Colorants are added to foods to make them more attractive, replacing their natural color

that can be lost during the industrial process or to avoid variations in the color of the
final product. The trouble is that some synthetic azo dyes can be toxic to the human
healt hand when in contact with some drugs can cause allergic and asthmatic reactions
to some people, induced the development of cancer and others diseases [1]. In this way,
in the last years, efforts have been made to control and to limit the amount of synthetic
colorants that are added in foods, whereas the more toxic dyes have been banned. Thus,
it is necessary to have efficient methodologies to control the amount of colorants in
foods. The synthetic indigotin dye, indigotin (indigo carmine, E 132, IND), and the
synthetic azo dye, brilliant blue (E 133, BB) are among the colorants used in common
foods such as sweets, drinks, ice cream, and chewing gum. As with many other food
additives, the analytical control of these colorants is of considerable importance in the
food industry because of their toxic and carcinogenic potential [2, 3]. Several methods
have been proposed for the codetermination of colorants in mixtures. These methods
include UV/VIS spectrophotometry [48], chromatography [1, 912], capillary
electrophoresis [13], differential pulse polarography [14], voltammetry [15], and
chemometric techniques [1619].
Artificial sweeteners areal so widely used in food, beverage, confectionary, and
pharmaceutical industries throughout the world. They are the modern non-caloric
alternatives to sugars as additives in foods and drinks. Consumers select low-calorie
foods added with artificial sweeteners to decrease or to control calorie intake and thus
body mass and to aid control of certain health or medical conditions such as diabetes and
hypoglycemia. The acceptable daily intake (ADI) values, determined by Joint FAO/WHO
Expert Committee on Food Additives, are 040 mg Kg -1-1 body mass for aspartame (ASP, E
951) and 015 mg Kg for acesulfameK(ACE-K, E 950) [20]. The determination of ACE-K
and ASP in samples with the other sweeteners or additives has been carried out by high
performance liquid chromatography (HPLC) [2124]. In addition, ion chromatography (IC)
offers an attractive alternative to traditional HPLC methods [25]. In the past few years,
micellar electrokinetic chromatography (MEKC) and capillary zone electrophoresis (CZE)
have been applied to the simultaneous determination of several kinds of sweeteners
[26]. Other methods less commonly used for the Acesulfame-K and Aspartame
determination are Fourier transform Raman spectrometry [27], chemometry [2830], and
the others [31](Scheme 1).
Chromatography and capillary electrophoresis are very suitable when the sample
contains several colorants or sweeteners, and these methods need special equipment
that may not be available in certain quality laboratories. All multivariate calibration
methods, including partial least squares (PLS), require the data processing with powerful
software as well as the manipulations of the abstract vector space, and its application to
the regression analysis and various chemometric methods are often used for more
complex mixtures. But the foods, beverages, and pharmaceuticals contain only one, two,
or rarely three colorants and sweeteners. Thus, analytical methods for alternative
technique are always useful, especially if the methods are simple, cheap, and
comparatively fast. Spectrophotometry, as an alternative methodology, is suitable for
routine laboratories especially for developing countries, and sometimes, serious
analytical problems can be resolved by this common technique.
One of the classic analytical problems of spectrophotometric multicomponent
analysis is that the analyte of interest is often accompanied by other compounds
absorbing in the same spectral region. Under computer controlled instrumentation,
derivative spectrophotometry is playing a very important role in the resolution of band
overlapping in quantitative analysis [32]. However, for binary mixtures, the classical
zero-crossing method requires often to use a wavelength with low sensitivity in the
measurements. Salinas et al. [33] designed another spectrophotometric method, which is
based on the derivation of the ratio-spectra to resolve binary mixtures.
The main advantage of the ratio derivative spectrophotometry is the chance of
performing easy measurements in correspondence of peaks so it permits the use of the
wavelength of highest value of analytical signals (a maximum or a minimum), and
moreover, the presence of a lot of maxima and minima is another advantage by the fact
that the sewavelengths give an opportunity forthe determination of active compounds in
the presence of other compounds and ingredients which possibly interfere with the assay.

Although a great variety of methods have been applied to the analysis of the
aforementioned compounds in foods, there is no report about simultaneous estimation of
this combination in synthetic mixtures or in food samples. The aim of this work is to
developeasy,sensitive, and fast spectrophotometric methods that can be applied for the
routine analysis of the colorants (BB and IND) and sweeteners (ASP and ACE-K)
simultaneously in the quaternary laboratory mixtures, foods, and drinks without previous
separation. In the present study, measurements were assayed zero-crossing and ratio
spectra derivative techniques[3436]. Two methods were successfully applied for the
above combination, and satisfactory results were obtained. No extraction, no evaporation
step, no complexation agent, and no harmful chemicals are involved in the suggested
methods, in that connection decreasing time and the error in quantitation and therefore
can be used for routine analysis of both colorants in quality control and routine
laboratories.

