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Captulo 6
Bacterias formadoras de ndulos en

leguminosas
Ftima M. S. Moreira
LA IMPORTANCIA ECONMICA Y ECOLGICA DE LA SIMBIOSIS DE

BACTERIAS FORMADORAS DE NDULOS EN LEGUMINOSAS (BFNFNL)
La fijacin biolgica de nitrgeno es uno de los procesos ms importantes para
mantener la vida en el planeta, pues proporciona alrededor del 70% de todo el nitrgeno requerido en los ecosistemas naturales y agroecosistemas (Burns y Hardy,
1975), manteniendo as la armona con el medio ambiente. La inoculacin con
cepas de BFNFNL altamente eficientes y adaptadas a las condiciones ambientales dominantes, se utiliza en algunos pases con un pequeo y selecto grupo de
leguminosas con el propsito de reemplazar el uso de fertilizantes qumicos de
nitrgeno. En Brasil, la inoculacin con cepas de Bradyrhizobium reemplaza completamente la aplicacin de fertilizantes sintticos, en el caso de la soya. En el ao
2006, considerando un rea de 21 millones de hectreas, donde se cosecharon
cerca de 57 millones de toneladas de soya, se ahorraron alrededor de US$ 3.3
billones de gastos en fertilizantes mediante la aplicacin de esta biotecnologa. Las
cepas, usadas para la inoculacin, provienen de una diversidad que se encuentra
en el suelo; al mismo tiempo, la biodiversidad del suelo puede afectar el comportamiento de la formacin de ndulos de manera positiva o negativa, debido a las
mltiples interacciones que se dan entre organismos del suelo y plantas, por lo tanto, un conocimiento de la diversidad de BFNFNL en el suelo deber ser el primer
paso para el manejo y la conservacin de este recurso gentico de tanto valor.
177
TAXONOMA ACTUAL DE BFNFNL

Las bacterias fijadoras de nitrgeno, conocidas anteriormente como rizobios, forman
ndulos en las races (y algunas veces en los tallos) de algunas especies de leguminosas y en las races de Parasponia spp. (Ulmaceae). El trmino rhizobia se deriva de
Rhizobiaceae (Conn, 1938), una taxa a nivel familia de bacterias creada expresamente para acomodar organismos que pueden formar ndulos en leguminosas. Una extensin reciente de conocimientos acerca de las bacterias formadoras de ndulos en
leguminosas fue el descubrimiento que estableci que las bacterias pertenecientes
al -proteobacteria (gnero Burkholderia y Ralstonia/Cupriavidus) y a otras familias de la - proteobacteria (por ejemplo, Methylobacterium Methylobacteriaceae
y Dovosia Hyphomicrobiaceae) tambin pueden formar ndulos en leguminosas
(Moulin et al., 2001; Chen et al., 2001; Sy et al., 2001; Jourand et al., 2004 Rivas
et al., 2002, 2003) (Tabla 6.1); por esta razn, el nombre rhizobia ya no resulta
idneo para describir bacterias formadoras de ndulos, aunque se contina usando
en alguna literatura.
Tabla 6.1 Filum/Orden, Familia, Gnero, Especie de bacterias formadoras de ndulos
en leguminosas. Las citas referidas describen a las especies y/o comprueban su capacidad de nodulacin.
Filum/Orden,Familia/Gnero/Especie
Referencia
-Proteobacteria-Orden Rhizobiales
Rhizobiaceae
Rhizobium
R. leguminosarum biovars phaseoli, trifolii,
viceae
R. galegae
R. tropici
R. etli
R. giardinii biovars phaseoli, giardinii
R. gallicum
R. hainanense
R. mongolense
R. huautlense
R. etli biovar mimosae
178
Manual de biologa de suelos tropicales
Frank, 1879, 1889; Jordan, 1984

Lindstrm, 1989
Martinez-Romero et al. 1991
Segovia et al. 1993
Amarger et al. 1997
Amarger et al. 1997
Chen et al. 1997
van Berkun et al. 1998
Wang et al. 1998
Wang et al. 1999a
Tabla 6.1 Contina.

Filum/Orden,Familia/
Gnero/Especie
R. yanglingense
R. sullae
R. indigoferae
R. loessense
R. daejeonense
R. lusitanum
R. selenireducens
R. miluonense
R. multihospitium
R. oryzae
R. pisi
R. alamii
R. tibeticum
R. alkalisoli
R. mesosinicum
R. fabae
R. vignae
R. tubonense
Ensifer (Sinorhizobium)
E. meliloti
E. fredii
E. xinjiangense
E. saheli
E. teranga
E. medicae
E. arboris
E. kostiense
E. kummerowiae
E. morelense
E. americanum
Referencia
Tan et al. 2001
Squartini et al. 2002
Wei et al. 2002
Wei et al. 2003
Quan et al. 2005
Valverde et al. 2006
Hunter et al. 2007
Gu et al. 2008
Han et al. 2008
Peng et al. 2008
Ramirez-Bahena et al. 2008
Berge et al. 2009
Hou et al. 2009
Li et al. 2009
Lin et al. 2009
Tian et al. 2008
Ren et al. 2011
Zhang et al. 2011
Dangeard, 1926; Jordan et al. 1984; Chen et al. 1988;
de Lajudie et al. 1994; Young, 2003
Scholla & Elkan, 1984; Chen et al. 1988; de Lajudie et
al. 1994
Chen et al. 1988
de Lajudie et al. 1994
de Lajudie et al. 1994
Rome et al. 1996
Nick et al. 1999
Nick et al. 1999
Wei et al. 2002
Wang et al. 2002
Toledo et al. 2003
B acterias
formadoras de ndulos en leguminosas
179
Tabla 6.1 Contina.

Filum/Orden,Familia/Gnero/
Especie
E. adhaerens
E. mexicanus
E. chiapanecum
E. garamanticus
E. numidicus
Allorhizobium*
A. (Rhizobium) undicola
Agrobacterium*
A (Rhizobium).adiobacter/
tumefasciens
Shinella
S. kummerowieae
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobium
B. japonicum
B. elkanii
B. liaoningense
B. yuanmingense
B.canariense
B. jicamae
B. pachyrhizi
B. iriomotense
Bradyrhizobium (Blastobacter)
B. denitrificans**
Xanthobacteraceae
Azorhizobium
A. caulinodans
A. doebereinerae
Phyllobacteriaceae
Mesorhizobium
M. loti
M. huakuii
180
Referencia
Casida, 1982; Young, 2003; Willems et al. 2003
Lloret et al. 2007
Rincon-Rosales et al. 2009
Merabet et al. (2010)
Merabet et al. (2010)
de Lajudie et al. 1998a; Young et al. 2001
Cummings et al. 2009
Lin et al. 2008
Jordan, 1984
Kuykendall et al. 1992
Xu et al. 1995
Yao et al. 2002
Vinuesa et al. 2005a
Ramrez-Bahena et al. 2009
Ramrez-Bahena et al. 2009
Islam et al. 2008
van Berkun & Eardly, 2002; van Berkun et al. 2006**
Dreyfus et al. 1988

Moreira et al. 2006
Jordan et al. 1984; Jarvis et al. 1982; Jarvis et al. 1997

Chen et al. 1991; Jarvis et al. 1997
Tabla 6.1 Contina.

