LABORATORIO #3 ELECTROFORESIS (SECUENCIA DE DNA)

Maricel Daz Martnez

Objetivos Generales
1. Realizar correctamente una electroforesis con muestras de DNA
2. Lograr la correcta replicacin de un fragmento de DNA mediante PCR
Objetivos Especficos PCR
* Entender el fundamento terico de la PCR para la replicacin artificial de
un fragmento de DNA
* Realizar una adecuada extraccin de DNA de la sangre de un voluntario
para tener un DNA de alta pureza
* Realizar adecuadamente los pasos de la PCR (Desnaturacin, anillamiento,
extensin) para obtener una rplica artificial optima de un fragmento de
DNA
Objetivos Especficos Electroforesis
* Entender el fundamento terico de la electroforesis en el gel de agarosa
para la separacin de molculas, en este caso cidos nucleicos
* Por medio de la electroforesis en gel de agarosa lograr una adecuada
visualizacin del DNA.
Marco Terico
Electroforesis en gel de Agarosa
Procedimiento y Equipos
Buffer de PCR10X
Agua ultrapura
MgCl2 50 mM
dNTPs Mezcla 10mM
Primer F GAPDH
Primer R GAPDH
Taq Polimerasa
Molde de DNA
Gradilla
Puntas de 1, 5 y 10ul
Pipetas automticas
Tubos de 0,2ml de PCR estriles (Eppendorf)
Termociclador Mastercycler
Eppendorf
Resultados
PCR
Electroforesis
en el gel de
agarosa
Agarosa al 1%
SYBR green
Marcador de peso molecular
Buffer TBE
Muestra de DNA

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Buffer de corrida
y de carga
Gradillas
Cubeta de electroforesis
Pipetas
automticas
Transiluminador de luz ultravioleta
Fuente de poder
Peines
Extraccin del DNA
Luego de realizar el procedimiento de purificacin del DNA a partir de la
muestra de sangre, la asistente de laboratorio realiz una electroforesis con
las muestras de ambos grupos con el fin de confirmar la presencia de DNA.
Este es el resultado de la muestra del grupo 4
PCR
Electroforesis
Anlisis de Resultados
PCR
Extraccin de DNA
La presencia de una banda fluorescente en el carril del gel correspondiente a
la muestra #4a nos permite verificar la presencia de material gentico en la
muestra del grupo, adems se obtuvo una concentracin de 67,2 ng/l de
DNA en cuestin lo que refleja que hubo una buena extraccin del DNA.
Aunque hubo una buena extraccin del DNA, el cociente 260/280 (A260) dio
como resultado 1.58. Siendo el umbral de pureza >1,8, se puede decir que
la muestra no era DNA puro y por consiguiente una buena parte de la
concentracin mencionada anteriormente esta determinada por protenas
externas al DNA
Electroforesis
La presencia de una banda fluorescente en el carril del gel correspondiente a
la muestra #4a nos permite verificar la presencia de material gentico en la
muestra del grupo.
Conclusiones PCR
Conclusiones Electroforesis
* En la prctica de laboratorio se pudo efectuar correctamente la
electroforesis en el de agarosa para la visualizacin del DNA, ya que al
observar la electroforesis bajo luz fluorescente su puede ver una banda
fluorescente en el carril #4 lo cual es debido a la presencia de material
gentica en la muestra del grupo.
* El entendimiento del fundamento terico de la electroforesis y su adecuado
procedimiento son claves para desarrollar de manera correcta la tcnica de
separacin molecular de cidos nucleicos (Electroforesis en gel de Agarosa),
ya que un mal manejo de los insumos o de los equipos pueden generar un
error que afecte el resultado final.

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* La electroforesis en gel de agarosa es una de las tcnicas ms adecuadas

