Sie sind auf Seite 1von 97

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA

GUIA DE
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGA

2014

DOCENTES DE LA CTEDRA:

CELIA BOWEN FERNNDEZ


Dra. Bioqumica y Farmacia especializacin Bioqumica Clnica
Docente de la facultad de Medicina de la Pontificia
Universidad Catlica del Ecuador
MARCELA MARDONES
Lcda. Bioqumica Clnica
Docente de la facultad de Medicina de la Pontificia
Universidad Catlica del Ecuador
LOIDA VELASQUEZ
Dra. Patloga Clnica
Docente de la facultad de Medicina de la Pontificia
Universidad Catlica del Ecuador

NDICE
INTRODUCCIN. 4
PRCTICA N 1
Bioseguridad.

PRCTICA N 2
Coloraciones...11
PRACTICA No.3
Medios de cultivos....20
PRACTICA No. 4
Antibiograma..32
PRACTICA NO. 5
Identificacin de cocos Gram positivos.....38
PRACTICA No. 6
Orina.46
PRCTICA No. 7
Identificacin bioqumica de bacilos Gram negativos...52
PRCTICA No. 8 (PRIMERA PARTE)
Coprolgico y coproparasitario.......57
PRCTICA No. 8 (SEGUNDA PARTE)
Examenes en heces fecales..66
PRCTICA No. 9
Esputo.70
PRCTICA No. 10
Malaria o paludismo....76
PRCTICA No. 11
Infecciones de transmisin sexual.....79
PRACTICA No. 12
Tcnicas bsicas de inmunologa......86
PRCTICA No. 13
Micosis....91
BIBLIOGRAFA.....96

INTRODUCCIN
El diagnstico de las infecciones y el estudio de la Microbiologa Mdica se basan fundamentalmente
en mtodos de laboratorio. Mediante estos mtodos se hicieron precisamente los ms grandes
descubrimientos en Microbiologa, Gentica e Inmunologa. Los estudiantes de Medicina deben, por
tanto estar familiarizados con stos y por ello en la Facultad de Medicina de la PUCE se incluye una
Unidad destinada a cumplir con este paso importantsimo en la formacin de sus alumnos. La presente
gua fue realizada pensando sobre todo en el/la estudiante de medicina de cuarto nivel, que requiere
complementar el estudio terico de la Microbiologa Mdica con la observacin directa y, en muchos
casos, de la puesta en prctica de los mtodos utilizados habitualmente en esta ciencia. La
metodologa expuesta en cada una de las prcticas es sencilla y fcil de ejecutar, pero no por ello deja
de ser suficiente, en el sentido de que son pasos que se siguen en la rutina diaria del laboratorio. Al
inicio de cada prctica se hace una explicacin acerca de la importancia y aplicabilidad del mtodo, su
correlacin clnica diversos aspectos de inters mdico. Luego se entra directamente en la parte
prctica y al final se exponen algunas preguntas de consulta para estimular en el estudiante el afn de
investigacin en esta apasionante rama de la Medicina. El empezar hablando sobre Bioseguridad tiene
un doble objetivo: que los estudiantes aprendan ros protocolos de manejo muestras biolgicas,
potencialmente infecciosas, y de los materiales de laboratorio; y, por otro lado, inducir en ellos la
formacin de hbitos y actitudes acordes con su condicin de futuro miembros del equipo de salud.
Muchos de los mtodos expuestos a continuacin son de uso diario, no solo en los laboratorios, sino
tambin en los consultorios mdicos. La realizacin de un examen en fresco y una tincin bsica de una
muestra de una secrecin corporal, es rpida y sencilla y con el conocimiento bsico adquirido en este
curso se convertir en una herramienta muy til para ayuda en el diagnostico y en el tratamiento de las
infecciones.
Dra. Celia Bowen Fernndez
Dr. Francisco Prez Pazmio

PRCTICA N 1
BIOSEGURIDAD

CONTEXTUALIZACIN
Observa el video en el siguiente link https://www.youtube.com/watch?v=tXt7Zs5GBMw e
imagina los riesgos a los que nos exponemos cuando no cumplimos las normas de
bioseguridad.
CONCEPTUALIZACIN
La
seguridad
en
el
laboratorio
se
puede
definir
como:
"La situacin carente de riesgo o con un riesgo limitado, que resulta del cumplimiento de un
conjunto de normas y prcticas para lograr este fin"
1. Medidas generales de seguridad
Barrera
La seguridad como prevencin viene definida por una serie de barreras. Si estas fallan y
ocure un accidente, es preciso efectuar un tratamiento precoz y adecuado para evitar un
dao
mayor
y
posteriormente
hacer
un
diagnstico
del
fallo.
Las barreras se rompen por fallos humanos y/o errores mecnicos.
Barreras primarias: Las localizadas en tomo al origen del riesgo, como son: - Contenedores,
equipo e instrumental correcto y "buena prctica (la tcnica de trabajo ordenada v rigurosa es
probablemente la mejor proteccin que existe) - Uso de desinfectantes y cabinas de
seguridad.

Barreras secundarias: Localizadas en el crculo del operador, incluirn:


La higiene personal rigurosa.
La vacunacin Programas de salud laboral.
Vestimenta: usode ropa adecuada, guantes, gafas, pelo recogido.
No frotarse los ojos o la nariz con las manos contaminadas.
No inhalar los aerosoles producidos durante la centrifugacin, la sedimentacin o el
derrame de cultivos lquidos.
Evitar ingerir microorganismos por accidente, al llevarse los dedos o el lpiz a la boca.
No sufrir inoculacin percutnea, por ejemplo, al pincharse con una aguja.
No comer, beber, fumar o aplicarse cosmticos.
No colocarse o quitarse lentes de contacto.
No pipetear con la boca.
Presuponer que todos los pacientes estn potencialmente infectados por HIV u otros
patgenos transportados por la sangre.
Las heridas en las manos deben vigilarse, ya que pueden ser una puerta de entrada a la
infeccin. En caso de tenerlas, deben cubrirse adecuadamente con material resistente al
agua.
Lavarse a conciencia las manos y otras superficies de la piel tras quitarse los guantes e
inmediatamente despus de cualquier contaminacin.

Barreras terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio: Evitan que los riesgos de
laboratorio puedan repercutir en la comunidad.
Ningn material txico o infeccioso abandone el laboratorio.
Acceso restringido a determinadas reas de laboratorio.
6

Contenedores especiares para material bio-peligroso, autoclaves e incineradores para


desechos contaminados.
Acceso al laboratorio nicamente al personal capacitado.

DESINFECCIN, DESCONTAMINACIN Y ESTERILIZACIN Existen muchos agentes


qumicos o fsicos para eliminar los microorganismos podemos distinguir tres grupos:
Agentes antispticos: son germicidas qumicos para la utilizacin en la piel como por
ejemplo; alcohol, iodforos, etc.

- Agentes desinfectantes: destruyen microorganismos en superficies e instrumentos, como por


ejemplo: soluciones fenlicas al 3 o 5%, hipocloritos.

- Agentes esterelizantes: destruyen toda forma de vida incluidas las esporas. Por ejemplo: los
sistemas de autoclave, calor seco, xido de etileno.

Eliminacin de residuos peligrosos Todos los materiales contaminados son agentes


potencialmente infecciosos que deben ser descontaminados antes de su eliminacin. Esto
implica porciones no utilizadas de las muestras de los pacientes, cultivos de las muestras y
7

cultivos almacenados de microorganismos e instrumentos descartables, por ejemplo,


escalpelos y jeringas con agujas. Los residuos infecciosos se deben descontaminar mediante
autoclave, incinerador o cualquiera de los diversos mtodos alternativos de tratamiento de
residuos.
2. Smbolos de riesgo en los reactivos

3. Manejo del mechero de Bunsen


La llama ms utilizada en el laboratorio es la producida por la combustin de un gas
(propano,
butano
o
gas
ciudad),
con
el
oxgeno
del
aire.
La combustin completa (con exceso de oxgeno) produce agua y dixido de carbono, una
llama poco luminosa y de gran poder calorfico.
La combustin incompleta produce, adems de dixido de carbono y agua, carbono,
monxido de carbono y otros productos intermedios, da origen a llamas de bajo poder
calorfico y altamente luminosas (debido a la incandescencia de las partculas de carbono que
se producen).
Para controlar las llamas se utiliza el mechero de laboratorio que, a pesar de existir diversos
tipos, el mecanismo de funcionamiento es similar en todos ellos. La llama utilizada es la de
combustin completa, que es de mayor poder calorfico y no deposita holln en el material de
trabajo de laboratorio que es expuesto a la misma.
Encendido del mechero: Cerrar totalmente la entrada de aire, abrir ligeramente la llave de
paso del gas y acercar, lateralmente, una cerilla encendida a la boca del can. Regular la
llave hasta obtener una llama con la altura deseada, gradualmente, abrir la entrada de aire.
No abrir repentinamente porque puede apagarse el mechero.
Para obtener mayor temperatura, abrir ms el flujo de gas y la entrada de aire.
EL MECHERO SE APAGA AL CERRAR LA LLAVE DE GAS.

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
Actividad 1: Video de Bioseguridad Tarea
Estimados estudiantes, por favor subir un video a la plataforma Moodle con las
respectivas fotos sobre el cumplimiento de las normas de Bioseguridad de cada una de las
prcticas realizadas, as como tambin cuando ests no son cumplidas. No olvidar colocar las
reflexiones debajo de cada foto respecto al aprendizaje obtenido.
Nota: Este portafolio ser entregado al finalizar las prcticas del primer parcial el cual debe
tener una duracin de aproximadamente 4 a 5 minutos
Actividad 2: Responda al siguiente cuestionario:
1. Definicin de seguridad en el laboratorio.
2. Mencione cinco ejemplos (c/u) de barreras primarias, secundarias y terciarias.
3. Cul es la diferencia entre desinfeccin, descontaminacin y esterilizacin? (ejemplo de
c/u).
4. En qu nivel de enseanza se ubica un laboratorio bsico de enseanza y qu equipos
de seguridad necesita? (Revisar Manual de Bioseguridad OMS)
5. Qu requisitos necesita un laboratorio bsico de enseanza?
6. Cul es el smbolo de peligro biolgico?
7. Cmo debe protegerse el personal de laboratorio?

8. Qu procedimientos debe tener en cuenta el personal o los estudiantes durante su


trabajo en el laboratorio?

Manual Bioseguridad OMS, tercera edicin, Ginebra 2005 (Leer ls pgs.


1,2,3,10,11,12) Archivo

10

PRCTICA N 2
COLORACIONES

OBJETIVOS

Realizar coloraciones: simples, diferenciales


Diferenciar que tipos de muestras se utilizan para cada coloracin.
lnterpretar y evaluar correctamente los resultados obtenidos en tas distintas
coloraciones y discernir si la coloracin fue bien realizada.

CONTEXTUALIZACIN
La coloracin Gram debe su nombre al bacterilogo dans Chistian Gram en 1884. La
tincin de Gram aporta dos ideas bsicas para la definicin de las bacterias: el color que
adquieren tras la tincin y la forma que presentan las clulas bacterianas. En lo relativo a
la coloracin tenemos:
- Gram positivos color azul-violeta
- Gram negativos color rojo-rosado

CONCEPTUALIZACIN
Coloracin Gram
Las bacterias se clasifican en Gram positivas y en Gram negativas de acuerdo a los
componentes qumicos de su pared celular. Las Gram positivas poseen una pared
celular poco permeable y resisten la decoloracin. Las Gram negativas poseen una
pared celular ms permeable, se decoloran y luego adquieren la coloracin de la
safranina.
La coloracin Gram consiste en una tcnica de tincin que utiliza 4 componentes: un
colorante bsico (cristal violeta), un mordiente (lugol), un decolorante (alcohol
cetona) y un colorante de contraste (safranina).

11

12

Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp

Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo


B.

Bacilos Gram-negativos

Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae

Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis

13

Tambin Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfologa de diplococos.


Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces aparece como coco Gram-positivo.

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-variable.

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C.
jejuni

Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp

a. Realizacin de la extensln
Producto lquido: Depositar en el centro de un portaobjetos una pequea cantidad del
producto a examinar y extenderlo con la ayuda de un asa de platino o una pipeta de
modo que la extensin sea lo ms fina y homognea posible. Un producto denso puede
ser diluido antes ligeramente.
Cultivo en medio slido: depositar en un portaobjetos una gotita de agua solucin
salina estril y disociar en ella una pequea cantidad de cultivo. Extender para obtener
un frotis fino y homogneo.
Sangre: hacer un frotis como para un examen hematolgico, depositar sobre el primer
tercio de un portaobjetos limpio y desengrasado una pequea gotita de sangre. Hacer
contactar con la misma un portaobjetos de bordes esmerilados, que se inclinar 45 C.
La sangre alcanza por capilaridad todo el borde del portaobjetos que se empujar hacia

14

la parte libre del primer portaobjetos que contenga la gota de sangre, hacindolo de un
solo movimiento, sin detener ni volver atrs.
rganos: seccionar un pequeo fragmento. Sujetarlo con una pinza, secar el trozo
seccionado sobre un papel secante, haciendo seguidamente con sta porcin una
extensin o una serie de aposiciones, sin apoyar demasiado, de manera que se
obtengan preparaciones finas.

b. Secado
Dejar secar por s solo el frotis. Se puede acelerar la desecacin calentando ligeramente con
un mechero Bunsen, pero sin calentar jams brutalmente.
c. Fijacin
Cuando la extensin est bien seca, proceder a la fijacin. Slo algunas
coloraciones
especiales no deben ir precedidas de una fijacin. l motivo de la misma es hacer adherir el
frotis al portaobjetos y fijar la morfologa de las bacterias, clulas, por coagulacin rpida de
las protenas.
Puede ser por:
Alcohol flameado: Es la tcnica ms general. Verter sobre la preparacin algunas gotas
de alcohol absoluto. Despus de algunos segundos de contacto, escurrir lo mejor
posible e inflamar despus el alcohol restante.
Por el calor: Aplastar la llama de un mechero Bunsen 2 a 3 veces contra la parte
inferior de la preparacin, que sujetaremos con unas pinzas. Este mtodo debe
rechazarse para los productos patolgicos puesto que altera la morfologa de los
elementos celulares.
Por el alcohol en fro: Recubrir la preparacin con alcohol etlico absoluto o metlico.
Dejar actuar 1 o 2 minutos. Escurrir y dejar secar.
Por el cido smico: Ciertas coloraciones necesitan una fijacin previa por el cido
smico en solucin acuosa al 1 por 100. Exponer la extensin hmeda a los vapores de
cido smico durante algunas decenas de segundos. Fijar seguidamente con alcohol
flameado o con alcohol metlico.
Examen de las preparaciones teidas
Las preparaciones coloreadas se examinan con el objetivo de inmersin (100x) sin usar
cubreobjetos.
Depositar sobre el frotis una gota de un aceite especial (aceite de inmersin).
Descender primero el objetivo de 10 x, una vez enfocado pasar al lente de 100 x
sumergindolo en la gota, comprobar el enfoque microscpico con el tornillo
micromtnco.
CUADRO GENERAL SOBRE LA RECOLECCIN Y EL MANEJO DE LAS MUESTRAS
MUESTRA
Lquidos corporales:
amnitico, abdominal,
asctico, biliar, articular,

PREPARACIN DEL PACIENTE


Desinfectar la piel antes de aspirar la muestra

15

pericrdico, pleural
Odo externo
Absceso superficial
Absceso profundo
Catteres
IV,
clavos,
vlvulas prostticas

Orina, chorro medio previa


higiene

Puncin suprapbica

Sangre o mdula sea

Tracto
Crvix

genital

femenino:

Tracto GI: aspirado gstrico

Hisopado rectal
Cultivo de materia fecal

Vas respiratorias inferiores


Vas
respiratorias
superiores: nasofaringe
Faringe (fauces)

Eliminar la costra con solucin fisiolgica estril


Limpiar la zona con solucin fisiolgica estril o alcohol al
70%. Pasar el hisopo sobre los bordes de la herida
Limpiar la zona con solucin fisiolgica estril o alcohol al
70%. Aspirar el material de la pared o extraer tejido.
Desinfectar la piel antes de la extraccin. No cultivar
catteres de Foley; se obtienen cultivos cuantitativos de los
catteres IV al hacer rodar el segmento sobre el agar 4 veces
con un frceps estril; valores 15 colonias se asocian con
significado clnico.
Mujeres: limpiar la zona con un antisptico suave, luego
enjuagar con agua; mantener separados los labios mayores y
comenzar a evacuar en el inodoro; recoger el chorro medio
despus de eliminar varios ml.
Varones: limpiar el glande con un antisptico suave, luego
enjuagar con agua; retraer la piel del glande; recoger el
chorro medio despus de eliminar varios ml.
Desinfectar la piel. Aspiracin con aguja por encima de la
snfisis pubiana, a travs de la pared abdominal, hasta la
vejiga llena
Desinfectar el sitio de puncin venosa con alcohol al 70% y
desinfectante, p. ej., betadina. Extraer sangre durante el
episodio febril; extraer dos muestras, de brazo izquierdo y
derecho; no extraer ms de tres muestras en un periodo de
24 horas
Eliminar moco antes de recolectar la muestra. No usar
lubricante en el espculo; usar ,medio de transporte para
clamidias, de ser necesario; tomar muestra de la profundidad
del canal endocervical.
Recolectar temprano por la maana, antes de que el paciente
coma o salga de la cama. La mayora de los aspirados
gstricos se obtienen de lactantes o para BAAR
Insertar el hisopo aproximadamente 2,5 cm por dentro del
esfnter anal
Cultivo de rutina debe incluir Salmonella, Shiguella y
Campilobacter; especificar Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas,
Yersinia, escherichia coli O157:H7, segn necesidad
Esputo: Enjuagar o hacer grgaras con agua antes de la
recoleccin
Insertar un hisopo flexible a travs de la nariz, hasta la
nasofaringe posterior, y rotar durante 5 segundos; muestra
de eleccin para Bodertella pertussis
Pasar el hisopo por la faringe posterior y las amgdalas;
cultivo de rutina solo para Streptococcus grupo A (S.
pyogenes)
16

Coloracin de Ziehl Neelsen


El bacilo de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, es resistente a los cidos y se
tie de rojo con la coloracin de Ziehl Neelsen con la fucsina fenicada. No se pueden
decolorar por medio de cidos o etanol (son bacilos alcohol-cido resistentes o BAAR),
en tanto que casi todos los dems microorganismos se tien de azul.
Colorante base (fucsina), mordiente (calor), decolorante (alcohol-cido), colorante de
contraste (azul de metileno).

