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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUMICOS

APOSTILA DE BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL

Anlise Microbiolgica de gua

EDMAR DAS MERCS PENHA


MRCIA MONTEIRO MACHADO GONALVES

2015
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I- Introduo
gua estril no encontrada na Natureza. Ela recebe sua flora microbiana das mais variadas
fontes: ar, solo, guas residurias, resduos orgnicos, plantas, animais mortos, etc. Isto
significa que a gua pode conter micro-organismos de vrias espcies, patognicas ou no. O
numero de espcies presentes depende da fonte contaminante.
A anlise microbiolgica consiste na pesquisa do chamado grupo coliforme que, quando
presente, evidencia uma possvel contaminao fecal. As principais caractersticas do grupo
coliforme so: bastonetes Gram-negativos, no esporulados, aerbios ou anaerbios
facultativos, que no so inibidos por sais biliares ou pelo corante verde brilhante e so
capazes de fermentar lactose com produo de aldedo, cido e gs dentro de 48h a 35oC. O
grupo inclui tanto espcies de bactrias originrias do trato gastrintestinal de humanos e
outros animais de sangue quente, como tambm espcies no entricas. Por esse motivo, a
presena de bactrias do grupo coliforme menos representativa como indicao da
contaminao fecal, do que a enumerao de coliformes fecais ou Escherichia coli. Embora a
presena do grupo coliforme em amostras de gua seja considerada uma indicao de
contaminao.
O grupo de coliformes fecais representa os membros do grupo coliforme capazes de fermentar
a lactose com produo de gs, em 24h a 44,5oC. Esta definio teve como objetivo selecionar
os coliformes do trato gastrintestinal. Atualmente sabe-se que o grupo de coliformes fecais
inclui pelo menos trs gneros: Escherichia, Enterobacter e Klebsiella. Entretanto, dois
desses gneros (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem no fecal. Logo, a
existncia de coliformes fecais em uma determinada amostra de gua pode no significar uma
contaminao fecal. Cabe ressaltar que a presena de coliformes fecais em uma determinada
amostra de gua muito mais representativa da contaminao por fezes do que a de
coliformes totais, dada alta incidncia de E. coli dentro do grupo fecal.
Dentre as bactrias de habitat fecal, pertencente ao grupo de coliformes fecais, a E. coli a
mais conhecida e a mais facilmente diferenciada dos no fecais. Todos os demais membros do
grupo tem uma associao duvidosa com a contaminao fecal. Portanto, a enumerao da E.
coli o melhor indicador de contaminao fecal conhecido.
A Contagem Padro de Bactrias realizada visando conhecer a densidade de bactrias na
gua, tendo em vista que um aumento considervel da populao bacteriana pode
comprometer a deteco de organismos coliformes. Embora a maioria dessas bactrias no
seja patognica, pode representar riscos a sade, como tambm, deteriorar a qualidade da
gua, provocando odores e sabores desagradveis e a produo de limo ou pelculas.
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II-Contagem de Coliformes Totais e Coliformes Fecais pelo Mtodo do Nmero Mais


Provvel (NMP).

II.1- Coleta da amostra quantidade representativa ( 100 mL) so coletadas em


ambientes limpos e estreis. No caso de gua clorada o frasco dever conter um pouco de
tiossulfato de sdio com o intuito de inibir a ao do cloro presente, evitando seu efeito
oxidante sobre a matria orgnica presente no material analisado. H recomendao para se
adicionar 0,1 mL de tiossulfato de sdio a 1,8% para cada 100mL de amostra de gua a ser
analisada.
II.2- Estocagem deve ser mantida em geladeira por no mximo 24 horas.
II.3- Tcnica a anlise realizada em duas etapas: teste presuntivo e teste confirmativo,
quando o NMP de coliformes/mL determinado utilizando uma tabela de NMP apropriada. A
contagem padro de bactrias e realizada empregando a tcnica de plaqueamento pour-plate.