para la visualizacin del DNA, ya que adems de ser fcil su preparacin, es
fcil de visualizar el DNA ya que solo es necesario colorearlo con un
colorante fluorescente como el bromuro de etidio y el Sybergreen, para
posteriormente someterlo a una luz fluorescente y de esta manera visualizar
el DNA.
* El entendimiento del fundamento terico de la PCR y su adecuado
procedimiento son claves para desarrollar de manera correcta la tcnica de
replicacin de un fragmento de DNA, en este caso del gen SRY, ya que un
mal manejo de los insumos o un error en el procedimiento puede alterar el
resultado final de la PCR generando una errnea o nula replicacin del
fragmento de DNA.
* La extraccin del DNA a partir de la sangre de un voluntario, es de suma
importancia para efectuar la PCR, ya que entre mejor sea extrado el DNA de
la muestra de sangre y este contenga mayor pureza (entre 1.8 - 2), se
realizara una mejor replicacin y visualizacin de este posteriormente.
* La realizacin de los pasos tanto de manera correcta como en el orden
adecuado es esencial para la correcta replicacin de DNA, ya que la
alteracin de los pasos puede provocar un inadecuado proceso de
replicacin del fragmento de DNA con el cual no se podra trabajar, ni utilizar
para procesos de investigacin mdica y biolgica y de tipo forense.
PCR
Electroforesis en gel de
agarosa
1. El primer paso que vamos a seguir es una vez tenemos el tubo eppendorf
con el material gentico necesitamos llegar a un volumen de 50 microlitros
lo primero que adicionaremos es cloruro de magnesio (MgCl2) en una
solucin de 1,5milimoral/3 microlitros (1,5mM/3 microlitros)
2. Despus de este paso agregamos al tubo una solucin de Buffer para PCR
de 10 microlitros.
3. Seguidamente a este paso se adiciona un 1 microlitro de Primer F para
GAPDH (el conjunto de primers GAPDH se usa con el fin de abarcar el lmite
entre el exn 1-exn 2 que limita la amplificacin por PCR).
4. A continuacin se adiciona el segundo primer que es primer R con un
volumen de 1 microlitro.
5. Ahora adicionaremos a esto una solucin de dNTPs (desoxinucletidos
trifosfato) de 10mM/1 microlitro.
6. Se debe agregar a esto agua ultrapura en una cantidad tal que nos
permita completar los 50 microlitros de muestra que necesitamos en este
caso fueron 32,75 microlitros.
7. El penltimo paso es el cDNA que se agregan de 1-3 microlitros de este en
este caso fue 1 microlitro.
8. Por ltimo se agrega el Taq polimerasa (la polimerasa que copia las

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secuencias de nucletidos ms usada ya que funciona muy bien a altas

temperaturas) de esta se adicion un volumen de 0,25 microlitros.
9. Despus de tener todo esto en el tubo de PCR se lleva a la centrifugadora
por 20 segundos.
10. El siguiente paso es ir al TERMOCICLADOR este aparato nos permite
hacer ciclos a diferentes temperaturas para realizar las reacciones de
amplificacin de la PCR, por lo general usa temperaturas de 4 a 96 grados
centgrados las cuales se manejan por diferentes programas que tiene el
termociclador, en este proceso ocurre la desnaturalizacin, hibridacin y
extensin del DNA. En el caso de nuestra practica :
Se utiliz el programada del termociclador S5A7.
Lo primero que debemos tener en cuenta es que el termociclador tiene
una tapa que en la prctica se encontr a 105 grados centgrados, la funcin
de esta es evitar la condensacin del agua en la tapa de los tubos de PCR
para evitar que los solutos se concentren lo que podra generar una
modificacin de los resultados.
1. Lo primero que hizo el programa fue un ciclo de 4 minutos a 94 grados
con el fin de realizar la denaturalizacin inicial.
2. Despus a los mismos 94 grados pero por 40 segundos se realiz otra
denaturalizacin.
3. A continuacin, a 57 grados por 40 segundos se realiz el proceso de
hibridacin del DNA.
4. El siguiente paso fue a 72 grados por 7 minutos el proceso de
amplificacin o extensin del DNA.
5. A partir de aqu se realizan otros 35 ciclos iguales desde el paso 2 al paso
4 para un total de 36 ciclos de termociclado.
Despus de obtener el resultado del termociclador se va a conservar a 4
grados centgrados la muestra.
1. Despus de saber todos los materiales y equipos que vamos a utilizar, el
primer paso que hicimos fue hacer el gel de Agarosa que en nuestro caso
fue al 1% .
* Empezamos utilizando 40 microlitros de SYBR Green (compuesto utilizado
para la tincin del DNA) antes de aadir a la cubeta de electroforesis.
*Seguido de esto agregamos 40mL un tampn TAE (que se encarga de
separar cidos nucleicos) que se pondr en el microondas para que est listo
ms rpido.
*Se agregan 0,4 g de Agarosa que se va a disolver en el TAE.
*Una vez todos estos estn en la bandeja se procede a poner el peine para
poder separar los pozos de la electroforesis.
*La bandeja se cubre con un papel aluminio, ya que, el SYBR Green es
sensible a la luz y se puede daar.
*Una vez hecho esto retiramos el peine con el fin de evitar que en el gel
queden burbujas y se pone finalmente en la cubeta de electroforesis.
2. Una vez tenemos el gel preparado, procedemos a colocar las muestras