Es una tcnica de tincin diferencial que se basa en que las paredes celulares de
ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena
larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos.

Por esto se denominan Bacilos cido-alcohol resistentes o BAAR.

La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese


la pared bacteriana que contiene ceras.

Uso:
Para
identificacin
de
bacilo
tuberculoso
(Acido
Desventaja: Emisin de vapores fenlicos por el calentamiento.

alcohol

resistente)

EXAMEN DE LAS PREPARACIONES


Utilice el objetivo de inmersin en aceite (100x):
Los bacilos de la tuberculosis (BAAR):
Son de color rojo fuerte: destacan sobre un fondo azul
Tienen frma recta o ligeramente curva
Son muy pequeos (1 - 4)
Son frecuentemente granulosos
Se disponen en grupos de 3 a 10 bacilos que asemejan a trozos de hilos o parecen
formar letras torcidas
17

Cmo examinar las preparaciones


Haga un examen completo del primer portaobletos empleando el objetivo de inmersin (100x)
en aceite, con iluminacin mxima y sin filtro de color.
Placa positiva: una vez que se hayan examinado 10 bacilos resistentes a los cidos.
Registro de los resultados

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
Experimentacin
1. Durante la clase los estudiantes deben aprender a manejar el mechero de Bunsen y el
uso de las asa microbiolgicas.
2. Realizarn frotis de muestras biolgicas lquidas, slidas y de esputo.
3. Efectuarn tinciones como la coloracin Gram (dos placas por grupo) y BAAR (una
placa por grupo). Por favor traer mascarilla.
4. Realizar el portafolio de la prctica y subirlo a la plataforma Moodle.

RESPONDER AL CUESTIONARIO:
1. Cules son los reactivos y tiempos empleados para la coloracin Gram y BAAR?
2. Porqu la Escherichia coli puede adquirir el color de la safranina?De qu est
compuesta su pared celular?. Explique brevemente.
3. Porqu el Staphylococcus aureus adquiere el color del cristal violeta y no el de la
safranina? De qu est compuesta su pared celular? Explique brevemente.
4. Porqu el bacilo de Koch se tie con la fucsina fenicada y no con el azul de metileno?
De qu est compuesta su pared celular?. Explique brevemente.
5. Cmo realiza una placa con frotis para coloracin Gram de una muestra de orina y de
un agar sangre?
6. Cmo realiza una placa con frotis para coloracin BAAR de una muestra de esputo y
de orina?
7. Cual es el mtodo para observar las placas teidas con Gram o BAAR en el
microscopio?
18

8. Qu debe realizar para recolectar muestras de mdula sea, pleural y de la faringe?


9. Problema: Mara Augusta tiene un resultado de BAAR de 1 a 9 bacilos en 100 campos.
Cul es la interpretacin de este resultado?
10. Qu coloracin adquiere el Streptoccocus pneumoniae cuando se lo tie con ZhielNeelsen? Es posible diferenciarlo de otras bacterias?
11. Qu coloracin adquiere el Micobacterium tuberculosis cuando se lo tie con Gram?
Es posible identificarlo mediante esta tcnica?
12. Qu errores observaron durante la prctica en cuanto a la realizacin de los frotis,
coloracin y manejo del microscopio?

19

PRACTICA No.3
MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVOS:
Conocer la importancia y los diferentes medios de cultivo para el crecimiento bacteriano
Realizar tomas de muestras y siembras en medios de cultivo como agar sangre
Observacin en los medios de cultivo las diferentes colonias bacterianas en crecimiento
y realizacin de coloracin Gram

CONTEXTUALIZACIN
Excepto algunas raras excepciones, todo examen bacteriolgico incluye el cultivo del producto
a examinar. El cultivo bacteriano tiene tres propsitos principales:
Facilitar el crecimiento y aislamiento de todas las bacterias presentes en una infeccin.
Determinar cules bacterias que se desarrollan es ms probable que sean la causa de
la infeccin y cules son contaminantes probables o colonizadores.
Obtener desarrollo suficiente de las bacterias relevantes en clnica para permitir su
identificacin y caracterizacin.
Necesario para los estudios complementarios como los de la sensibilidad de las
bacteriuas a los distintos antibiticos.
El cultivo es el proceso de crecimiento de microorganismos mediante la toma de bacterias de
un sitio de infeccin (el ambiente in vivo) por mtodos de recoleccin de muestra y
crecimiento en un ambiente artificial en el laboratorio (el ambiente in vitro).
REQUERIMIENTOS PARA EL DESARROLLO BACTERIANO
Las bacterias pueden ser divididas en auttrofas y hetertrofas. Las primeras comprenden las
bacterias del suelo y el agua que obtienen carbono y nitrgeno de la atmsfera y de la materia
inorgnica simple. Las bacterias hetertrofas reguieren compuestos orgnicos ms complejos
como fuente de carbono y nitrgeno, as como proteinas o sus derivados, tambin requieren
carbohidratos y grasas. Este ltimo grupo de organismos es el ms importante en
bacteriologa mdica.
20

Protenas. Se suministran generalmente como "peptonas', que se encuentran disponibles, en


el comercio, preparadas por digestin parcial de carne con enzimas ppticas; consisten en
polipptidos, dipptidos y aminocidos.
Carbohidratos. Suministran carbono para la sntesis, y adems su fermentacin libera
energia utilizable en el metabolismo.
Factores accesorios de crecimiento. Son tambin requeridos por algunas bacterias. Entre
ellos estn las vitaminas del complejo B (tiamina, cido nicotnico, piridoxina, biotina). Estas
suministran enzimas necesarias que las bacterias son incapaces de sintetizar. Otros factores
necesarios para algunas bacterias son obtenidos de nutrimentos ms complejos, como el
suero, la sangre, la yema de huevo, etc.
Sales minerales. Elementos como potasio, sodio, calcio, etc. tambin son requeridos por
algunas bacterias en su desarrollo.
Atmsfera. Algunos microorganismos precisan de una atmsfera con oxgeno para su
desarrollo (aerobios obligados); otros, son incapaces de producirse en presencia de oxgeno
libre (anaerobios obligados) en tanto, que los de un, tercer grupo, aunque pueden crecer en
una atmsfera con oxgeno, logran sobrevivir y crecer sin l (anaerobios facultativos).
Algunos grupos bacterianos, especialmente los gonococos y los neumococos, prefieren una
atmsfera en la que haya una concentracin de CO2 de 5 a 10 %.
Presin Osmtica. Las clulas pueden encogerse y ser destruidas (plasmlisis) en
soluciones hipertnicas; inversamente, se rompen (plasmoptisis) por entrada de agua, en las
soluciones hipotnicas,
Temperatura. La temperatura en la cual el microorganismo bacteriano crece mejor, es
considerada como temperatura ptima. Para la mayora de las bacterias patgenas del
hombre es de 37 C. El desarrollo bacteriano tiene lugar entre lmites de temperatura cuyos
extremos son designados como mnimos y mximos.
Para la mayora de las bacterias patgenas del hombre los lmites se encuentran entre 15 y
40C. La temperatura en la cual en un tiempo dado mueren las bacterias es conocido como
punto trmino letal. Las bacterias que son congeladas, no mueren, sino que inhiben su
crecimiento. Los microorganismos importantes en bacteriologa mdica son generalmente
mesoflicos (lmites entre 5 y 43C). Sin embargo, hay microorganismos que pululan entre
lmites de temperatura mucho ms bajas (psicroflicos), o bien, superiores (termoflicos). Los
primeros son encontrados en el suero y en el agua fra, los ltimos en la materia orgnica en
fermentacin.
Luz. La mayora de las bacterias se desanollan mejor en ausencia de luz. La luz del sol, con
su componente ultravioleta, puede incluso ser letal.
Reaccin. La mayora de las bacterias crecen mejor en un medio ligeramente alcalino (pH 7.2
a 7.6), pero existe tambin un lmite de potencialidad bastante amplio. Los hongos crecen con

21

facilidad en medios cidos (pH 5) mientras que el medio especial para el crecimiento del
Vibrio cholerae debe ser marcadamente alcalino (pH 9.6)

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO


De acuerdo a su consistencia
Lquidos: Utilizados generalmente para obtener crecimiento rpido y masivo; en estos medios
las bacterias conservan su forma original y caractersticas.

Semislidos: tiles para investigar movilidad y conservar las bacterias por perodos largos,
contienen de 1-1 5% de agar

Slidos: Especialmente tiles para el aislamiento de bacterias y observacin de colonias,


contienen de 2 a 3 % de agar
CLASIFICACIN Y FUNCIONES DE LOS MEDIOS
Los medios se clasifican de acuerdo con su funcin y uso. En el diagnstico bacteriolgico
hay cuatro categoras generales de medios: enriquecimiento, apoyo, selectivo y diferencial.
Los medios de enriquecimiento contienen nutrientes especficos requeridos para el
desarrollo de determinados patgenos bacterianos que pueden estar presentes solos o con
otras especies bacterianas en una muestra del paciente. Este tipo de medios se utiliza para
favorecer el desarrollo de un determinado patgeno bacteriano, a partir de una mezcla de
microorganismos, por el uso de especificidad de nutrientes. Un ejemplo de estos medios es el
agar amortiguado con carbn y extracto de levadura que proporciona L-cistena y otros
nutrientes necesarios para el crecimiento necesario de Legionella pneumfila, el agente
etiolgico de la enfermedad de los legionarios.

22

Los medios de apoyo o universales contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de la


mayora de los microorganismos sin requerimientos especiales y sin brindar ventaja alguna en
el crecimiento de un microorganismo en particular.

Los medios selectivos contienen uno o ms agentes que inhiben todos los microorganismos
excepto los que son buscados. En otras palabras, estos medios seleccionan el crecimiento de
ciertas bacterias e inhiben el de otras. Los agentes inhibidores utilizados para este propsito
son colorantes, sales biliares, alcoholes, cidos y antibiticos. Un ejemplo es el agar con
alcohol feniletlico, que inhibe el desarrollo de bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios
facultativos, y permite el crecimiento de cocos Gram positivos.

Los medios diferenciales emplean un factor (o factores) que permite que las colonias de una
especie o tipo bacteriano exhiban ciertas caractersticas metablicas o de cultivos que pueden
utilizarse para diferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo agar placa.

Medios de transporte: En algunas circunstancias puede haber una demora entre la


extraccin de una muestra y su cultivo. Muchos microorganismos pierden su viabilidad cuando
se almacenan en medios ordinarios de laboratorios. Se dispone de varios medios de
transporte, que consisten en agentes reductores como el tioglicolato o la cisteina en cierto
nmero de tipos de medios salinos altamente amortiguados (buffered).
23

Un ejemplo de medio de transporte es el medio de Stuart. Se utiliza en una unidad


descartable de cultivo, denominado Culturette, que consiste en un tapn estril de poliestireno
y una ampolla del medio de Stuart. Despus de recoger la muestra, se coloca en el tubo y se
aplasta la ampolla para liberar el medio alrededorr del extremo de tapn. Este tipo de medio
no es adecuado para aislar anaerobios sensibles al oxgeno.
Es importante destacar que muchos medios utilizados en el diagnstico bacteriolgico
cumplen ms de una funcin. Por ejemplo, el agar MacConkey es tanto diferencial como
selectivo, debido a que inhibe el desarrollo de la mayora de las bacterias grampositivas. Otro
ejemplo es el agar sangre de carnero. ste es el medio de apoyo ms comn utilizado en el
diagnstico bacteriolgico, debido a que permite el desarrollo de muchos microorganismos.
Sin embargo, en muchos casos este agar es tambin diferencial, porque la apariencia de las
colonias producidas por ciertas especies bacterianas es muy diferente.

Medios en placas para la bacteriologa de rutina


Medio
Agar alcohol feniletlico

Agar chocolate

Componentes/comentarios
Objetivo principal
Agar base nutritivo. El feniletanol Aislamiento selectivo de
inhibe
el
crecimiento
de cocos
grampositivos
y
microorganismos gramnegativos
bacilos
anaerobios
gramnegativos
Medio extremadamente nutritivo , Cultivos de especies de
preparado con adicin de sangre de Haemophilus y especies
cordero calentada sobre 80C hasta patgenas de Neisseria
que el medio se torne parduzco,
para liberar la hemoglobina y
entregar al medio todos los factores
de crecimiento

Agar
Columbia Agar base Columbia con 10 mg de
colistina-cido
colistina por litro, 15 mg de cido
nalidxico (CNA)
nalidxico por litro y sangre de
carnero al 5%
Agar con bilis y esculina Agar base nutritivo con citrato
frrico. La hidrlisis de la esculina
por los estreptococos del grupo D le
otorga un color castao al medio; el
desoxicolato de
sodio
inhibe
muchas bacterias
Agar eosina azul de Base de peptona con lactosa y
metileno (EMB)
sacarosa, eosina y azul de metileno
que actan como indicadores

Aislamiento slectivo
cocos grampositivos

de

Aislamiento diferencial e
identificacin presuntiva de
estreptococos grupo D y
enterecocos

Aislamiento y diferenciacin
de
bacilos
entricos
fermentadores
y
no
fermentadores de lactosa
Agar Hektoen entrico Base de peptona con sales biliares, Medio
diferencial
y
(HE)
lactosa, sacarosa, salicina y citrato selectivo,
para
el
24

de amonio frrico. Los indicadores aislamiento y diferenciacin


son el azul de bromotimol y la de especies de Salmonella
fucsina cida
y Shiguella de otros bacilos
entricos gramnegativos
Agar MacConkey
Base de peptona con lactosa. Los Aislamiento y diferenciacin
microorganismos grampositivos son de
bacilos
entricos
inhibidos por el cristal violeta y las gramnegativos
sales biliares. Rojo neutro como fermentadores
y
no
indicador
fermentadores de la lactosa
Agar manitol salado
Base de peptona, manitol y rojo Aislamiento selectivo de
fenol
como
indicador.
La estafilococos
concentracin de sal al 7,5% inhibe
la mayora de las bacterias
Agar sangre
Agar con sustrato nutritivo (extracto Cultivo de microorganismos
de levadura,peptona, hidrolizado de con
requerimientos
hgado), cloruro de sodio, con 5% especiales
de
cultivo,
de sangre de cordero
determinacin
de
reacciones hemolticas
Agar Thayer-Martin
Agar sangre base enriquecido con Selectivo
para
N.
hemoglobina y suplemento B; los gonorrhoeae
y
N.
microorganismos
contaminantes meningitidis
inhibidos por colistina, nistatina,
vancomicina y trimetoprima
Caldo
para Caldo base de peptona con glucosa Medio
lquido
selectivo
gramnegativos (GN)
y manitol. El citrato de sodio y el (enriquecimiento)
para
desoxicolato de sodio actan como patgenos entricos
agentes inhibidores
Caldo selenito
Caldo base de peptona. El selenito Enriquecimiento para el
de sodio resulta txico para la aislamiento de las especies
mayora de las Enterobacteriaceae
de Salmonella
Caldo tetrationato
Caldo base de peptona. Las sales Selectivo para especies de
biliares y el tiosulfato de sodio Salmonella y Shigella
inhiben
los
microorganismos
grampositivos y Enterobacteriaceae
Caldo de tioglicolato
Digerido pancretico de casena, Favorece el crecimiento de
caldo de soja y glucosa que anaerobios,
aerobios,
enriquece el desarrollo de la microaerfilos
y
mayora de los microorganismos. El microorganismos exigentes
tioglicolato y el agar reducen el
potencial rdox
Caldo tripticasa soja Caldo enriquecido con mltiples Caldo de enriquecimiento
(TSB)
propsitos que puede favorecer el utilizado para el subcultivo
crecimiento de muchas bacterias de diversas bacterias de
con requerimientos especiales de cultivos primarios en placas
cultivo y sin ellos
de agar

25

MEDIOS USADOS PARA EL AISLAMIENTO PRIMARIO


La velocidad, la especificidad del procedimiento de ensayo y la economia de la prueba
son tres factores que el laboratorio de microbiologa clnica debe tener en cuenta en los
procedimientos de diagnstico. Cuando es posible identificar un microorganismo con rapidez y
certeza, se puede tratar al paciente de una manera ms rpida y aumenta as la posibilidad de
su curacin. Por consiguiente, la eleccin de un medio de aislamiento de las especies
microbianas es sumamente importante. Suele ser dictado por la fuente de la muestra,
materias fecales, orina, lquido cefalonaqudeo, etc. y por el tipo del agente infeccioso del cual
se sospecha que causa la infeccin. Cierto nmero de microorganismos fisiolgicamente
diferentes podran provocar la infeccin. Por lo general el microbilogo clnico utiliza ms de un
tipo de medio, as como condiciones ambientales distintas para el aislamiento primario; por
ejemplo, el cultivo es incubado por va aerobia y anaerobia. Los medios ms comnmente
recomendados para el aislamiento primario son: tioglicolato, agar sangre, feniletilalcohol,
agar eosina-azul de metileno (EMB), agar chocolate.
CARACTERSTICAS DE LA COLONIA
Es importante destacar las caractersticas clave de una colonia bacteriana para toda
identificacin bacteriana; el xito o el fracaso de los procedimientos posteriores de
identificacin a menudo dependen de la precisin de estas observaciones. Los criterios
utilizados con frecuencia para caracterizar el crecimiento bacteriano son:

Tamao de la colonia (por lo comn calculado en milmetros o descrito en trminos


relativos como cabeza de alfiler, pequeo, medio, grande)
Pigmentacin de la colonia
Forma de la colonia (incluye forma, elevacin y bordes de la colonia
Aspecto de la superficie de la colonia (p. ej., brillante, opaca, roma, transparente)
Cambios en los medios con agar como resultado del crecimiento bacteriano (p. ej.,
patrn hemoltico en agar sangre, cambios en el color de los indicadores de pH,
corrosin de la superficie del agar)
Olor (ciertas bacterias producen olores caractersticos que pueden ayudar a la
identificacin preliminar.

