ELISA (Enzime Linked

Immunoassay):
Bases Tericas y Fundamentos
Prcticos
Versin a utilizar
en sesiones: 6 y 9

Ensayo inmunoenzimtico
Definicin:

Es una tcnica que combina la especificidad

de los anticuerpos con la sensibilidad de un
ensayo enzimtico. Esta tcnica es utilizada
para medir tanto antgenos como anticuerpos,
de manera cualitativa, semicuantitativa y
cuantitativa

http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp

Las inmunoglobulinas:
estructura y funcin

Antgenos e Interacciones
Antgeno-anticuerpo
Molculas
complejas extraas
al organismo, de
naturaleza proteica
que son capaces de
inducir una RI y
combinarse con los
elementos
efectores
de la misma

Enlaces
Enlaces inicos
Enlaces
Enlaces
de
hidrgeno
Interacciones
Interacciones
hidrofbicas
Fuerzas
Fuerzas de van
der Waals
Interacciones
Interacciones
dipolo
-dipolo
dipolo-dipolo

Fases de las respuesta inmune

humoral

Abbas
Abbas A,
A, Inmunologa
Inmunologa celular
celular yy molecular
molecular 2000
2000

FUNDAMENTO DEL ELISA

Muestra
Muestra
Ag
Ab
Ag
Ab
Ag-Ab
Ag-Ab-Enzima

Fase Slida
Enzima unida al
anticuerpo

Substrato

Compuesto
Compuesto coloreado
coloreado

ELEMENTOS DEL ELISA

Tipo de muestra
Antgenos
Anticuerpos
Fase slida
Enzimas
Lavados
Substratos

Lequin RM, Clin Chem, 2005; 51:2415

Revelador de la actividad enzimtica

TIPO DE MUESTRA
Orina

Suero

Saliva

Heces

LCR

Otros

ANTGENO
Completo (Organismo, estructura
ntegra)

Extracto total

(Ultrasonido,solventes)

Fase slida

Fraccin Purificada (Ncleo, de

membranas,

organelas)

Pptido sinttico

ANTICUERPOS: Policlonales (infecciones naturales)

Monoclonales
Produccin de Anticuerpos Monoclonales
Inmunizacin de un ratn para
estimular la produccin de
anticuerpos

Clulas formadoras de
anticuerpo aisladas del bazo

Clulas tumorales crecen

en cultivos tisulares

Conjugado
Conjugado con
con la
la
enzima
enzima
Clulas formadoras de anticuerpo se fusionan con
clulas tumorales cultivadas para formar un hibridoma

Se mide la produccin de
anticuerpos por los hibridomas

Se clonan las clulas de hibridoma

productoras de anticuerpo

Se separan los anticuerpo

monoclonales del cultivo

Capturar
Capturar antgenos
antgenos

MATERIALES DE LA FASE SLIDA:

Soporte
Nitrocelulosa
Polivinilo
Poliestireno
Ltex, nylon,
celulosa

Forma
disponible
Membranas,
Lminas
Placas, Lminas
Placas, Lminas,
Perlas
Lminas, Perlas

Unin
No
covalente
Covalente
Covalente
Covalente

SOLUCIN
DE BLOQUEO
:
Buffer de
bloqueo
Casena

Composicin

Desventajas

5% p/v leche sin grasa

Deteriora
rpidamente.
Enmascara algunos
antgenos

Casena/Tween2 5% p/v leche sin grasa, O,2

0
%de Tween20

Tween 20
Gelatina
BSA

O,2 %de Tween

Deteriora
rpidamente.
Enmascara algunos
antgenos
Podra generar
algunos residuos

Gelatina 0.2% (2mg/ml)

3% de BSA,

Relativamente costoso

Sistema de revelado de la reaccin Ag-Ac:

ENZIMA

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Alta pureza
Actividad especfica
Bajo costo
Ausencia en fluidos biolgicos
Fcil deteccin
Facilidad de conjugacin
Estabilidad a ciertas
condiciones de
almacenamiento
http://www.che.utexas.edu/~angela/sbelisa.jpg

TIPOS LA ENZIMA

ENZIMA

ORIGEN

Substrato

Peroxidasa

Rabano picante

OPD (Amarillo 492 nm)

TMB (Amarillo 450 nm)

Fosfata Alcalina

PNP(Amarillo)

-Galactosidasa

Eschericia coli
Escherichia coli

Glucosa oxidasa

Aspergilus ninger

Lisozimas

Clara del huevo

Malato
Deshidrogenasa

Corazn de Cerdo

ONPG (Amarillo 410)

Glucosa OPD
(Anaranjado 490nm)

(Campbell, 1991)

SUBSTRATOS
1.
2.
3.
4.

Compuestos solubles
Fcil de manipular
No resulten txicos
Bajo costo

Deteccin de la actividad Enzimtica

cidos Fuertes
Bases Fuertes

Ensayo inmunoenzimtico

Sensibilizacin de la placa
Bloqueo de los espacios
vacos
Incubacin con la Muestra
problema
Incubacin con El sistema
de deteccin: Ej. Si se
busca IgG contra Ag del
VIH, se trata con anti
-IgG
anti-IgG
humana conjugada con
una enzima
Adicin del sustrato

http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/elisa.htm

E
E

Antgeno
Antgeno
Buffer
Buffer de
de bloqueo
bloqueo
Anticuerpo
Anticuerpo

9 DIRECTO
9
INDIRECTO
9INDIRECTO
9
TIPO SNDWICH
9TIPO
O CAPTURA DE
ANTGENOS
9
COMPETITIVO
9COMPETITIVO

Tipos de ELISA

Anti-IG
Anti-IG acoplada
acoplada aa una
una
enzima
enzima
Substrato
Substrato

Tipos de ELISA

9 INDIRECTO
9
TIPO SNDWICH O
9TIPO
CAPTURA DE ANTGENOS
9
COMPETITIVO
9COMPETITIVO
E

E
E

Anticuerpo
Anticuerpo acoplado
acoplado aa la
la enzima
enzima
S

Antgeno
Antgeno
Buffer
Buffer de
de bloqueo
bloqueo
Anticuerpo
Anticuerpo

Substrato
Substrato

Tipos de ELISA
9 INDIRECTO
9
TIPO SNDWICH O
9TIPO
CAPTURA DE
ANTGENOS
9
COMPETITIVO
9COMPETITIVO

APLICACIONES
Deteccin de antgenos o anticuerpos
Virus
Hongos
Parsitos
bacterias
Deteccin de autoanticuerpos
IgG (Factor reumatoideo
reumatoideo))
DNA
PProtena
rotena del nncleo
cleo
Tiroglobulina
-Microsomales
Tiroglobulina-Microsomales
Complejos inmune

APLICACIONES
Medicin de Hormonas
Progesterona,
estr
genos,
cortisol
insulina
estrgenos,
cortisol,,
insulina,,
testosterona
nica humana ,TSH.
testosterona,, gonadotropina cori
corinica

Deteccin de antgenos tumorales:

Antgeno prosttico
Alfa
-fetoprotena
Alfa-fetoprotena
Antgeno del ovario
Antgeno carcinoembrionario