UNVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA

I.

INTRODUCCION
El virus de la Hepatitis B es uno de los agentes causales de la Hepatitis aguda, pertenece a la
familia Hepadnaviridae. Tiene en su superficie el antgeno de superficie del virus de la Hepatitis B
(HBsAg), el cual es altamente inmunognico y til para el diagnstico del estado portador. La
hepatitis es transmitida por contacto sexual, por va transfusional, transmisin vertical madre-hijo o
por accidentes con material cortopunzante. La infeccin, es capaz de dejar portadores crnicos de
por vida, capaces de transmitir silenciosamente la enfermedad, y en algunos casos producir una
hepatitis crnica, la cual puede terminar en un hepatocarcinoma maligno. Debido a ello, lo que
debe vigilarse es el estado de portador crnico a la Hepatitis B, es decir, aquellos que sean
reactivos al Antgeno de Superficie de la Hepatitis B (HBsAg.)
El antgeno Australiano o antgeno de superficie (HBsAg) fue el primer marcador serolgico
descrito para el diagnstico de la hepatitis viral B.
Este marcador HBSAg, es uno de los primeros en aparecer en sangre de los pacientes que
padecen hepatitis B, luego desaparece. En, aproximadamente, el 10% de los casos vuelve a
aparecer.
Cuando aparece por primera vez, estamos frente a una hepatitis B aguda y cuando reaparece nos
indica una hepatitis B crnica.
En la gente infectada por HBV, el virus persiste por el resto de sus vidas y puede ser trasmitido a
otras.
Tcnicas ELISA especficas para la deteccin de antgeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg),
utilizan un anticuerpo anti-HBsAg en fase slida, que se une al antgeno presente en el suero del
paciente, el cual reacciona frente a un conjugado marcado con una enzima, la que en contacto con
un sustrato apropiado, desarrolla una reaccin colorimtrica, la que puede ser leda visual o
instrumentalmente.
Dado que existen resultados falsos positivos que tienen estas tcnicas de tamizaje, se recomienda
confirmarlas con tcnicas suplementarias. Estas ltimas se basan en la neutralizacin del HBsAg,
presente en la muestra del paciente, a travs de su anticuerpo especfico, las que son corridas en
una prueba ELISA en paralelo, semejante al tamizaje, y en donde se mide posteriormente la
absorbancia de la muestra no neutralizada y la neutralizada.

II.

COMPETENCIAS

1. Analizar la prueba del antingeno de superficie de hepatitis B (HBsAg), prueba de ELISA.

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III.

FUNDAMENTO TEORICO:

La infeccin por el virus de la hepatitis B (VHB) es un problema mundial; el 66% de la