Clasificacin de los medios de cultivos de acuerdo a su empleo


Mtodo de placas: El propsito de utilizar medios slidos pulverizados en cajas de Petri,
consiste en inocular cantidades sucesivamente menores de material en el rnedio, de manera
que en algn tiempo los microorganismos sean colocados en una capa tan delgada que les
permita el crecimiento de colonias individualbs aisladas.
Para realizar un cultivo bacteriano es necesario tomar el asa e introducirla al fuego para que
se esterilice, dejar enfriar unos segundos y tomar la muestra que se va a estudiar; abrir la caja
petri y flamear delante del mechero, con el asa impregnada de la muestra se efecta un
pequeo inculo en el borde, de all se parte la primera estriacin; luego de la esquina de una
26

de las estras de la primera estriacin se realiza la segunda estriacin y finalmente de la


esquina de una de las estras de la segunda estriacin, se realiza la tercera estriacin,
procurando hacer las estras mucho ms separadas de las dos primeras, con la finalidad de
separar las colonias que sean sembradas; se tapa la caja y se lleva a la incubadora,
colocndola de lado contrario al que se sembr y se la deja en las condiciones apropiadas
para el crecimiento de cada bacteria (temperatura, atmsfera, potencial rdox, tiempo, etc.)
Debe trabajarse siempre cerca de un mechero de Bunsen al inocular, ya que la corriente
asendente de aire va por la flama, arrastra el polvo, etc.; con el aire hacia arriba, alejndole de
la placa, y cuando el aire se enfra, el polvo se precipita lejos de la placa.

A menudo se reciben torundas para cultivo; en vez de recogerse material con el asa, deben
emplearse las torundas corno material primario de inoculacin a partir del cual se distribuye
con el asa en la forma descrita ms adelante. Deben ser subrayados ciertos puntos de
importancia sobre el uso del mtodo de placas; por ejemplo, las placas deben estar
preferentemente secas antes de usarse, para que los microorganismos no se extiendan,
impidiendo la formacin de colonias aisladas.
Medios inclinados: Este tipo de cultivo es empleado principalmente para resembrar cepas
aisladas, sea para identificacin ulterior o para base de cultivo. Se requiere prctica y siempre
debe hacerse cerca del mechero de Bunsen; el cuello del tubo o del frasco debe ser flameado
antes de recubrirlo o de volver a colocar el tapn de algodn (mtodo que se usar en la
prctica No. 7 Pruebas bioqumicas).
Cultivos por agitacin: Este medio de cultivo es de empleo particular en el aislamiento de
anaerobios esporulados.
Cultivos por picadura: En este mtodo de material para investigacin es colocado en un
alambre recto e introducido al medio. Debe tenerse cuidado en hacer que el trayecto de la
salida sea el mismo que el de entrada. Ciertos microorganismos tienen un aspecto
caracterstico en el cultivo hendido. El mtodo puede ser tambin empleado para conservar
los cultivos patrn y para comprobar la licuefaccin de la gelatina (mtodo que se usar en la
prctica No. 7 Pruebas bioqumicas).
Cultivos lquidos: Al inocular un medio lquido como el agua de peptona o el caldo con
tioglicolato, el tubo se inclina y el material se extrae el asa por frotamiento contra la pared del
tubo. Cuando ste se endereza, el material se encuentra bajo la superficie del medio.

27

FACTORES DETERMINANTES EN LA PREPARACIN DE UN MEDIO DE


CULTIVO
Los factores siguientes son importantes en la preparacin de un medio de cultivo:
1. Fluidez: El medio deshidratado comercialmente disponible o la mezcla del propio
microbilogo se disuelve en primer trmino en agua. Si se requiere un medio slido, se
agrega agar.
2. pH: Se verifica el pH del medio y se regula si es preciso. En preparaciones comerciales
no suele ser necesario el ajuste. Para amortiguar los propios medios sintticos se
utilizan generalmente buffers de fosfato, porque el crecimiento ptimo de la mayor parte
de las bacterias se encuentran en el intervalo de amortiguacin de los iones fosfato: 6.6
a 7.2.
3. Esterilizacin: Se debe esterilizar el medio. Este procedimiento asegura la destruccin
de todos los microorganismos no deseados que estn presentes durante su
preparacin. Si los componentes del medio son estables al calor se lleva a cabo la
esterilizacin en un autoclave (121C durante 15 minutos). Si se requiere sangre y
ciertos componentes inestables, como antibiticos o compuestos oxidables al calor en
el medio, se los debe esterilizar por separado mediante filtracin u otros procesos, y
luego se agregan al medio esterilizado cuando ste se enfra hasta una temperatura de
50C.
4. Tensin de oxgeno:
4.1. Aislamientos de aerobios: como la respiracin es su nica fuente de energa,
los microorganismos aerobios deben tener una provisin adecuada de oxgen en
su ambiente, se pueden satisfacer las demandas de oxgeno de las siguientes
maneras:

Agitando o haciendo girar medios de cultivo en varios dispositivos de agitacin


automtica Tambin se pueden cultivar microorganismos aerobios sin agitacin.
Se puede hacer burbujear aire filtrando a travs de recipientes de cultivo. Algunos
microorganismos aerobios requieren una tensin de dixido de carbono (CO2) para su
crecimiento en un cultivo
4.2. Aislamiento de anaerobios: Su aislamiento requiere la recoleccin de
muestras adecuadas, el transporte de estas muestras y mtodos de cultivo en
condiciones anaerobias. Algunas de las tcnicas qumicas y fsicas de las cuales
dispone el microbiblogo para aislar anaerobios menos sensibles son las siguientes:

Agentes reductores como el tioglicolato de sodio, la cistena o el ascorbato pueden ser


agregados al medio de cultivo. En estas condiciones es posible cultivar anaerobios en
presencia de oxgeno porque estos agentes reductores absorben el oxgeno libre y lo
ponen fuera del alcance de las bacterias.

28

Se pueden mezclar cido piroglico y carbonato de sodio en una cpsula o un frasco,


que luego se coloca en un recipiente sellable ms grande que contiene los frascos de
cultivo o las placas de agar. Cuando se mezclan el cido piroglico y el carbonato de
sodio, se absorbe oxgeno y se libera CO2, creando de este modo un ambiente
anaerobio.

El sistema GasPak es el ms comunmente empleado en los laboratorios qumicos. Se


agrega una cantidad especfica de agua al contenido de un sobre de papel de aluminio
descartable. Se coloca en envoltorio en el recipiente junto con los cultivos inoculados.
Se cierra hermticamente, y el agua agregada al envoltorio genera la produccin de
hidrgeno e hidrxido de carbono. Con la ayuda de un catalizador que se encuentra en
la tapa del recipiente, cualquier cantidad de oxgeno presente en el Gaspak se
combina con el hidrgeno formando agua y de este modo produce un medio
anaerobio. Se utilizan otras tcnicas como el tubo enrollado y la caja anaerobia con
guantes para aislar los anaerobios ms sensibles.

5. Temperatura: El medio se debe incubar a una temperatura que permite el crecimiento


ptimo de las especies bacterianas. La mayora de los laboratorios qumicos tienen
estufas con controles automticos de tmperatura. El conocimiento de las necesidades
trmicas de un microorganismo es tan importante como cualquiera de los factores
fsicos y qumicos ya examinados. La mayora de las bacterias patgenas se cultivan
entre los 35 y 40C, con verificaciones muy cuidadosas para prevenir fluctuaciones.
Algunos patgenos, como Neisseria gononhoeae, son sumamente sensibles a la
temperatura.
PRESERVACIN DE MICROORGANISMOS AISLADOS
Muchos microorganismos infecciosos son sumamente sensibles a las condiciones
ambientales fuera del husped. Estas especies deben ser identificadas con la mayor rapidez
posible. Se puede preservar la mayor parte de los microorganismos para una futura
identificacin o para procedimiento experimentales. Pero si se dejan las colonias aisladas
originales sobre la superficie del agar, se deshidratarn y morirn en pocas semanas. Por lo
tanto, es necesario transferirlas a medios adecuados con intervalos regulares. Se pueden
utilizar diversas tcnicas:
Subcultivo: El mtodo ms tradicionalde preservacin es por subcultivos en medios que
estimulan el crecimiento. El subcultivo se realiza a intervalos, regulares, que pueden variar de
un da a varias semanas segun la especie.
Despus de un subcultivo en una superficie de agar o en un caldo, se conserva la muestra a
temperaturas de refrigeracin (4C). A 4C la muestra es an metablicamente activa, y en su
mayor parte las clulas mueren en pocos das o en algunas semanas. Adems, el subcultivo
se presta a una posible contaminacin o a una prdida del cultivo por accidentes de
laboratorio.
Reduccin metablica: Se puede reducir el metabolismo de los microorganismos
colocndolos en un medio que contiene elementos nutritivos mnimos. Se dejan los cultivos en
29

tales medios mnimos de agar y luego se sellan con cera para preservarlos a las temperaturas
de refrigeracin. Una varilla de agar del cultivo se puede recubrir con parafina lquida y
almacenar durante aos, se ha aplicado esta tcnica para la preservacin de los hongos. A
menudo se almacenan las bacterias esporuladas en suelo estril. En primer trmino se seca
el suelo a la temperatura del ambiente y luego se almacena a la temperatura de refrigeracin.
Desecacin: Algunas bacterias se preservan por desecacin. Se colocan grandes
concentraciones de la muestra en discos de cera u otro material adecuado y luego se pasan a
un desecador. Se elimina el aire en el desecador mediante una bomba de vaco. Despus del
secado, se pueden almacenar los discos de cera en recipientes estriles a 0-5C.
Congelacin: La mayora de las Bacterias pueden ser congeladas en varios tipos, de medios,
se congelan rpidamehte las muestras a temperaturas de -20 a 30C para mantener la mayor
parte de las clulas en un estado viable. Se han empleado con xito temperaturas ultrabajas
utilizando el hidrgeno lquido, a fin de almacenar y preservar una amplia variedad de clulas,
incluso hongos, virus, y hemates.
Congelacin-desecacin (liofilizacin): La formacin de cristales de hielo producidos
durante el proceso de congelacin pueden daar las clulas. Si se congela en primer trmino
la muestra en un bao que contiene hielo seco y acetona o alguna otra mezcla, se puede
extraer el agua que contiene por sublimacin y prevenir as ese inconveniente. Se emplea
comnmente esta tcnica para preservar cultivos y para remitirlos por correo
ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
EXPERIMENTACIN:
1. Los estudiantes procedern a realizar siembras en agar sangre cuyos resultados se
observarn en la siguiente semana.
2. Se evaluar el portafolio de coloraciones
3. Realizar el portafolio de la prctica e incluir los resultados, reflexiones y el cuestionario en el
mismo.

RESPONDER AL SIGUIENTE CUESTIONARIO:


1.
2.
3.
4.

Qu necesitan las bacterias hetertrofas para su crecimiento?


Cules son los requerimientos necesarios para el crecimiento bacteriano?
Qu significa la plasmlisis y la plasmoptisis?
Cul es la temperatura ptima de crecimiento para la mayora de bacterias que son
patgenas para el hombre?
5. Escriba un ejemplo de medios de cultivo de acuerdo a la categora para el diagnstico
bacteriolgico.
6. Complete: El medio de cultivo llamado agar.es
aquel que al ser calentado a ..C libera la hemoglobina y factores de crecimiento.

30

7. El
agar
MacConkey
se
considera
un
medio..porque permite reconocer las
bacterias que fermentan o no la lactosa, tambin es considerado un medio selectivo ya
que contiene y violeta cristal que
inhiben el crecimiento de bacterias no entricas.
8. Cmo se llama el medio de cultivo que sirve para el asilamiento selectivo de cocos
Gram positivos y bacilos anaerobios Gram negativos, inhibiendo el crecimiento de
bacilos Gram negativos?
9. Escriba el nombre de un medio de cultivo que permita el crecimiento de especies de
Neisseria (gonorrhoeae y N. meningitis).
10. Escriba el nombre de un medio de cultivo que reducen el potencial rdox favoreciendo
el crecimiento de anaerobios.
11. Mencione los criterios utilizados con frecuencia para caracterizar el crecimiento
bacteriano.
12. Mencione los 5 factores determinantes para la preparacin de un medo de cultivo.

31

PRACTICA No. 4
ANTIBIOGRAMA

OBJETIVOS:
Conocer y realizar el mtodo convencional de difusin en discos
Interpretar la sensibilidad y resistencia que presentan diferentes bacterias a los
antibiticos
CONTEXTUALIZACIN
Las enfermedades infecciosas siempre han sido un problema grave para el hombre, el
hallazgo de sustancias eficaces que pudieran ser utilizadas en el tratamiento de estas
enfermedades se remonta al siglo XVll en el que ya se emplearon sustancias qumicas como
la quinina para la malaria.
Hacia el ao de 1900, el trabajo de Paul Ehrlich marca el inicio de la quimioterapia como
ciencia pues este cientfico establece los principios de la toxicidad selectiva, el desarrollo de la
resistencia a los medicamentos y el uso de la terapia combinada para combatir dicha
resistencia.
Antimicrobiano o antibitico es una sustancia producida por microorganimos o de manera
sinttica, que tiene la capacidad de actuar sobre otros microorganismos inhibindolos o
destruyndolos.

TCNICA DE BAUER.KIRBY MODIFICADA PARA MEDICIN DE LA


SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
Reactivos y Materiales
1. Agar de Mueller Hinton: Preparar el agar de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Una vez salido del autoclave permitir que el medio alcance entre 45 y 50C, es
recomendable para asegurarse de tener esta temperatura colocar el medio que sale del
autoclave, en un bao Mara a 48C y mantenerlo ah por un tiempo prudencial hasta
32

que la temperatura interna del medio contenida en el recipiente alcance la temperatura


deseada.
En condiciones aspticas dispensar el medio en cajas petri estriles de 100 mm de
dimetro y permitir que solidifique el medio, cuidar de obtener un espesor de 4mm. Una
vez solidificadas colocar una de las cajas en la estufa a 37C, para control, chequear
hasta al da siguiente por ausencia de microorganismos. Seleccionar una caja de lote
preparado y someter a la prueba de inhibidores de timidina y timina utilizando
Streptococcus faecalis ATCC 29212 o 33186 y colocar un disco de cotrimoxazol. Un
agar de Mueller Hinton fiable debe mostrar una sensibilidad bien diferenciada de 20
mm de dimetro. Las cajas que no se utilicen deben colocarse en funda plstica y
guardarlas en la nevera en posiciri invertida. Conservarlas en refrigeracin hasta dos
semanas.

2. Caldo de Tripticase Soya (TSB): Para la suspensin se debe preparar de acuerdo a


las recomendaciones del fabricante un caldo de tipo de digerido de soya y casena y
dispensar 4 5 ml de este caldo en tubos adecuados.Un caldo se coloca en la estufa
para control y los otros se almacenan en la nevera.
3. Agua destilada estril y solucin salina estril al 0.85 %
4. Discos de antibiticos
5. Frascos con etanol al 70 %
6. Pinzas
7. Hisopos estriles
8. Regla en milmetros o plantilla de lectura
9. Mechero
10. Desinfectante TEGO
Preparacin del patrn de turbidez MacFrarland #0.5
Reactivos: Cloruro de Bario 0.048M (1.75%p/v), Acido Sulfrico 0.3N (1% p/v).
Aadir 0.5 ml de Cloruro de Bario a 99.5ml de Acido Sulfrico. La densidad ptica en un
espectrofotmetro a 625nm que debe dar 0.08 a 0,10 de absorvancia.
Tcnica
Una vez sembrado y obtenido el crecimiento de los microorganismos de una muestra clnica,
evaluar correctamente el hallazgo antes de decidir la realizacin del antibiograma.
Seleccionar 4 a 5 colonias similares del microorganismo suceptible de practicar el
antibiograma y colocarlas en el caldo de cultivo.
Incubar a 35C y mantenerlos en esa temperatura de 2 a 5 horas. Ajustar la turbidez del
cultivo a la turbidez del estndar MacFarland #0.5. Si la turbidez del cultivo sobrepasa a la del
estndar diluir con agua destilada estril a la concentracin deseada.

33

En las bacterias exigentes tales como Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae y


Streptococcus pneumoniae, obviar el paso de crecimiento en caldo y preparar un inculo
directamente en 4 a 5 ml de solucin salina y ajustarlo con el estndar MacFarland # 0,5 para
luego inocularlo en las cajas petri.
lntroducir un aplicador estril en el caldo de crecimiento, eliminar el exceso por rotacin en las
paredes del tubo luego inocular en un sentido en toda la superficie de la caja petri y repetir el
paso anterior en dos sentidos diferentes para finalizar la inoculacin pasar el aplicador por la
periferia del medio de cultivo.
Permitir secar la siembra mediante el reposo por un lapso de 3 a 5 minutos y no ms all de
15 minutos.
lntroducir la pinza en el frasco de alcohol y pasarla por el mechero esperar hasta que el fuego
de la pinza se consuma. Colocar los discos de los antibiticos seleccionados con la pinza e
impregnarlos en la superficie de las placas inoculadas haciendo una ligera presin sobre ellos.