2. Material and Methods

2.1. Instruments. A double-beam Shimadzu 2450 UV-VIS spectrophotometer, connected to
personal computer compatible with alaser printer, wasused. The bundle software,
version2.21,was used to process the absorption and derivative spectra. The spectral
band width was 1 nm and scanning speed was medium. Magnetic stirrer (Arex-Velp
Scientifica),
Hettich EBA 20 centrifuge, and 0.45 m membranes were used in this study.
2.2. Reagents and Materials.
All chemicals were analytical grade,anddoubledistilledwaterwasusedthroughout
the experiments. The standard synthetic colorants were Brilliant Blue (CI 42090, CAS
3844-45-9) from SigmaAldrich (Steinheim, Germany) and Indigotin (CI 73015, CAS 48289-3) from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany). The standard sweeteners were
Acesulfame-K (CAS 55589-62-3) from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) and
Aspartame
(CAS 22839-47-0). Chewing-gum samples were purchased from local markets. The
commercial chewing-gum samples, containing gum base, sweeteners (E950, E951),
softeners, bulking agents, flavorings, colorants (E132, E133), preservatives, moisture
trap, acid regulating, and antioxidant (BHA), were studied. The ingredients are in order
decreasing of concentration.
2.3. Solutions. Stock solutions (100 gmL
)of ASP and ACE-K were prepared separately by dissolving appropriate
weights of pure product in distilled water. These solutions were freshly prepared and
protected from light. Stock solu- tions of BB and IND (100 gmL) were also prepared in
distilled water. These stock solutions were further diluted with distilled water to obtain
working standard solutions of suitable concentrations (corresponding to the linearity
range stated in Tabl e 1 ). Accurate volumes of each of ASP, ACEK, BB, and IND stock
solution were transferred into 10 mL volumetric flasks and diluted to volume with distilled
water to prepare synthetic mixtures within the concentration range (210 gmL) of eac
hcompound (Tabl e 2).
2.4 prosedure
2.4.1. Spectrophotometric Measurements
(a) Sample Preparation. 50 chewing-gum samples were
Weighed and cut into small pieces. An accurately weighed
sample equivalent to ten chewing-gums was taken to erlenmeyer flask. 35mL of water
wasadded and stirred with magnetic stirrer for 20 min keeping temperature constant at
40 C by a thermostat. After the flask was cooled to the room temperature, centrifuged
and volume was completed to 50 mL with distilled water. The solution was filtered
through 0.45 mmembrane and transferred into a quartz cell. Absorption spectrum of the
solution was recorded between 300700 nm against distilled water. Then 0.1 g activated
charcoal was added to decolorize the solution [37], and the mixture was stirred

vigorously to adsorb all colorants in the solution. If the solution still has some colour, a
small further amount of activated charcoal should be added. The mixture was
centrifuged, and 0.5 mL solution was transferred into 10 mL volumetric flask. The volume
was completed with distilled water, and the absorption spectrum of the solution was
recorded between 200300 nm against distilled water. The proposed methods were
applied to the solutions thus prepared.
(b) Zero-Crossing Derivative Spectrophotometry. The absorption spectra of the standard ACE-K
and ASP solutions were recorded between 200300 nm against distilled water, using
1.0cm quartz cell and stored in adiskfile.These spectra were smoothed, and their firstand third-derivative spectra were recorded. The amplitudes, from the baseline to peak at
242 nm (1D2423), were related to the actual contents of ACEKand third derivative
amplitude at 227 nm (D)relatedto ASP content. Absorption spectra of the standard
colorant (BB and IND) solutions were recorded within a wavelength range of 300700 nm
against distilled water and stored in a disk file. These spectra were smoothed, and their
first derivative spectra were recorded. First-derivative absorbance values were measured
at 420 nm ()for Bb and 348nm (D348) for IND. Laboratory prepared mixtures of ACE-K,
ASP, IND, and
BB with different ratios in the concentration range stated in Tabl e 2 were prepared.
These solutions and commercial product were analyzed as described above. (c) Ratio
Derivative Spectrophotometry. According to the theory of the ratio-spectra derivative method,
absorption spectra of the standard ACE-K solutions were recorded with 1 nm resolution in
the
range
200300
nm
against
distilled
water
andstoredinthecomputer.ThestoredspectraoftheACEK were divided, wavelength by
wavelength, by a standard spectrum of 6 gmL -1 ASP solution. The ratio spectra were
smoothed, and their first-derivative spectra were recorded. In the binary mixtures, we
can determine the amount of) corresponding to a minimum. On the other hand, stored
spectra of ASP solutions were divided by a standard spectrum ACE-K by measuring the
amplitudes at 248 nm ( of 4 gmL -1 ACE-K solution. In the same way as we have
previously described, we obtained third derivative spectra from smoothed ratio spectra.
Now, ASP can be determined by measuring the signals at 225 nm ( 3 D 225 ) corresponding
to a minimum wavelength. trumof 6.0 gmL.
Absorption spectra of the solutions at different concentrations of BB were
recorded and divided by a standard spec- -1 IND, and the ratio spectra were obtained. All
spectra were stored in computer. Then the first derivative spectra of the ratio spectra
were plotted. In the binary mixture, the amount of BB can be determined by measuring
the first derivative signal at 419 nm ( 1 D 419 ) corresponding to a minimum in the spectral
region 300450 nm. In the same way, the absorption spectra of the solution at different
concentration of IND were divided by the standard spectrum of 4.0 gmL -1 BB solution.
First derivative spectra of the ratio spectra were plotted from the obtained ratio spectra.
The concentration of IND was determined by measuring the signal at 356 nm ( 1 D
356 ) corresponding to a minimum in the first derivative of the ratio spectra in 300400
nm region. Laboratory-prepared mixtures at different ratios were prepared in the
concentration range stated in Tabl e 2,and then the ratio derivative absorbance values
were measured at the selected wavelengths mentioned in Tabl e 1 . Commercial product
was also analyzed according to the procedure described above. 1 D 248.
GAMBARRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

