SARGASUM

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
REA DE CONOCIMIENTOS DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO ACADMICO DE BIOLOGA MARINA
TESIS:
EVALUACIN DEL POTENCIAL DE Sargassum lapazeanum
Setchell & N.L. Gardner (Ochrophyta: Fucales, Phaeophyceae)
COMO FUENTE DE COMPUESTOS ANTIBACTERIANOS,
ANTIOXIDANTES Y ANTICOAGULANTES.
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

BILOGA MARINA
PRESENTA:
VALERIA ALEXANDRA VILLEGAS SILVA
DIRECTOR:
DR. MAURICIO MUOZ OCHOA
LA PAZ, B.C.S., MXICO. JUNIO DE 2014
Agradecimientos
Este proyecto se realiz en las instalaciones del Centro Interdisciplinario de Ciencias
Marinas del Instituto Politcnico Nacional, bajo la direccin del Dr. Mauricio Muoz
Ochoa, financiado por el proyecto "Sargassum lapazeanum como fuente de
compuestos bioactivos IPN-SIP20131037.
Al Dr. Mauricio Muoz Ochoa por su incondicional apoyo y paciencia, as como por
su orientacin y gua en laboratorio durante las pruebas realizadas incluso en
momentos de desesperacin acadmica. Gracias por ensearme las bases de la
qumica de productos naturales, motivndome siempre a seguir adelante.
A la Dra. Gabriela Andrade Sorcia, por la agradable leccin de botnica y la
identificacin taxonmica del alga.
A mi comit de tesis Dr. Rafael Riosmena
Rodrguez, Dr. Juan Manuel Lpez Vivas, Dra. Gabriela Andrade Sorcia y Dr. Jess
Ivn Murillo lvarez por sus acertados comentarios y observaciones, as como el
tiempo y dedicacin a la hora de aclarar dudas.
A las M. en C. Yoloxochitl Elizabeth Rodrguez Montesinos y Dora Luz Arvizu
Higuera por el apoyo, la confianza y las facilidades que me permitieron disponer del
laboratorio hasta altas horas de la noche. Asimismo agradezco a mis compaeros de
laboratorio de qumica de algas por hacer del tiempo trabajando algo ms ameno.
Finalmente a aquellas personas que me apoyaron y confiaron en m durante la
realizacin de este proyecto, principalmente mis hermanos y amigos por escucharme
cuando ms lo necesite y acompaarme a lo largo de este proceso, muchas gracias.
... pero sus estridentes ladridos slo son seal de que cabalgamos.
(Goethe, 1808).
RESUMEN
La pennsula de Baja California cuenta con una gran variedad de hbitats y

condiciones climticas, por lo que alberga una enorme riqueza de algas marinas destacando
la presencia de las algas pertenecientes al gnero Sargassum por su alta dominancia en
biomasa. (Surez Castillo et al., 2013). Se seleccion la especie Sargassum lapazeanum,
para el estudio de su potencial actividad biolgica como fuente de compuestos con actividad
antibacteriana, antioxidante y anticoagulante. Los resultados obtenidos indican que el
extracto etanlico de S. lapazeanum, as como sus diferentes fracciones presentan

una actividad selectiva contra bacterias del gnero Vibrio como V. harveyi y V.
parahaemolyticus, adems de actividad secuestrante de radicales libres en la
mayora de los extractos analizados, obteniendo la menor EC 50=39.96 g mL-1 a
partir de F6. Por su parte el fucoidan crudo y sus fracciones mostraron valores
comparables a los observados por la heparina a concentraciones de 10 gmL -1.
Finalmente el anlisis estructural del fucoidan demostr que se trata de un
heterofucano con sustituciones de grupos sulfato en posicin C4 mayoritariamente.
Palabras clave: actividad biolgica, algas pardas, caracterizacin, proximal,
fucoidan.
NDICE
Pginas
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABLAS
III
LISTA DE ABREVIACIONES
IV
GLOSARIO
I. INTRODUCCIN
II. ANTECEDENTES
1. Anlisis del potencial antibacteriano
1.1. Antibacterianos y su clasificacin
1.2. El gnero Sargassum como fuente de compuestos con

actividad antibacteriana.
2. Anlisis del potencial antioxidante
2.1. Radical libre DPPH
5
6
6
2.2. Algas del gnero Sargassum como fuente de compuestos

antioxidantes
3. Anlisis del potencial anticoagulante
7
9
3.1. Polisacridos sulfatados: Fucoidan y actividad anticoagulante

en phaeophytas
3.2. Mecanismos de coagulacin sangunea
12
3.3. Evaluacin de la actividad anticoagulante
16
III. JUSTIFICACIN
18
IV. OBJETIVOS
21
V. MATERIAL Y MTODOS
22
1. Recoleccin e identificacin taxonmica
22
2. Anlisis proximal del alga S. lapazeanum
23
3. Obtencin del extracto
23
3.1. Obtencin del extracto etanlico
23
3.2. Obtencin del extracto acuoso: Fucoidan
23
5.
4.1. Fraccionamiento por gradiente de polaridad
26
4.2. Fraccionamiento de F2 en columna cromatogrfica
26
4.3 Purificacin parcial del fucoidan
26
Pruebas de actividad biolgica
26
5.1. Evaluacin de la actividad secuestrante de radicales libres