Especie
M. ciceri
M. tianshanense
M. mediterraneum
M. plurifarium
M. amorphae
M. chacoense
M. temperatum
M. septentrionale
M. albiziae
M. caraganae
M. gobiense
M. tarimense
M. shangrilense
M. australicum
M. opportunistum
M. metallidurans
M.alhagi
Phyllobacterium
P. trifolii
P. ifriqiyense***
P. leguminum***
Methylobacteriaceae
Methylobacterium
M. nodulans
Brucellaceae
Ochrobactrum
O. lupini
O. cytisi
O. ciceri
Hyphomicrobiaceae
Devosia
D. neptuniea
Referencia
Nour et al. 1994; Jarvis et al. 1997
Chen et al. 1995; Jarvis et al. 1997
Nour et al. 1995; Jarvis et al. 1997
De Lajudie et al. 1998b
Wang et al. 1999b
Velsquez et al. 2001
Gao et al. 2004
Gao et al. 2004
Wang et al. 2007
Gu et al. 2008
Han et al. 2008
Han et al. 2008
Li et al. 2009
Nandasena et al. 2009
Nandasena et al. 2009
Vidal et al. 2009
Chen et al. 2010
Valverde et al. 2005
Mantelin et al. 2006
Mantelin et al. 2006
Sy et al. 2001, Jourand et al. 2004
Trujillo et al. 2005

Zurdo-Pineiro et al. 2007
Imran et al. 2010
Rivas et al. 2002, 2003

B acterias
181
Tabla 6.1 Contina.

Especie
D. yakushimensis
-Proteobacteria Orden
Burkholderiales
Burkolderiaceae
Burkholderia ****
B. tuberum
B. phymatum
B. caribensis
B. dolosa (B.cepacia genomovar VI)
B. mimosarum
B. nodosa
B. sabie
Cupriavidus (Ralstonia)
C. (Ralstonia) taiwanensis *****
Referencia
Bautista et al. 2010
Moulin et al. 2001

Vandamme et al. 2002
Vandamme et al. 2002
Achouak et al. 1999; Vandamme et al. 2002
Vandamme et al. 2002; Vermis et al. 2004
Chen et al. 2006
Chen et al. 2007
Chen et al. 2008
Chen et al. 2001; Vandamme & Conye 2004
Notas:
* Se propuso incluir a las especies Agrobacterium como A. tumetaciens (syn. A. adiobacter), A.
rhizogenes, Arubi y A. vitis y
(Young et al., 2001) y A. larrimoorei
(Young 2004) en Rhizobium.
** Estos autores no describieron estas especies, pero descubrieron que pueden formar ndulos
en leguminosas y la propusieron para que se incluyera en el gnero Bradyrhizobium.
*** Fueron aislados de ndulos, pero su capacidad de nodular no fue comprobada.
**** Estos autores no describieron el gnero, pero descubrieron que pueden formar ndulos
en leguminosas
***** El gnero Wautersia (Vaneechoutte et al., 2004) y ms tarde del gnero Cupriavidus
(Vandamme y Conye, 2004) fueron propuestos para acomodar dichas especies de Ralstonia.
Las leguminosas contienen alrededor de 20 mil especies, distribuidas en las