TABELA DE NMERO MAIS PROVVEL


Numero Mais Provvel (NMP) por 100 mL e 95 % de intervalo de confiana para diversas
combinaes de tubos positivos em sries de 3 tubos. Quantidade inoculada da amostra: 10,0;
1,0 e 0,1 mL.

1 Prtica
I-Teste Presuntivo de Coliformes Totais:
1-Objetivo: verificar a fermentao da lactose com produo de gs nos tubos inoculados.
2-Meio de cultura: Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)
3-Procedimento: Inoculao de trs sries de tubos
1 - Inocular 10 mL de amostra em tubos (3 ou 5) contendo 10 mL do caldo LST em
concentrao dupla e tubos de Durhan.
2 - Inocular 1 mL de amostra em tubos (3 ou 5) contendo 10 mL do caldo LST em
concentrao simples e tubos de Durhan.
3 - Inocular 0,1 mL de amostra em tubos (3 ou 5) contendo 10 mL do caldo LST em
concentrao simples e tubos de Durhan.
4 - Incubao: 35oC/48 horas.
5 - Contagem: verificar a produo de gs nos tubos de Durhan e anotar os tubos
positivos de cada srie.

II-Contagem Padro de Bactrias


1-Objetivo: determinar o numero de bactrias heterotrficas totais (Norma CETESB L5.201 Bactrias Heterotrficas - Contagem em Placas), uma vez que de fundamental importncia
que se mantenha sob controle a populao bacteriana geral da gua.
2-Meio de cultura: Plate Count Agar (PCA).
3-Procedimento: Transferir, com pipeta estril, 1 ml da amostra (diluda se necessrio em
soluo fisiolgica) para uma placa de Petri previamente esterilizada; adicionar o meio de
cultura previamente fundido e homogeneizar o contedo da placa em movimentos circulares
moderados em forma de ().
4-Incubacao: incubar a placa em posio invertida a 35 + 0,5oC durante 48 + 3 horas.
5-Contagem: Fazer a contagem das colnias com o auxilio de um contador de colnias.
Selecionar a placa contendo entre 30 e 300 colnias. Contar o numero de colnias e, de
acordo com a diluio utilizada no material de origem, expressar o numero de unidades
formadoras de colnia (UFC) presentes na amostra, nas condies de teste.
Exemplo de calculo:
no de colnias = 54
diluio = 10-1
Total: 54 10-1 = 54 x 101 = 5,4 x 102 UFC/g de amostra
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2 Prtica
I-Teste Confirmativo de Coliformes Totais
1-Objetivo: evidenciar o crescimento dos coliformes no caldo verde-brilhante. O verdebrilhante inibe o crescimento dos outros micro-organismos que fermentam a lactose e no so
do grupo coliforme.
2-Meio de cultura: Caldo Verde-Brilhante
3-Procedimento: Transferir uma alada bem carregada de cada tubo de LST onde houve
produo de gs para tubos de caldo verde-brilhante contendo tubos de Durhan.
4-Incubao: 35oC/48 horas.
5-Contagem de coliformes totais: verificar a produo de gs nos tubos de Durhan e anotar os
tubos positivos, confirmativos da presena de coliformes totais. Determinar o NMP/ml
utilizando uma tabela de NMP apropriada.

II-Teste Confirmativo de Coliformes Termotolerantes (Fecais)


1-Objetivo: evidencia o crescimento da E. coli, uma bactria de habitat reconhecidamente
fecal dentro do grupo coliforme.
2-Meio de cultura: Caldo E. coli (EC Medium)
3-Procedimento: Transferir uma alada bem carregada de cada tubo de LST onde houve
produo de gs para tubos de caldo E. coli contendo tubos de Durhan.
4-Incubao: Banho-maria 44,5oC/48 horas.
5-Contagem de coliformes fecais: verificar a produo de gs nos tubos de Durhan e anotar
os tubos positivos, confirmativos da presena E. coli. Determinar o NMP/ml utilizando uma
tabela de NMP apropriada.

Concluso:

Padro de potabilidade, segundo a PORTARIA N 2.914, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2011 do Ministrio da Sade (Anexo 1).