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MVZ
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Crdoba 17(1):2852-2860,
REVISTA MVZ CRDOBA
2012. Volumen 17(1), Enero - Abril 2012
ORIGINAL
po de Inmunologa Molecular (GYMOL). Carrera 15 Calle 12 Norte, Telfono: +57(6) 7460168. Armenia, Colombia. *Correspondencia: jhoncarlos@uniquindio.edu.co
Recibido: Septiembre de 2010; Aceptado: Junio de 2011.
RESUMEN
Objetivo. Establecer una tcnica para el aislamiento de bacterifagos a partir de aguas residuales
especficos para E. coli DH5. Materiales y mtodos. Se tom como base el mtodo 1601 de la
Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos de Amrica y un mtodo de obtencin de
enterovirus a partir de aguas residuales. En el desarrollo del protocolo se realizaron mltiples pruebas
utilizando como control positivo el bacterifago T4 y los aislamientos de bacterifagos obtenidos a
partir de aguas residuales. Resultados. Se observ la formacin de unidades formadoras de placa
(UFP), se obtuv la titulacin de los bacterifagos presentes en cada uno de los cultivos de E.coli
DH5, se determinaron las relaciones que existen entre la cuantificacin de la formacin de unidades
formadoras de placa (UFP) del tratamiento control y el tratamiento experimental y las respectivas
caractersticas de las (UFP) en cada uno de los experimentos realizados. Conclusiones. Se logr
establecer un protocolo microbiolgico para el aislamiento de bacterifagos especficos para E. coli
DH5.
Palabras clave: Aislamiento, bacterifagos, E. coli (Fuente: CAB).
ABSTRACT
Objetive. To develop an isolation technique for DH5 E. coli specific bacteriophages in wastewater.
Materials and methods. The 1601 method of the Environmental Protection Agency of the United
States of America and an wastewater enterovirus obtaining method were used as a reference. During
the development of the protocol, multiple tests were performed using the T4 bacteriophage as
positive control and the bacteriophage isolates obtained from wastewater. Results. Plaque-forming
units (PFU) were observed; tittering of bacteriophages present in each of the DH5 E. coli cultures
was obtained; the relationships between the quantification of PFU in the control and experimental
groups, and their corresponding PFU characteristics were determined for each of the experiments.
Conclusions. It was possible to establish a microbiological protocol for the isolation of bacteriophages
specific for DH5 E. coli.
Key words: Bacteriophage, isolation, E. coli (Source: CAB).
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INTRODUCCIN
Los bacterifagos son virus que fueron
descubiertos de forma independiente por los
microbilogos Frederick W. Twort (1) en 1915 y
Flix dHrelle (2) en 1917. Siendo esta la ltima
clase principal de virus en ser descubierta; este
tipo de virus constituye un sistema simple y de
gran abundancia en la naturaleza. En esencia,
los bacterifagos se encuentran de manera
ubicua en el ambiente y en el lugar en que se
encuentre su clula husped (3).
Los bacterifagos son virus que infectan y
se multiplican en la bacteria, llevando a la
destruccin la clula hospedera con la liberacin
de bacterifagos que re-infectan otras bacterias.
Los bacterifagos fueron descubiertos en las
primeras dcadas del siglo XX, pero su uso
clnico no se extendi en pases occidentales
sino hasta la dcada del 80, debido a diferentes
razones. A pesar de que se realizaron mltiples
esfuerzos para generalizar su uso como agentes
teraputicos en las dcadas de 1920 y 1930
fueron cayendo en el olvido por la ciencia
de la poca debido al descubrimiento de los
antibiticos.
Un papel muy importante jug la Asociacin
Mdica Americana, la cual recomend que se
deba dejar todo tipo de tratamiento a travs de
bacterifagos. Este rechazo se dio por razones
como el desconocimiento de la biologa de los
bacterifagos para ese entonces, el diseo
errneo de los protocolos experimentales y la
falta de controles adecuados en los diferentes
experimentos realizados (2). Adems, con el
empleo generalizado de los antibiticos para
combatir infecciones, durante casi cuarenta
aos se abandon en occidente cualquier tipo
de investigacin sobre el uso de bacterifagos
como agentes teraputicos, aunque se usaron
de forma extensa para anlisis genticos y para
establecer las bases de la biologa molecular.
Posteriormente, para la dcada de 1980, de
nuevo se empezaron a usar los bacterifagos
en animales de experimentacin en los pases
occidentales. En este sentido, los trabajos de
Smith y Huggins (4) en la dcada del 80 se
pueden considerar como un punto de inflexin,
al retomar de nuevo la importancia de los
bacterifagos en la terapia animal, ya que
de estos se haban obtenido resultados muy
esperanzadores.
Los bacterifagos se componen de un solo tipo
de cido nucleico (ARN o ADN) encapsulado por
una cubierta proteica que exhibe los elementos
estructurales necesarios para una infeccin
especfica (5). Algunos presentan una envoltura
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MATERIALES Y METODOS
Obtencin de bacterifagos. Para alcanzar los
objetivos propuestos se desarroll la siguiente
metodologa, se utilizaron 5 litros de agua
residual para la obtencin de bacterifagos. Se
realizaron 7 repeticiones de cada uno de los
experimentos, siguiendo lo sugerido por varios
autores (16,21,22). Esto se realiz para brindar
una mayor confiabilidad de los resultados en
cuanto a la estandarizacin de la tcnica para el
aislamiento de bacterifagos a partir de aguas
residuales.
Sitio de estudio y toma de la muestra. Se
tom un litro de agua residual de un vertedero
de aguas residuales del municipio de Salento,
Quindo, utilizando una botella de plstico nueva
y limpia. Se almacen a 4C en una nevera de
poliestireno expandido y luego se transport al
laboratorio para su procesamiento.