Los discos deben quedar a una distancia de 15 mm de los bordes de la placa y


suficientemente alejados entre ellos para evitar la sobreposicin de halos.

.
La seleccin de los agente antimicrobianos se denominan batera de antimicrobianos, las
decisiones finales con respecto al contenido de la batera deben ser tomadas por el
laboratorista, el personal mdico (en particular de los especialistas en enfermedades
infecciosas) y de la farmacia.
El siguiente paso es incubar a 35C en un ambiente de aerobiosis sin CO2 ya que puede
alterar el pH de la superficie y consecuentemente el desarrollo de los microorganismos
inoculados, excepto para Haemophilus influenzae y Neisseria gonorrhoeae cuyas variaciones
de estandanzacin fueron determinadas bajo ese parmetro, chequear adecuadamente la
temperatura de la incubadora ya que si sobrepasa la temperatura ideal puede afectar la
prueba.

34

Luego de 16 a 18 horas de incubacin se procede a la lectura de las zonas, de inhibicin, para


ello se puede utilizar una regla o tambin se puede utilizar plantillas previamente diseadas
para el efecto. Una vez hecha la lectura de los halos de inhibicin se procede a comparar con
las tablas pertinentes para establecer la categora con la cual ser clasificado el
microorganismo para cada uno de los antibiticos.
Mtodos de prueba
Mtodos que miden directamente la actividad de antimicrobianos en forma directa
Las mediciones directas de la actividad antimicrobiana se hacen mediante:

Mtodos de prueba de sensibilidad convencionales, como dilucin en caldo, dilucin en


agar y difusin con discos (la explicada anteriormente)
Sistemas comerciales de pruebas de sensibilidad
- Mtodos de microdilucin en caldo
- Derivados de la dilucin en agar
- Derivados de la difusin en agar
- Sistemas automatizados de prueba de sensibilidad a antimicrobianos
Pruebas especiales de screening e indicadoras

CRITERIOS PARA EL CONTENIDO Y USO DE BATERAS DE ANTIMICROBIANOS


Identificacin del microorganismo o grupo: los antimicrobianos a los que le
microorganismo es intrnsecamente resistente se excluyen de rutina de la batera. Por
ejemplo vancomicina no se usa para bacilos gramnegativos.
Patrones de resistencia adquiridos frecuentes en la flora microbiana local: si la
resistencia a un agente determinado es frecuente, la utilidad del agente puede presentar
limitaciones suficientes como para que no se justifique la realizacin de pruebas de rutina
y solo los antimicrobianos ms potentes se incluyen en la batera de prueba. A la inversa,
puede que no sea necesario que los agentes ms potentes integren la batera de prueba
si la sensibilidad a agentes menos potentes es frecuentes.
Mtodo de prueba de sensibilidad a antimicrobianos usados: en funcin del mtodo
de prueba, algunos agentes no detectan la resistencia de forma confiable, y no deben
incluirse en la batera. Por ejemplo, la resistencia de Streptococcus Pneumoniae a la
cefotaxima no puede detectarse por difusin con discos, por lo que no debe formar parte
de una batera de prueba con discos.
Localizacin de la infeccin: los agentes antimicrobianos, como nitrofurantona, que
solo alcanzan niveles efectivos en el aparato urinario, no deben incluirse en bateras
probadas contra aislamientos bacterianos provenientes de otros sitios del cuerpo (es
decir, deben ser capaces de lograr la aproximacin anatmica).
Disponibilidad de los agentes antimicrobianos: las bateras de prueba de agentes
antimicrobianos se seleccionan por su capacidad de detectar resistencia bacteriana a
agentes utilizados por el personal mdico al que presta servicios el laboratorio.

35

El NCCLS publica tablas actualizadas que enumeran los posibles agentes antimicrobianos a
incluir en las bateras de prueba contra determinados microorganismos o grupos de
microorganismos.
DISCOS DE ANTIBITICOS USADOS PARA GRMENES GRAM POSITIVOS Y GRAM
NEGATIVOS TOMANDO EN CUENTA AL PACIENTE AMBULATORI
GRAM POSITIVOS
Oxacilina (ox)
Eritromicina (E)
Clindamicina (cc)
Cefoxitin (fox)
Sulfas (sxt)
Ciprofloxacina (cip)
Vancomicina (va)

GRAM NEGATIVOS
Ampicilina (am)
Cefuroxima (cxm)
Ampicilina + sulbactam (sam)
Gentamicina (gm)
Norfloxacina (nor)
Nitrofurantona (fm)
Sulfas (sxt)

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
EXPERIMENTACIN
1. Continuando con la prctica anterior, cada estudiante realizar la observacin de las
colonias sembradas en agar sangre y realizar la coloracin Gram de dos
colonias diferentes, observar en el microscopio y anotar los resultados de todos los del
equipo de trabajo en un cuadro para el informe pendiente.
2. Se realizar el antibiograma y su respectiva interpretacin. Trabajo grupal.
RESPONDA AL SIGUIENTE CUESTIONARIO:
1. Cmo se llama la tcnica empleada en clases para medicin de sensibilidad de
antimicrobianos?
2. Para qu sirve el caldo de tripticasa soya en el antibiograma?Qu tipo de medio es:
enriquecimiento, universal, selectivo, etc.?
3. Se puede realizar el antibiograma nicamente con el resultado Gram? Qu falta
realizar antes?
4. Se compara el patrn de turbidez Mac Farland con el cultivo realizado en el medio de
Muller Hinton o con el caldo de cultivo TSB?
5. Qu debe hacer cuando la turbidez supera al patrn Mac Farland?
6. A qu temperatura se debe incubar el cultivo lquido (TSB) y el slido (Muller Hinton?
Porqu?
7. Por qu razn se debe obviar el crecimiento de bacterias como Haemophilus
influenzae, Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus pneumoniae en el caldo de TSB?
Qu debe hacer?
8. A qu distancia se deben poner los discos de antibiticos en el medio de Muller
Hinton?Porqu?
9. Se puede utilizar Vancomicina en un antibiograma para la Escherichia coli? Porqu?
10. Porqu razn la Nitrofurantona no debe ser utilizada para las vas respiratorias?
36

11. Podemos utilizar la Ampicilina para bacterias cuyo resultado Gram es: cocos Gram
positivos dispuestos en cadena?
12. Cmo se llama el mtodo convencional empleado para realizar el antibiograma
empleado en la prctica de nuestra clase?

37

PRACTICA NO. 5
IDENTIFICACIN DE COCOS GRAM POSITIVOS

OBJETIVOS:
Conocer los diferentes fundamentos de las pruebas empleadas para la identificacin
Realizar los diferentes mtodos de identificacin de las familias y gneros de cocos
Gram positivos
Reconocer algunas especies mediante las tcnicas de identificacin empledas
FAMI LIA Micrococcaceae

Son cocos gram positivos, aparecen solos, en pares, tetradas, paquetes de ocho y en
racimos. No mtiles, no esporulados, catalasa (+), reducen nitratos a nitritos.
Las colonias son redondas, lustrosas, blancas aunque tambin existen especies pigmentadas.
Forman esta familia especies Saprfitas, parsitas y patgenas que se encuentran
distribuidas ampliamente en la naturaleza
Los grieros Micrococcus y Staphylococcus forman parte de la flora humana y de animales
pero tambin existen ciertas especies patgenas para el hombre.
El gneio Staphylococcus contiene tres especies de importancia clnica:
Staphylococcus aureus: (facultativo anaerobio)

38

Puede infectar cualquier parte del cuerpo humano, es la causa ms comn de infecciones
supurativas, en casos severos puede producir septicemias, es frecuentemente el agente
causal de la ostiomielitis.
Cepas de S. aureus cuando crecen en altas concentraciones de CO2 (30%) pueden producir
una enterotoxina termoestable, causante de envenenamiento por alimentos.
Otras cepas producen una toxina epidermoltica (exfoliativa) causante del sndrome de piel
escaldada.
Staphylococcus epidermidis:
Se lo encuentra en el aire y en la piel. Normalmente no patgeno, pero puede causar
infecciones secundarias de la piel, heridas posquirurgicas y endocarditis posoperatorias.
Staohylococcus saprofiticus:
Se lo encuentra en el aire, polvo y productos animales. Generalmente considerados no
patgenos, pero en ocasiones puede producir infecciones urinarias.
Micrococos: (estrictos aerobios)
Forman parte de la flora normal de la piel y mucosas.
Las coloirias son blancas y chiclosas.
Peptococcus:
Son anaerobios estrictos se los considera los Estafilococos anaerbicos, se los encuentra en
cultivos de heridas profundas.

39

FAMILlA Streptococcaceae

Son cocos gram positivos que se dividen en un solo plano, formando pares o cadenas,
aerobios y anaerobios facultativos. No producen esporas, no son mtiles. Son catalasa
negativa.
Este gnero contiene organismos patgenos para el hombre. Los ms importantes
son:
GRUPO A: Streptococcus pyogenes
GRUPO B: Streptococcus agalactiae (pigmento)
GRUPO D: Enterococcus faecalis
Streptoccocus pneumoniae y grupo viridans

Enfermedades: faringitis estreptoccica, escarlatina, endocarditis, neumonas, infecciones en


el R.N.

40

Adems las infecciones causadas por Estreptococos del grupo A pueden llevar a sndromes
post-infecciosos de fiebre reumtica, cardiopatas reumticas y glomrulo nefritis aguda.
Los estreptococos tienen hemolisinas que actan de diferente manera en agar sangre:
Hemlisis beta: zona clara alrededor de la colonia
Hemlisis alfa: zona de hemlisis incompleta (verde).
Hemlisis gamma: ausencia de hemlisis

Streptococcus pneumoniae
Son dipldcocos gram positivos, con los extremos alargados en forma de lanza, tambin se
agrupan en cadenas; no forman esporas, no mtiles, poseen una cpsula formada de
polisacridos especficos, lo que permite una tipificacin con antisueros especficos.
Patgenos para el hombre, producen neumonas, meningitis, otitis y endocarditis. Crecen bien
en agar sangre y chocolate en atmsferas que contienen el 10% de CO2.

PRUEBAS DE LABORATORIO
-Catalasa: la catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H 2O2) en
oxgeno y agua.El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del
metabolismo oxidativo o aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el perxido
de hidrgeno es letal para las clulas bacterianas.
41

2H2O2

2H2O

O2 (burbujas de gas)

Procedimiento: En una placa portaobjetos aadir 1 o 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3%


(diluir la solucin al 30% con agua destilada), transferir clulas del centro de una colonia bien
aislada y mezclar. La rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas o
efervescencia indica una reaccin positiva.

-Coagulasa: la coagulasa es una enzima proteca de composicin qumica desconocida, con


actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibringeno en fibrina,
provocando la formacin de un cogulo visible en un sistema analtico adecuado. En el
laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza ms comnmente para diferenciar al S. aureus
(coagulasa positivo) de otros estafilococos y micrococos.us (coagulasa positivo) de otros
estafilococos y micrococos. La coagulasa se halla en 2 formas, libre y fija, cada una de las
cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de tcnicas separadas.
Prueba en tubos (coagulasa libre):
1. Colocar aspticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo
estril.
2. Mezclar por rotacin suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido.
3. Colocar el tubo en la incubadora de 4 a 24 horas. Observar la formacin de un coagulo
visible.
La reaccin se considera positiva ante cualquier grado de coagulacin visible dentro del
tubo.

42

-Novobiocina: Se usa el agar Mueller-Hinton, como el antibiograma tambin en agar


sangre.
Se utiliza para identificar que tipo de Staphylococcus coagulasa negativos es. Pueden ser
sensibles o no a la novobiocina (5 g). Staphylococcus epidermidis es sensible, mientras que
Staphylococcus saprophyticus no lo es.
Procedimiento: Se toma un agar Muller Hinton agar sangre y en un lado de la placa se
estria con el asa en forma continua la cepa del Staphylococcus coagulasa negativo, con una
pinza estril se coloca el disco de novobiocina en el centro del estriado realizado se incuba a
35C por 18 horas.
Interpretacin de resultados: Un halo de inhibicin de crecimiento menor o igual a 16 mm
correswponde Staphylococcus saprofiticus. Un halo de inhibicin mayor de 16 mm
corresponde al Staphylococcus epidermidis (tambin pueden ser otros estafilococos
negativos).

-Bacitracina: las pruebas presuntivas en la identificacin del EbHGA (Estreptococo beta


hemoltico del grupo A) se basan en la susceptibilidad e inhibicin del crecimiento en una
placa de agar sangre, y que tienen la mayor parte (95%) de las cepas al ponerlas en contacto
con discos que contienen dosis bajas (0.04U) de bacitracina.
Procedimiento: Se toma un agar sangre y en un lado de la placa se estria con el asa en
forma continua la cepa de estreptococo beta hemoltico, con una pinza estril se coloca el
disco de bacitracina en el centro del estriado realizado. La placa de agar sangre es incubada a
35-37 C durante toda la noche. Los resultados son cualitativos y es positiva para
estreptococo beta hemoltico del grupo A si se encuentra cualquier halo de inhibicin
alrededor del disco.
-Camp: Se realiza en agar sangre. Se usa para poder identificar que estreptococo puede ser
(A, B, D). Se basa en que los estreptococos del grupo B (Streptococcus agalactiae) producen
un factor llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina cclica) que aumenta la zona de
hemlisis producida por un estafilococo productor de lisina.
Procedimiento: La prueba se realiza en agar sangre, colocando una estra del estreptpcoco
sospechoso del grupo B y luego se coloca otra estra en forma perpendicular del estafilococo
productor de lisina, el resultado es positivo cuando hay la presencia de una zona de
potenciacin de la hemlisis en forma de puntas de flecha en el lugar donde se contactan las
dos estras. La lisina aumenta la zona de hemlisis producida por un estreptococo del grupo
B.
43

-Bilis esculina: Los estreptococos del grupo D crecen rpidamente en el agar bilis esculina e
hidrolizan la esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde
oliva hasta negro. Las sales biliares presentes inhiben el desarrollo de la flora acompaante.
-Optoquina: se usa el disco de optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae (sensibles) y
otras especies de estreptococos a hemolticos (resistentes). La sensibilidad a la optoquina es
una medida de la fragilidad de la membrana celular bacteriana. La optoquina, que es el
clorhidrato de etilhidrocuprena.
Procedimiento: Se toma una suspensin de colonias puras en caldo Mueller Hinton o
tioglicolato y con un hisopo se estra una placa de agar sangre de carnero al 5 %. Sobre la
estra se coloca el disco de optoquina. Se incuba con atmsfera de CO2 al 5 %(jarra con vela)
durante 24 hs. a 35 C.
Interpretacin: Sensible, cuando hay inhibicin alrededor del disco. Se considera como punto
de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos de 6 mm). Resistente, cuando el
crecimiento no es inhibido alrededor del disco. Los casos de halos intermedios deben
resolverse por acumulacin de pruebas a favor o en contra.

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
EXPERIMENTACIN
1. Se realizarn pruebas de:
- Catalasa para diferenciar a la familia Micrococcaceae de Streptcoccoceae
-Coagulasa para identificar al Staphylococcus aureus
-Novobiocina, bacitracina, optoquina, Camp
- Diferenciar hemlisis en agar sangre
2. Realizar el portafolio de la prctica correspondiente y colocar los resultados obtenidos.

RESPONDA AL SIGUIENTE CUESTIONARIOCUESTIONARIO:


1. Qu tcnicas diagnsticas se utilizan en el laboratorio para identificar a los a los
Staphylococcus y a los Streptococcus?
2. Cmo se presentan en la coloracin Gram las bacterias pertenecientes a la familia
Micrococcaceae y la Streptococcaceae?
3. Cmo identificamos al Staphylococcus aureus del Strpetoccous pyogenes? Mencione
varias tcnicas de identificacin que ayuden para este propsito.
4. Segn el grado de hemlisis clasifique a varias especie de Streptococcus y coloque
adems las diversas pruebas con las que se las puede identificar.
5. Mara Teresa presenta una herida post-quirrgica con abundante pus, su mdico
solicita realizar exmenes microbiolgicos para detectar el microorganismo presente:

44

a. Cuales seran los pasos para la identificacin del microorganimo luego de tomar la
muestra? Coloque los resultados obtenidos en cada paso.
b. Cul sera el microorganismo presente segn los resultados del literal 5.1.?
c. Qu antibiticos empleara?
6. Jos Antonio presenta fiebre reumtica, su mdico solicita realizar exmenes
microbiolgicos para detectar el microorganismo presente:
a. Cuales seran los pasos para la identificacin del microorganimo luego de tomar la
muestra? Coloque los resultados obtenidos en cada paso.
b. Cul sera el microorganismo presente segn los resultados del literal 6.1.?
c. Qu antibiticos empleara?
7. Utilizando una foto explique la prueba de Camp.
8. Verdadero o falso:
Es mejor sembrar al Streptococcus pneumoniae en agar chocolate que en agar sangre
(justifique su respuesta).
9. Mencione dos diferencias entre enterococos y no enterococos.
10. Por qu razn especies de bacterias del gnero Micrococcus crecen bien en agar
sangre en una atmsfera con oxgeno?
11. Cmo identificara al Staphylococcus saprofyticus del Streptococcus pneumoniae?.
Mencione dos pruebas microbiolgicas.
12. Segn el grado de hemlisis como puedo identificar al Streptococcus pneumoniae del
Streptococcus pyogenes?. Mencione dos pruebas microbiolgicas.