3. Result and Discussion

3.1. Zero-Crossing Derivative Spectrophotometry.
Zero-order absorption spectra of ACE, ASP and, their mixture in the 200300
nmwavelength region are shown in Figure 1(a).The extensive overlap of the spectral
bands of the two sweeteners prevents the use of conventional UV spectrophotometry for
assaying binary mixtures. In contrast to zero-order spectra, derivative spectra show more
resolution in terms of 1 zero-crossing points shown in Figures 1(b) and 1(c).Firstderivative
wavelength was considered 242 nm (D) forthe determination of ACE-K, and the third
derivative wavelength 227 nm (3D2271) was considered for the determination of ASP. At
242 nm ( D 242 ) ASP shows zero absorbance; therefore ACE-K is determined at this
wavelength without any interference of ASP. At 227 nm ( 3 D 227 ) there is no contribution

of ACE-K and ASP is determined at this wavelength in the presence of ACE-K represented
in Figure 1(c). Absorption spectra of BB, IND, and their mixture were recorded within a
wavelength range of 300700 nm are shown in Figure 2(a). As can be seen, the spectra of
the colorants are strongly overlapped in the 400600 nm wavelength region. Hence,
direct absorption measurement for assaying binary mixture seems to be impossible. On
the other hand, the absorption spectra of the two components within a wavelength range
300450 nm were less overlapped than the region 450700 nm. So, in this work, the
region of 300 450 nm was chosen to analyze each colorant. Figure 2(b) shows the first
derivative spectra of IND and BB, and these
spectra allow the simultaneous determination of colorants. 1 1 D spectrum of IND shows a
well-defined minimum at 348 nm ( D 348 1 ), while BB has a zero 1 Dvalueatthesame
wavelength. BB has a minimum 242 D value at 420nm( ) which IND exhibits no
contribution. Therefore, at these selected wavelengths, two colorants can be quantified
in the presence of each other without interference. For the quantitative analysis of
colorants and sweeteners, the representative linear equations and other analytical
parameters are shown in Tabl e 1 . The correlation coefficients for active compounds
showed good linearity in the concentration range pronounced in the previous section.
3.2. Ratio Derivative Spectrophotometry. Ratio Derivative
Spectrophotometry permits determination of a component in their mixture at the
wavelengths corresponding to a maximum or a minimum and ,also, the use of the peak
to peak between consecutive maximum and minimum. The values of absorbance in
these points permit one, in some cases, to reach a better sensitivity. The main
instrumental conditions were optimized to obtain the most distinct curve of first and third
derivative of the ratio spectra. Divisor concentration is the main instrumental parameter.
The ratio spectra derivative method permits the use of the different concentrations as
the divisor to obtain the different calibration graphs. In a preliminary investigation, for
selecting the standard solution as a divisor at an appropriate concentration,
concentrations of ASP and ACE-K in the range 210 gmL -1 were tested. The
concentration of 4 gmL -1 of ACE-K and 6 gmL of ASP as a divisor gave the best results
in terms of signal to noise ratio and highest correlation coefficient values, being an
indication of the quality of fitting of the data to the straight line. spectrum of 6 gmL
Figure 3(a) shows the first derivative of the ratio-spectra of different amounts of ACE-K
solutions (divided by a standard -1 1 ASP solution). The first derivative amplitude at 248
nm ( D 248 ) corresponding to a minimum was proportional to ACE-K concentration. Figure
3(b) shows the third derivative ratio spectra of different concentration -1 1 D 420 of ASP
standard solutions using the spectrum of 4 gmL ACE-K solution as a divisor.
The concentration of ASP is proportional to the amplitude of the minimum at 225
nm ( 3 D 225 ). As can be seen in Figure 2(a), determination of IND and BB was not possible
by direct measurements of absorbance in zero-order spectra. On the other hand,
derivative spectroscopy shows more resolution and makes it possible to analyze each
colorant in the presence of one another as well as in the presence of other ingredients
without any pretreatment. Figure 4(a) indicates first derivative of the ratio spectra of IND
at increasing concentrations values, in the solution of distilled water, which were
obtained by dividing each of absorption spectrum with the spectrum of the standard
solution of BB. The calibration graph of IND ) corresponding to a minimum (Tabl e 1 ). Also
Figure 4(b) indicates the first derivative of the ratio spectra of different BB standards
(spectra divided by the spectrum of 6 gmL was established by measuring the signal at
356 nm ( BB). corresponding to a minimum (Tabl e 1 ). Also Figure 4(b) indicates the first
derivative of the ratio spectra of different BB standards (spectra divided by the spectrum
of 6 gmL BB).
Moreover, each set of standard solution of tested colorants and sweeteners,
within the concentration range stated in Tabl e 1 , was assayed by the proposed ratiospectra derivative method. There gressi online obtained with one divis or concentration
with their statistical data compiled in Tabl e 1 .The correlation coefficients were (from
0.9992 to 0.9999) indicating good linearity, and very small intercepts values were
obtained. For the determination of colorants and sweeteners in their synthetic mixtures
and in the chewing-gum sample, only the calibration graphs, that were obtained by
measuring 1 the signals at 356 nm( 1 D) for IND; 419 nm( 1 D 419 )forBBand 248 nm( D 248 )

forACE-K;225nm( 3 D 225 ) for ASP in the first and third derivative of the spectra, were
used. The developed methods were validated, and accuracy is shown in Tabl e 2.
Summary of various validation parameters is given listed in Tables 1 and 2, and the
results of chewinggum analysis are listed in Tabl e 3. A good coincidence was observed
for the assay results of the chewing-gum sample by application of two methods in this
paper (Tabl e 3).