subfamilias Caesalpinoideae (2250 spp., en su mayora plantas tropicales leosas),
Mimosoideae (3270 spp. plantas leosas, del trpico, subtrpico y zona templada) y Papilionoidae (13.800 spp., en su mayora herbceas) (Lewis et al., 2005).
El alcance de la simbiosis con BFNFNL entre leguminosas queda todava sujeta a
investigacin. Hasta 1989, nicamente el 57% del gnero y el 20% de las espe182
cies haban sido examinadas por la formacin de ndulos y los porcentajes de las
especies que s podan formar ndulos se encontraron en porcentajes de 23, 90 y
97% entre Caesalpinoideae, Mimosoideae y Papilionoidae, respectivamente (Faria
et al., 1989). Aunque se han llevado a cabo bsquedas extensivas para nuevos
gneros y especies formadoras de ndulos, especialmente en Brasil (Magalhes
et al., 1982; Faria et al., 1989; Moreira et al., 1992), se estima que hoy en da,
nicamente el 25% de las especies existentes han sido examinadas. De esta manera, es posible que nuevas simbiosis se identifiquen en el futuro, en ecosistemas naturales (por ejemplo, en selvas tropicales); tradicionalmente, la taxonoma
del BFNFNL estaba basada en cepas aisladas de cultivos de zonas templadas. Sin
embargo, ahora que se encuentran disponibles las que han sido aisladas de otras
especies y regiones, y que han sido desarrolladas nuevas tcnicas de gentica molecular, ha ocurrido una revolucin en la taxonoma con 90 especies y 10 gneros
adicionadas a las 4 especies y a los 2 gneros originales enlistados por Jordan, en
1984 (vase Tabla 6.1), y se esperan ms revisiones en un futuro. Tres especies de
los gneros descritos de BFNFNL no fueron incluidas en la tabla porque no fueron
aisladas de ndulos ni la capacidad de nodulacin se comprob hasta el momento: Rhizobium cellulosilyticum (Garca-Fraile et al., 2007), Bradyrhizobium betae
(Rivas et al., 2004) y Mesorhizobium thiogangeticum (Ghosh et al., 2006)
EVALUACIN DE DIVERSIDAD DE BFNFNL EN EL SUELO
Los estudios sobre poblaciones y diversidad de BFNFNL dependen de un aislamiento exitoso de ndulos de races y ocasionalmente de tallos, de leguminosas
hospederas; los ndulos pueden muestrearse en plantas cultivadas en el campo
(colecciones in situ), aunque este mtodo puede resultar difcil en el caso de hospederas perennes o leosas (Moreira et al., 1992; Odee et al., 1995). Para poder
aislar o enumerar BFNFNL en una poblacin microbiana diversa, como la que surge
en el suelo, se requiere de un mtodo que separe claramente BFNFNL de otras
especies bacterianas y que permita un muestreo fcil y sistemtico de los ndulos.
El proceso de infeccin de la planta es el resultado de la formacin de ndulos en
s, para poder estimar la poblacin de BFNFNL en el suelo. El cultivo posterior y
caracterizacin de BFNFNL y de los ndulos, puede proveer informacin sobre
la composicin taxonmica de poblaciones de BFNFNL y determinar el grado de
especificidad entre cepas especficas y candidatos hospederos. Aunque algunas
plantas hospederas se consideran muy promiscuas, por ejemplo, muestran una
B acterias
183
baja especificidad, ningn hospedero promiscuo puede ser nodulado por todas las
especies o cepas existentes de BFNFNL y, de manera contraria, no existe ninguna
cepa de BFNFNL que sea lo suficientemente promiscua como para nodular a todas
las especies leguminosas. Para poder evaluar la diversidad de BFNFNL en el suelo,
es deseable hacer uso de una variedad de especies de plantas hospederas candidatas y cuantas ms sean empleadas, ms variedad resultar de cepas de BFNFNL,
aisladas e identificadas.
El bioensayo para BFNFNL puede hacer uso de hospederos promiscuos, cultivados en muestras de suelo tomadas del campo o inoculadas con suspensiones
del suelo (Moreira et al., 1993; Odee et al., 1997; Pereira, 2000). Las especies
encontradas posteriormente deberan compararse con las especies que forman ndulos en el lugar, de manera natural. Aunque algunas de las asociaciones mencionadas pueden ser relativamente especficas, la comparacin de BFNFNL, aisladas
de ndulos formados de manera natural, con los que se muestrea con el bioensayo, representa una comprobacin til de la exactitud del procedimiento en el
laboratorio; por ejemplo: Macroptilium atropurpureum es uno de los hospederos
ampliamente conocido (Vicent, 1970), pero, en la mayora de los casos, se reporta
que suele estar nodulado por la especie Bradyrhizobium (Woomer et al., 1988a);
tambin cabe la posibilidad de que sea nodulado por especies de rpido crecimiento como Rhizobium (Pereira, 2000; Lima, 2007) y Burkholderia, entre otras
(Moreira et al., 2002; Moreira, 2006 y 2008, Lima et al., 2009). Resultados preliminares de Taita, punto de referencia CSM-BGBD, en Kenia, indican que M. atropurpureum fue nodulado, en la mayora de los casos, por Bradyrhizobium spp., de
crecimiento lento. De manera similar, Lewin et al., 1987 demostraron que Vigna
unguiculata, normalmente considerada como hospedero de Badyrhizobium, de hecho, tiene una especificidad muy baja y puede ser nodulada por Rhizobium spp., de
rpido crecimiento. Resultados obtenidos en Brasil (Alto ro Solimes) muestran
que caup (Vigna unguiculata) captura ms especies que M. atropurpureum y que
el frijol Phaseolus vulgaris, y, nicamente, siratro (Macroptilium atropurpureum)
atrapa BFNFNL en los 98 puntos de muestreo del proyecto CSM-BGBD (Lima et
al., 2009). Por lo anterior, se recomienda llevar a cabo experimentos preliminares para cada tipo de suelo. Antes de escoger las plantas hospederas para realizar
un bioensayo, donde sea posible, debera incluirse una especie leguminosa nativa
como trampa hospedera.
La nitrogenasa es la enzima responsable de la reduccin del gas nitrgeno a amoniaco. Tambin reduce, entre otros sustratos, acetileno a etileno (Dilworth, 1966;
184
Schollhorn Burris, 1966). Esta reaccin se utiliza como tcnica para medir la actividad
de la nitrogenasa; la gran ventaja de un ensayo de reduccin de acetileno (ERA), es
que destaca por su gran sensibilidad y velocidad, es barato y fcil de realizar aun en
condiciones de campo. Aunque el uso de ERA para obtener estimaciones cuantitativas de fijacin de nitrgeno a la nutricin de la planta ha sido ampliamente discutido
(Boddey, 1987; Giller, 1987), resulta muy til para la deteccin simple de fijadores de
nitrgeno. Por ejemplo, dado que la anatoma de los ndulos vara ampliamente en forma y en tamao, el personal que no posee la suficiente experiencia podr confundirlos
con estructuras no inducidas por BFNFNL. El ensayo tambin puede usarse para confirmar una nueva simbiosis de BFNFNL o en el caso de ndulos no usuales (Moreira et
al., 1992). La actividad de la nitrogenasa constituye una informacin invaluable porque en muchos casos es imposible verificar que los ndulos an son efectivos y viables
(color interior rojo), puesto que deben quedarse intactos para su aislamiento posterior
o secarse cuando requieran ser almacenados durante un largo periodo. Los ndulos sin
actividad de la nitrogenasa pueden estar senescentes o ser inefectivos.
METODOLOGA APLICADA EN EL PROYECTO CSM-BGBD:
UNA REVISIN GENERAL
Los pasos utilizados en la metodologa para la caracterizacin de BFNFNL, aplicados en el proyecto CSM-BGBD, se encuentran resumidos en la Figura 6.1, cuyos
seis pasos a seguir se muestran en la ilustracin 3a hasta la 3f. Una descripcin
previa fue hecha por Moreira en 2004.
Paso 1A: recoger muestras de suelo del campo, tal y como se describe a
continuacin.
Paso 2A: para el proyecto se utiliza el mtodo convencional de uso de especies promiscuas, como trampas para aislar las BFNFNL de las muestras del suelo;
sin embargo, el uso de especies mltiples no es viable con un gran nmero de
puntos de referencia (por ejemplo 100), dado lo afanoso del procedimiento,
y estar limitado por el tiempo disponible y las facilidades que ofrezca el laboratorio. Es por ello que se emplea una nica especie promiscua como trampa.
Bajo estas circunstancias, resulta idneo Macroptilium atropurpureum (siratro),
ya que posee pequeas semillas y resulta fcil de manipular bajo condiciones
controladas en bolsas de plstico y jarras de Leonard, con una solucin nutritiva,
dentro de cmaras de crecimiento o invernadero. Cuando se llevan a cabo varios
experimentos, deben utilizarse semillas de la misma procedencia; con esto se
B acterias
185
Figura 6.1 Evaluacin de bacterias formadoras de ndulos en leguminosas, fijadoras

de nitrgeno en diversos sistemas de uso de suelo, resumida en seis pasos.
1A. 12 muestras compuestas
de suelo por punto, colectadas
bajo condiciones aspticas
2A. capturando BFN: tcnica de infeccin de planta:

inoculacin de especies
promiscuas, capturadas con
suspensiones de suelo 1:1,
solucin de nutriente de suelo
o NaCl a 0.55% 1. Siratro*
2. Caup (opcional) 3. Frijol
(opcional) 4. Especies nativas
(opcional) Bolsas de plstico
(Ilustracin 3. a), agar inclinado (Ilustracin 3. b), Jarra
de Leonard, con la muestra de
suelo, (Ilustracin 3. c)
3 A. Eficiencia de poblaciones nativas: nmero de

ndulos, peso de materia
seca y peso seco de planta
(contenido N); dos controles sin inoculacin (con
o sin mineral N), ms un
control de una cepa conocida, eficiente.
rea de referencia /Uso

del suelo/ Puntos de
muestreo
1C. Claves de identificacin de plantas. Origen del

hospedero.
1B. Ndulos de especies

de plantas locales
2 B. Ensayo de reduccin
con acetileno (opcional)
3 B. Almacenaje en frascos
con gel de slice o CaCl2
4. Aislamiento de NLB de ndulos ** en YMA/79 con azul de
bromotimol (Ilustracin 3.
d) caracterizacin de cultivo
5. Bioensayos con aislados: verificacin (postulados de Koch) y propiedades simbiticas (nmero

de ndulos y peso seco
de materia); peso seco de
materia area de planta;
contenido de N por planta
(opcional). Dos controles
sin inoculacin (con o sin
mineral N) ms un control con un tipo eficiente
(Ilustracin 3. 2e)
6. Caracterizacin de aislados verificados; tamizar segn caractersticas de cultivo y REP-PCR o perfiles de

protena (Ilustracin 3. f (ii), representativos de grupos
previos; secuencia del gen (16S rRNA para todos los gneros, otros genes, tales como dnaK, especialmente para
Bradyrhizobium); ndices de diversidad.
* Puede usarse para conteo NMP (opcional).

