Resultado

Solubilizacin de protenas de membrana

de epimastigote de Trypanosoma cruzi
con Tritn X-114 y agentes caotrpicos.
Luego de haber solubilizado las protenas
de con distitnto tratamientos, las
fracciones como resultado de esto fueron
analizadas con un sistema de geles de
poliacrilamida al 12 %. Las primeras
muestras analizadas fueron las obtenidas

mediante el uso de detergentes y agentes

caotrpicos. Para procesar y cuantificar
las bandas obtenidas, se calcul el valor
de frente relativo (Rf), lo que nos
permiti comparar entre los resultados
obtenidos (no mostrado).

Al revelar el gel (figura 1), fue

sorprendente el hecho de la notaria
ausencia de algunas de las fracciones
procesadas. Solo se pudo observar bandas
en las fracciones solubles de los
tratamientos de agentes caotrpicos y de
choque osmtico, y en el pellet de este
ltimo, cabe destacar que el pozo 10 ser
analizado ms adelante. Al comparar las
bandas nmero 1 de los pozos 4 y 6, tanto
cualitativa como cuantitativamente, no

muestran
diferencia
alguna.
Por
cuestiones operativas, se obviar la
extrapolacin de los pesos moleculares.
Es bastante interesante el hecho de que
las bandas 1 de los pozos anteriormente
nombrados
presenten caractersticas
similares, a pesar de venir de tratamientos
diferentes.
Posteriormente
se
realizaron
electroforesis para los tratamientos con
proteasas.
Digestin dependiente del tiempo y la
concentracin de las protenas de de
membrana.
El primero de los elementos examinados
a la hora de realizar digestiones

enzimticas, es ver cul es la

concentracin ideal para realizar este tipo
de anlisis, y cual tipo de proteasa
(especifica o no) te permite visualizar
mejor resultados. En la figura 2, la cual
corresponde el gel en el que se probaron
distintas concentraciones de dos proteasas
(Tripsina, la cual es una serinproteasa y
Proteinasa K, la cual no es especfica),
que a su vez, nos permiti realizar un
estimado de los componentes proteicos
extramembranales.

En el pozo 1, en el cual se inicia el

tratamiento con Tripsina a concentracin
0, la banda 1 y una banda 2 de menor
intensidad, que podemos estimar tanto
por su posicin como por su Rf, son un
conjunto de protenas de alto peso
molecular. A medida de que se aumenta la
concentracin observa una consecuente
aparicin (y desaparicin) de bandas
como las bandas 2, 3 y 4 de los pozos 1,
2, 3 y 4 respectivamente, y que cuando se
compara con la Proteinasa K, en
cualquiera de los casos, es un proceso de
digestin menos catico. Las aparicin de
las bandas 3 y 4, parece obedecer a la
digestin de sus antecesoras, aunque es
bastante llamativo la desparicin de
ambas bandas en el pozo 4.

En los pozos correspondientes al

traramiento con Proteinasa K, como se
haba mencionado antes, la obtencin de
banda aparentemente fue aleatoria, y que
a
pesar
unas
concentraciones
relativamente bajas con respecto a las
utilizadas para la Tripsina (7,5 mM para
la proteinsa, 50 mM para la Tripsina),
pareci ms efectiva para la digestin.
Aparentemente la concetracin ideal
aparente para utilizarlo en un estudio de
anlisis, es de 4,5 mM que se ve reflejada
en el pozo 6 de la figura 2.

Ahora, ara la digestin a concentracin

fija pero en distintos tiempos, representa
por el gel de la figura 3, se puede
observar
que
para
los
pozos
correspondientes a la Tripsina, persisten
(aunque con una marcada atenuacin de
la seal) las mismas 4 bandas vistas en la
figura 2. En la caso de la Proteinsa K,
aunque se ve una marcada corrida, que
conforman el conjunto de bandas 2 y 3
para el pozo 1 que representa el tiempo 0,
es fcilmente denotada la disminucin de
la intensidad con el pasar del tiempo. La
formacin de una 4ta banda en el pozo
dos, es visible en el pozo 2. Para el pozo
5, cabe destacar que tiene un

comportamiento de recorrido muy similar

al pozo 7 de la figura 2.
Discusin.
Antes de dar un anlisis completo de los
resultados obtenidos en esta experiencia,
se debe tomar en cuenta una seride
aspectos: 1) Los mtodos para la
solubilizacin de protenas y el hecho de
haber realizado una sola vez la
experiencia, no son determinantes para
determinar o no la presencia de protenas
de membrana; 2) No se garantiza adems,
de que lo que realmente se estaban
obteniendo era fracciones puras de las
protenas de membrana, ya que se debi

utilizar algn tipo de marcador

(eznimtico o qumico), que realmente
certificara esto. Podramos mencionar
ejemplos especficos de experiencias
hechas en el glicosoma de Leishmania
mexicana, el cual es un parsito bastante
cercano a T. cruzi (Quiones et. al, 2014)
como en otros organismos como bacterias
(Collin), en cual se buscaba el mejor
mtodo de pruficacin de protenas que
intervengan en procesos metablicos; 3)
No se realiza de inmediato la
comparacin de los pesos moleculares
obtenidos mediante extrapolacin de
datos de una escalera de peso molecular
conocida, ya que no se present la

