproximadamente 1 micrmetro en
el centro y de 2 a 2.5 micrmetros en la periferia. La membrana tiene un grosos de
aproximadamente 6 nanmetros, y sta compuesta de 49% de protenas, 44% de lpidos
y 7% de carbohidratos.

La principal funcin del eritrocito del eritrocito es transportar

oxgeno y CO. Para ello, el eritrocito posee una solucin de hemoglobina al 34%. El
eritrocito de mamferos adultos tiene un metabolismo respiratorio relativamente bajo y es
una de las pocas clulas importantes del cuerpo con un lapso de vida de tiempo
establecido, 126 7 das en el hombre.

El eritrocito se comporta como un osmmetro, ya que se hincha o se contrae con un

descenso o aumento de la presin osmtica del fluido circundante. En una solucin
suficiente hipotnica, el glbulo rojo se hincha, se rompe la membrana celular y ocurre el
fenmeno conocido como hemlisis.

La hemlisis puede ser provocada en un medio isotnico por varios agentes, tales como
jabones y detergentes y cloroformo. Virtualmente todos los constituyentes en el eritrocito

82
humano estn en solucin y despus de ocurrir la hemlisis se difunden al medio,
dejando un residuo insoluble o fortasma que representa la membrana original.

Como mencionamos anteriormente, el eritrocito obtienen su energa principalmente por

gluclisis anaerobia, una de las vas ms importantes en el metabolismo de
carbohidratos. Trastornos en le metabolismo de carbohidratos del eritrocito es causa de
hemlisis.

Existen varios factores:

1.

Lesiones a la membrana celular cuando se oxidan los grupos sulfihidrilos. Esto

puede ser causado por el H2O2 y otros agentes oxidantes, tanto endgenos como
exgenos.

2.

La interrupcin de caminos metablicos normales en el interior de la clula, ya sea

por la presencia de inhibidores, deficiencia de una coenzima o deficiencia
enzimtica.

3.

La degradacin de la hemoglobina (Hb) y el desplazamiento del equilibrio entre la

oxihemoglobina y la metahemoglobina, el cual puede ser inducido por una carencia
de ADN, o de la enzima glutain peroxidasa que requiere glutatin reducido para
degradar H2O2.

4.

Lesiones bioqumicas en la sntesis de glutacin reducido.

5.

Una deficiencia de riboflavina (vitamina B12) conduce a una disminucin en la

actividad de la glutacin reductasa, la cual es una flavoprotena.

6.

La deficiencia en la produccin de NBADPH (poder reductor), una coenzima

necesaria para la produccin del glutatin.

La hemlisis excesiva es causa de una serie de trastornos. En el hgado se presentar

una cantidad de bilirrubina mucho mayor que lo normal.

Si el hgado trabaja

normalmente, el aumento es controlado sin provocar ningn dao de importancia.

Como la bilirrubina circulante aumenta, se establece un nuevo equilibrio a travs de la
membrana del hepatocito. Sin tomar cuenta la destruccin de los eritrocitos, esto se
conoce como ictericia hemoltica.

83

Materiales y reactivos:
Solucin de NaCl al 2% agua destilada, solucin saturada de jabn, cloroformo, solucin
de saponina, etanol, tubos de ensayo.

Procedimiento
2.

Hemlisis por efecto osmtico:

En 4 tubos de ensayo preparar las siguientes

mezclas.
Tubo N

mL de agua

mL de NaCl al 2%

Conc. Final (%NaCl)

10

0.0

7.5

2.5

0.5

5.5

4.5

0.9

3.5

6.5

1.3

Agitar bien cada y a cada uno agregar 2 gotas de glbulos rojos lavados.
nuevo y dejar sedimentar la muestra por una hora.

Agitar de

Observar el grado de hemlisis en

los tubos, de acuerdo con la intensidad del color rojo del lquido sobrenadante.

3.

Hemlisis por agentes qumicos:

A 10 mL de NaCl al 0.9, colocados en cada

uno de los 5 tubos de ensayo, aadir 2 gotas de sangre. Conservar uno de los
tubos como control y a los otros cuatro aadirles respectivamente, 2 gotas de una
solucin saturada de jabn, 2 gotas de cloroformo, 2 gotas de solucin de saponina
y 2 gotas de alcohol.

Agitar repetidamente y dejar la solucin en reposo por 15

minutos. Observar los tubos y comprelos con el control.

Resultados:
1.