45

PRACTICA No. 6
ORINA

OBJETIVOS:
Conocer la forma adecuada de recoleccin de una muestra de orina tanto en hombres
como en mujeres
Realizar el examen elemental y microscpico de orina y Gram gota fresca
Conocer la realizacin de un urocultivo y los diferentes microorganismos que pueden
estar presentes
CONTEXTUALIZACIN
El examen general de orina de rutina urianlisis es una de las primeras pruebas usadas
para la identificacin de patologa en las vas urinarias y es parte indispensable de la patologa
clnica. Puede proporcionar una estimacin de la funcin renal, dar informacin sobre las
posibles causas de disfuncin e incluso puede indicar enfermedad sstmica. El examen
general de orina es un estudio cuidadoso y sistemticos de las prpiedades fsicas, qumicas
y microscpicas de la orina. Aunque los datos que se obtienen slo en ocasiones ayudan a
dar un diagnstico tentativo, al mismo tiempo sirven de gua para seleccionar pruebas ms
especficas para un diagnstico definitivo.

RECOLECCIN DE LA MUESTRA
Obtencin limpia del chorro medio de orina
-La informacin adecuada al paciente es esencial, deben prepararse pautas para la obtencin
apropiada de la muestra en una tarjeta impresa, con el procedimiento descrito y
prefentemente ilustrado para asegurar el cumplimiento por parte del paciente.
-Debe indicarse al paciente que se lave y enjuague bien las manos
-Luego que higiniece bien el rea periuretral con un antisptico suave para evitar la
contaminacin.
-Indicar al paciente que se enjuague muy bien, porque el antisptico puede ser
bacterioesttico, en las mujeres se debe hacer que escurra el agua de adelante hacia atrs.
46

-Una vez completada la higiene, el paciente debe retraer los labios vaginales o el glande del
pene, empezar a orinar. En cuanto cierta cantidad de orina haya limpiado la entrada uretral
obtener una muestra de orina del chorro medio de la miccin, se coloca el frasco de
recoleccin en posicin con la mano libre, sin tocar la superficie de el borde interno de la
abertura con los dedos, es importante indicar a los varones que la punta del pene no debe
tocar ninguna de las partes del frasco recolector en ningn momento.
-Cuando la muestra est dentro del frasco, se tapa tan pronto como sea posible para evitar la
contaminacin bacteriana proveniente del aire. Es indispensable no tocar la superficie intena
de la tapa. El frasco de recoleccin debe ser estril.
-Llevar de inmediato al laboratorio, cuando hay que esperar ms de una hora se debe
refrigerar.

ELEMENTAL Y MICROSCPICO DE ORINA (EMO)


Consta de tres partes:
- Macroscpico: color, aspecto, olor,

Parmetro
determinado por
la concentracin
de la orina.
Dependiente
especialmente de
pigmentos
urocrmicos,
urobilina y
uroeritrina

En condiciones
referenciales, la orina
presenta un color de
amarillo plido a ambar
oscuro.

*Blanco: Presencia de quilo pus.


*Amarillo/Naranja: Bilirrubina,
Urobilina, colorantes de alimentos,
derivados del caroteno.
*Rosa/Rojo: Eritrocitos, Hemoglobina,
Mioglobina, Colorantes de alimentos,
antocianinas.

El color de la orina puede


variar desde blanco hasta
castao o negro; Tambin
puede ser Anaranjado,
Rosa, Rojo Prpura Azul
verde.

*Rojo/prpura: Porfobilina,
porfobilingeno, uroporfirina.
*Castao /Negro: Bilirrubina, Fenol,
Melanina, Porfirinas.
*Azul/Verde: Biliverdinas, Complejo de
vitamina B.

- Qumico: pH, densidad, leucocitos, nitritos, proteinas, glucosa, urobilingeno, bilirrubina,


cuerpos cetnicos, sangre.

47

- Microscpico: leucocitos, eritrocitos, clulas bajas, clulas altas (se reporta nmero por
campo en 10 campos con lentes 40x), moco, bacterias, cristales, parsitos, hongos (se
reporta por cruces en 10 campos con lentes 40x) y cilindros se reporta nmero por placa (con
lentes de 10x).

Clulas epiteliales bajas

Hemates

GRAM GOTA FRESCA


La observacin en fresco permite descartar o afirmar la presencia de bacterias, al teirlas con
la coloracin de Gram tenemos ya una orientacin sobre que microorganismo puede ser el
causante de infeccin urinaria.
En un examen en fresco de una orina normal puede haber escassimo nmero de clulas
epiteliales, hemates y leucocitos.

CULTIVOS DE ORINA (Urocultivos)


Los organismos que pueden encontrarse en la orina incluyen: Escherichia coli, Proteus,
Pseudomona aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, enterococos,
Mycobacterum tuberculosis, Serratia, Klebsiella y Enterobacter.

48

Una vez recogida la muestra en las condiciones anteriormente descritas se debe proceder a
cultivar enseguida, no debe pasar ms de una hora entre la recogida de la muestra y el
cultivo.
El cultivo de la muestra de orina comprender preferiblemente una tcnica cuantitativa y otra
cualitativa.
Puesto que en la orina nos encontramos con organismos Gram positivos y negativos es
necesario realizar cultivos para ambos grupos.
As se utilizar agar sangre para los Gram positivos (se puede aadir cido nalidixico
colimicina para evitar crecimiento de Gram negativos) y Mc Conkey o EMB para los Gram
negativos.

El cultivo cuantitativo de la orina puede verificarse bien con una asa de 0.001ml, se utiliza
muestra no centrifugada.
El nmero total de bacterias encontradas por mililitro es el siguiente se cuenta cuantas
colonias crecieron y se multiplica por 1000.
Una bacteriuria infenor o igual a 10.000 grmenes por ml se considera que no tiene
significacin patolgica, ms all de los 100,000 grmenes por ml, la infeccin urinaria es
prcticamente segura.
Entre 10.000 y 100.000 grmenes por ml, la repeticin del examen y el contexto clnico son
indispensables para una correcta interpretacin.
La presencia de 104 /ml de un solo tipo de bacilo Gram negativo es una indicacin consistente
de infeccin de vias urinarias, en especial en varones. En algunas ocasiones en mujeres
jvenes con disuria e infeccin de vas urinarias agudas tendrn 102 o 103 por mililitro.
Es importante la identificacin del microorganismo causante de la infeccin y que el cultivo
sea puro para luego realizar un antibiograma.
As, la interpretacin de los resultados del cultivo de orina depende del mtodo de recogida y
entrega al laboratorio, de los tipos y nmero de bacterias presentes y de la valoracin de
estos hallazgos en relacin con el cuadro clnico del paciente.

49

PRUEBA DE BAAR EN ORINA


Cuando se sospecha de una infeccin tuberculosa del aparato urinario, deber examinarse el
sedimento de la orina centrifugada por media hora a 3000 rpm por seis das consecutlvos. Se
recomienda la recogida de la orina matutina pero todo su volumen en recipientes estriles.
Las extensiones del sedimento se tien mediante la coloracin de Ziehl Neelsen y se busca la
presencia de organismos cido resistentes.
Para el reporte igual que para esputo, si se siembra esta muestra en medio de Lowenstein
Jensen se debe tratar previamente a la muestra por digestin como a la muestra de esputo.
50

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
EXPERIMENTACIN
1. Cada grupo de trabajo recibir una muestra de orina para que le realicen un EMO,
Gram gota fresca y un urocultivo. Para esta actividad los estudiantes deben revisar los
procedimientos mencionados y la manera en que se deben reportar. Se evaluar el
informe durante la clase.
2. Realizar un portafolio de la prctica y subirlo a la plataforma Moodle.

51

PRCTICA No. 7
IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

OBJETIVOS:

Mediante el empleo de medios de cultivos identificar enterobacterias


Realizar la correcta interpretacin de las reacciones de los medios de cultivos mediante
la intervencin de enzimas y cambios de pH

1. ENSAYO DEL ROJO DE METILO (RM/VP)


Principio
El test se usa para determinar la presencia de iones hidrgeno cuando un microorganismo
fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa
en cido pirvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan
cido pirvico producen cido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan,
en cambio, el camino del butilenglicol producen acetona y butanodiol (diacetilo). El
indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es til
para la diferenciacin de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo
negativo).
Procedimiento y resultado:

Con un asa estril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP.
Incubar a 35 C por un mnimo de 48 horas.
Transferir 2.5 ml de la suspensin a un tubo.
Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.
Agregar 5 gotas del indicador rojo metilo y observar si hay cambio de color.
Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.
Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
Si el resultado es negativo continuar la incubacin de la bacteria por 24 horas ms.

52

2. ENSAYO DE VOGES-PROSKAUER
Principio
El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del cido pirvico
un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como
productos finales cidos lctico, actico o frmico. Otros metabolizan el piruvato por el
camino del butilenglicol para formar como productos finales acetona (acetilmetilcarbinol) y
2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos
metablicos. En presencia de oxgeno e KOH, la acetona se oxida a diacetilo, que da un
complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de alfa-naftol antes
del agregado de KOH.
Procedimiento y resultados:

Con un asa estril tomar material e inocular un tubo de RM/VP


Incubar a 37C por un mnimo de 48 horas
Agregar unas gotas del reactivo de alfa-naftol
Agregar unas gotas del reactivo de KOH
Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos
Observar la formacin de un color rosado a rojo

3.PRUEBA DE LA UREA
Principio
La urea es una diamida del cido carbnico, cuya hidrlisis por accin de la ureasa da 2
molculas de amonaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza
independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de
la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinizacin del medio. Es una
actividad caracterstica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de
Escherichia (-) y Proteus (+ rpido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de
Yersinia pestis (-)
Procedimiento y resultados

Con un asa estril se toma abundante material y se inocula por puncin

53

Se incuba a 37C y se efectan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos


negativos se observan diariamente por 4 a 7 das para detectar reacciones tardas
que dan ciertos miembros de la familia, registrando los resultados da por da.
Ensayo positivo: aparicin de color rojo en el medio por una alcalinizacin del
mismo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.

4. PRUEBA DEL SIM (H2S, indol, motilidad)

Determinar si la bacteria a travs de Triptofanasas puede degradar el Triptfano a


indol.
Determinar si hay produccin de H2S a partir de aminocidos azufrados dando como
resultado un color negro
Determinar si la bacteria es mvil mediante la difuminacin de la misma hacia los lados,
de lo contrario, la bacteria slo crece en la lnea de inoculacin

Principio del Indol


El indol es uno de los productos del metabolismo del aminocido triptofano. Con un medio
rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos
aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un mtodo rpido
para detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del
aldehdo se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente til en la identificacin preliminar
de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+)de Salmonella (-).
Procedimiento y resultados
Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular en el medio SIM.
Incubar a 37C por 18 a 24 horas.
Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.
Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el medio y el reactivo.
Si el ensayo es negativo no hay cambio ded c o hay un color amarillo en la
interfaseolor, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.

54

5. AGAR KLIGLER (TSI)


Principio
El agar de Kligler contiene dos azcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%).
Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la puncin como la estra aparecern
de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y, la estra permanecer cida
(amarilla). Si no fermenta lactosa, la estra se vuelve alcalina (roja). Los organismos que
no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirn productos
alcalinos y el medio permanecer rojo. La produccin de SH2 se manifiesta por un
ennegrecimiento del medio.
Resultados
Estra cida/fondo cido (amarillo/amarillo): fermentacin de glucosa, lactosa (E.
coli)
Estra alcalina/fondo cido (rojo/amarillo): fermentacin de glucosa solamente
(Shigella spp.)
Estra alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa)
Precipitado negro en el fondo: produccin de SH2 (Salmonella spp)
Burbujas o roturas: produccin de gas (E. coli, Salmonella spp.)

55

6. PRUEBA DE LA LISINA (CARBOXILASA-DIHIDROLASA)


Principio
La descarboxilacin es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo
carboxilo de los aminocidos, formando la correspondiente amina. La decarboxilacin de
lisina da cadaverina (diaminas). Como la decarboxilacin es una reaccin anaerbica, se
debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estril. El proceso ocurre en dos
etapas: por fermentacin de la glucosa se produce una acidificacin del medio (pH < 6.0),
apareciendo color amarillo. La acidificacin es necesaria para que ocurra la
decarboxilacin. Este ltimo proceso de lugar a la formacin de las aminas que elevan el
pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta.
La prueba de la lisina ayuda en la diferenciacin de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de
Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter
agglomerans (-)
Procedimiento y resultados:

Tomar material con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los aminocidos
Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estril.
Incubar a 37C
Efectuar las lecturas da por da hasta 4 das, registrando los resultados da por da
Ensayo positivo: medio turbio y prpura a prpura amarillento
Ensayo negativo: color amarillo
Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo
es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo)

7.PRUEBA DEL CITRATO


Principio
Es uno de los test del IMVIC (Indol, Rojo de metilo, Vogues-proskauer y Citrato) usado
para diferenciar enterobacterias. Hay microorganismos capaces de utilizar el citrato como
nica fuente de carbono produciendo alcalinidad, se detecta en un medio de cultivo con
56

citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio
Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a
pH 7,6. Cuando el resultado es positivo el medio de cultivo se vuelve azul y cuando es
negativo se mantiene verde.
Procedimiento
Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en
un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir
falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C
durante 4 das. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra,
acompaado o no de un viraje del indicador al azul.
Resultados
(+)Klebsiella spp , ( - ) Escherichia Coli
8. FENILALANINA DESAMINASA
Las desaminasas catalizan la prdida de NH3 en un aminocido originando un cido
carboxlico. Las bacterias que desaminan la fenilalanina producen cido fenilpirvico que
con Fe3Cl en solucin cida produce un color verdoso ( resultado positivo) y cuando es
negativo es de color amarillo (reactivo es de color amarillo).
7. MALONATO
El fundamento es igual al citrato, de esta manera se puede observar si se utiliza al
malonato como fuente de carbono.

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
1. Efectuar la siembra en los medios de cultivo para la identificacin de bacilos Gram
negativos, partiendo de un medio Mac conkey en donde un microorganismo "x" se ha
desarrollado. Trabajo grupal, venir estudiando la prctica, se evaluar durante la
clase.
2. Realizar el portafolio de la prctica y subirlo a la plataforma Moodle.

57

PRCTICA No. 8 (PRIMERA PARTE)


COPROLGICO Y COPROPARASITARIO
Objetivos:
-Realizar el examen coproparasitario utilizando soluciones apropiadas
-Identificar diversos parsito causantes de infecciones
1. Obtencin de la muestra para el examen coproparasitario:
-Recoja las heces directamente en un recipiente adecuado, limpio y seco, sin contaminarla
con orina, agua o cualquier material extrao proveniente del suelo (el agua o la orina pueden
destruir los trofozoitos si estn presentes)
-Muestras frescas deben ser examinadas o procesadas dentro de los 30 minutos posteriores a
la recoleccin pues es ms probable que en estas se encuentren trofozoitos mtiles. Las
muestras blandas pueden ser examinadas hasta despus de 2 horas.
-Guardar a temperatura ambiente mximo por 1 a 2 horas. En refrigeracin hasta por 48 horas
si no dispone de preservantes.
- Preserve las muestras tan pronto como sea posible. La muestra debe ser dividida y
guardadas en dos diferentes preservantes: formalina al 40% y PVA.
-Usando los recipientes adecuados. Aada un volumen de heces a 3 volumenes del
preservante.
-Asegrese de que la muestra se mezcle bien con el preservante (heces formadas necesitan
ser bien desarmadas).
-Asegrese de que el recipiente est bien sellado. Refuerce con parafilm y otro material.
Guarde el recipiente en una funda plstica.
Observaciones:
- Ciertas drogas y compuestos pueden provocar que la muestra sea insatisfactoria para la
examinacin. Las muestras deben recolectarse antes de que estas sustancias sean
administradas o despus de que los efectos hayan pasado. Tales sustancias incluyen:
anticidos, caoln, aceite mineral y otras sustancias que contengan aceites, antidiarreicos no
absorbibles, bario o bismuto (se necesitan 7 a 10 das para superar estos efectos), agentes
antimicrobianos (2 a 3 semanas) y pigmentos biliares (3 semanas).
- La recoleccin de la muestras deber repetirse si la primera examinacin es negativa. Si es
posible, deben examinarse 3 muestras con intervalos de 2 a 3 das.
- Al momento de recibir la muestra fjese que est en el recipiente adecuado y correctamente
identificada: nombre, nmero, edad, fecha, hora de recoleccin de la muestra.

58

2. Examen corpolgico y coproprasitario


a. Macroscpico:
Examine macroscpicamente usando un aplicador para detectar la presencia o ausencia de:
progltides, esclex o gusanos adultos. Puede encontrar progltides mtiles de tenias entre o
sobre las heces. Ocasionalmente puede encontrar en la superficie de las heces gusanos de
Ascaris y Enterobius.
COLOR: la dieta es el factor determinante de mayor importancia
OLOR: el olor normal de las heces no es muy desagradable y se debe al indol y al escatol
(sustancias aromticas provenientes de la desaminacin y descarboxilacin del triptfano por
las bacterias). Las dietas a base de carne lo hacen ms desagradable al igual que la
presencia de metano, cido sulfhdrico y metilmercaptano; las dietas vegetarianas y leche lo
producen casi nulo.
CONSISTENCIA: normalmente la deposicin debe ser slida, formada, es decir cilndrica y
consistente, para mantener esta forma despus de excretada. Mientras mayor es el tiempo da
trnsito intestinal mayor es la firmeza de las heces en trminos generales. Los nios tienden a
presentar heces fecales ms blandas.
La consistencia de las heces fecales debe reportarse como: dura, pastosa, blanda,
semilquida y liquida. La consistencia pastosa es la normal

La consistencia de las heces nos puede dar una idea del estado de vida del parsito que
buscamos, as para protozoarios intestinales: las formas qusticas sern posiblemente ms
observadas en heces formadas o semiformadas, pastosas; mientras que los trofozoitos se
hallarn en heces semilquidas y lquidas.
En el caso de los helmintos intestinales, huevos, larvas se pueden encontrar en heces fecales
de cualquier consistencia. Se puede sospechar de infeccin amebiana cuando las heces
fecales estn Iquidas y gaseosas.