poblacin del mundo vive en zonas donde el nivel de infeccin es elevado. Ms de 2000 millones
de personas saben que tienen o han tenido una infeccin por el VHB y 350 millones de personas
son portadoras crnicas del virus en tanto aparecen 2,5 millones de nuevas infecciones de ese
virus por ao. El VHB es una causa importante de hepatitis aguda y crnica y de cirrosis heptica,
y puede ser la causa de hasta el 80% del carcinoma hepatocelular, que es el cncer ms
importante en varias regiones del mundo. El VHB ocupa el segundo lugar despus del tabaco;
entre los carcingenos identificados en el humano. Slo en los Estados Unidos se calcula que hay
cerca de 1.25 millones de portadores crnicos del VHB.
La infeccin con VHB constituye la causa principal de enfermedad heptica, generando una
gran carga econmica en los servicios de salud de pases industrializados y en desarrollo. En
stos, la prevalencia global de portadores oscila entre 5 y 20%.
Aunque el VHB fue reconocido inicialmente como un agente transmitido por transfusiones o
punzadas con agujas recicladas y otros materiales contaminados con sangre, desde la dcada de
1970 se reconoci que la mayora de las infecciones se adquieren por contacto sexual.
La infeccin con el VHB (familia Hepadnaviridae), se refleja en sus marcadores serolgicos:
antgeno de superficie (HBsAg), anticuerpos anti-antgeno de superficie (anti-HBs), antgeno central
(HBcAg), anticuerpos anti-antgeno central (anti-HBc), antgeno e (HBeAg), anticuerpos antiantgeno e (anti-HBe) y ADN viral.
La presencia del HBeAg denota sntesis viral activa y por lo tanto alta infectividad. Los
anticuerpos anti-e, que reflejan una baja tasa de infectividad, que aparecen en la fase integrada de
la infeccin, cuando el ADN del virus forma parte del material gentico de las clulas husped. Los
anticuerpos anti-HBc totales se presentan en casi todos los casos de hepatitis crnica. Los
anticuerpos anti-HBc de forma 7-8S, tipo IgM predominan en la infeccin crnica, mientras que los
de forma 19S predominan en la hepatitis aguda. La persistencia del HBsAg en sangre, durante seis
meses o ms, despus de su deteccin inicial, permite el diagnstico de laboratorio definitivo del
proceso crnico. La presencia del marcador, sin alteracin de transaminasas ni otros signos
sugestivos de inflamacin heptica, caracteriza al "estado de portador crnico sano". Los ttulos
bajos de IgG anti-HBc y de anti-HBs indican una infeccin vieja de VHB. Los ttulos altos de IgG
anti-HBc sin anti-HBs denotan una infeccin viral persistente.
JUSTIFICACIN DE LA VIGILANCIA DE LABORATORIO
El virus de la Hepatitis B es uno de los agentes causales de la Hepatitis aguda, la cual es
transmitida por contacto sexual, por va transfusional, transmisin vertical madre-hijo o por
accidentes con material cortopunzante. La infeccin con virus de la Hepatitis B es capaz de dejar
portadores crnicos de por vida, capaces de transmitir silenciosamente la enfermedad, y en
algunos casos producir una hepatitis crnica, la cual puede terminar en un hepatocarcinoma
maligno. Debido a ello, lo que debe vigilarse es el estado de portador crnico a la Hepatitis B, es
decir, aquellos que sean reactivos al Antgeno de Superficie de la Hepatitis B (HBsAg.)
DESCRIPCIN DEL AGENTE
El virus de la Hepatitis B pertenece a la familia Hepadnaviridae. Es un virus DNA de doble cadena
asimtrica y abierta. Tiene en su superficie el antgeno de superficie del virus de la Hepatitis B
(HBsAg), el cual es altamente inmunognico y til para el diagnstico del estado portador. Su
nucleocpside est constituida por el antgeno core, en cuyo interior est el material gentico, el
antgeno e y la DNA polimerasa.

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ENFERMEDADES HUMANAS QUE PRODUCE ESTE AGENTE

Hepatitis aguda, de curso habitualmente benigno. Aproximadamente un 10 % quedan como
portadores crnicos. De ellos, un 20% mueren por Cirrosis heptica y un 4% desarrollarn un
hepatocarcinoma primario del hgado.
Tipo de muestras requeridos
- Suero
- Plasma
Las muestras pueden recolectarse ya al comienzo de la sintomatologa aguda.
PERODO PTIMO PARA LA TOMA DE MUESTRA
Para determinar el estado de portador, puede tomarse una muestra de suero posterior a la
mencionada en el Artculo 18.5, en la etapa de convalecencia.
CONSERVACIN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS
Las muestras de sangre deben recolectarse en envases sin anticoagulantes, para obtener suero.
Este debe ser extrado en condiciones de asepsia, ojal en frascos limpios y estriles, plsticos y
con tapa rosca.
En el caso de enviar ms de una muestra simultneamente al laboratorio, deber tomarse la
precaucin de colocar cada una protegida por separado en un recipiente metlico o de material
aislante. Esto evitar rupturas, prdidas y contaminacin del operador.
TCNICAS DE LABORATORIO UTILIZADAS
Tcnicas ELISAs especficas para la deteccin de antgeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg),
utilizan un anticuerpo anti-HBsAg en fase slida, que se une al antgeno presente en el suero del
paciente, el cual reacciona frente a un conjugado marcado con una enzima, la que en contacto con
un sustrato apropiado, desarrolla una reaccin colorimtrica, la que puede ser leda visual o
instrumentalmente.
La sensibilidad mnima exigida para una tcnica ELISA es que detecte al menos 1 ng/ml de
HBsAg.
Existen tcnicas ms rpidas para la deteccin de este antgeno, pero son menos sensibles que
los ELISAs, y su lectura es generalmente visual.
Dado que existen resultados falsos positivos que tienen estas tcnicas de tamizaje, se recomienda
confirmarlas con tcnicas suplementarias. Estas ltimas se basan en la neutralizacin del HBsAg,
presente en la muestra del paciente, a travs de su anticuerpo especfico, las que son corridas en
una prueba ELISA en paralelo, semejante al tamizaje, y en donde se mide posteriormente la
absorbancia de la muestra no neutralizada y la neutralizada.