En base a los resultados Cul es la resistencia osmtica mnima de los

corpsculos?

2.

Analizar cada tubo en la prctica N 2 y explicar el efecto de cada agente qumico.

Explicar en cules tubos se produjo hemlisis y por qu?

84

EXPERIMENTO 20
Determinacin del cido Ascrbico usando 2,6-diclorofenolindofenol

Objetivo:
1. Determinar el contenido de vitamina C en muestras naturales.

Marco terico:
Las vitaminas son factores alimenticios, accesorios para mantener una buena salud
y su ausencia de la dieta produce enfermedades por deficiencia. Por ejemplo, la falta de
vitamina C (cido Ascrbico) produce escorbuto y la ausencia de vitamina B1 (tiamina)
origina beri-beri.

Las hormonas son mensajeros qumicos producidos en las glndulas endocrinas y

que son transportados a los tejidos blancos donde actan produciendo cambios
bioqumicos y fisiolgicos profundos en el organismo.

Estos dos grupos de compuestos se consideran en conjunto puesto que solo se

necesitan pequeas cantidades para producir grandes cambios bioqumicos o
fisiolgicos. Adems, de esto, las vitaminas y las hormonas tienen estructura qumica
diversa y participan en una gran cantidad de actividades metablicas.

En este laboratorio se determinar la cantidad de vitamina C presente en una

muestra natural, en el cual el cido ascrbico es oxidado por el colorante 2,6
diclorofenolindofenol a cido dehidroascorbico. Al mismo tiempo, el colorante se reduce
a un compuesto incoloro permitiendo determinar fcilmente el punto final de la reaccin.

Adems, del cido ascrbico otros compuestos pueden decolorar el pigmento, pero
la especificidad puede aumentarse hasta cierto punto efectuando la reaccin en solucin
cida en la cual las sustancias que interfieren reaccionan muy lentamente.

85
El 2,6 diclorofenolindofenol se obtiene comercialmente en forma de tabletas y cada
una es equivalente a 1 mg de cido ascrbico.

Iii. Materiales y reactivos:

Solucin de 2,6 diclorofenolindofenol (muela 1 tableta en aproximadamente 40 mL de
agua caliente, enfre y diluya hasta 50 mL: filtre la solucin si es necesario).
Solucin patrn de cido ascrbico (20 mg/L, preprese inmediatamente antes de
usarse).
cido actico glacial.
Jugos de frutas (jugo de limn, jugo de mora, otros).
Buretas 10 mL.
Cloroformo.

Iv. Procedimiento
1 Para soluciones incoloras

En un tubo resistente al calor pipetee 5 mL de jugo de fruta diluido

que contenga aproximadamente 0.1 mg de vitamina C.

Agregue 1 mL de cido actico glacial y titule con la solucin de

colorante hasta obtener un color rosa estable.

Anote el volumen usado para la titulacin (t).

Repita la titulacin usando para el blanco 5 mL de agua (Bl) y 5 mL

de solucin patrn de cido ascrbico (Pt) y calcule el contenido de
vitamina C en la muestra.

Vitamina C en la muestra = (mg/100 mL) = T Bl x 2 x dilucin.

Pt Bl

86
2.

Para soluciones coloreadas.

a. Es difcil ver el punto final cuando la muestra es muy coloreada, por lo
tanto, debe agregarse cloroformo a la muestra de reaccin y el punto final
se logra cuando se obtiene un color rosa estable en la fase orgnica. La
muestra y el blanco se tratan en forma idntica y el contenido de vitamina C
se calcula como se indico anteriormente.

87

EXPERIMENTO 21
Anlisis de la orina I
Constituyentes normales de la orina
I.

Objetivos:

1. Estudiar las caractersticas de una muestra de orina normal.

2. Identificar los componentes orgnicos e inorgnicos de una muestra de orina
normal.

II.

MARCO TERICO:

El lquido extracelular constituye el medio interno de las clulas del organismo. En este
medio llevan a cabo sus actividades vitales.

Puesto que los cambios del lquido

extracelular necesariamente reflejan cambios en el lquido intracelular y por tanto

tambin en el funcionamiento de las clulas, es esencial para las funciones normales de
las mismas, que la composicin de este lquido se mantenga relativamente constante.