59

MOCO: su aparicin suele ser reconocida macroscpicamente. Si est mezclado con las
heces, dando un aspecto brillante, procede del intestino delgado. Moco en colon distal, moco
opaco, mezclado con clulas epiteliales, sangre o pus es indicativo de un proceso inflamatorio
(enteritis o colitis).
El moco tambin est presente en heces fecales de pacientes con infeccin donde se hallarn
trofozoitos.
RESTOS ALIMENTICIOS: normalmente no hay restos alimenticios macroscpicos o estos
son escasos. La digestin deficiente en algunos tramos del tubo gastrointestinal se evidencia,
en el examen coprolgico, por la aparicin de restos alimenticios ingeridos, siempre que el
defecto no haya sido compensado en tramos inferiores. Sin embargo seala trastornos
anteriores al colon: gstricos, pancreticos de intestino delgado, etc.
Para el uso clnico corriente basta la observacin macroscpica de las heces y el examen
microscpico de las preparaciones clsicas
En general, una aceleracin global del trnsito gastrointestinal determina la presencia de
restos groseros de los alimentos en las heces (lientera) y al examen macroscpico la
aparicin de esteatorrea, creatorrea y amilorrea.
SANGRE: normalmente no debe existir sangre macroscpica. Patolgicamente se observa en
hemorroides, tumores de colon distal, etc.
b. Microscpico:
Para el examen microscpico se necesita de las siguientes soluciones:
Solucin salina al 0,85%:
- Conserva la motilidad de los trofozoitos,
- No es buena par la identificacin definitiva de ciertas especies de protozoarios intestinales
en su fase qustica debido a que la estructura interna est probremente definida
- Los trofozoitos se presentan mtiles, transparentes, refrctiles y se pueden observar dentro
de ellos glbulos rojos fagocitados.
- Los quistes aparecen redondos, contorno definido, se ven bien los cuerpos cromatoides
(refrctile
- Para huevos y larvas de helmintos intestinales tambin es muy til esta solucin.
Solucin de lugol:
- Hace ms notable la estructura interna de los parsitos intestinales.
Los quistes se tien rnuy bien con el lugol haciendo posible la identificacin correcta de la
especie: se puede observar el nmero y estructura del nucleo, la cromatina toma un color caf

60

oscuro, el citoplasma un color amarillo o naranja, las masas de glucgeno se tien de caf
rojizo. Los cuerpos cromatoides son menos visibles que en solucin salina
- Destruye la motilidad de los trofozoitos.
- Se observan mejor las caracterfsticas morfolgicas de huevos y larvas de helmintos
intestinales.
-Facilita tambin la observacin de los siguientes elementos:
CLULAS:
- La presencia de clulas epiteliales es indicativo de irritacin gastrointestinal.
- Los eritrocitos no deben ser observados en condiciones normales. Su presencia evidencia
sangrado en la parte baja del apararato digestivo.
- Los leucocitos normalmente no se observan o son escasos. Nmeros elevados aparecen
en las inflamaciones gastrointestinales; indican principalmente infeccin bacteriana. Se
pueden observar macrfagos y leucocitos en los casos de disentera amebiana crnica con
invasin bacteriana secundaria. Los eosinfilos son numerosos en la amebiasis
especialmente en la fase aguda.
- Los PMN (polimorfonucleares) pueden ser identificados por presentar forma redonda o
irregular, de 10 a 20 , citoplasma claro, refringente, granuloso y el ncleo escasamente
notable. Se los puede observar mejor si se aade una gota de cido actico al 10% a la
emulsin de heces. Se debe informar en que cantidad se encuentran por campo. Si se
observan ms de 10 leucocitos por campo, se hace una lmina y se colorea con Wright, se
hace el recuento diferencial y si hay mayor cantidad de neutrfilos (polimorfonucleares) la
infeccin es causada por bacterias, si hay mayor cantidad de mononucleares la infeccin es
de tipo viral.
CRISTALES:
- Oxalato de calcio, y fosfato triple: son encontrados con frecuencia y carecen de
significado clnico al igual que escasos cristales de cidos grasos.
- Cristales de hematoidina: son agujas amarillas que se presentan en grupo o haces
despus de hemorragia intestinal.
- Cristales de Charcot-Leyden: tienen forma de rombos alargados, normalmente se
encuentran en el citoplasma de los eosinfilos. Se observan ocasionalmente en las
infecciones parasitarias, especialmente en amebiasis invasora.
ALIMENTOS NO DIGERIDOS:
- Sustancias vegetales: las clulas vegetales se observan en varias etapas de
descomposicin. Los pelos vegetales son de tamao variable (50-300), truncos en un
extremo y delgados en el otro, curvos, de color amarillo plido o transparentes.
En su interior se observa un conducto central estrecho, vaco, entre dos capas transparentes
que refractan la luz. Los pelos vegetales se asemejan a las larvas de Strongyloides.
- Sustancias animales: las fibras de carne digerida tiene un tamao de 100-200, de forma
oval, rectangular, redondeada, De color amarillo o trasparente, sin grnulos ni estriaciones en
su interior. Poseen estriaciones longitudinales y transversales cuando no han sido digeridas
adecuadamente,

61

- Grnulos de almidn: pueden estar bien, parcial o no digeridos. Su tamao va de 50-100,


de forma redonda u oval y contorno irregular. El almidn no digerido se torna azul, violeta o
negro si se aade lugol. En solucin salina aparecen blancos o amarillo grisceos.
- Grasas: glbulos de grasa neutra aparecen de tamao variable, perfectamente redondos,
contomo bien definido, uno o varios anillos que refractan la Iuz intensamente. En lugol se los
ve de color naranja, amarillo o rojo. Los cidos grasos se observan como agujas incoloras. Se
puede usar tambin una tincin Sudn para su identificacin.
FLORA INTESTINAL
- Levaduras: Cndida es un habitante normal del intestino humano. Aparecen de forma
redonda u oval, a menudo con brotes, de 5-8, conteniendo de 3 a 6 grnulos en posicin
excntrica. En solucin salina se las ve con paredes gruesas y bastante refrctiles. Con lugol
aparecen de color pardo. Raras veces se observa pseudohifas o pseudomicelios. Tambin
puede aparecer en heces fecales artrosporas, que, son otra clase de hongos, tienen forma
rectangular y citoplasma claro; stas deben ser reportadas. Cndida puede producir
candidiasis o moniliasis intestinal especialmente despus de tratamientos prolongados con
antibiticos o en pacientes inmunodeprimidos. Un nmero significativo de micelios, hifas o
cualquier otra clase de esporas deben ser reportados.
-Bacterias: la flora bacteriana normal constituye un tercio del peso de las heces secas.
Predominan en el adulto la flora gramnegativa especialmente el colibacilo. En los lactantes
predomina la flora grampositiva. Tanto en lugol como en solucin salina solo se aprecia si se
trata de cocos y/o bacilos.
TECNICAS DE CONCENTRACIN DE HECES FECALES
Cuando en los montajes directos de heces fecales no se encuentran parsitos o estos son
raros se procede a concentrar la muestra
Esto hace posible:
- Examinar una mayor cantidad de muestra en menor volumen
- Detectar parsitos que se encuentran en nmero reducido
- Liberar los organismos de los restos fecales: bacterias, restos alimenticos mal digeridos
Los procedimientos desarrollados son aplicables para la concentracion de huevos larvas de
helmintos y quistes de protozoarios, pero no para trofozoitos de protozoos.
Tcnicas:
- Flotacin
- Sedimentacin
Principio:
Se basan en la diferencia de peso especlfico de los parsitos y el medio de suspencin
empleado.
La flotacipn debe permitir que los organismos floten.
La sedimentacin debe favorecer el asentamiento

62

PARSITOS
a. Nemtodos: Gusanos redondos
Ascaris lumbricoides: Se observan huevos que miden aprox. 45-75 x 30-50
micras, presenta una clula rodeada por tres capas, producen una patologa de
dolor de estmago y desnutricin.

Tricocfalo: El huevo mide de 50-55 x 22-25 micras. Tiene la forma de baln de


ftbol americano, produce anemia intensa, dolores abdominales, prolapso rectal
ocasional.
Uncinarias: Tienen una forma elptica, estn cubiertas de una membrana lisa,
transparente y fina, mide de 60 - 40 x micras producen anemia.

Strongyloides stercolaris: Se observan larvas. Produce diarrea, vmito,


desnutricin.
Enterobius vermiculares (Oxyurus):Los huevos son ovoides con una cara
convexa y una plana, presenta una membrana interna y delicada y otra gruesa
hialina y mamelonada, mide de 50-60 x 20-30 micras. Produce prurito en la regin
perianal, insomnio, cambios de conducta
.
b. Cstodos: Gusanos planos
Taenia solium: Los huevos miden 20-30 x 30-40 micras, son ovoides con
membrana gruesa, amarillenta que se encuentra estriada en forma de empalizada y
encierra un embrin de seis ganchos poco visibles. Produce trastornos nerviosos.

63

Hymenolepis nana : Huevos ovoides, mide aprox. 50 micras tiene una membrana
interna y una externa, tambin puede causar trastornos nerviosos.

c. Protozoarios: Amebas
Entamoeba histoltica: Se observan quistes que miden aprox. 20 micras, se
observa con uno a cuatro ncleos. Pueden causar lesin de la mucosa intestinal.

Entamoeba coli: Son quistes ms grandes que los de histoltica, tiene ms de


cuatro ncleos. Es considerada como no patgena.

Endolimax nana: Los quistes son ovalados miden de 6 - 10 micras presentan de


uno a cuatro ncleos.
Iodamoeba btschlii: Su quiste se caracteriza por la presencia de una vacuola de
yodo, no es una ameba patgena.

64

Gardia lamblia: Es una ameba en forma de pera simtricamente lateral, con un


extremo ancho y redondeado, el quiste presenta cuatro ncleos y dos cuerpos
parabasales, produce una diarrea amarillenta y vmito.

d. Tremtodos : Forma de hoja plana

Fasciola heptica: Dao en hgado . quistes.

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
Recolectar las evidencias de la prctica y adjuntarlo al portafolio de la segunda parte.

65

PRCTICA No. 8 (SEGUNDA PARTE)


EXMENES EN HECES FECALES

OBJETIVOS:
-Conocer y poner en prctica diversas pruebas qumicas en heces fecalesque ayudan a
diagnosticar enfermedades de origen gastrointestinal
-Realizar siembras y coloraciones en heces fecales sospechosas de microorganimos
bacterianos infecciosos

ANALISIS QUMICOS
Reaccin qumica, pH: Las heces normales son neutras o ligeramente alcalinas, pero esto
depende de mltiples factores: dietticos, endgenos, etc. por lo que las variaciones tanto en
la salud como en la enfermedad son irregulares y de escaso valor clnico. Para su medicin
se emplea una tira de papel indicador universal. Sobre el cual se aplica una pequea cantidad
de material fecal. Se espera unos minutros y se compara con la escala de colores.
Azcares reductores: tienen importancia en diarreas de infantes, especialmente si padecen
intolerancia o mala absorcin de carbohidratos. Para su examinacin se utiliza pastillas
Clinitest, las cuales reaccionan con cualquier sustancia reductora de las heces como glucosa,
lactosa, sacarosa, maltosa, etc.
Pigmentos biliares: en el examen coprolgico de un individuo sano no debe encontrarse
bilirrubina ni biliverdina. La presencia de estos puede deberse a trnsito o ictericia hemolltica.
La ausencia de estercobilina y estercobilingeno (no hay pigmentos biliares en la luz
intestinal) indica una ictericia obstructiva con heces aclicas.
Grasas: la presencia de un exceso de grasas (esteatorrea) en las deposiciones obedece a
mecanismos tales como trnsito acelerado, dficit enzimtico, hipersecrecin endgena.
Pueden estar presentes las grasas neutras sin desdoblar o los cidos grasos y jabones.
Se realiza tinciones con Sudn lll o lV para cualificarlas. Tambin se realiza dosificacin de
grasas. Se considera patolgica la materia fecal que contiene una cantidad total de grasas por
encima del 30%.

66

Rotavirus: Los rotavirus del grupo A constituyen la principal causa de gastroenteritis grave en
nios de todo el mundo. Producen unos 125 millones de infecciones cada ao en los pases
en desarrollo y son causa de ms de 800.000 fallecimientos anuales. Las infecciones
humanas son producidas principalmente por rotavirus del grupo A y, en menor medida, o con
otras caractersticas epidemiolgicas, por los grupos B y C.
Sangre oculta: el examen qumico de sangre en las deposiciones tiene inters cuando se
sospecha de la existencia de hemorragias digestivas subclnicas, es decir, sin que se avisen
visiblemente en forma de melenas, las causas pueden ser neoplsicas o inflamatorias. Por
ejemplo en la parasitosis por anquilostoma o tenias.
La prdia de 50 - 75 ml sangre (tubo gastrointestinal superior) provoca una coloracin roja
oscura, negra de las heces (melena). Una hemorragia de 2 a 3 das ocasiona prdidas de ms
de 1000 ml de sangre. La sangre oculta puede persistir hasta 5 a 12 das. Heces de un color
rojizo brillante se presentan por prdidas ms leves (tubo gastrointestinal bajo). Se debe
adems descartar una coloracin anormal de las heces causada por colorantes de alimentos.

Causas de hemorragia gastro-intestinal:


Pruebas para la deteccin de sangre oculta en las heces:
Principio: determinan la actividad de la peroxidasa y seudoperoxidasa en los
hemates incluida la hemoglobina.
lndicadores: guayaco (menos sensible), ortotoluidina, ortodinisidina y bencidina.
Muestra Fecal con peroxidasa o seudoperoxidasa presentes en los hemates + H202
Resultado:
Indicadores oxidado (compuesto de quinona) de color azul ( en el caso dei
guayaco); o en funcin del reactivo.
La intensidad del color en la prueba depende de:
- actividad enzimtica de la hemoglobina u otras peroxidasas,
- presencia de otro material colorante,
- presencia o ausencia de inhibidor
- sensibilidad del material de la prueba
La prdida normal de sangre va de 2 a 2.5 ml diariamente en el tubo gastrointestinal,
nte una prdida mayor (5 a 10 ml de sangre diariamente) se necesita una prueba.

67

Causas para el aparecimiento de falsos positivos y falsos negativos son:


- la mioglobina y hemoglobina de la carne y el pescado ingeridos tienen actividad de la
peroxidasa.
- frmacos como la aspirina y el hierro incrementan las hemorragias del tubo gastrointestinal.
- las bacterias de los intestinos, las verduras y las frutas digeridas como lo rbanos, los nabos,
los pltanos, la uva negra, las peras, las ciruelas, tanhbin contienen peroxidasa
- la vitamina C y otros antioxidantes puede suprimir la actividad de la peroxidasa y dar un
resultado falsamente negativo.
DETERMINACIN DE PMN EN HECES FECALES
Leucocitos fecales suelen encontrarse en las infecciones bacterianas del intestino provocadas
por microorganismos como:
- Salmonella spp.
- Shigella spp.
- Yersinia spp.
- Escherichia coli invasiva
As como por procesos inflamatorios no bacterianos como:
- Colitis ulcerosa
- Colitis asociada a antibiticos
En las heces de la diarrea secundaria a virus, bacterias toxnicas y parsitos no suelen
encontrarse leucocitos fecales.
Tcnica para la deteccin de PMN:
MUESTRA: Heces fecales frescas
Preparacin del frotis:
- Realice un frotis delgado con la porcin ms representativa, de preferencia las reas donde
est presente moco.
- Deje secar al aire
- Tcnica de tincin:
- Cubra el portaobjetos con colorante Wrigth y deje 3 minutos.
- Coloque agua corriente, sople suavemente sobre el colorante y deje 3 minutos ms.
- Deseche el colorante y lave.
- Deje secar y observe con lente de 100x y aceite de inmersin.
Observacin:
- Realice una observacin sistemtica de varios campos hasta obtener 100 clulas
- Mientras cuenta las 100 clulas debe diferenciar las clases de clulas blancas.
Resultados:
La morfologa y propiedades de tinciln de los PMN en esta muestra son los mismos que los
estudiados en Hematologa, la diferencia es que se los observa ms pequeos.
68

Reporte:
- Si hay variedad de leucocitos se reporta como % de PMN (diferencial)
lnterpretacin:
Mayor cantidad de neutrfilos: infeccin bacteriana
Mayor cantidad de mononucleares: infeccin viral
PMN
Neutrfilos
Mononucleares
Linfocitos y Monocitos

COPROCULTIVO
Obtngase la muestra de una evacuacin, tracto rectal o escobillado anal.
Suspndase una pequea cantidad en caldo GN (enriquecimiento para Salmonella y
Shiguella) y un medio diferencial para bacterias que no fermenten la lactosa (EMB
Macconkey), las no fermentadoras son las patgenas, Hektoen Agar e identificacin de las
colonias aisladas con una bioqumica o APl.
Para la determinacin de bacterias especficas como Campylobacter se siembra en medios
especficos para estas bacterias.
Medio de transporte: Cary Blair

Caldo GN

Agar Mac conkey


coconkeyconkey

Agar entri:o Hektoen

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN
Colocar en el portafolio la primera parte de la prctica y adjuntar reportes de exmenes de
heces fecales: Coprocultivo, PMN, sangre oculta y pH, incluir reflexiones.