3.3. Validation of the Methods.

Themethods were validated as regards in selectivity, linearity, precision (within and
between days) limit of detection (LOD), and limit of quantification (LOQ). The validation
results are shown in Tables 1 and 2.
3.3.1. Linearity.
Linearity was studied for each colorant and sweetener in the concentration ranged stated
in Tabl e 1 . The regression equations for the results were derived using the least-square
smethod. In all cases, Beers law plots( :5) were linear with very small intercepts and
good correlation coefficients (from 0.9992 -to 0.9999). The results of the linearity study
for all colorants and sweeteners with two methods are given in Tabl e 1 .
3.3.2. Precision, Accuracy and Percent Recoveries.
To tes the repeatability of the proposed methods, five separate determinations at
different concentration levels were carried out for each colorant in the presence of
certain concentration of the other component and for each sweetener in the presence of
other component. The percentage recoveries of each colorant and sweetener were
calculated by comparing the found and added concentration (gfound/g added) 100.
Mean recoveries are given in Tabl e 2. No interference occurred in the presence of the
others, and the mean percentage recoveries were found in the range 99.50%103.5% for
derivative zero-crossing and for derivative ratio method 98.00%103.5%. Recovery
values were close to 100%, and they indicate that the developed methods were
appropriate for accurate determination of sweeteners and colorants in their quaternary
mixtures. Beside these, RSD was calculated as <1.76% for the determination of BB, IND,
ACE-K, and ASP, and these values indicate that the developed methods could estimate
concentration values with a good precision. To evaluate the intra-day precision and interday precision (as RSD), each sample was analyzed three times in the same day. Three
replicates of each sample preparation and analysis were done to evaluate inter-day
precision (as RSD) in three the mean of RSD % (RSD% :(/ ) 100,where is the
standard deviation and is the mean of the sample analyzed) was taken for conclusion.
The results are shown inTabl e 2. These results show the accuracy and reproducibility of
the assay. Thus, it was concluded that there was no significant difference for the assay,
which was tested within the day and between the days. The results obtained show that
the relative standard deviation values were less than 2% which indicate high degree of
precision of the proposed methods. The low values of standard deviations showed that
the methods were precise. different days. The concentration values for both intra-day
precision and inter-day precision were calculated. Finally,
The mean of RSD % ( RSD% :(/ ) 100,where is the standard deviation and
is the mean of the sample analyzed) was taken for conclusion. The results are shown in
Tabl e 2. These results show the accuracy and reproducibility of the assay. Thus, it was
concluded that there was no significant difference for the assay, which was tested within
the day and between the days. The results obtained show that the relative standard
deviation values were less than 2% which indicate high degree of precision of the
proposed methods. The low values of standard deviations showed that the methods were
precise.

Pewarna ditambahkan ke makanan untuk membuat mereka lebih menarik, mengganti

warna alami mereka yang bisa hilang selama proses industri atau untuk menghindari
variasi warna produk akhir. Masalahnya adalah bahwa beberapa pewarna azo sintetis
dapat menjadi racun bagi tangan healt manusia ketika kontak dengan beberapa obat
dapat menyebabkan reaksi alergi dan asma untuk beberapa orang, disebabkan
perkembangan penyakit kanker dan lain-lain[1].Dengan cara ini, dalam tahun-tahun
terakhir, upaya telah dilakukan untuk mengendalikan dan membatasi jumlah pewarna
sintetis yang ditambahkan dalam makanan, sedangkan pewarna lebih beracun telah
dilarang. Oleh karena itu, perlu untuk memiliki metodologi yang efisien untuk mengontrol
jumlah pewarna dalam makanan. Sintetis indigotin pewarna, indigotin (indigo carmine, E
132, IND), dan pewarna azo sintetis, biru cerah (E 133, BB) adalah salah satu pewarna
yang digunakan dalam makanan umum seperti permen, minuman, es krim, dan permen
karet . Seperti banyak aditif makanan lainnya, kontrol analitis pewarna ini adalah hal
penting dalam industri makanan karena potensi beracun dan karsinogenik mereka[2,
3].Beberapa metode telah diusulkan untuk codetermination pewarna dalam campuran.
Metode
ini
termasuk
UV
/
VIS[4-8],kromatografi[1,
9-12],elektroforesis
kapiler[13],polarografi pulsa diferensial[14],voltametri[15],dan teknik chemometric[1619].
Buatan pemanis areal yang begitu banyak digunakan dalam makanan, minuman,
kembang gula, dan industri farmasi di seluruh dunia. Mereka adalah alternatif non-kalori
modern untuk gula sebagai aditif dalam makanan dan minuman. Konsumen memilih
makanan rendah kalori ditambahkan dengan pemanis buatan untuk mengurangi atau
mengontrol asupan kalori dan dengan demikian massa tubuh dan untuk membantu
kontrol kesehatan tertentu atau kondisi medis seperti diabetes dan hipoglikemia. Asupan
harian diterima (ADI) nilai-nilai, ditentukan oleh FAO / WHO Joint Committee Ahli Aditif
Makanan, adalah 0-40 mg Kg-1-1 massa tubuh untuk aspartam (ASP, E 951) dan 0-15 mg
Kg untuk acesulfameK (ACE-K, E 950)[20].Penentuan ACE-K dan ASP dalam sampel
dengan pemanis lainnya atau aditif telah dilakukan dengan kromatografi cair kinerja
tinggi (HPLC)[21-24].Selain itu, kromatografi ion (IC) menawarkan alternatif yang
menarik untuk metode HPLC tradisional[25].Dalam beberapa tahun terakhir,
kromatografi misel elektrokinetik (MEKC) dan zona kapiler elektroforesis (CZE) telah
diterapkan untuk penentuan simultan beberapa jenis pemanis[26].Metode lain yang
kurang umum digunakan untuk Acesulfame-K dan Aspartame tekad yang Fourier
transform
Raman
spektrometri[27],chemometry[28-30],dan
lain-lain[31]
(Skema1)sampel.
Chromatography dan elektroforesis kapiler sangat cocok bila berisi beberapa
pewarna atau pemanis, dan metode ini membutuhkan peralatan khusus yang mungkin
tidak tersedia di laboratorium kualitas tertentu. Semua metode kalibrasi multivariat,
termasuk kuadrat terkecil parsial (PLS), memerlukan pengolahan data dengan perangkat
lunak yang kuat serta manipulasi dari ruang vektor abstrak, dan aplikasi untuk analisis
regresi dan berbagai metode chemometric yang sering digunakan untuk campuran yang
lebih kompleks. Tapi makanan, minuman, dan obat-obatan hanya berisi satu, dua, atau
jarang tiga pewarna dan pemanis. Dengan demikian, metode analisis untuk teknik
alternatif selalu berguna, terutama jika metode yang sederhana, murah, dan relatif
cepat. Spektrofotometri, sebagai metodologi alternatif, cocok untuk laboratorium rutin