escalera en todos los geles. Sin embargo,

con respecto al ltimo punto, durante el
anlisis de los resultados, se dar a
conocer algunas cifras obtenida de estos
anlisis.
En los trabajos mencionados en el prrafo
anterior, son bastantes tiles para ver los
alcances de tcnicas tan elementales.
Quiones et al, en el 2014 lograron
aportar mucha informacin sobre la
biologa de los glicosomas, ya que se
determinaron las posibles topologas de
las distintas protenas que conforman la
membrana adems de la composicin
lipdica. Lo que hizo poderosa la
investigacin, fue la utilizacin de una
mtodo alternantivo de fraccionamiento,
fue la centrifugacin isopicnica con un
gradiente de glucosa, adems de una
verficacin con marcadores enzimticos,
que indicaba el nivel de riqueza organelas
de las fracciones obtenidas.
Collins y , en 1979 lograron realizar
distintas pruebas de rendimiento de
solubilizacin a travs de detergente y
agentes caotrpicos, para el aislamiento
de protenas de membrana de Microcous
lysodeikticus, y que verficaron la pureza
de
lo
obtenido
mediante
Inmunoelectroforesis.
Con los ejemplos anteriores, podemos
concluir que la metodologa es fuerte, si
existiera manera de certificar que
realmentes se logr purificar o por lo
menos enriquecer la fraccin que
obtuvimos de la experiencia.
A continuacin, se proceder al anlisis
de los resultados obtenidos en la
experiencia.
La solubilizacin mediante distintos
mtodo, aparentemente no fue plausible.

La figura 1, donde se encuentran todos

los tratamientos qumicos, al momento de
no revelarse bandas en casi todos los
tratamientos, tanto con Titrn X-114
como para agentes caotrpicos. Primero,
nos enfocaremos en los tramtamientos
Tritn X-114; el hecho de que no se
visualice ninguna protena en el gel, no
hace pensar en varias posibilidades, todas
que provienen del error sistemtico. Una
de ellas fue que la cuantificacin proteica
mediante el mtodo de Lowry, hecha al
inicio de la expereincia, no estim bien
este contenido en el cultivo, por lo que
pudo subestimar o sobrestimar
los
clculos de la cantidad necesaria de Tritn
X-114 para solubilizar las membranas de
los parsito presentes. Esto se fundamenta
a que Bordier en 1981, hace mencin de
que existe una cantidad determinada de
4,7 g de Triton X-114 al 2%, en la
experiencia, se llevo una concentraci
madre de 7,27 mg/ml a 1 mg/ml, por lo
que aqu podra acarrear un error. La otra
posibilidad es que realizando algn
traspaso, se perdi una importante
cantidad de la muestra, y por ello no fue
observado en el gel.
Para el caso de los resultados obtenidos
para los tratamientos con agentes
caotrpicos, en donde se observa una
banda de muy dbil seal, en el pozo 4
que corresponde al sobrenadante de la
muestra tratada con los mismos. A pesar
de estar reportado que la extraccin con
dichos agentes, son bastantes menos
eficientes (Collins), los resultados
obtenidos no son comparables con otros
reportados para protenas de membrana
de organelas del mismo parsito
(Quiones et al, 2004) y parsitos
relacionados como Leishmania mexicana
(Quiones et al, 2014). A pesar de ser

reportado que algunas protenas integrales

pueden separarse (), por la definicin para
protenas perofricas dicha por Nicolson
en el 2014, la banda observada observada
en el pozo 4, se podra asegurar que son
protenas perifricas. Aunque la ausencia
de bandas en el pozo 5, que corresponde
al pellet de los tratamientos con agentes
caotrpicos, puede indicar alguna falla en
la metodologa, ya que se ha reportado la
presencia de protenas en el pellet de un
tratamiento con estos agentes, ya que son
clulas completas asentadas (Quiones et
al, 2004).
Para las muestras de choque osmtico,
que corresponden a los pozos 6 y 7, se
pueden
observar
tanto
para
el
sobrenadante como el pellet, seal de
presencia de protenas, y se ha reportado
que con este mtodo, se pueden lograr
obtener protenas perifricas, ya que
existen experiencias previas que reporta
este resultado (), aunque actualmente se
reconoce el dao que puede llegar a sufrir
la clula y que posteriormente se debe
aplicar mtodos para el reconocimiento
de las protenas citoslicas y de
membrana ().
El anlisis de los pesos protenas de la
figura 1, el cual fue el nico gel en el que
se pudo observar la escalera, fue
determinado los rfs y pesos moleculares
de las bandas obtenidas. Se debe tener en
cuenta que las bandas observada que no

corresponden a una sola protena, si no a

un conglomerado de las mismas, que
tienen un peso similar dentro de un rango
de los mismos y que para lograr
caracterizar las protenas en cada de las
bandas obtenidas, se debe realizar otros
mtodos de separacin y anlisis ().
Digestin de protenas de membrana con
dos proteasas distintas y con distitnas
variables.
Para ambos casos, tanto para la medida
con concentraciones distintas como en
tiempos distintos, dieron resultados
similares entre s. Se puede observar que
la
ms
informativa
de
las
concentraciones, para el caso de la
Tripsina fue de 25 g y para la proteinasa
K fue de 4,5 g. Sin embargo, esto
depende de lo que se quiera realizar, lo
obtenido puede ser til o no, pero para
certificar que realmente se estn obtenido
protenas de membrana digeridas, es
necesario utilizar algn marcador (). Se
puede confirmar que los patrones de
digestiones obtenidos son propios para
cada enzima, y se puede observar esto en
la figura 3.