Este medio interno es regulado principalmente por dos pares de rganos: a) los
pulmones, los cuales regulan las concentraciones de oxgeno y CO 2; y b) los riones,
que mantienen la composicin qumica ptima de los lquidos del cuerpo. El rin es un
rgano que no solamente elimina los residuos metablicos, sino que de hecho lleva a
cabo funciones homeostticas de la mayor importancia.

Los riones tiene como

funciones principales: la filtracin del plasma sanguneo por los glomrulos del rin; la
reabsorcin selectiva por los tbulos, de sustancias como las sales, el agua, los
azcares simples y los aminocidos, que son necesarios para mantener el medio interno
o contribuir a los procesos metablicos y la secrecin por los tbulos de sustancias de la
sangre que pasan a la luz de aquellos para su excrecin. Este ltimo proceso incluye la
manipulacin de potasio, cido rico, aniones orgnicos e hidrogeniones.

Las caractersticas de la orina normal son las siguientes:

88

Volumen: En el adulto normal se forman diariamente de 600 a 2,500 mL de orina.

Densidad:

Normalmente flucta entre 1.003 y 1.030, variando de acuerdo a la

concentracin de solutos.

pH: La orina normal es ligeramente cida (pH: 6, que flucta entre 4,0 y 8,0).

Color: Es amarillo claro a ambarino. Vara con la cantidad y concentracin de la

orina excretada. El principal pigmento de la orina es el urocromo, pero tambin
estn la urobilina y la hematoporfirina que pueden proveerle color.

La orina es

generalmente transparente, pero en las orinas alcalinas pueden proveerle color.

La orina es generalmente transparente, pero en las orinas alcalinas puede
desarrollarse una turbidez por la precipitacin de fosfato de calcio.

Una orina

fuertemente cida precipita las sales del cido rico, las cuales tienen un color
rosado.

Olor:

La orina fresca tiene olor aromtico modificado por diversas sustancias de

la dieta. En las cetosis puede apreciarse olor a acetona.

Constituyentes Normales:
1.

Urea:

Es el principal producto final del metabolismo de las protenas en los

mamferos.

Su excrecin est directamente relacionada con la ingestin de

protenas. Normalmente constituye el 80-90% del nitrgeno urinario total.

La excrecin de urea aumenta con la fiebre, diabetes o un exceso de actividad de
la corteza suprarrenal. En la acidosis se da una disminucin de la urea, pues parte
del nitrgeno que de otra manera se convertira en urea, se utiliza en la formacin
de amonaco. La urea sin embargo, no produce NH directamente.

2.

Amonaco:

Existe un poco en la orina recin excretada normal.

3.

Creatina y Creatinina:

La creatina es sintetizada en el hgado y sirve como

fuente de energa en los tejidos, especialmente en el tejido muscular.

La

creatinina es el producto de la desintegracin de la creatina. A su vez, la creatinina

es un indicador importante de la funcin renal.

Adems, ella es una sustancia

89
endgena que puede ser medida tanto en la sangre como en la orina.

La

creatinina, es filtrada en el rin y no es reabsorbida. La concentracin en la

sangre es filtrada en el rin y no es reabsorbida. La concentracin de creatinina
en la sangre es independiente de la dieta pero si es dependiente de la masa
muscular. Por lo tanto, la creatinina es generalmente ms alta en los hombres que
en las mujeres.

4.

cido rico:

Es el producto final ms importante de la oxidacin de las purinas

en el organismo. Se forma a partir no slo de las nucleprotenas de la dieta, sino

tambin de la desintegracin de las nucleoprotenas celulares en el cuerpo.

El

cido rico es ligeramente soluble en lcalis, por esto se precipita fcilmente en las
orinas cidas si se les deja en reposo.

La excrecin de cido rico aumenta en la leucemia, en enfermedades hepticas

graves y en varias etapas de la gota.

5.

Aminocidos:

En los adultos se excretan aproximadamente de 150 a 200g de

nitrgeno de los aminocidos por la orina en 24 horas.

Algunos desrdenes congnitos envuelven defectos en la reabsorcin tubular de

aminocidos dando como resultado en una aminoacioduria. En el siguiente cuadro
se muestran cantidades de aminocidos libres, encontrados en la orina de hombres
normales.
Aminocido

Nios

Adultos (moles/24h)

Alanina

438

225

Aarginina

26

26

cido Asprtico

---

145

Cistina

100

45

Glicina

1280

2600

Histidina

1110

1300

Isoleucina

54

40

90
Leucina

76

75

Lisina

506

224

Metionina

94

38

Fenilalanina

103

90

Serina

543

770

Prolina

---

22

Tritfano

---

125

Tirosina

166

167

Valina

43

37

6.