terutama bagi negara-negara berkembang, dan kadang-kadang, masalah analitis yang

serius dapat diatasi dengan teknik umum ini.
Salah satu masalah analitis klasik analisis multikomponen spektrofotometri adalah
bahwa analit kepentingan sering disertai oleh senyawa lain menyerap di wilayah spektral
yang sama. Di bawah dikendalikan komputer instrumentasi, spektrofotometri derivatif
memainkan peran yang sangat penting dalam resolusi band yang tumpang tindih dalam
analisis kuantitatif[32].Namun, untuk campuran biner, metode zero-crossing klasik
membutuhkan sering menggunakan panjang gelombang dengan sensitivitas rendah
dalam pengukuran. Salinas et al.[33]dirancang metode spektrofotometri lain, yang
didasarkan pada derivasi dari rasio-spektrum untuk menyelesaikan campuran biner.
Keuntungan utama dari spektrofotometri rasio derivatif adalah kesempatan
melakukan pengukuran mudah dalam korespondensi puncak sehingga memungkinkan
penggunaan panjang gelombang nilai tertinggi sinyal analitis (maksimum atau
minimum), dan terlebih lagi, kehadiran banyak maxima dan minima adalah keuntungan
lain oleh fakta bahwa sewavelengths memberikan kesempatan forthe penentuan
senyawa aktif dalam kehadiran senyawa lain dan bahan-bahan yang mungkin
mengganggu pengujian tersebut. Meskipun berbagai macam metode telah diterapkan
pada analisis senyawa tersebut dalam makanan, tidak ada laporan tentang estimasi
simultan kombinasi ini dalam campuran sintetis atau dalam sampel makanan. Tujuan dari
penelitian ini adalah untuk developeasy, sensitif, dan metode spektrofotometri cepat
yang dapat diterapkan untuk analisis rutin pewarna (BB dan IND) dan pemanis (ASP dan
ACE-K) secara bersamaan di laboratorium kuaterner campuran, makanan, dan minuman
tanpa pemisahan sebelumnya. Dalam penelitian ini, pengukuran diuji zero-crossing dan
spektrum rasio teknik derivatif[34-36].Dua metode berhasil diterapkan untuk kombinasi
di atas, dan hasil yang memuaskan diperoleh. Tidak ada ekstraksi, ada langkah
penguapan, tidak ada agen kompleksasi, dan tidak ada bahan kimia berbahaya yang
terlibat dalam metode yang disarankan, di koneksi mengurangi waktu dan kesalahan
dalam kuantisasi dan karena itu dapat digunakan untuk analisis rutin baik pewarna
dalam kontrol kualitas dan laboratorium rutin.

2. Bahan dan Metode

2.1. Instrumen. Sebuah double-beam Shimadzu 2450 UV-VIS spektrofotometer, terhubung ke

komputer pribadi yang kompatibel dengan printer alaser, wasused. Perangkat lunak
bundel, version2.21, digunakan untuk memproses penyerapan dan spektrum derivatif.
Band lebar spektral adalah 1 nm dan kecepatan scanning adalah media. Magnetic
pengaduk (Arex-Velp Scientifica),
Hettich EBA 20 centrifuge, dan 0,45 membran m yang digunakan dalam penelitian ini.
2.2. Reagen dan Material.
Semua bahan kimia yang kelas analitis, anddoubledistilledwaterwasusedthroughout
percobaan. Pewarna sintetis standar yang Brilliant Blue (CI 42090, CAS 3844-45-9) dari
Sigma-Aldrich (Steinheim, Jerman) dan Indigotin (CI 73015, CAS 482-89-3) dari SigmaAldrich (Steinheim, Jerman). Pemanis standar yang Acesulfame-K (CAS 55589-62-3) dari
Sigma-Aldrich (Steinheim, Jerman) dan Aspartame
(CAS 22839-47-0). Sampel permen karet yang dibeli dari pasar lokal. Sampel permen
karet komersial, yang mengandung gum base, pemanis (E950, E951), pelembut, bulking
agen, perasa, pewarna (E132, E133), pengawet, kelembaban perangkap, mengatur
asam,
dan
antioksidan
(BHA),
dipelajari.
Bahan-bahan
dalam
rangka
penurunankonsentrasi.