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IV.

MATERIALES:

Reactivos provistos en los Kits:

Pocillos de microtitulacin recubiertos con anticuerpos monoclonales anti-HBS.

Control negativo
Control positivo
Conjugado enzimtico
Concentrado Buffer de lavado
Solucin de TMB
Solucin stop
Pipetas de 0.05 y 0.10 ml
Punteras desechables Agua destilada
Estufa a 37C
Papel absorbente o papel toalla.

V.

PROCEDIMIENTO:

PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE LAVADO:

diluir el buffer de lavado concentrado 25X con agua destilada o desionizada 1:25. Es decir 1
ml de buffer de lavado concentrado debe ser diluda en 25 ml de agua destilada.

PROCEDIMIENTO PARA EL ANTIGENO DE SUPERFICIE DE HEPATITIS B (HBsAg):

1. Marcar tres pocillos: Positivo, negativo y suero problema. Y aadir 50ul a cada uno segn
lo especificado.
2. Aadir 50ul de conjugado HRP-HBsAg y agitar por unos 20 segundos. Cubrir los pocillos.
3. Incubar a 37C por 60 minutos.

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4. Eliminar la mezcla de cada pocillo y agregar el buffer de lavado y agitar por 20 segundos.
Repetir el paso por 4 veces.
5. Aadir 50 ul de sustrato TMB A y TMB B a cada pocillo.
6. Incubar a 37C por 15 minutos.
7. Aadir 50 ul de solucin de parada (STOP) a cada uno y mezclar por 30 segundos.
PROCEDIMIENTO DEL TEST DE ELISA:

Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de usar.

Colocar 50 ul de control positivo, control negativo, suero problema en los respectivos pozos.
Agregar 50 uL de Conjugado enzimtico a cada pozo. Mezclar suavemente la microplaca por

2 min.
Incubar a 37C durante 1 hr.
Lavar cada pozo 5 veces llenando cada pozo con buffer de lavado diluido, invertir la placa

vigorosamente para eliminar el agua y colocar en papel absorbente por pocos segundos
Agregar 50 ul de cromogen A y 50 ul de cromogen B a cada pozo, e incubar a 37C por 15

min.
Luego de la incubacin se desarrollar un color azul si fuese reactiva la muestra. La

intensidad de color es proporcional a la cantidad de HBsAg en la muestra

Agregar 50 ul de Solucin Stop a cada pozo para parar la reaccin de color. La cual cambia a color
amarillo. Leer a O.D. a 450 nm y 630 nm con un lector de microplacas dentro de los 10 minutos.

VI.

RESULTADOS:

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VII.

CONCLUSION:

Se analiz la prueba del antingeno de superficie de hepatitis B (HBsAg), prueba de

ELISA. El ELISA para HBsAg es un inmunoensayo de fase slida simultnea de
sndwich, que emplea anticuerpos monoclonales y policlonales especficos para
HBsAg, Pozos de microtitulacin recubiertos con anticuerpos especficos para HBsAg.
El especmen es agregado al pozo de microtitulacin recubierto con anticuerpos junto
con conjugado enzimtico con anticuerpos policlonales. Si el HBsAg est presente,
formar un complejo Anticuerpo HbsAg-anticuerpo enzima. La placa fue lavada para
remover material no ligado.
Finalmente, una solucin de sustrato enzimtico HRP (TMB) se agreg a los pocillos e
incubada. Un color azul se desarrollar en la proporcin de la cantidad presente de
HBsAg en la muestra. La reaccin enzima substrato debe ser detenida y los resultados
visualizados pticamente o leda en un lector de ELISA.

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VIII.

BIBLIOGRAFA

Domnguez P., Otorola G. Virus HBSV. Colombia; 2010. Fecha de acceso:

02/12/15.

Disponible

en:

http://www.ispch.cl/virus-hepatitis-b-antigeno-de-

superficie-hbsag

Ispch.cl [actualizado mayo del 2015; citado 02 diciembre 2015]. Disponible en:
http://www.ispch.cl/virus-hepatitis-b-antigeno-de-superficie-hbsag