Alantona:

7.

Aniones:
a.

Se deriva de la oxidacin parcial del cido rico.

Cloruros:

Se excretan principalmente bajo la forma de NACl. Debido a

que la mayora de los cloruros son de origen diettico, la excrecin vara

considerablemente segn la ingestin de ellos.
b.

Sulfatos:

El azufre de la orina principalmente de las protenas, pues en

las molculas proteicas existen aminocidos que contienen azufre como la

metionina y la cistina.
c.

Fosfatos:

Los fosfatos de la orina son combinacin de sulfato de sodio y

de potasio (fosfatos alcalinos), as como de calcio y magnesio. La dieta y

su contenido proteico influyen sobre la excrecin de fosfatos. En ciertas
enfermedades seas como la osteomalacia se encuentra la excrecin de
fsforo en la orina. En ocasiones se nota una disminucin en la excrecin
de fsforo en la orina.

En ocasiones se nota una disminucin en la

excrecin de fsforo en la orina. En ocasiones se nota una disminucin en

la excrecin de fsforo en las enfermedades infecciosas, en el
hiperparatiriodismo y en las enfermedades renales.
d.

Oxalatos:

Generalmente la cantidad de oxalatos en la orina es muy

poca, pero en una enfermedad hereditaria (hiperoxaluria primaria) pueden

excretarse grandes cantidades de oxalatos.

91

8.

Minerales: El contenido de sodio vara considerablemente con la ingestin y con

los requerimientos funcionales. El potasio de la orina se lleva cuando aumenta la
ingestin o en presencia de un catabolismo celular excesivo.

La mayor parte del calcio y del magnesio se pierde del cuerpo a travs del
intestino, representando el mineral no absorbido; el contenido de estos elementos
patolgicos, especialmente los que afectan el metabolismo de los huesos.

9.

Indican: Es la sal potsica del cido indosilsulfrico. Su presencia en la orina es

el resultado de la coaccin bacteriana sobre el triptfano dando lugar al indol, el
cual se oxida en el hgado a Indoxilo; ste se esterifica luego con SO 42-.

Su

excrecin es de 5 a 25mg/24horas.

10.

Componentes en Trazas:

Generalmente es el Cu, Zn, Co, F, Mn, I Hg, vitaminas

hidrosolubles, hormonas peptdicas hipofisiarias y gonadotropina corinica en la

orina del embarazo.

PARTE EXPERIMENTAL:
MATERIALES Y REACTIVOS:
cido ntrico diluido, solucin de AgNO3 al 1%, cido clorhdrico diluido, solucin de
cloruro de bario, solucin de NaOH, cido actico diluido, solucin saturada de oxalato
de amonio, fenolftalena, solucin de ureasa, solucin saturada de carbonato de potasio,
reactivo de Obermayer, cloroformo.

PROCEDIMIENTO:
1.

Examinar el volumen, color, pH y gravedad especfica de una muestra de orina.

Realizar luego las siguientes pruebas.

92
2.

Prueba de Cloruros:

Acidificar una porcin de la muestra de orina con HNO 3 y

aadir gota a gota una solucin de AgNO3.

Un precipitado blanco indica la

presencia de cloruros (bromuros o yoduros).

3.

Prueba para Sulfatos:

Acidificar una porcin de la muestra con HCl y aadir

gota a gota una solucin de BaCl2.

Un precipitado blanco indica la presencia de

sulfatos.
4.

Prueba para iones Calcio: Hacer ligeramente alcalina una porcin de la muestra,
usando para ello una solucin de NaOH, luego hacer ligeramente cida con
solucin de cido actico y aadir luego unas gotas de la solucin saturada de
oxalato de amonio. Un precipitado blanco indica la presencia de iones calcio.

5.

Reaccin de Obermayer para el Indican:

A 5mL de orina aadir 5mL del

reactivo de Obermayer y tambin 3mL de cloroformo.

Colocar la yema del dedo

sobre la boca del tubo e invertir ste varias veces para permitir que el cloroformo
extraiga el azul de ndigo, que se ha producido por la oxidacin del indican
presente.
6.

Prueba para Identificar Creatinina:

Adicionar 5mL de orina en un tubo de

ensayo, agregar 5 gotas de solucin de nitroprusiato de sodio 0.1M. Aadir gota a

gota NaOH 0.1M hasta que se torne rojo. Acidificar con cido actico glacial (tenga
mucho cuidado con este reactivo).