2.3. Solusi. Solusi Stock (100 gmL)

dari ASP dan ACE-K disusun secara terpisah dengan melarutkansesuai
bobot produk murni dalam air suling. Solusi ini baru siap dan terlindung dari cahaya.
Tions saham larutan dari BB dan IND (100 gmL) juga disiapkan dalam air suling. Solusi
saham tersebut lebih diencerkan dengan air suling untuk mendapatkan solusi standar
kerja konsentrasi cocok (sesuai dengan rentang linearitas dinyatakan dalam Tabl e

1).Volume akurat dari masing-masing ASP, acek, BB, dan larutan stok IND ditransfer ke
10 mL labu volumetrik dan diencerkan dengan volume dengan air suling untuk
mempersiapkan campuran sintetis dalam rentang konsentrasi (2-10 gmL) dari
hcompound EAC(Table2).
2.4 prosedure
2.4.1. Pengukuran spektrofotometri
(a) PreparasiSampel.50 sampel permen karet yang
Ditimbang dan dipotong kecil-kecil. akurat ditimbang
Sampelsetarauntuk sepuluh mengunyah-gusi dibawa ke erlenmeyer flask. 35ml air
wasadded dan diaduk dengan pengaduk magnet selama 20 menit suhu menjaga konstan
pada 40 C dengan termostat. Setelah labu didinginkan ke suhu kamar, disentrifugasi dan
volume selesai 50 mL dengan air suling. Larutan disaring melalui 0,45 mmembrane dan
ditransfer ke dalam sel kuarsa. Spektrum penyerapan larutan tercatat antara 300-700
nm terhadap air suling. Kemudian 0,1 g diaktifkan arang ditambahkan ke dekolorisasi
solusi[37],dan Campuran diaduk dengan penuh semangat untuk menyerap semua
pewarna di solusinya. Jika solusi masih memiliki beberapa warna, kecil selanjutnya
sejumlah arang aktif harus ditambahkan. Itu Campuran disentrifugasi, dan 0,5 mL larutan
dipindahkan menjadi 10 mL labu ukur. Volume selesai dengan air suling, dan spektrum
penyerapan larutan tercatat antara 200-300 nm terhadap air suling. Metode yang
diusulkan diterapkan untuk solusi sehingga siap.
(B) Zero-Crossing Spektrofotometri Derivatif. Spektrum penyerapan standar ACE-K dan ASP
solusi dicatat antara 200-300 nm terhadap air suling, menggunakan sel 1.0cm kuarsa
dan disimpan di adiskfile.These spektrum yang dihaluskan, dan spektrum pertama dan
ketiga turunannya dicatat. Amplitudo, dari baseline untuk puncak pada 242
nm(1D2423),yang terkait dengan isi sebenarnya dari ACEKand amplitudo derivatif ketiga di
227 nm (D) konten ASP relatedto. Spektrum penyerapan pewarna standar (BB dan IND)
solusi dicatat dalam kisaran panjang gelombang 300-700 nm terhadap air suling dan
disimpan dalam file disk. Spektrum tersebut dihaluskan, dan spektrum derivatif pertama
mereka direkam. Pertama-derivatif nilai absorbansi diukur pada 420 nm () untuk Bb dan
348nm (D348)untuk IND. Campuran laboratorium disiapkan dari ACE-K, ASP, IND, dan
BB dengan rasio yang berbeda dalam rentang konsentrasi dinyatakan dalam Tabl e
2dibuat. Solusi dan produk komersial dianalisis seperti dijelaskan di atas. (c) Rasio
SpektrofotometriDerivatif.Menurut teori metode derivatif rasio-spektrum, spektrum
penyerapan standar solusi ACE-K yang direkam dengan resolusi nm 1 di kisaran 200-300
nm terhadap air suling andstoredinthecomputer.ThestoredspectraoftheACEK dibagi,
panjang gelombang dengan panjang gelombang, dengan standar spektrum 6 gmL -1
Solusi ASP. Spektrum rasio yang merapikan, dan spektrum pertama-derivatif mereka
direkam. Dalam campuran biner, kita dapat menentukan jumlah) sesuai dengan
minimum. Di sisi lain, spektrum disimpan solusi ASP dibagi oleh standar spektrum ACE-K
dengan mengukur amplitudo pada 248 nm ( dari 4 gmL -1 Solusi ACE-K. Dengan cara
yang sama seperti yang kita miliki dijelaskan sebelumnya, kami memperoleh spektrum
derivatif ketiga dari spektrum rasio merapikan. Sekarang, ASP dapat ditentukan dengan
mengukur sinyal pada 225 nm ( 3 D 225 ) sesuai dengan panjang gelombang minimum.
trumof 6.0 gmL.
spektrum Penyerapan solusi pada konsentrasi yang berbeda dari BB dicatat dan
dibagi oleh alamiah lainnya standar -1 IND, dan spektrum rasio diperoleh. Semua
spektrum yang disimpan dalam komputer. Maka spektrum derivatif pertama dari
spektrum rasio diplotkan. Dalam campuran biner, jumlah BB dapat ditentukan dengan
mengukur sinyal derivatif pertama di 419 nm(1 D 419) sesuai dengan minimal di spektral
wilayah 300-450 nm. Dengan cara yang sama, spektrum penyerapan solusi pada
konsentrasi yang berbeda IND dibagi dengan spektrum standar 4.0 gmL -1 solusiBB.
Spektrum derivatif pertama dari spektrum rasio diplotkan dari spektrum rasio yang
diperoleh.
Konsentrasi IND ditentukan dengan mengukur sinyal pada 356 nm (1 D 356) sesuai
dengan minimal di turunan pertama dari spektrum rasio di wilayah 300-400 nm.
Campuran laboratorium disiapkan pada rasio yang berbeda disiapkan pada rentang
konsentrasi dinyatakan dalam Tabl e2,dan kemudian rasio nilai absorbansi derivatif