** Algunos ndulos pueden guardarse en gel de slice para su aislamiento, en caso necesario.
Nota: 1A. Doce muestras en cada punto de muestreo (vase esquema global CSM-BDBG, Captulo 2). 2A. Captura de BFN, utilizando la tcnica de infeccin de planta. 3A. La eficiencia de
poblaciones nativas es evaluada con la floracin, cuando se aprecian diferencias significativas
entre tratamientos 4. Caracterizacin de cultivos (son necesarios los experimentos preliminares con suelo de selvas y cultivos de leguminosas para determinar el nmero de aislamientos
requeridos para caracterizar las comunidades de simbiontes en su conjunto, basados en una
186
evita cualquier variacin de NFNLB debida a las plantas. Cuando un equipo puede manejar ms de una trampa de especies, para trampas promiscuas adicionales
se recomienda usar Vigna unguiculata (como segunda especie) y Phaseolus
vulgaris (frijol) como tercera especie. Las semillas que se encuentren disponibles en la localidad proveern informacin til para agricultores del lugar. Las
dos especies fueron escogidas por ser bastante promiscuas y porque se cultivan
en muchos pases. Se selecciona Phaseolus vulgaris con base en que en varios
pases existen datos, an dispersos, sobre poblaciones de BFNFNL donde se
utiliza el frijol comn como especie-trampa; esto puede servir como un punto de
referencia. Despus de las tres especies mencionadas (siratro, caup y frijol) se
pueden seleccionar otras, incluyendo algunas especies nativas que, por supuesto, pueden ser diferentes en cada pas. El criterio para la seleccin debe basarse
en que la especie-trampa sea ecolgica y econmicamente relevante para el pas;
aunque sera imposible estandarizar esta seleccin.
Las muestras de suelo en macetas pueden usarse nicamente cuando haya
disponibilidad en los laboratorios y se deben seguir todas las tcnicas aspticas normales de la microbiologa. Los suelos con un alto contenido de N debern evitarse;
otros factores limitantes como deficiencias de macro y micronutrientes, acidez y
un alto contenido de Al, debern corregirse para los ensayos. Las especies-trampas
pueden usarse para capturar y contar BFNFNL o simplemente para capturarlas.
Dada la complejidad del primer ejercicio, ste no es obligatorio, ni forma parte de la
metodologa estndar. Para poder capturar BFNFNL, pueden cultivarse especiestrampas en bolsas de plstico, jarras de Leonard o en macetas que contengan las
muestras de suelo, las cuales se describen a continuacin.
Paso 3 A: aunque la eficiencia bajo condiciones controladas no refleja lo que
est pasando in situ, debido a diferentes relaciones simbiticas (diferentes especies
de plantas) y condiciones ambientales, es fcil de medir y proporciona informacin
til sobre la variabilidad y eficiencia de las poblaciones nativas; incluso puede indi-
curva de extincin de especies). Incluye caractersticas de cultivos obtenidos en el paso nmero

4, en el tamizado de la coleccin entera de aislamientos (para conseguir racimos) y elementos repetitivos extragnicos palindrmicos/secuencias de DNA (REP-PCR) (u otros mtodos
como perfiles de protenas por electroforesis con SDS-PAFE/poliacrilamida gel puede ser complementario). Representantes de racimos, basados en caractersticas de cultivo (si este es el
caso) y/u otro mtodo deben ser secuenciados para 16SrRNA y otros genes como dnaK (por
ejemplo, Bradyrhizobium, aunque tambin se puede aplicar a otros gneros).
B acterias
187
car la existencia de cepas eficientes en las poblaciones del suelo, para una especie
hospedera en particular.
Paso 1B/2B, 3B: se recomienda tambin que las BFNFNL sean aisladas de
especies leguminosas (nativas e introducidas) que nodulan naturalmente, en los
diferentes sistemas de uso de suelo. Una comparacin de BFNFNL aisladas de
ndulos del campo y de ndulos introducidos en una especie-trampa, con una inoculacin de suspensiones de suelo, har posible la mejor evaluacin de diversidad y
de eficiencia de la especie-trampa. Se sabe que la diversidad gentica en poblaciones naturales de las NFNLB del mismo lugar puede presentar diferencias entre los
aislados de ndulos, formados en el campo, y los de plantas, cultivadas en una serie
de diluciones de suelo, en condiciones de laboratorio (Bala et al., 2001).
Paso 1C: las especies de leguminosas en un rea especfica, por ejemplo, de
ocho metros de radio alrededor de cada punto de muestreo, deben ser inventariadas para que las relaciones con poblaciones naturales de BFNFNL puedan determinarse; tal y como se explic anteriormente.
Paso 4: despus de la aparicin y crecimiento de ndulos, las BFNFNL deben ser
aisladas; los aislados de estos ndulos, junto con los de ndulos recogidos de plantas
nativas que naturalmente forman ndulos, pertenecientes a los diferentes sistemas de
uso de suelo en cuestin, proporcionarn los datos de la diversidad. Cuando se usa la
tcnica de infeccin por planta, los ndulos debern muestrearse a partir de plantas que
nodulen y representen niveles secuenciales de diluciones (Moreira y Pereira, 2001)
porque los tipos de BFNFNL capturadas pueden variar tambin con la dilucin (Bala
et al., 2001). En la literatura se ha discutido que, por lo menos, se necesitan entre 30
y 50 ndulos, y quiz ms de 100 por uso del suelo (Jess et al., 2005), lo que permite la construccin de curvas de muestreo para evaluar si la diversidad en un lugar ya
ha sido completamente caracterizada. Considerando que estas curvas se obtienen con
base en el nmero de diferentes cultivos que todava pueden mostrar caractersticas
genticas variables, se necesitarn ms aislamientos para obtener una buena resolucin.
Las curvas de muestreo (acumulacin o escasez) pueden revelar el nmero de aislados
requeridos para evaluar correctamente la diversidad. Este nmero se encuentra en el
punto (asntota) donde la curva alcanza su mayor nivel; en caso de no alcanzarlo, esto
indica que no se han detectado todas las especies y que muestras adicionales (aisladas
de ndulos) debern ser analizadas. Se necesitar aplicar las curvas de muestreo a todos los aislados, es decir, a los del bioensayo y a los ndulos colectados en campo. Los
ndulos se almacenan en slica gel (Figura 6.2); de esta forma estarn disponibles para
futuros aislamientos.
188
El aislamiento de BFNFNL de ndulos deber hacerse en el medio 79 con azul

de bromotimol (Fred y Waksman, 1928). El medio 79 se conoce tambin como
YMA (Vincent, 1970) (anexo 6.1); esto permite la caracterizacin completa del
cultivo (tasa de crecimiento, cambio de pH, produccin de exo-polisacridos, morfologa de colonia, color, tamao, etc.). Para obtener grupos a partir de estas caractersticas de cultivo. La diversidad gentica de poblaciones de BFNFNL puede
evaluarse al agrupar los perfiles que resultan de rep-PCR, utilizando un software
como Gelcompar (Brujin et al., 1997) o mediante el uso de otra tcnica: perfiles
de protenas por electroforesis con gel de SDS-Poliacrilamida; que dan una buena
resolucin a nivel cepa (Paso 6); sin embargo, esto puede ser opcional, de acuerdo
con los recursos disponibles en cada pas y debe llevarse a cabo despus del paso 5
para evitar perder el tiempo con contaminantes.
Finalmente, los representantes de cultivos de los clados generados mediante el
agrupamiento por Rep-PCR u obtenidos mediante otros mtodos se secuenciarn para obtener el gen 16SrRNA (Paso 6). Cuando existen recursos suficientes,
dnaK u otros genes involucrados en el mantenimiento de la bacteria, tales como
atpD, rpoB, recA, glnII (Parker, 2004; Vinuesa et al., 2005b; Gaunt et al., 2001),
pueden ser probados para algunas cepas de gnero que no hayan sido bien discriminadas por 16 SrRNA, como en el caso de Bradyrhizobium.
Figura 6.2 Trabajo de campo: a) toma de muestras de gas del ensayo de nitrogenasa
por reduccin de acetileno y b) almacenaje de ndulos hasta su aislamiento en el
laboratorio. Fuente: Moreira y Pereira, 2001.
1 ml de C2H2
Tapn de goma
Tubo al vaco
Muestra de gas
Tapn de goma
(a)
Vial (10 ml)
30 minutos a 1 hora
Ndulo
Tapn de rosca
Ndulo efectivo
Tubo de ensayo
8.5 ml
Nase
C2H2+2H++2e
2C2H4
(b)
B acterias
Tapn de rosca, ndulo,

algodn y slica gel o
CaCl2
189
REQUERIMIENTO DE MATERIALES PARA TRABAJO DE CAMPO Y