Aislamiento de bacterifagos. Una vez en
el laboratorio, se llev el litro de agua residual
a centrifugacin a 5100 x g a 4C durante 30
minutos, en una centrifuga de Marca IEC modelo
B-22 M 34961048. Concluido este tiempo, el
sobrenadante se transfiri a un frasco plstico
de 1.5 L. El precipitado se resuspendi en 1 mL
de extracto de carne y 1 mL de cloroformo y
se almacen en tubos de vidrio de 10 mL. Esta
solucin se homogeniz utilizando un vrtex
durante 3 min y se centrifug a 1050 x g a 4C
durante 30 minutos. Una vez finalizado este ciclo,
se colect el sobrenadante, el cual se deposit
en el frasco de plstico de 1.5 L que contena
el sobrenadante de la primera centrifugacin.
El precipitado restante se resuspendi en 1 mL
de extracto de carne y se someti nuevamente
a centrifugacin bajo las mismas condiciones
antes mencionadas. Finalmente se tom de
esta etapa el sobrenadante y se almacen en el
frasco de plstico mencionado al inicio de este
protocolo. Luego, al total de muestra almacenada
en el frasco de 1.5 L, se le agregaron 17.5 g de
cloruro de sodio (NaCl) y 80 g de polietilenglicol
(PEG) y se dej en reposo, almacenado a una
temperatura de 4C durante 24 horas.
Posteriormente se centrifug esta solucin
a 5100 X g a 4C durante 45 minutos. Al
finalizar este paso se descart el sobrenadante
y el precipitado se resuspendi con 1 mL de
solucin amortiguadora de fosfato al 1x (PBS).
Luego, para lavar el frasco donde se encontr
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RESULTADOS
En el conteo y observacin de las UFP, que
se realizaron al tratamiento control con el
bacterifago T4 y al tratamiento experimental
de los bacterifagos obtenidos a partir de aguas
residuales, se encontr que no existe una diferencia
significativa (p>0.05) entre los tratamientos,
(Figura 1). Sin embargo, aunque la diferencia
no fue marcada, en la lectura de placas del
tratamiento control se observ un mayor nmero
de estas. En los conteos realizados se cuantific
un mayor nmero de UFP dentro del experimento
control que dentro de la prueba experimental.
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El comportamiento resultante del modelo estadstico utilizado mostr tambin que entre cada
una de las diluciones realizadas desde 1x102 hasta 1x10-6 existe diferencia significativa
(p>0.005; Figura 2). Partiendo de este anlisis
estadstico se deduce hasta qu punto se deben
extender las diluciones, una vez se ha iniciado
un ensayo con bacterifagos obtenidos a partir
de aguas servidas especficos para E. coli DH5.
Figura 4. Observacin de lisis generada por los bacterifagos obtenidos a partir de aguas residuales en medios de cultivo de E. coli. DH5.
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Los
resultados
del
tratamiento
control
mostraron, en lo general, valores por encima
del tratamiento experimental. Esto se present
ya que en la mayora de las repeticiones de los
ensayos que se realizaron se encontr un mayor
nmero de placas dentro del tratamiento control,
cuyas caractersticas presentaron formas
redondeadas y aisladas una de otra. Cuando
se observaron algunas de ellas fusionadas y de
forma irregular dentro de las primeras diluciones
(1x10-1, 1x10-2, 1x10-3), para la discusin se
consideraron sus caractersticas y cada una de
las formas en las que se presentaron ensayo
tras ensayo. Adems, se encontr una diferencia
significativa en cuanto a la lectura de placas
entre el tratamiento control y el tratamiento
experimental en la dilucin 1x10-3 , como se
muestra en la figura 3, en la cual se presenta
un mayor nmero de UFP en el tratamiento
experimental que en el tratamiento control.
De igual forma, siempre se observ un
mayor nmero de UFP en el control, tanto
en el experimento, como en las diferentes
repeticiones que se realizaron para confirmar
la reproducibilidad y especificidad de la
tcnica que se estandariz. Se encontraron las
diluciones adecuadas donde se encuentra la
sensibilidad de la tcnica y, por ende, el factor
de dilucin hasta donde se deben extender los
diferentes experimentos realizados bajo este
protocolo. De acuerdo con las observaciones
que se realizaron, se describe claramente en la
figura 3 que las diluciones que se deben realizar
para determinar la sensibilidad que se encontr
en este experimento estn dentro de 1x10-1 y
DISCUSIN
En las observaciones y conteos que se realizaron al tratamiento control se determin que
ste obedece a las caractersticas propias de
la muestra control, ya que, a medida que se
encuentra el bacterifago purificado, se espera una mayor accin ltica a las bacterias que
se tienen como anfitrin, en este caso E. coli
DH5. Tanto la cantidad de unidades formadoras de placa(UFP), como la pureza en que encuentren los bacterifagos, estn directamente
relacionadas con el tipo de bacterifago que se
utilice en la prueba control. Existen otros factores entre los que se cuenta la alta densidad
bacteriana (20). Esto quiere decir que, a mayor
densidad del hospedero, mayor es la oportunidad de infeccin y, por ende, mayor nmero
de unidades formadoras de placa (UFP). Adems, esto se relaciona con otro factor o, ms
bien, otra caracterstica biolgica, que es la
alta especificidad que poseen los bacterifagos
frente a las clulas diana que ellos infectan.
La caracterstica de especificidad que tienen los
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REFERENCIAS
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2.
3.
4.
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9.
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aguas
Agua