diukur pada panjang gelombang yang dipilih disebutkan dalam Tabl e 1.Produk komersial
juga dianalisis sesuai dengan prosedur yang dijelaskan di atas. 1 D 248.
GAMBARRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Zero-Crossing Spektrofotometri Derivatif.
Orde nol penyerapan spektrum ACE, ASP dan, campuran mereka di wilayah
nmwavelength 200-300 ditunjukkan pada Gambar 1 (a).suatu tumpang tindih ekstensif
band spektral dari dua pemanis mencegah penggunaan spektrofotometri UV
konvensional untuk pengujian biner campuran. Berbeda dengan nol-order spektrum,
spektrum derivatif menunjukkan resolusi lebih dalam hal 1 poin zero-crossing ditunjukkan
pada Gambar 1 (b) dan 1 (c).Firstderivative panjang gelombang dianggap 242 nm (D)
forthe penentuan ACE-K, dan panjang gelombang turunan ketiga 227 nm(3D2271)dianggap
untuk penentuan ASP. Pada 242 nm ( D 242 ) ASP menunjukkan nol absorbansi; karena itu
ACE-K ditentukan pada panjang gelombang ini tanpa campur tangan dari ASP. Pada 227
nm ( 3 D 227 ) Tidak ada kontribusi ACE-K dan ASP ditentukan pada panjang gelombang ini
di Kehadiran ACE-K direpresentasikan pada Gambar 1(c). Spektrum penyerapan BB, IND,
dan campuran mereka direkam dalam kisaran panjang gelombang 300-700 nm yang
ditunjukkan pada Gambar 2(a).Seperti dapat dilihat, spektrum dari pewarna sangat
tumpang tindih dalam panjang gelombang 400-600 nm wilayah. Oleh karena itu,
penyerapan langsung pengukuran pengujian campuran biner tampaknya tidak mungkin.
Di sisi lain tangan, spektrum penyerapan dari dua komponen dalam berbagai panjang
gelombang 300-450 nm yang kurang tumpang tindih dari wilayah 450-700 nm. Jadi,
dalam pekerjaan ini, wilayah 300- 450 nm dipilih untuk menganalisa setiap pewarna.
Gambar 2 (b) menunjukkan spektrum derivatif pertama IND dan BB, danini
spektrummemungkinkan penentuan simultan pewarna. 1 1 Spektrum D dari IND
menunjukkan minimum didefinisikan dengan baik di 348 nm ( D 348 1 ), Sedangkan BB
memiliki nol 1 Dvalueatthesame panjang gelombang. BB memiliki minimum 242 Nilai D di
420nm ( ) Yang pameran IND ada kontribusi. Oleh karena itu, pada ini panjang
gelombang yang dipilih, dua pewarna dapat diukur dalam kehadiran satu sama lain tanpa
gangguan. Untuk analisis kuantitatif pewarna dan pemanis, persamaan linear perwakilan
dan analisis lainnya parameter yang ditampilkan di Tabl e 1.Korelasi koefisien untuk
senyawa aktif menunjukkan linearitas yang baik di konsentrasi Kisaran diucapkan dalam
bagian sebelumnya.
3.2. Rasio Spektrofotometri Derivatif. RasioDerivatif
Spektrofotometrimemungkinkan penentuan komponen dalam campuran mereka pada
panjang gelombang yang sesuai dengan maksimum atau minimum dan, juga,
penggunaan puncak ke puncak antara maksimum berturut-turut dan minimum. Nilai-nilai
absorbansi di titik-titik ini mengizinkan satu, dalam beberapa kasus, untuk mencapai
sensitivitas yang lebih baik. Kondisi berperan utama yang dioptimalkan untuk
mendapatkan kurva yang paling berbeda dari turunan pertama dan ketiga dari spektrum
rasio. Konsentrasi pembagi adalah parameter berperan utama. Rasio spektrum metode
derivatif memungkinkan penggunaan konsentrasi yang berbeda sebagai pembagi untuk
mendapatkan grafik kalibrasi yang berbeda. Dalam penyelidikan awal, untuk memilih
solusi standar sebagai pembagi pada konsentrasi yang tepat, konsentrasi ASP dan ACE-K
di kisaran 2-10 gmL -1 diuji. Konsentrasi 4 gmL -1 dari ACE-K dan 6 gmL dari ASP
sebagai pembagi memberikan hasil terbaik dalam hal sinyal untuk rasio kebisingan dan
tertinggi nilai koefisien korelasi, menjadi indikasi kualitas pas data untuk garis lurus.
spektrum 6 gmL Gambar 3 (a) menunjukkan turunan pertama dari rasio-spektrum
jumlah yang berbeda dari solusi ACE-K (dibagi dengan standar -1 1 solusi ASP). Amplitudo
derivatif pertama di 248 nm (D 248) sesuai dengan minimum adalah sebanding dengan
konsentrasi ACE-K. Gambar 3 (b) menunjukkan spektrum rasio turunan ketiga
konsentrasi yang berbeda -1 1 D 420 dari ASP solusi standar menggunakan spektrum 4
gmL ACE-K solusi sebagai pembagi.
Konsentrasi ASP adalah sebanding dengan amplitudo minimum pada 225 nm (3 D
225). Seperti dapat dilihat pada Gambar 2(a),penentuan IND dan BB tidak mungkin
dengan pengukuran langsung dari absorbansi nol-order spektrum. Di sisi lain,

spektroskopi derivatif menunjukkan resolusi lebih dan memungkinkan untuk menganalisa