LABORATORIO
Trabajo de campo: para muestrear suelo: alcohol al 95%, agua para eliminar el
suelo del equipo de muestreo antes de la esterilizacin con alcohol, caja refrigeradora, bolsas de plstico esterilizadas (300 ml), esptula, bolsas grandes de plstico
(5 l) y un pequeo sacabocados. Para muestrear ndulos: tijera pequea, cuchara,
azada y azadn, pinzas, pala, tubos de tapn de rosca, slica gel o CaCl2 anhidro.
Para resguardo de plantas: alcohol, prensa y peridico.
Trabajo de laboratorio para aislar y enumerar BFNFNL: pipetas de 1 ml y 5 ml,
solucin para dilucin, matraces Erlenmeyer de 1 L y 125 ml, agitador orbital, bolsas esterilizadas de plstico (125 ml) para crecimiento, tubos de ensayo (150 x
20 ml 200 x 30 mm), o botellas de cerveza recicladas, rejillas para bolsas de crecimiento o tubos, solucin de nutrientes, semillas de plantas leguminosas hospederas promiscuas o nativas, temperatura ambiente controlada de luz y humedad.
Trabajo de laboratorio para aislamiento de BFNFNL y caracterizacin de cultivos: cajas Petri, alcohol al 95%, HgCl2 al 0.1% (acidificado con HCl concentrado
a 5ml/L) (Hipoclorito de Na o Ca; puede usarse H2O2 para sustituir al HgCl2),
agua esterilizada, pinzas, medio de cultivo que contiene levaduras, manitol y sales
minerales (hipoclorito de sodio o calcio, o H2O2 (pueden sustituir al HgCl2), agua
esterilizada, pinzas, medio de agar con sales, levadura-manitol-mineral, pH6.8.
Para la actividad de nitrogenasa mediante reduccin de acetileno: matraces
Kitasato Erlenmeyer, globo de hule, jeringas de 1 ml a prueba de gas, tubos de vaco de 5 ml, frascos de 10 ml o de mayor capacidad con tapones de goma, carburo
de calcio CaC2, cromatgrafo de gases equipado con un detector de ionizacin de
flama (FID) y columna RN Poropak para determinaciones de acetileno/etileno.
Nota: los ensayos de nitrogenasa pueden llevarse a cabo en campo.
MTODOS DETALLADOS
Muestreo del suelo. Se saca una muestra de suelo a una profundidad de 20 cm, en
12 puntos, distribuidos alrededor de cada parcela de muestreo (vase Captulo 2,
Figura 2.3). Se utiliza el mismo esquema de extraccin del ncleo para el muestreo en todos los grupos microbianos, incluyendo el BFNFNL. Se junta cada juego
de 12 muestras, para formar una muestra compuesta de alrededor de 300 g que,
posteriormente, se introduce en una bolsa plstica esterilizada. De manera alter190
nativa, cuando lo permitan los recursos, se pueden obtener tres o ms muestras

compuestas en cada punto. Todas las herramientas: sacabocados, esptulas, azadn, etc. debern lavarse muy bien con agua para remover partculas de suelo y ser
esterilizadas mediante alcohol y flama antes y despus de cada muestreo, con el
fin de evitar la introduccin de BFNFNL exticas. Se deben minimizar las pisadas
cerca de los puntos de extraccin y la hojarasca deber ser removida justo antes de
que se lleve a cabo el muestreo. Las muestras de suelo se trasladan al laboratorio
lo antes posible, utilizando un envase con aislamiento (preferiblemente debe permanecer a 4 C).
Una segunda muestra compuesta de alrededor de 200 g ser recogida en una
bolsa de plstico no estril para su anlisis fsico-qumico.
Muestreo de ndulos. Se debern identificar plantas leguminosas dentro de un
radio de 8 m (lo mismo que para un inventario de vegetacin) en el punto de muestreo y se recoger el material vegetal resultante. Ser de gran ayuda contar con
informacin previa acerca de cules son las especies que pueden nodular, de manera
que se confine el muestreo a estas especies en concreto; sin embargo, hay que aclarar que existe un enorme potencial para el descubrimiento de nuevas especies de
leguminosas de este tipo. En el caso de plantas herbceas, se puede extraer todo el
sistema de races del suelo, utilizando una azada, un azadn o una pala, cuidando
no romper ndulos de manera accidental. Los ndulos de plantas leosas debern
descubrirse extrayendo las races y poniendo gran atencin para no daar las ramificaciones delgadas en donde stos normalmente se encuentran. Se debe verificar,
con extremo cuidado, que las races delgadas pertenezcan a la planta leguminosa
identificada; por este motivo, se recomienda empezar la excavacin junto al tallo;
se extirpan los ndulos (dejando un pedazo de raz para facilitar la manipulacin)
y se guardan en tubos de tapn de rosca con un desecador (Figura 6.2b). Antes
del almacenaje, las partculas de suelo debern removerse, bien por sacudido o bien
mediante lavado, retirando el exceso de agua con una servilleta. Por lo menos se recogern 50 ndulos por cada punto de muestreo y la muestra ser representativa de
todas las especies nodulantes existentes en la parcela de muestreo. En ocasiones,
algunos ndulos pueden ser demasiado grandes para los tubos normales de rosca:
debern ser almacenados en un recipiente de mayor capacidad.
Actividad nitrogenasa. La actividad de nitrogenasa puede medirse en el campo
o a partir de cada ndulo, justo despus del muestreo o en el laboratorio (Figura
6.2). Se introduce el ndulo en un frasco de tapa de goma de 10 ml o de mayor capacidad, en caso necesario. Se produce acetileno en un matraz Kitasato Erlenmeyer
B acterias
191
por la reaccin de CaC2 con agua (Figura 6.3). Si se lleva a cabo el trabajo en laboratorio, se obtiene acetileno de cilindros de gas comerciales. Se inyecta 1 ml de este
gas en el frasco que contiene el ndulo. Despus de una hora aproximadamente,
se remueve 1 ml de gas de la superficie y se transfiere a un tubo al vaco para su
posterior anlisis de etileno por cromatografa de gases (Figura 6.2a).
Especmenes de resguardos de plantas. Los especmenes de resguardos de
plantas nodulantes, debern recogerse en el rea que se encuentra alrededor del
punto de muestreo (radio de 8 m). Se debe poner especial atencin en el etiquetado (vase a continuacin) y si es posible, incluya flores y frutas. Enseguida, los
especmenes se mandan al herbario para su identificacin junto con una tarjeta de
identificacin de las mismas:
Proyecto: CSM-BGBD
Colector: Ftima Moreira
Fecha: 2 de abril de 2005
Localidad: Benjamin Constant
Altitud: 500 m
Nombre vulgar de la especie: faveira
Nombre cientfico de la especie: ?
Nmero de vale: 05
Caractersticas del ndulo: crecimiento medio, tamao 0.5 a 1.5 cm
Descripcin del lugar: pastizales abiertos con ganado y troncos de madera
Tipo de suelo: limo arenoso
Figura 6.3 Produccin de acetileno en campo o laboratorio.
Agua
Globo de hule
CaH2
Tubo de goma
CaC2
CaC2 + H2O C2H2 + Ca (OH)2