69

PRCTICA No. 9
ESPUTO

OBJETIVOS:
-Obtener muestras de esputo vlidas que provengan del sistema respiratorio inferior
-Detectar diferentes microorganismos que pueden causar infecciones en las vas respiratorias
bajas mediante el anlisis del esputo utilizando diversas tcnicas microbiolgicas

CONTEXTUALIZACIN
En las condiciones habituales de la clnica diaria, no es una muestra representativa de la
situacin existente en el tracto respiratorio inferior por su mezcla con secreciones procedentes
de todo el rbol traqueo-bronquial y con la flora saprfita de la orofaringe. No obstante es un
mtodo fcil y rpido cuya utilidad o relacin entre resultado obtenido y verdadera etiologa
depende en gran medida de su correcta obtencin, control de calidad antes de iniciar su
procesamiento, tipo de agente que se pretenda detectar y valoracin adecuada del resultado.
El anlisis del esputo es una herramienta bsica, til y comnmente utilizada en el campo de
la Medicina debido a que la tcnica de obtencin de la muestra es relativamente sencilla y
segura. Permite el estudio, diagnstico y seguimiento de mltiples enfermedades de tipo
inflamatorio, infeccioso y/o tumoral, tanto pulmonares como sistmicas que cursen con
afectacin pulmonar.
TCNICA PARA LA OBTENCIN DE LA MUESTRA
Material necesario:
- Frasco estril de boca ancha y hermtico.
- Suero fisiolgico estril y nebulizador.
Tcnica:
-Enjuagar la boca con agua destilada estril o solucin salina.
-Obtener el esputo tras una expectoracin profunda, preferentemente matinal.
-De no producirse expectoracin espontnea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones
de suero fisiolgico estril (15 ml durante 10 minutos), siendo til adems realizar un drenaje
postural o fisioterapia respiratoria.
70

-Volumen de muestra requerido: de 2 a 10 Ml

Transporte y conservacin:
Envo inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas). Si esto no es posible, conservar en
frigorfico a 4C.
Observaciones:
- Es preferible realizar la toma antes de instaurar el tratamiento antibitico.
- No es til para anaerobios.
- No son inoculables las secreciones de sospechosa procedencia
- La expectoracin debe rechazarse hasta obtener un esputo de calidad suficiente (ms de 25
leucocitos polimorfonucleares y menos de 10 clulas epiteliales por campo 10x).

EXAMENES
a) Examen macroscpico:
La descripcin del esputo o de las secreciones producidas con la tos debe comprender
el color, la consistencia, aspecto, el olor entre otros, as:

Consistencia y aspecto: el esputo puede describirse como lquido (seroso) mucoide,


purulento, sanguinolento o en cualquier combinacin de dichas posibilidades.

71

Aspecto normal: el esputo es de aspecto claro y acuoso y cualquier opacidad procede


de material celular en suspensin.
Color: el color del esputo est determinado por las sustancias que contiene y con
frecuencia puede indicar el proceso patolgico.

Olor: en los esputos normales y patolgicos no se detecta ningn olor, pero si se ha


producido una descomposicin microbiana tanto dentro de cuerpo como despus de la
expectoracin pueden presentarse diversos olores.
Observaciones diversas: masas caseosas, masas bronquiales, broncolitos, tapones de
Dittrich, cuerpos extraos y parsitos.

Este anlisis nos ayuda a tener un diagnstico previo de lo que podra tener el paciente,
por ejemplo, los esputos muy abundantes y purulentos sugieren un absceso pulmonar o
una bronquiectasia; los esputos sanguinolentos, sangrado (hemoptisis); los esputos

72

espumosos y teidos de sangre, edema pulmonar; los esputos abundantes y mucinosos,


carcinoma de clulas alveolares.

b) Examen microscpico:
Tmense porciones de moco, pus, material caseoso. Examnese en forma de preparacin
hmeda y frotis coloreado.

Sin teir (preparacin hmeda): La presencia de unas cuantas clulas epiteliales


escamosas indica una mezcla profusa de la saliva y las mucosidades nasofarngeas.
Tales muestras no reflejan procesos bronquiales o pulmonares y se deben rechazar
para luego solicitar al paciente una nueva muestra tomada en forma adecuada y que no
sea rechazada. Luego de que la muestra es acepatada bsquense hongos, parsitos,
masas de piocitos, eritrocitos, glbulos grasos, fibras elsticas (ndice de destruccin
pulmonar), diferentes tipos de clulas de descamacin.

Muestra coloreada: Hgase tincin de Gram para determinar bacterias dominantes,


tincin de Kinyoun o de Ziehl-Neelsen para determinar la presencia de bacilos alcohol
cido resistentes, la tincin de Wright para eosinfilos en el asma bronquial y para
histoplasma.

c) Siembra en medios de cultivos:


Para cultivos rutinarios bacterianos realizarlo en placas de agar sangre, en otros
medios seleccionados como MacConkey agar y caldo de tioglicolato.
Si se sospecha una micosis, hgase cultivo en condiciones anaerbicas sobre placas
de agar sangre y medio de Sabouraud. Los enfermos bajo tratamiento con antibiticos,
frecuentemente presentan un gran nmero de levaduras en el esputo. Candida y
Aspergillus pueden ser importantes en pacientes en estado de inmunodepresin.
Cultivo para bacilo Tubercuiloso (Lowenstein Jensen)
Puede requerirse de cultivos especiales para Mycoplasma, virus, etc,
Los cultivos anaerobios para padecimientos como absceso pulmonar y neumona por
aspiracin son importantes.
En los nios se deber hacer cultivo de materiales tomados directamente de la faringe,
ya que frecuentemente es imposible obtener el esputo. Este procedimiento puede dar
informacin sobre la flora pulmonar. Si se encuentra colocado un tubo endotraqueal se
deber cultivar el material aspirado.
d) Estudio citolgico de las clulas del esputo: tincin de Papanicolaou o Giemsa
PROCESOS CLNICOS EN QUE EL MDICO NECESITA UN EXAMEN DE ESPUTO
Enfermedades
Bronquitis: Es una inflamacin de las vas areas bajas. Sucede cuando la trquea y los
bronquios, situados entre los pulmones, se inflama a causa de una infeccin o por alguna
otra causa. La bronquitis aguda generalmente sigue a una infeccin respiratoria viral. La
bronquitis crnica es una afeccin prolongada. Las personas tienen tos que produce moco
73

excesivo.
Tuberculosis pulmonar: Es una enfermedad infecciosa, causada por Mycobacterium
tuberculosis. Infecciones ocasionadas por micobacterias atpicas (bacilos tuberculoides)
tales como: M. Kansasii, M. marinum, M. flavescens, M. gordonae, M. obuense.
Neumona bacteriana: Pulmona o neumonitis es una enfermedad inflamatoria de los
pulmones. La neumona puede afectar a un lbulo pulmonar completo (neumona lobular), a
un segmento de lbulo, a los alvolos prximos a los bronquios (bronconeumona) o al tejido
intersticial (neumona intersticial). La neumona bacteriana es una infeccin de los pulmones
causada por bacterias. El Streptococcus pneumoniae, un organismo Gram positivo que a
menudo coloniza la garganta, es la bacteria que con ms frecuencia causa neumona en
todos los grupos de edad excepto en recin nacidos. Otra causa importante de neumona por
bacterias Gram positivas es la causada por el Staphylococcus aureus. Tambin ocasionan
neumona bacterias del gnero Pseudomonas (bacilos Gram negativos), Klebsiella (bacilos
Gram negativos), Haemophilus influenza (cocobacilo Gram negativo).
Neumona viral: Es una inflamacin (irritacin e hinchazn) de los pulmones causada por
una infeccin con un virus que puede ser influenza, parainfluenza, adenovirus, rinovirus,
virus del herpes simple, virus sincicial respiratorio, hantavirus y citomegalovirus.
Neumona atpica: Se refiere a la neumona causada por ciertas bacterias a saber:
Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae y Chamydophila pneumoniae.
Enfermedades pulmonares parasitarias: Se producen ms comnmente por un nemtodo
como el Strongyloides stercoralis o el Ascaris lumbricoides. Tambin estn enfermedades
pulmonares causadas por parsitos trematodos como el Paragonimus westermani.
Fibrosis qustica (FQ): Es una enfermedad hereditaria frecuente que afecta al organismo
en forma generalizada, causando discapacidad progresiva y muerte prematura.
Neoplasias pulmonares: Tumores o cnceres del pulmn. Se atribuye al hbito de fumar,
asbesto, derivados del carbn, radiaciones ionizantes, xido de hierro, gas mostaza, nquel,
petrleo, uranio y cloruro de vinilo.
Asma bronquial: Es una enfermedad en la que se inflaman los bronquios, lo que produce
obstruccin de las vas areas, marcada por ataques recurrentes de disnea paroxstica, con
produccin de silbido debido a la contraccin espasmdica de los bronquios.
Esputo: mucoide viscoso generalmente presenta eosinofilia.
Neumoconiosis: Condicin caracterizada por la deposicin permanente de cantidades
sustanciales de partculas de materia en los pulmones, generalmente de origen ocupacional
o ambiental, y por la reaccin tisular a su presencia. Como por ejemplo al inhalar polvo de
piedras, arenas o pedernales que contienen bixido de silicio, con formacin de cambios
fibrticos nodulares generalizados en ambos pulmones.
Neumona por hongos: Infecciones con hongos del gnero Aspergillus, Pneumocistis,
Blastoyces dermatitidis, Coccidioides immitis (generalmente se presenta en pacientes con
SIDA), Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum. La infeccin ocasionada por el
Histoplasma capsulatum, est considerada una de las principales micosis endmicas del
continente americano.
Neumona por aspiracin: Tipo de neumona que se produce por la aspiracin de
alimentos, de lquidos, o del contenido gstrico en el tracto respiratorio superior.
Absceso pulmonar: Es la inflamacin de los pulmones y de las vas respiratorias que llevan
a ellos (bronquios) debido a la inhalacin de materiales extraos.

74

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN:
- Se realizar el examen macroscpico de la muestra y se observar una preparacin
hmeda para rechazar o aceptar la muestra de esputo.
- Examen microscpico: Montaje hmedo directo y con KOH (para visualizar hongos),
GRAM y BAAR .
- Realizar el portafolio de la prctica y subirlo a la plataforma.

75

PRCTICA No. 10
MALARIA O PALUDISMO

CONTEXTUALIZACIN
Los parsitos causantes de la malaria o paludismo son protozoarios esporzoarios del gnero
Plasmodium. Las dos especies que existen en el Ecuador, en las zonas tropicales y
subtropicales son Plasmodium vivax y Plasmodium falciplarum.
Se transmiten por la picadura de un vector, el mosquito del gnero Anopheles.
DIAGNOSTICO POR LABORATORIO
Cllnicamente la malaria puede confundirse con otras enfermedades febriles. Si el paciente ha
tomado drogas antipaldicas que no curaron su malaria, el diagnstico se hace diffcil.
El diagnstico principal se hace por la bsqueda de parsitos circulantes, aunque a veces se
recomienda mejor realizar la prueba luego del paroxismo febril, para poder localizar los
trofozoitos jvenes.
El examen se hace por frotis de gota gruesa teidos con Giemsa, o por frotis extendidos
teidos con Wright y Giemsa. Tambin existen pruebas para la deteccin del antgeno del
parsito y reacciones inmunolgicas para demostrar la presencia de anticuerpos.
En la sangre circulante se pueden encontrar todas las formas del ciclo eritrocito (merozoitos,
trofozoitos o formas anilladas, esquizontes), incluso a veces los gametocitos, a excepcin de
los esquizontes de Plasmodium falciparum.
El recuento de parsitos es importante para determinar el grado de infeccion, seguir la
evolucin del paciente, para el pronstico y para la evaluacin de la eficacia del tratamiento.
Gota gruesa
Es ms eficaz que el extendido, pues permite visualizar mayor numero de parsitos, por la
mayor cantidad de sangre que se estudia en cada campo microscpico. Es necesario lisar los
eritrocitos para permitir la visualizacin de los parsitos.
76

Frotis extendido
Facilita la observacin del detalle mor'folgico de los parsitos y su relacin con los entrocitos,
por lo tanto permite confirmar la especie con mayor certeza.

MUESTRAS
Se puede utilizar sangre totalobtenida en un tubo que contenga EDTA. Muchas veces resulta
conveniente tambin tornar una muestra capilar para realizar los frotis. No se recomienda usar
sangre con heparina o con citrato de sodio.
COLORACION DE GIEMSA
Fundamento: Los parsitos causantes der patudismo se encuentran en la sangre; una parte
de su evotucin ocurre en el interior de los glbulos rojos. Estos parsitos se detectan en
extensiones sanguneas teidas con los colorantes de Giemsa.
Preparacin de las extensiones sanguneas
-Cuando se debe obtener la muestra.- Por lo general los parsitos son ms numerosos en la
sngre al final de un ataque de fiebre. La recoleccin de sangre se debe hacer invariablemente
antes de que se administren medicamentos antipaldicos.
- Preparar un frotis sanguneo para un examen minucioso por especies
- Preparar una gota gruesa para deteccin de los parsitos
- No se recomienda conservar los frotis sin tincin durante ms de 4 das.

Tincin
Antes de teirlas fijense las extensiones solo con metanol (2 a 3 minutos). Evtese que este
alcohol toque las gotas gruesas.
1. Haga una dilucin delcolorante de giemsa 1:10 con agua amortiguada,
2. Coloque los portaobjetos en una bandeja de tincin y cbralos con el colorante diluido.
3. Deje reposar por 30 minutos.
4. Lave la tincin con agua amortiguada.
5. Escurra el agua y deje secar el frotis
OBSERVACIN MICROSCPICA DEL PARSITO:

77

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACION

Realizar frotis extendidos y de gota gruesa y teirlos


Observar placas positivas al microscopio con el lente de inmersin
Realizar el portafolio de la prctica y subirlo a la plataforma Moodle.

78

PRCTICA No. 11
INFECCIONES DE TRANSMISIN SEXUAL

CONTEXTUALIZACIN
La importancia de este tipo de infecciones es cada vez mayor, pues su incidencia va cada vez
en aumento. Varios son los factores que intervienen: aumento de densidad y movilidad de las
poblaciones, dificultad para lograr cambios en la inadecuada conducta sexual de las personas.
Adems se debe tomar en cuenta que para la mayora de estas infecciones no existen
todava vacunas disponibles.
Cuando se sospecha clnicamente de una infeccin de transmisn sexual (lTS) se hacen
pruebas especficas para confirmar el diagnstico. Estas pueden consistir en anlisis de
sangre, orina, estudios del flujo vaginal o del lquido seminal, y pruebas inmunolgicas. Un
aspecto muy importante en el diagnstico es recordar que se pueden producir infecciones
mltiples.

CLASIFICACIN DE LAS I.T.S


De acuerdo a su caracterstica clnica, a su forma de presentacin (infeccin o enfermedad
infecciosa) y al microorganismo que las producen, las ITS se clasifican en:
1. ENFERMEDADES QUE CURSAN CON EXUDADO GENITAL:
- Neisseria gonorrhoeae (gononea)
- Chlamypia trachomatis, serotipos D-K (uretritis)
- Ureaplasma urealyticum (uretritis)
- Candida spp. (Vaginitis, infecciones del prepucio, e IVU)
- Trichomonas vaginalis (vaginitis, uretritis)
- Gardnerella vaginalis (Vaginosis bacteriana)
79

OTROS: Staphylococcus aureus


2. ENFERMEDADES QUE CURSAN CON TUMORACIONES Y/O ULCERACIONES
GENITALES:
- Treponema pallidum (sfilis)
- Haemophilus ducreyi (chancro blando)
- Chlamydia trachomatis, serotipos L 1, L2, L3 (linfogranuloma venreo)
- Calymniatobacteriu m g ranu lomatis (granuloma inguinal)
- Sarcoptes scabiei y Phtirus pubis (ectoparsitos).
- HPV (papiloma y cncer cervicat), HSV 1 y 2 (hrpes genitat), EBV (Mononuleosis
infecciosa)

3. INFECCIONES CON SINTOMATOLOGA VARIADA O CON LARGOS PERiODOS


ASINTOMTICOS:
HAV, HBV, HCV (hepatitis)
CMV, HVZ, HIV (SIDA)

DIAGNSTICO POR LABORATORIO


De acuerdo a estos grupos de clasificacin, el diagnstico se realiza con los siguientes
mtodos:
GRUPO 1: mtodos propios, muchas veces el xito o fracaso der estudio recae en la
experiencia del microbilogo
GRUPO 2: diagnstico clnico primario, confirmacin por tcnicas parasitarias, bacterianas y
pruebas serolgicas (inmunolgicas)
GRUPO 3: pruebas inmunolgicas
Neisseria gonorrhoeae (gonococo)
Son diplococos GRAM (-), semejando granos de caf, en frotis directo, se los obserya dentro
de leucocitos, para crecer necesitan medios de cultivo enriquecidos: agar sangre, chocolate,
Thayer-Martin. Necesitan atmsferas de CO2 del 5 al 10%.
Las colonias son pequeas, grises, suaves, no producen hemlisis en agar sangre. Se las
reconoce por ser oxidasa (+) y fermentar glucosa.
El gonococo es el agente causal de la gonorrea (enfermedad venrea), puede producir
uretritis, prostatitis, epididimitis, cervicitis, salpingitis, faringitis, vulvo-vaginitis en nias,
ceguera en el RN e infecciones en articulaciones. El humano es el nico husped natural del
gonococo.

80

Ureaplasma urealyticum
Puede ser responsable de uretritis no gonococcicas en varones.
Son difciles de aislar, requiere de medios de cultivo especiales. Las colonias tienen
apariencia de huevos fritos, muy pequeas.
Cultivos: caldos de peptona con infusin de corazn y 2% de agar (pH7.8), 7% de lquido
asctico humano o de suero de animal (caballo o conejo), 37C por 48 a 96 horas.
Muestras: Hisopos rectales, secreciones uretrales o genitales.
El diagnstico puede tambin ser serolgico.