Calentar por un minuto.

Al final deber

aparecer un color verde que despus cambiar a azul.

7.

Prueba para identificar creatinina usando cido Pcrico:

Color 5mL de orina

en un tubo ensayo y en otro colocar 5mL de agua. Adicionar a cada tubo 1mL de
la solucin saturada de cido pcrico y 1mL de NaOH 2M. Observar en el tubo que
contiene la orina la formacin de picrato de creatinina de color rojo.
8.

Prueba para identificar Fosfatos:

Adicionar 10mL de orina y agregar NH 4OH

diluido (1:10) hasta que la solucin se torne alcalina. Verificar con papel tornasol o
cualquier otro que marque el pH. Calentar suavemente y observar la formacin de
un precipitado que indica la presencia de fosfatos.
Filtrar, guardar el precipitado y el filtrado. Al filtrado adicionar 3mL de la mixtura
magnesiana.

Calentar suavemente.

magnesio y amonio.

Observar la formacin de fosfato de

93
9.

Prueba para determinar el cido rico:

Diluir 3mL de orina con 2mL de agua

luego aadir 2mL de una solucin saturada de carbonato de sodio. Agitar bien.
Agregar 2mL de la solucin de cido fosfatngstico. Observar si se forma un color
azul.
RESULTADOS:
Explicar los resultados obtenidos con cada ensayo. Escribir las ecuaciones para explicar
la formacin del indican en el organismo y del color azul en el tubo.

94

Experimento 22
Anlisis de la orina II
Orina patolgica

I OBJETIVOS:
2.

Analizar una muestra de orina patolgica mediante ensayos sencillos.

3.

Aplicar ensayos conocidos a la determinacin de compuestos anormales en la

orina.

II. MARCO TERICO:

La presencia de una cantidad anormal de azcar reductor en la orina se denomina

glicosuria. Este es un trmino genrico, independiente del carbohidrato especfico se
emplean los siguientes trminos: glucosuria para referirse a la excrecin de cantidades
anormales de glucosa, fructosuria para referirse a la excrecin anormal de fructosa,
etc

Glucosuria: La orina normal recin excretada contiene entre 10 y 20mg de glucosa por
100mL. Cantidad no usuales pueden darse luego de las anestesias, asfixia y estados
emocionales.

Aproximadamente el 25% de las personas con hipertiroidismo severo

presentan glucosuria; la glucosuria renal se observa en individuos con algn problema

en la funcin tubular renal. Sin embargo, la causa ms comn de glucosuria es la
diabetes mellitas, la orina de pacientes diabticos puede variar entre 0.5-12% de
glucosa.

Pentosuria:

La pentosuria alimentara se da luego de comer grandes cantidades de

frutas o jugos de frutas.

Hay un sndrome gentico relacionado que se denomina

pentosuria idioptica en el que la L-xilosa se excreta en la orina debido a la falta de la

enzima L-xilulosa deshidrogenada.

95
Lactosuria:

Durante el periodo de lactancia, las madres presentan una excresin

moderada de lactosa pero raras veces se da durante el embarazo (15% de los casos).

Galactosuria:

La galactosuria es una consecuencia de la galactosamia, un defecto

familiar raro, generalmente detectable en la infancia temprana.

Fructosuria:

Raramente aparece fructosa en la orina. Su presencia en ella puede

deberse a un defecto metablico heptico que puede ser hereditario.

La orina normal contienen trazas slo de protenas (albmina srica y globulinas),

glicoprotenas del tracto genitounitario y mucoprotenas.
clnicas usuales dan resultados negativos.

Sin embargo, las pruebas

Cuando se dan cantidades anormales de

protenas en la orina, se dice que hay proteinuria, siendo la protena principal, la

albmina srica. La causa ms comn de proteinuria es la enfermedad renal, como la
glomerulonefritis aguda y toximia del embarazo.

La albuminuria se da tambin por fiebre, anemia, falla cardiaca congestiva, enfermedad

en el hgado, etc

Adems de los azcares y protenas pueden darse otros compuestos en forma anormal
en la orina, cuando sus concentraciones plasmticas se presentan elevadas.