Slido
192
Gas
Slido
Caractersticas de la planta: herbcea con frutos maduros

Otros comentarios: se recogieron semillas; flores amarillas.
El conteo de BFNFNL. Se someten muestras de suelo a una serie de diluciones
antes de la inoculacin de las plantas hospederas candidatas (Figura 6.4). La correlacin de diluciones vara entre 2.0 (1:2) y 14.5 (1:14.5), segn la concentracin
de clulas esperada en la muestra. Esto significa una mayor dilucin para suelos con
ms BFNFNL; sin embargo, an es necesario inocular plantas hospederas en todas
sus diluciones (vase a continuacin). Asimismo, en cada dilucin se debe emplear
una rplica del bioensayo (2 a 5 veces). Las plantas se cultivan en condiciones controladas (Vicent, 1970) y despus de 15 das, se les examina para ver si han formado
ndulos. Las poblaciones de BFNFNL se estiman por el mtodo del Nmero ms
Probable (Cochran 1950; Woomer et al., 1988b, 1999). En el caso de inocular las
plantas nicamente para capturar las BFNFNL, las muestras de suelo debern resuspenderse en agua esterilizada o en una solucin de nutrientes (la misma que se utiliza
para un medio de cultivo o crecimiento de plantas) (vase anexo 6.1 y 6.2) en una
correspondencia 1:1. Las plantas pueden cultivarse en bolsas de plstico, jarras de
Leonard u otro tipo de frasco. Se deben utilizar tres tipos de controles sin inoculante
de suelo: el primero comprueba la presencia de contaminacin durante los procedimientos experimentales. Si no se mantienen de manera correcta las condiciones axnicas, este control resultar en ndulos y el experimento se invalidar (an cuando
ndulos ocurren en una sola rplica). Se recomienda que el nmero de rplicas dentro
de este control sea mayor que las rplicas de tratamientos de inoculacin y el control
debe localizarse dentro de diferentes posiciones en el protocolo. Los otros dos controles permitirn comprobar la eficiencia de las comunidades de BFN.
Las comunidades que nodulan la planta hospedera indican si las condiciones del
experimento (temperatura, concentraciones de nutrientes) son adecuadas para
que se lleven a cabo la nodulacin y la fijacin de nitrgeno en las plantas y su
crecimiento. El primero de los controles se complementa con nitrgeno mineral
(para jarras de Leonard, 70 mg N-NH4NO3) cada semana desde la tercera hasta
la penltima, pero no se inocula. Para bolsas de plstico o recipientes de pequeos
volmenes, se utiliza una sola aplicacin de 70 mg N-NH4NO3). De esta manera
el caup, que alcanza su nivel de floracin en dos meses, con el uso de jarras de
Leonard recibirn un total de 350 mg N-NH4NO3, mientras que los frijoles con un
periodo de crecimiento de mes y medio, en jarras de Leonard, recibirn 280 mg de
N-NH4NO3. El otro control se inocular con un inoculante recomendado para esta
B acterias
193
especie de planta; por ejemplo, CIAT 899 para Phaseolus vulgaris en Brasil, pero
no se aade nitrgeno.
Aislamiento y caracterizacin de BFNFNL. Las BFNFNL son aisladas de los
ndulos recogidos en campo y por bioensayo en el laboratorio. En el ltimo caso,
los ndulos obtenidos en cada dilucin sucesiva pueden indicar cules son las cepas menos frecuentes en la muestra de suelo y cules, las ms comunes.
El primer paso ser esterilizar la superficie de los ndulos con una breve inmersin en 95% de alcohol, seguida de una inmersin ms larga de tres a cuatro minutos en HgCl2 (hipoclorito de Na o Ca, o H2O2 pueden usarse como sustitutos) y
lavado mediante varios enjuagues con agua estril (Vicent, 1970). A continuacin
se aplasta el ndulo dentro de unas gotas de agua estril, utilizando pinzas y esto
se vierte sobre un medio de agar. En el caso de los ndulos disecados, stos deben
remojarse en una solucin de agua esterilizada para mejorar la absorcin de la solucin desinfectante. Los tiempos de inmersin en HgCl2 u otros desinfectantes,
deberan ajustarse al tamao del ndulo (ms corto para ndulos pequeos).
En la composicin del medio de agar: levadura-manitol-sales minerales (Fred
y Waksman, 1928) (Anexo 6.1), especialmente el pH y la fuente de carbohidrato
pueden variarse, tomando en cuenta las condiciones especficas del suelo (Date
y Halliday, 1979; Souza et al., 1984; Elkan y Bunn, 1991). Puede incluirse azul
de bromotimol como indicador porque los cambios en el pH, causados por la formacin de BFNFNL, pueden resultar tiles en la identificacin de gnero. Otros
caracteres incluyen: la tasa de crecimiento (tiempo TAIC de aparicin de colonias
aisladas), la cantidad de polisacridos celulares, forma y tamao de colonia, dimetro y color segn lo descrito por Moreira et al. (1993) y Jess et al. (2005).
Los principales descriptores de cada gnero son:
Allorhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium: colonias circulares, de 2 a 4 mm
de dimetro, normalmente unidas debido a la copiosa produccin de polisacridos extracelulares, convexas, semitraslcidas, elevadas y mucilaginosas, la mayora
con el centro de color amarillo (debido al indicador de pH), de crecimiento rpido
(TAIC: de 2 a 3 das). Mesorhizobium: igual que Rhizobium, pero normalmente de
crecimiento ms lento (TAIC: de 4 a 5 das).
Bradyhizobium: colonias circulares que no exceden de un milmetro de dimetro,
produccin extracelular de polisacridos de abundante a escasa (esto ltimo, generalmente en el caso de los tipos que toman ms de diez das para su crecimiento), opacas,
raramente traslcidas, blancas y convexas, granulares en textura y que producen un
cambio de pH a alcalino, de crecimiento lento o muy lento (TAIC: de 6 a ms das).
194
Figura 6.4 Mtodo para calcular el nmero ms probable de clulas de rhizobia en el

suelo mediante la tcnica de infeccin de plantas.
Nivel de dilucin
Paso de dilucin
El porcentaje base de la dilucin (Nd) puede variar de 1:2 hasta 1:14.5 y el numero de replicas
por dilucin (N) de 2 a 5.
Fuente: adaptado de Woomer, 1993 y Vincent, 1970 por Moreira y Pereira, 2001.
B acterias
195
Azorhizobium: colonias circulares, de 0.5 mm de dimetro, de color cremoso,