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que tenemos de DNA en los pozos para esto es importante realizar los
siguientes procedimientos:
*En el primer pozo se pone una especie de buffer inicial y a partir del
segundo pozo se pusieron las muestras.
*En nuestro caso nos correspondi el pozo #5 ya que somos el grupo 4.
*Lo que hicimos bsicamente fue tomar 3 microlitros de Buffer de carga que
es color naranja.
*Despus tomamos 7 microlitros de la muestra de DNA y se mezclan con el
Buffer de carga, esta mezcla al final queda de un color violeta.
*Una vez bien mezclados dan como resultado 10 microlitros que se llevan a
la cubeta de electroforesis y se ponen en el pozo que nos correspondi, este
paso requiere pulso con el fin de no romper el gel y no daar las dems
muestras.
3. Despus de poner todas las muestras en el gel se procedi a conectar la
fuente de poder durante 40 minutos a 80V (Voltios) que correr del ctodo
(polo negativo) al nodo (polo positivo).
4. Una vez se acaba el proceso de electroforesis se analizan los fragmentos
de DNA por luz UV.
PCR
PCR
Electroforesis en gel de Agarosa
La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las
metodologas ms utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el
trabajo con cidos nucleicos.
Mediante la electroforesis podemos:
* Separar fragmentos de ADN y ARN en funcin de su tamao.
* Visualizar dichos fragmentos mediante una sencilla tincin y de esta forma
determinar el contenido de cidos nucleicos de una muestra, teniendo una
estimacin de su concentracin y grado de entereza.
* Extraer del gel los fragmentos de ADN que sean de inters, para
posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones.
Es por esto que para la presente prctica, se utiliz la electroforesis para el
anlisis de fragmentos de amplificacin obtenidos mediante PCR del gen que
codifica la gliceraldehdo 3- fosfato deshidrogenasa.
Usualmente al final de la PCR, para saber si la reaccin transcurri
eficientemente, es decir, se gener la amplificacin especfica de
determinada secuencia o lo que es lo mismo los fragmentos obtenidos son o
no puros, estos son visualizados a travs de una electroforesis en geles de
agarosa.
Cuando los fragmentos de amplificacin son corridos en el gel, stos deben

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ser cargados junto con un marcador molecular que contenga un nmero

determinado de segmentos de ADN conocidos, lo que facilita la identificacin
de los fragmentos de amplificacin y si su tamao corresponde con el
esperado.
Finalmente, la visualizacin de los fragmentos de amplificacin se lleva a
cabo tomando una foto digital al gel de agarosa expuesto a luz UV,
adicionalmente un procesador de imgenes se encarga de analizar las
bandas observadas.
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingls) es
una de las herramientas tecnolgicas ms innovadoras para el estudio de los
cidos nucleicos. Se caracteriza por ser una tcnica de alta sensibilidad,
reproducibilidad y eficiencia, que genera resultados confiables en poco
tiempo y fciles de analizar. Por ello, se ha convertido en el mtodo de
eleccin de muchos investigadores para los estudios genticos y de biologa
molecular.
La misin de la PCR es copiar millones de veces una secuencia especfica de
ADN blanco mediante una poderosa catlisis llevada a cabo por una enzima
conocida como ADN polimerasa, de tal manera que cantidades pequeas de
ADN pueden ser sintetizadas y copiadas fielmente para analizarse con
diferentes fines.
Los elementos importantes en la reaccin son el templado o molde (ADN o
ADNc), la enzima, los oligonucletidos o primers, los desoxirribonucletidos
trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina) el in magnesio
(Mg +), una solucin amortiguadora o buffer y H2O. Todos estos elementos
interactan en tres etapas principales de las que se compone la PCR:
desnaturalizacin, hibridacin y extensin.
En el gel de PCR no se evidencia ninguna banda, con lo cual se puede decir
que no hubo una adecuada replicacin del fragmento de DNA deseado. Esto
se puede deber a diferentes factores como: al inadecuado uso de los
insumos ya que al ser nuevos y no haberse utilizado antes, no se conoca
adecuadamente el procedimiento y esto pudo generar el error que llevo a
una replicacin nula del fragmento del DNA.