masing-masing pewarna di hadapan satu sama lain sebagai serta dengan adanya bahanbahan lainnya tanpa pretreatment. Gambar 4 (a) menunjukkan turunan pertama dari
rasio spektrum IND meningkatkan nilai konsentrasi, dalam larutan air suling, yang
diperoleh oleh membagi masing-masing spektrum penyerapan dengan spektrum solusi
standar BB. Kalibrasi grafik IND ) sesuai dengan minimal(Table 1).Juga Gambar 4 (b)
menunjukkan turunan pertama dari spektrum rasio yang berbeda Standar BB (spektrum
dibagi dengan spektrum 6 gmL didirikan dengan mengukur sinyal pada 356 nm ( BB).
sesuai dengan minimal(Table 1).Juga Gambar 4 (b) menunjukkan turunan pertama dari
spektrum rasio yang berbeda Standar BB (spektrum dibagi dengan spektrum 6 gmL BB).
Selain itu, setiap set larutan standar pewarna diuji dan pemanis, dalam rentang
konsentrasi dinyatakan dalam Tabl e 1,diuji dengan turunan rasio-spektrum yang
diusulkan metode. Ada gressi secara online diperoleh dengan satu divis atau konsentrasi
dengan data statistik mereka disusun dalam Tabl e 1 .suatu koefisien korelasi adalah
(0,9992-0,9999) menunjukkan nilai-nilai yang baik linearitas, dan sangat kecil
penyadapan yang diperoleh. Untuk penentuan pewarna dan pemanis dalam campuran
sintetis dan dalam sampel permen karet, hanya grafik kalibrasi, yang diperoleh dengan
mengukur 1 sinyal pada 356 nm ( 1 D) untuk IND; 419 nm ( 1 D 419 ) forBBand 248 nm ( D
248 ) forACE-K; 225nm ( 3 D 225 ) Untuk ASP di pertama dan turunan ketiga dari spektrum,
yang digunakan. Metode yang dikembangkan divalidasi, dan akurasi ditunjukkan dalam
Tabl e2.berbagai parameter validasi adalah mengingat tercantum dalam Tabel 1 dan
2,dan hasil chewinggum analisis tercantum dalam Tabl e3.Sebuah kebetulan yang baik
adalah diamati untuk hasil uji sampel permen karet oleh penerapan dua metode dalam
makalah ini(Table3).

3.3. Validasi Metode.

Themethods telah divalidasi sebagai salam di selektivitas, linieritas, presisi (dalam dan di
antara hari) batas deteksi (LOD), dan batas kuantifikasi (LOQ). Hasil validasi ditunjukkan
pada Tabel 1 dan 2.
3.3.1. Linearitas.
Linearitas dipelajari untuk setiap pewarna dan pemanis dalam konsentrasi berkisar
dinyatakan dalam Tabl e 1.Persamaan regresi untuk hasil yang diperoleh dengan
menggunakan smethod least-square. Dalam semua kasus, plot hukum Beer(: 5) yang
linear dengan penyadapan sangat kecil dan koefisien korelasi yang baik (dari 0,9992
-untuk 0,9999). Hasil studi linearitas untuk semua pewarna dan pemanis dengan dua
metode yang diberikan dalam Tabl e 1.
3.3.2. Presisi, Akurasi dan Persen Penerimaan.
Untuk tes pengulangan metode yang diusulkan, lima penentuan terpisah pada tingkat
konsentrasi yang berbeda dilakukan untuk setiap pewarna dengan adanya konsentrasi
tertentu dari komponen lain dan untuk setiap pemanis di hadapan komponen lainnya.
Perolehan persentase masing-masing pewarna dan pemanis dihitung dengan
membandingkan konsentrasi ditemukan dan ditambahkan(gfound/ g ditambahkan)
100. pemulihan Berarti diberikan dalam Tabl e2.Tidak ada gangguan terjadi di hadapan
orang lain, dan mean persentase pemulihan ditemukan di kisaran 99,50% -103,5% untuk
derivatif zero-crossing dan untuk metode rasio derivatif 98,00% -103,5%. Nilai pemulihan
yang mendekati 100%, dan mereka menunjukkan bahwa metode yang dikembangkan
yang sesuai untuk penentuan akurat pemanis dan pewarna dalam campuran kuaterner
mereka. Selain ini, RSD dihitung sebagai <1,76% untuk penentuan BB, IND, ACE-K, dan
ASP, dan nilai-nilai ini menunjukkan bahwa metode yang dikembangkan bisa
memperkirakan nilai konsentrasi dengan presisi yang baik. Untuk mengevaluasi presisi
intra-hari dan inter-hari presisi (seperti RSD), masing-masing sampel dianalisis tiga kali di
hari yang sama. Tiga ulangan dari setiap persiapan sampel dan analisis dilakukan untuk
mengevaluasi antar-hari presisi (seperti RSD) di tiga rerata RSD% (RSD% :(/ ) 100, di
mana adalah standar deviasi dan adalah mean sampel dianalisis) diambil untuk
kesimpulan. Hasilnya ditunjukkan dalamTabl e2.Hasil ini menunjukkan akurasi dan
reproduktifitas pengujian tersebut. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa tidak ada

perbedaan yang signifikan untuk pengujian, yang diuji dalam hari dan antara hari. Hasil
yang diperoleh menunjukkan bahwa relatif nilai standar deviasi kurang dari 2% yang
menunjukkan tingkat presisi yang tinggi dari metode yang diusulkan. Nilai-nilai yang
rendah dari standar deviasi menunjukkan bahwa metode yang tepat. hari yang berbeda.
Nilai konsentrasi untuk kedua presisi intra-hari dan inter-hari presisi dihitung. Akhirnya,
Rerata RSD% (RSD% :(/ ) 100, di mana adalah standar deviasi dan adalah
mean dari sampel dianalisis) diambil untuk kesimpulan. Hasilnya ditunjukkan dalam Tabl
e2.Hasil ini menunjukkan akurasi dan reproduktifitas pengujian tersebut. Dengan
demikian, dapat disimpulkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan untuk
pengujian, yang diuji dalam hari dan antara hari. Hasil yang diperoleh menunjukkan
bahwa relatif nilai standar deviasi kurang dari 2% yang menunjukkan tingkat presisi yang
tinggi dari metode yang diusulkan. Nilai-nilai yang rendah dari standar deviasi
menunjukkan bahwa metode yang tepat.