muy poca produccin extracelular de polisacridos (mucho menos que en el caso
de Bradyhizobium), producen un cambio de pH a alcalino, de crecimiento rpido a
medio (TAIC: de 3 a 4 das).
Cupriavidus: similar a Azorhizobium, con un poco ms de produccin extracelular de polisacridos.
Burkholderia: con caractersticas de crecimiento muy similares a las de crecimiento rpido; por ejemplo Rhizobium, con la excepcin de modificacin de pH
porque pueden producir una reaccin cida o alcalina (dependiendo de la edad), a
veces, al mismo tiempo.
Las BFNFNL son bastoncillos Gram negativos que no forman esporas y que,
generalmente, contienen grnulos refrctiles de poly--hidroxibutirato en microscopio de contraste de fases. Las cepas aisladas deben reconfirmarse como
BFNFNL, mediante una demostracin en la que formen nuevos ndulos en
una planta hospedera de prueba, bajo condiciones bacteriolgicas controladas,
de acuerdo con los postulados de Koch. En la Tabla 6.1 se pueden observar
referencias que ofrecen amplios detalles de las caractersticas de especies de
NFNLB. La diversidad de cepas, dentro de la especie puede ser genticamente
y fenotpicamente alta; por ejemplo, en sus caractersticas simbiticas, morfolgicas y fisiolgicas; por lo tanto, ser necesario definir el nivel apropiado de
diversidad que permita caracterizar gneros y especies especficos. Graham et
al., (1991) aportaron estndares mnimos para la descripcin de nuevos gneros y especies, donde incluyeron serologa (Dudman y Belbin, 1988), lipopolisacridos celulares (De Maagd et al., 1988), patrones totales de protena
por SDS-PAGE (Dreyfus et al., 1988; Moreira et al., 1993), secuencia de la
subunidad pequea del RNA ribosomal (Young y Haukka, 1996), perfiles de
plsmidos (Giller et al., 1989), resistencia intrnseca a los antibiticos (RIA)
(Kingsley y Bohlool, 1983), electroforesis de enzimas metablicas (Selander et
al., 1986), crecimiento en diferentes fuentes de carbono (Dreyfus et al., 1988),
hibridacin DNA:DNA, composicin de bases de DNA (%C + G), hibridacin
rRNA-DNA y polimorfismos en los tamaos de fragmentos de restriccin del
DNA. Recientemente, se han descrito nuevas tcnicas para la caracterizacin de
los procariotes; lo que mejora no slo la clasificacin bacteriana, sino tambin la
capacidad de discriminacin dentro de diferentes taxas: cada una tiene un nivel
especfico de resolucin para la clasificacin bacteriana, lo que puede ser muy
til para numerosos estudios. Estas tcnicas, tambin conocidas como huellas
196
genmicas, incluyen: la digestin de DNA genmico con endonucleasas que

cortan sitios (de restriccin) poco frecuentes seguido por PFGE (Electroforesis
en Gel en Campos Pulsados) y otros mtodos de RFLP. Los mtodos basados
en la reaccin de Polimerasa en Cadena (PCR), tales como ARDRA (Anlisis de
Restriccin del rDNA Amplificado), tRNA-PCR o ITS (Amplificacin y Anlisis
del tRNA y de Regiones Intergnicas del 16S-23S rRNA), AFLP (Polimorfismo
de Tamao de Fragmentos Amplificados) para el anlisis de todo el genoma,
RAPD (DNA polimrfico amplificado al azar): AP-PCR (PCR Con Arimers
Arbitrarios), REP-PCR (Huellas Genmicas de Elementos Genmicos Repetidos
de DNA,) (Rademaker y Bruijn, 1997; Bruijn et al., 1997). Los anlisis numricos con un nmero adecuado de cepas y la comparacin con las cepas de
BFNFNL permiten la caracterizacin de grandes poblaciones. La caracterizacin
gentica de DNA (secuencia del 16S, 23S rARN u otras secuencias de genes,
homologa DNA:DNA) requiere de mucho tiempo y de equipo especializado y,
normalmente, se restringe nicamente a representantes de grupos; por otro lado,
si existe disponibilidad de recursos, la secuenciacin de genes especficos puede
aplicarse directamente a un nmero de cepas determinado por las curvas de
rarefaccin o acumulacin.
Los costos y beneficios de una caracterizacin previa y secuenciacin de representantes versus una secuenciacin directa de un nmero mayor de aislados,
deben tomarse en cuenta. Los costos de la secuenciacin de DNA se han reducido
notablemente durante los ltimos aos y, en algunos casos, la secuenciacin directa de 16S rARN u otros genes puede ofrecer ventajas econmicas. Empresas
privadas dan buenos servicios para productos PCR y su purificacin y secuenciacin. Por ejemplo, la purificacin y secuenciacin de un fragmento de genes (una
muestra) ya amplificada por PCR, en la actualidad, puede costar alrededor de US
$6, si se piden las placas completas de 96 muestras. El nmero total de placas de
96 muestras cuesta alrededor de US $350 para la secuenciacin.
Extraccin de DNA: el DNA genmico es aislado de cultivos de fases log en
79/YMA durante diferentes periodos de incubacin, dependiendo de la tasa de
crecimiento especfica para cada cepa (de 2 a 10 das). Se pueden utilizar el kit
Ultraclean para el aislamiento de DNA de suelo de los laboratorios MOBIO o
cualquier otro kit recomendado por el productor. Se cuantifica el DNA a A260 nm
con un espectrofotmetro o se estima por comparacin con diferentes estndares de concentraciones de DNA en geles de agarosa. Alternativamente, para cada
tipo se suspende una azada con bacterias de una colonia aislada en 1 ml de agua
B acterias
197
esterilizada, lo que produce una suspensin ligeramente turbia que posteriormente

se hierve durante cinco minutos para lisar las clulas; se utiliza un volumen de esta
suspensin como templado para el PCR.
Secuenciacin 16S rDNA. Los genes casi completos del 16S rDNA se amplifican
con un par de oligonucletidos 27F (pA: 5`AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) y 1492R
(5GGTTACCTTGTTACGACTT), usando los aislamientos representativos de diferentes grupos (obtenidos bien por caracterizacin de cultivo, perfiles REP-PCR, o bien,
por otras tcnicas). Estos pares de oligonuclotidos corresponden a posiciones 8-27
y 1507-1492, respectivamente, del gen 16S del RNA ribosomal de Escherichia coli
(Wilson et al., 1990). Otros oligonucletidos pueden utilizarse si permiten la sntesis de un gen 16S rARN casi completo. Las concentraciones finales en las mezclas
de reaccin (100 ml) son: 1 x PCR Buffer, 2.5 mm MgCl2, 0.2 mm de cada dNTP,
0.2 m de cada oligonucletido y dos unidades de la enzima Taq polimerasa (DNA
extrado o cultivos lquidos): 6 l. El programa para PCR incluye un paso inicial: desnaturalizar a 94C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturalizacin a
94C durante 40 segundos, apareamiento a la temperatura de 55C, durante 40
segundos, con extensin a 72C durante 90 segundos. La extensin final se lleva a
cabo a 72C, durante 7 minutos. La purificacin de los productos PCR se hace con
filtros Microcon (Millipore) o mediante otros mtodos de purificacin. Un paso de
secuenciacin del PCR amplificado se obtiene con el primer 27F, pero tambin con
el primer reverso 1492R. Cuando se requiere la secuencia de todo el gen se deben
elegir otros primers internos y usarse para amplificar y secuenciar el fragmento del
gen que falte despus de utilizar 27F y 1492R.
Anlisis filogentico. Se comparan las secuencias con otras conocidas contenidas en las bases de datos, tales como la del National Center for Biotechnology
Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov/), el European Bioinformatics Institute
(EBI) secuenciacin de base de datos (www.ebi.ac.uk) y el Ribossomal Database
Project (RDP) (http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp).
MANTENIMIENTO Y COLECCIN DE CULTIVOS PUROS
Normalmente, los cultivos puros se mantienen en agar inclinado dentro de tubos
de tapa rosca en el mismo medio de cultivo, similares a los presentados en la Figura
6.2. Sin embargo, la viabilidad de dichos cultivos no es larga: los mtodos como
liofilizacin y almacenaje en un congelador (80C) garantizan una larga conservacin de las clulas viables.
198
AGRADECIMIENTOS
Agradecimientos especiales por sus comentarios y revisiones a los Drs. Esperanza
Martnez, David Odee y Nancy Karanja.
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cytisi sp. nov., isolated from nodules of Cytisus scoparius in Spain International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology, vol 57, pp784-788.
B acterias
213
APNDICE 6.1 Composicin de medio 79 para el crecimiento de Bfn