Entre

stos estn los cuerpos cetnicos, es decir el cido aceto actico, -hidroxibuttico y la
acetona, que aparecen durante una condicin conocida como cetosis. Tambin puede
haber bilirrubina en la orina si se padece de una ictericia hepatocelular u obstruiva,
urobilingeno en enfermedades hemolticas.

La orina normal contiene pequeas cantidad de porfirinas (aprox. 300 g/da).

La

excrecin puede aumentar de 10 a 20 veces en enfermedades del hgado y anemia

perniciosa.

96
La porfiria congnita es un desorden hereditario caracterizado por una sobreproduccin
de porfirinas tipo I.

La porfiria aguda se caracteriza por la excrecin de grandes

cantidades de uroporfirina III y coproporfirina III.

La excrecin de coproporfirina III se

observa en el envenenamiento por plomo.

La sangre puede presentarse en la orina en casos de nefritis. Cuando sta se encuentra

en la sangre se dice en forma general que hay hematuria. Tambin en casos de
traumatismo del sistema urinario. Adems, se puede encontrar hemoglobina libre en la
orina (hemoglobinuria) despus de una hemlisis rpida (ruptura de glbulos) , por
ejemplo en los casos de fiebre por aguas negras (una complicacin del paludismo) o
despus de quemaduras graves.

MATERIAL Y REACTIVO:
Orina patolgica, reactivo de Benedict, cido al 2%, solucin de nitroprusiato de sodio al
5%, cido ntrico concentrado, H2O2

al 3%, azufre en polvo, (NH4)2SO4 NH4OH

concentrado y bencidina.

PROCEDIMIENTO
1.

Presencia de carbohidratos en una muestra de orina patolgica:

A 5mL de

reactivo de Benedict para anlisis cualitativo un tubo de ensayo, agregar 8 gotas

de orina libre de protena. Hervir por medio minuto o colocar en un bao de agua
hirviendo por 5 minutos y luego dejarlo enfriar.

El grado de reduccin depende de la cantidad de azcar presente en la muestra,

por lo cual se pueden obtener resultados que van desde la coloracin verdosa
hasta la formacin de un precipitado de color rojo.

2.

Presencia de protenas en una muestra de orina patolgica: Calentar 5mL de

orina clara hasta la ebullicin.

La formacin de un precipitado se debe a la

coagulacin de las protenas presentes. Aadir 5 gotas de cidos actico al 2%

97
desaparece el precipitado al aadir el cido?

Si se disuelve entonces la

precipitacin se debi a la presencia de fosfatos y no a las protenas.

Debe

evitarse la adicin de un exceso de cido.

3.

Prueba para detectar sangre en la orina patolgica:

Color 3mL de orina

patolgica en un tubo de ensayo y en otro tubo 3mL de orina normal. Adicionar a

cada tubo 3mL de la solucin saturada de bencidina y 1 mL de perxido de
hidrgeno al 3%.

Observar si se forma un color azul o verde que nos indica la

presencia de sangre.

4.

Deteccin de pigmentos biliares en la orina patolgica:

Humedecer con la

orina un filtro, el cual se ha colocado previamente en un embudo. Colocar una

gota de HNO3 concentrado en el vrtice del papel y observar los cambios de color
que ocurren, iguales a los que se dan en la prueba de Gmelin.

5.

Presencia de sales biliares (Prueba de Hay):

Espolvorear un poco de flor de

azufre sobre la superficie de 10mL de orina patolgica colocada en un vaso

qumico de 50mL. La orina no debe contener ni tulueno, ni timol.

6.

Deteccin de cuerpos cetnicos con la prueba de Rothera:

A 5mL de orina

aadir sulfato de amonio en cristales hasta que la orina se encuentra saturada.

Agregar luego 2 3 gotas de una solucin fresca de nitroprusiato de sodio al 5% y
1 2mL de solucin concentrada de NH4OH. Un color prpura indica la presencia
de acetona.

Agitar ambos tubos y aadir 1.5mL de NH4OH.

presencia de acetona.

RESULTADOS:
Confeccionar un cuadro con los resultados en cada prueba.

Un color prpura indica la

98
CUESTIONARIO:
2.

Por qu se requiere que la muestra de orina patolgica que se analiza con el

reactivo de Benedict no contenga protenas?

3.

Si la orina patolgica contiene sales biliares, el azufre de la prueba de Hay se va al

fondo del vaso qumico. Por qu?

4.

Investigar que mtodos se emplean hoy da en los laboratorios clnicos y que

ahorran tiempo.