Cndida albicans
Es una levadura oval que produce un seudomicelio en cultivo, en los tejidos y exudados. Son
Gram positivas. En agar Sabouraud crecen colonias blandas color cremoso.
Puede causar vulvovaginitis, con irritacin, prurito y secrecin.
Muestras: raspados, exudados
Pruebas: Gram y cultivos en medios comunes o Agar de Nickerson.

81

Trichomonas vaginalis
Es un parsito protozoario mastigophoro (flagelado). Tiene forma de pera, con una membrana
ondulante alineada, posee un flagelo posterior recto y 4 flagelos anteriores.
Se la puede observar en ftotis directos de secreciones vaginales.
Muestras: secreciones uretrales y vaginares, los frotis se los puede teir con hematoxilina,
Wright-Giemsa o ticin de Gram.

Gardnerella vaginalis
Se lo asla de mujeres que sufren vaginitis, sepsis neonatal, bacteremia post partum, y de
hombre con uretritis no especfica.
En los frotis hmedos produce clulas indicadoras (clulas gua o clue cells), que son clulas
epitetiates vaginales con muchos bastoncillos minsculos. Se ha comprobado que estas
bacterias no requieren ningn factor especial de crecimiento y se los observa como
cocobacilos gram negativos. Las colonias son pequeas grises, beta hemolticas.
Una prueba rpida de su presencia es colocar unas gotas de KOH al 10% en preparaoiones
en fresco de secreciones vaginales; es caracterstico encontrar un olor a pescado por la
presencia de aminas.

82

Treponerrna pallidum
Son espiroquetas muy mtiles, no se le puede cultivar in vitro.
Se puede hacer la observacin directa en microscopio de campo oscuro en lquidos tisulares
exprimidos de las lesiones superficiales tempranas.
El diagnstico se lo hace en base a pruebas serolgicas: tesis no treponmicos para
screening: VDRL o su variante, el RPR. EI test confirmatorio es el FTA-Abs (prueba
Treponmica)

Haemophilus ducreyi
Causa la enfermedad venrea chancroide" (chancro blando), que es una lcera desgarrada
de los genitales.
Son cocobacilos Gram-negativos- pequeos, dificiles de cultivar, puesto que requieren del
llamado factor X, crece mejor a partir de raspados de la base de la lcera sembradas en agar
chocolate con 1% de isovitalex vancomicina (3g/ml).
Se incuba en atmsferde CO2 al 10%, a 37C.

Chlamydia trachomatis
Son bacterias parsitas intracelulares estrictias, no mtiles. Gram negativas.

83

lntracelularmente forman inclusiones (micro cotonias). Son metablicamente muy activas, Se


colorean bien con Giemsa
Producen linfogranuloma venreo (serotipos L1, L2 y L3), que se caracteriza por adenitis
inguinal supurativa, o uretritis inespecfica (serotipos-k).
Para su diagnostico se necesitan tcnicas especiales como cultivos celulares, que son
tcnicas complejas y poco utilizadas de forma rutinaria, por lo que se prefiere el diagnstico
inmunolgico para encontrar anticuerpos sricos. Tambin existen pruebas para detectar el
antgeno en orina o en secrecin vaginal.

Calymatobacterium granulomatis
Casa de la enfermdad venrea'"granuloma inguinale", caracterizada por la presencia de
hinchazones en los genitales, nalgas y abdomen con lesiones granulornatosas que pueden
ser ulcerativas o sangrantes.
Es un bacilo Gram negativo, no mtil, pleomrfico, con extremos redondeados, que se colorea
bipolarmente y aparece como "imperdibles".
Difcil de cultivar, Requrere de bajas tensiones de oxfgeno. Se pueden utilizar embriones de
pollo de 5 das y se desarrolla despus de las 72 horas a 35C.
Hrpes virus 1
El HSV-2 causa el herpes genital. El herpes genital primario puede ser grave y durar largo
tiempo. Produce lesiones vesculo-ulcerativas en el pene del varn o cuello, vulva, vagina y
perin en la mujer. Las lesiones son dolorosas y se acompaan de fiebre, malestar general y
linfadenopata inguinal.
El diagnstico del laboratorio se realiza por aislamiento del virus de las lesiones, pero ms
prcticos resultan los tests inmunolgicos.
HAV, HBV y HCV
Son los virus de la hepatitis. El HAV se transmite por vla oral-fecal y los otros dos por contacto
sexual o por vfa parenteral. El diagnstico se realiza por pruebas inmunolgicas.
VIH
Pertenece a los retrovirus. La enfermedad (SIDA) se caracteriza por una, depresin del
sistema immunitario y por desarrollo de neoplasias poco comunes como el Sarcoma de
Kaposiy por otras infecciones oportunistas graves.
El diagnstico de laboratorio se hace por aislamiento del virus por PCR, conteo de linfocitos
CD4 de sangre perifrica, mdula sea o plasma. Las pruebas inmunolgicas con suero del
paciente por ELISA (test de screening) y la confirmacrn por la tcnica de Western-Blot.
84

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN

Observar placas en el microscopio e identificar varios microorganismos productores


de ITS, tomando las respectivas fotos para que puedan realizar las reflexiones dentro
del informe, adems incluir fotos del color y aspecto secreciones vaginales de acuerdo
al agente etiolgico (mirar cuadro de clasificacin de ITS grupo 1).
Realizar un cuadro con los microorganismos presentes en la clasificacin (grupo 1, 2 y
3) en el que se colocarn las diferentes tcnicas de identificacin que tiene cada
microorganismo para ser detectados.
Realizar el portafolio de la prctica y subirla a la plataforma Moodle.

85

PRACTICA No. 12
TCNICAS BSICAS DE INMUNOLOGA

Objetivos:

Realizar varias pruebas inmunolgicas que permitan comprender el fundamento de


las reacciones basadas en la unin antgeno-anticuerpo para identificar diferentes
microorganismos infecciosos.
Desarrollar destrezas metodolgicas de laboratorio que ayuden a efectuar este tipo de
pruebas.

CONTEXTUALIZACIN
Las reacciones de antgeno y anticuerpo son muy especficas. Un antgeno reaccionar slo
con el anticuerpo estimulado por antgenos de su propia clase o muy relacionados. Debido a
su elevada especificidad, las reacciones entre un antgeno y un anticuerpo pueden usarse
para identificar uno por medio del otro.
Esta especificidad es la base de las reacciones serolgicas. Las posibles reacciones cruzadas
entre antgenos relacionados pueden limitar la especificidad de la prueba.
Las reacciones de antgenos con anticuerpos se utilizan para identificar componentes
especficos en mezclas. Los microorganismos y otras clulas poseen diversos antgenos, y
por tanto, pueden reaccionar con numerosos anticuerpos diferentes.
Antgeno: sustancia que reacciona con anticuerpos o receptores de clulas T, despertadas por
inmungenos.
Anticuerpo: Protena producida a causa de la introduccin de un antgeno, y que tiene la
capacidad de combinarse con el antgeno que estimul su produccin.

86

REACCIONES ANTGENO ANTICUERPO EN EL LABORATORIO


Los diferentes tipos de reacciones de antgenos con anticuerpos utilizan la ventaja de las
distintas caractersticas fsicas o biolgicas de sus reactantes y de acuerdo con ellas, se
escogen las ms adecuadas con fines de diagnstico.
Aglutinacin: el antgeno es particulado (por ejemplo bacterias, eritrocitos) o est
recubriendo partculas inertes de ltex. El anticuerpo une a las partculas en forma
entrelazada y las agrupa (aglutinina). Esta prueba puede hacerse en un tubo o por gotas en
un portaobjetos. Cuando se usan eritrocitos se llama hemaglutinacin

Precipitacin: en las reacciones de precipitacin (precipitina), el antgeno esta en solucin. El


anticuerpo entrelaza las molculas de antgeno en proporciones y agregados variables
(precipitados). Las reacciones de precipitacin pueden efectuarse en soluciones o en un
medio semislido (agar).
Radioinmunoanlisis (RIA): este mtodo cuantifica antgeno que pueden ser marcados con
radioactividad. Se basa en la competencia por el anticuerpo especfico entre una
concentracin conocida de material marcado y una concentracin desconocida de material no
marcado. Ms adelante los complejos que se forman entre antgeno y anticuerpo pueden
separarse y la cantidad de radiactividad se mide.

87

Anlisis inmunosorbente con enzima enlazada (ELlSA): Este mtodo tiene numerosas
variantes depende de la conjugacin de una enzima o un antgeno o un anticuerpo. La enzima
se detecta por anlisis de su actividad con su sustrato.

Para medir antgenos, anticuerpos conocidos se fijan a una fase slida, se incuba con
diluciones del suero problema, se lava e incuba de nuevo con una anti- inmunoglobulina
marcada con una enzima. La actividad enzimtica medida por adicin del sustrato especfico
con desarrollo de color es una funcin directa de la cantidad de anticuerpo unido.
lnmunofluorescencia: Colorantes fluorescentes pueden unirse por covalencia a molculas
de anticuerpo y hacerse visibles con ayuda de luz ultravioleta en el microscopio de
fluorescencia. Este anticuerpo, marcado puede usarse para identificar antgenos por ejemplo
en la superficie de bacterias como estreptococos, treponemas o en clulas en cortes
histolgicos u otro tipo de muestras.

88

Fijacin de complemento: El sistema de complemento est constituido por 20 o ms


protenas plasmticas que interactan entre si y con las membranas celulares. Cada
componente protenico debe ser activado en secuencia, en condiciones apropiadas para que
la reaccin progrese. Los complejos de antgenos con anticuerpos se cuentan entre los
activadores y la prueba de fijacin del complemento puede usarse para identificar a uno de
ellos si el otro se conoce.

Pruebas de hemaglutinacin: ciertos virus aglutinan los eritrocitos de algunas especies


(hemaglutinacin activa). Esta accin puede ser inhibida por anticuerpo dirigido en forma
especfica contra el virus (es decir inhibicin de la hemaglutinacin) efecto que puede usarse
para medir la presencia y concentracin de ese anticuerpo.

Inmunocromatografa: La prueba es un inmunoensayo que emplea reactivos nicos para la


deteccin rpida y segura de anticuerpos contra el VIH-1 y el VIH-2 en suero y plasma
humanos sin instrumental. Las protenas recombinantes que representan las regiones
inmunodominantes de las protenas envoltura y gag de VIH-1 y VIH-2 son inmovilizadas en la
regin de Prueba de la tira de nitrocelulosa y un agente bioqumico que reconoce anticuerpos
humanos dispersados en la regin de control de la tira. Las protenas de VIH-1 y VIH-2,
unidas a oro coloidal, son impreganadas por debajo de la regin de Prueba del dispositivo.
Una banda estrecha de la membrana es tambin sensibilizada como regin de control.

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN

Realizar la puncin venosa mediante la tcnica al vaco.

89

Efectuar varias pruebas inmunolgicas tales como: ASTO, VDRL, HIV y observar sus
resultados.
Realizar el portafolio de la prctica y subirlo a la plataforma Moodle.

90

MICOSIS

La Micologia es el estudio de los hongos. Un hongo es un protista eucaritico (posee un


ncleo verdadero), que est caracterizado por la ausencia de clorofila y por la presencia de
quitina en la pared celular. La estructura bsica puede ser filamentosa: mohos y setas o
unicelular,levaduras.
Hay alrededor de 100.000 especies de hongos de los cuales aproximadamente 50 son
consideradas patgenas. Adems hay una lista creciente de organismos oportunistas que
pueden causar enfermedad en el paciente comprometido.
Hasta que punto debe ser un hongo identificado es una decistin clnica y a veces acadmica.
Frecuentemente una identificacin es realizada para eliminar la posibilidad de que el aislado
sea un patgeno verdadero. La especificacin deber ser interpretada slo cuando sea
clnicamente relevante o acadmicamente importante.

COLECCIN DE ESPECMENES
La tcnica para la coleccin de material para cultivo de hongos es importante, ya que muchas
levaduras y mohos no patgenos: Son frecuentes contaminantes en especmenes clnicos y
pueden crecer ms y enmascarar los hongos patgenos significantes.
Especnenes cutneos y superficiales
Suspender la medicacin, lavar con agua y jabn secar bien al aire. Todo material puede ser
transportado al laboratorio en un sobre de papel limpio y estril. El material es viable por
meses.
Piel: Las lesiones cutneas requieren raspados del borde activo. Material suficiente y
representativo para cultivo y examen microscpico deber ser colectado y transportado al
laboratorio.
91

Pelo: Los pelos infectados deben ser arrancados y enviados al laboratono.

Uas: Las uas infectadas no deben ser cortadas con tijeras. No colecte detritus de debajo de
la ua infectada. Primero, remueva la parte superficial no infectada de la ua por raspado.
Cuando se alcanza la porcin enferma, remuvala por raspado y envela al laboratorio.

Especmenes subcutneos
Todo material debe ser enviado al laboratorio en un contenedor estril. Transporte e
inoculacin rpida son necesarios ya que muchos especmenes pueden tambin contener
bacterias que pueden crecer y enmascarar y consecuentemente inhibir o retardar el
aislamiento de los hongos patgenos.
Especmenes sistmicos (tejidos profundos)

92

Esputo, secreciones traqueales, secreciones bronquiales y respiratorias bajos un buen


especmen de esputo es de 5 a 10 ml de material recientemente descargado del rbol
bronquial, con cantidades mlnimas de contaminantes orales o nasales.
Tres especmenes pequeos de este tipo son mejores que un especimen coleccionado de 24
horas de volumen total igual. El hecho de que el especimen sea obtenido por la maana
temprano o a otra hora no es importante a pesar que muchos pacientes producen ms esputo
poco despus de levantarse en la maana. El esputo debe ser colectado usando un
contenedor estril. Esputos inducidos deben tambin ser colectados en un contenedor estril.
Aspirados traqueales y secreciones bronquiales pueden ser enviados en tubos de ensayo con
tapn de caucho u otros contenedores estriles apropiados,

Lavados gstricos
Lavados gstricos en ayunas debern ser colectados cuando no sea posible obtener esputo.
Debern ser colectados en tubos estriles. Una serie de tres especmenes es recomendada.
Orina
El espcimen de eleccin es la porcin media del chorro de la miccin de la maana obtenida
limpiamente. Mltiples especmenes de este tipo son superiores a un especimen recolectado
de 24 horas. Mantener refrigerado antes de procesar.
Fluidos pleural, espinal, articular y otros
Los especmenes de fluidos deben ser remitidos en contenedores estriles, prefieren grandes
cantidades de especimen ya que muy pocos organismos pueden estar presentes. Examine
mientras estn frescos o refrigrelos.
Mdula sea
Los especmenes de mdula sea son enviados en 0,1 ml de anticoagulante EDTA.
Tejidos
Los especmenes de tejido deben ser remitidos en un contenedor estril. Si el tejido est seco,
mjelo tigeramente con solucin salina al 0.85% y refrigrelo hasta ser procesado. Todo tejido
debe ser molido o finamente cortado cuidadosamente.

PROCEDIMIENTO PRIMARIO DE INOCULACIN PARA CULTIVOS DE


93

HONGOS
Examen macroscpico
Examen microscpico directo del material clnico (KOH 10%)

Coloraciones: Gram, azul de metileno, tinta china, cido resistente.

Cultivos

Reportes preliminares:
Dentro de 24 horas de la recepcin de especfmenes con el resultado de la coloracin
Despus de 7 das de incubacin (si no se detecta crecimiento) reportando No hay
crecimiento en siete das
Reportes finales:
Los reportes finales sern enviados al completarse los procedimientos de identificacin o
despus de 28 das de incubacin si no hay evidencia de crecimiento fungal.

94

ACTIVIDADES Y EXPERIMENTACIN

Examinar microscpicamente con KOH al 10 20% o en forma directa las muestras


entregadas y realizar la interpretacin de los elementos entregados.

Observar placas teidas con Gram y comparar entre las muestras.

Revisar los medios de cultivos con crecimiento de hongos y compare con cultivos
bacterianos.

Realice reflexiones sobre los resultados obtenidos junto con las fotos respectivas

95

BIBLIOGRAFIA
Felicita Caiza, Carlos Rubn. (2003). Resistencia a los antimicrobianos de bacterias
frecuentes encontradas como agentes causales de infeccin nosocomial. (Tesis de Maestra).
PUCE. Quito,Ecuador.
Forbes, Betty A.. (2004). Diagnstico microbiolgico Bailey & Scott/ Betty A.(11). Buenos
Aires, Argentina: Mdica Panamericana.
Gilbert, David N.. (2010). The Sanford guide to antimicrobial therapy 2010(40). Sperryville,
Estados Unidos: s.n..
Guadalupe Garca- Elorriaga. (2012). Citocinas, diabetes e infeccin de tejidos blandos. Su
relacin con la severidad y mortalidad. Revistas Mdica del Instituto Mexicano del seguro
Social, 50, 235.
Guadalupe Garca-Elorriaga. (2013). Bacterias oportunistas y microbiotas en nios con
leucemia y enterocolitis neutropnica. Revista Mdica del Instituto Mexicano del seguro social,
51..
Jawetz, Ernest. (2011). Microbiologa Mdica de Jawets(25). s.I.: Mac Graw-Hill.
Zurita Jeannete. (2012). Resistencia bacteriana en el Ecuador. Quito, Ecuador: s.n..
Ash L. R. (2010), Atlas de Parasitologa Humana, 5ta. Edicin, Buenos Aires: Editorial Mdica
Panamericana.
Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, (1995) O. M. S., Ginebra.
Henry, J. B.,(2005), El laboratorio en el diagnstico Clnico, edicin 20 Vol. 1, Mxico:
Editorial Salvat Mdica.
Rojas W. (2010), Inmunologa de Rojas, Medelln-Colombia: Editorial Corporacin para
Investigacin Biolgicas.

96

97