Medio 79 (Fred y Waksman, 1928) (similar a medio YMA Vincent, 1970):

10g manitol o sacarosa

1ml sol. K2HPO4 (10%) (o 0.1 gl1)
4ml sol. KH2PO4 (10%) (o 0.4 gl1)
2ml sol. MgSO4. 7H2O (10%) (o 0.2 gl1)
1ml sol. NaCl (10%) (o 0.1 gl1)
100ml extracto de levadura (o polvo 0.4 gl1)
5ml sol. 0.5% azul de bromotimol en 0.2 N KOH; para hacer 1000 ml con
agua destilada pH 6.87.0.
Medio slido: 15g Agar

Medio semislido: 1.75g Agar
Autoclave a 120C durante 15 minutos;
Cuando pH <5.0 se reemplaza azul por Azul de Bromotimol por Verde de
Bromocresol y se aumenta agar hasta 20 gl1.
214
APNDICE 6.2 Solucin de nutrientes Jensens para el crecimiento de espe-
cies de leguminosas en bolsas de plstico y jarras de Leonard

Componentes
K2HPO4 (2%)
MgSO4.7H2O (2%)
NaCl (2%)
CaHPO4(10%)
FeCl3.6H2O 1.7 % o FeCl3 1%
Solucin de micronutrientes*
Agua destilada (completar a)
Volumen
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
1 ml
1,000 ml
pH = 6.7, ajustar con KOH.

Diluir solucin a 1:4.
* Solucin de micronutrientes (para 1 l de agua).
H3BO3 .......................... 2.86 g
MnSO4.4H2O ............... 2.03 g
ZnSO4.7H2O ................ 0.22 g
CuSO4.5H2O ................ 0.08 g
Na2MoO4.H2O .............. 0.09 g
El mismo protocolo que para agar con semillitas. Vicent (1970) recomienda
la mezcla para una solucin de nutrientes, diluida de la misma manera. Tambin
despus se usa la solucin con sirato en bolsas de plstico.
Control
Se proveen los controles con nitrgeno a una concentracin final de aproximadamente 70 ppm N (0.05% KN03 o NH4 NO3). Esto puede aadirse a la solucin de nutrientes al principio del experimento, o entre 7 a 10 das despus de
plantar. Si al final del experimento esto resulta insuficiente para el crecimiento
sostenido y el color verde de las plantas control, entonces la concentracin puede aumentar o hacer una suplementacin dividida. Sin embargo, las concentraciones ms altas (>0.7% KNO3) pueden ser txicas. Normalmente, los controles
nitrogenados no presentan ndulos, pues las dosis elevadas inhiben la nodulacon; por lo tanto, los controles absolutos, es decir, sin inoculacin del suelo
B acterias
215
son necesarios para comprobar las condiciones aspticas del experimento. Otro
control importante, no mencionado por Vincent, es el uso de una cepa eficiente
como un control positivo para la nodulacin y la fijacin de nitrgeno. Si existe la
disponibilidad de las cepas recomendadas, stas debern utilizarse.
216

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Captulo 6

Bacterias formadoras de ndulos en

LA IMPORTANCIA ECONMICA Y ECOLGICA DE LA SIMBIOSIS DE

TAXONOMA ACTUAL DE BFNFNL

Manual de biologa de suelos tropicales

Frank, 1879, 1889; Jordan, 1984

Tabla 6.1 Contina.

formadoras de ndulos en leguminosas

Tabla 6.1 Contina.

Lin et al. 2008

Dreyfus et al. 1988

Jordan et al. 1984; Jarvis et al. 1982; Jarvis et al. 1997

Manual de biologa de suelos tropicales

Tabla 6.1 Contina.

Sy et al. 2001, Jourand et al. 2004

Trujillo et al. 2005

Rivas et al. 2002, 2003

formadoras de ndulos en leguminosas

Tabla 6.1 Contina.

Moulin et al. 2001

Las leguminosas contienen alrededor de 20 mil especies, distribuidas en las

Manual de biologa de suelos tropicales

formadoras de ndulos en leguminosas

Manual de biologa de suelos tropicales

formadoras de ndulos en leguminosas

Figura 6.1 Evaluacin de bacterias formadoras de ndulos en leguminosas, fijadoras

2A. capturando BFN: tcnica de infeccin de planta:

3 A. Eficiencia de poblaciones nativas: nmero de

rea de referencia /Uso

1C. Claves de identificacin de plantas. Origen del

1B. Ndulos de especies

5. Bioensayos con aislados: verificacin (postulados de Koch) y propiedades simbiticas (nmero

6. Caracterizacin de aislados verificados; tamizar segn caractersticas de cultivo y REP-PCR o perfiles de

* Puede usarse para conteo NMP (opcional).

Manual de biologa de suelos tropicales

curva de extincin de especies). Incluye caractersticas de cultivos obtenidos en el paso nmero

formadoras de ndulos en leguminosas

Manual de biologa de suelos tropicales

El aislamiento de BFNFNL de ndulos deber hacerse en el medio 79 con azul

Tapn de rosca, ndulo,

formadoras de ndulos en leguminosas

REQUERIMIENTO DE MATERIALES PARA TRABAJO DE CAMPO Y

Manual de biologa de suelos tropicales

nativa, cuando lo permitan los recursos, se pueden obtener tres o ms muestras

formadoras de ndulos en leguminosas

CaC2 + H2O C2H2 + Ca (OH)2

Manual de biologa de suelos tropicales

Caractersticas de la planta: herbcea con frutos maduros

formadoras de ndulos en leguminosas

Manual de biologa de suelos tropicales

Figura 6.4 Mtodo para calcular el nmero ms probable de clulas de rhizobia en el

formadoras de ndulos en leguminosas

Azorhizobium: colonias circulares, de 0.5 mm de dimetro, de color cremoso,

Manual de biologa de suelos tropicales

genmicas, incluyen: la digestin de DNA genmico con endonucleasas que

formadoras de ndulos en leguminosas

esterilizada, lo que produce una suspensin ligeramente turbia que posteriormente

Manual de biologa de suelos tropicales

formadoras de ndulos en leguminosas

Manual de biologa de suelos tropicales

formadoras de ndulos en leguminosas

Faria, S. M., Lewis, G. P., Sprent, J. I. y Sutherly, J. M. (1989) Occurrence of nodulation in

Manual de biologa de suelos tropicales