(DPPH): anlisis del
potencial antioxidante
26
5.2. Evaluacin de la actividad antibacteriana por medio del mtodo

de difusin en agar con discos
5.3. Anlisis de la actividad anticoagulante
6.
Caracterizacin parcial del fucoidan
28
28
29
VI. RESULTADOS
30
1. Anlisis proximal
30
2. Anlisis de la actividad biolgica
30
2.1. Actividad antibacteriana
32
2.2. Actividad secuestrante de radicales libres
34
2.3 Actividad anticoagulante
35
VII. DISCUSIN
1. Anlisis proximal
36
2. Anlisis de la actividad antibacteriana
37
3. Anlisis de la actividad antioxidante
41
4. Anlisis de la actividad anticoagulante
44
4.1 Caracterizacin parcial del fucoidan
44
4.2. Ensayo de actividad anticoagulante.
46
VIII. CONCLUSIONES
50
IX. BIBLIOGRAFA
51
X. ANEXOS
64
LISTA DE FIGURAS
Pginas
Figura 1.
Estructura qumica del dioctil ftalato
Figura 2.
Difenilpicrilhidracilo (radical libre).
Figura 3.
Difenilpicrilhidracina.
Figura 4.
Estructura de algunos compuestos qumicos aislados a partir de

especies del gnero Sargassum: A) sargothunbergol-A, B y C)
Tetrapreniltoluquinoles, D Y E) monogalactosil-diacilgliceroles.
Figura 5.
Estructura qumica promedio del fucoidan.
Figura 6.
Diagrama que muestra la cascada de coagulacin. Imagen
10
13
tomada de Martnez-Murillo (2003).

Figura 7.
Va afectada por la prueba de tiempo de protrombina. Imagen

17
tomada de Kitchen et al. (2010).

Figura 8.
Mapa que muestra la zona de recolecta del alga S. lapazeanum

en San Juan de la Costa, Baha de La Paz B.C.S, Mxico.
Modificado a partir de NOAA: http://www.ngdc.noaa.gov/mgg/
22
shorelines/shorelines.html.
Figura 9.
Obtencin del extracto crudo (EC) y fraccionamiento del alga S.

lapazeanum.
Figura 10.
Esquema
que
muestra
el
proceso
de
obtencin
fraccionamiento del fucoidan.

Figura 11.
24
25
Cromatografa en placa fina que muestra la actividad

antioxidante de S. lapazeanum por el mtodo bioautogrfico,
revelada con una solucin de DPPH al 0.4%. E.E.C= Extracto
32
crudo.
Figura 12.
Grfica comparativa de los valores obtenidos para las EC 50 en
las fracciones obtenidas por gradiente de polaridad a partir de

S. lapazeanum. 1= Menor polaridad, 7= Mayor polaridad E.EC.=
32
Extracto Crudo.
Figura 13.
Curva dosis efecto la fraccin F6 de S. lapazeanum, donde se

observa el porcentaje de reduccin del DPPH (%) en relacin a
la concentracin del extracto (g mL -1). En negro: lnea de
33
tendencia y desviacin estndar. En rojo: concentracin efectiva

media (EC50).
Figura 14.
Curva dosis efecto del cido ascrbico (AA), utilizada como

blanco de comparacin, donde se observa el porcentaje de
reduccin del DPPH (%) en relacin a la concentracin del AA
33
(g mL-1). En negro: lnea de tendencia y desviacin estndar.

EC50, obteniendo por extrapolacin= 1.5 g mL -1
Figura 15.
Grfico que muestra la relacin entre la concentracin de los

extractos obtenidos a partir de la precipitacin fraccionada del
Fucoidan (FC) de S. lapazeanum y su efecto sobre el tiempo
35
normal de coagulacin segn el ensayo de TTPA36

Figura 16.
Espectros de FTIR-ATR de las fracciones obtenidos por

precipitacin fraccionada del extracto acuoso (Fucoidan) de S.
44
-1
lapazeanum: FC1, FC2 y FC3 en la regin de los 500-1800cm .
II
LISTA DE TABLAS
Pginas
Tabla I.
Estudios realizados con el alga Sargassum lapazeanum
Tabla II.
Listado de algunas especies del gnero Sargassum que han
4
12
presentado actividad anticoagulante.

Tabla III.
Nombre y funcin de los diferentes factores y cofactores que

actan en las diferentes etapas de la cascada de coagulacin15
Tabla IV.
Resultados de anlisis proximal del alga S. lapazeanum.
Tabla V.
Resultados de la prueba de difusin en agar con discos [2
14
30
mg/disco] del extracto crudo y las fracciones obtenidas a partir de

S. lapazeanum. Se reporta el promedio del halo de inhibicin en
31
milmetros sd, n = 2.
Tabla VI.
Resultados de la prueba de difusin en agar con discos [2

mg/disco] del fraccionamiento del extracto F2 obtenido a partir de
S. lapazeanum. Se reporta el promedio del halo de inhibicin en
31
milmetros sd, n = 2.
Tabla VII. Actividad
anticoagulante
de
los
extractos
obtenidos
por
precipitacin fraccionada a partir de S. lapazeanum
34
Tabla VIII. Comparacin de actividad de los extractos acuosos obtenidos a

partir de Sargassum lapazeanum en el ensayo de tiempo de 46
protrombina (TP)47
Tabla IX.
Listado de algunos valores de TP y TPPA reportados para algas

del gnero Sargassum
47
III
LISTA DE ABREVIACIONES
CH2Cl2
Diclorometano
BHA
Butil-hiroxi-anisol
BHT
Butil-hidroxi-tolueno
DPPH
2,2-difenil-1-pricilhidracilo
ECV
Enfermedades Cardio Vasculares
ELN
Extracto libre de Nitrgeno
ERO
Especies Reactivas de Oxgeno
EtOH
Etanol
IR
Espectroscopia de infrarrojo
H2O
Agua
MEtOH
Metanol
TIH
Trombocitopenia inducida por heparina
TLC
Cromatografa en placa fina, del ingls: Thin Layer Cromatography.
TTPA
Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada
TP
Tiempo de Protrombina
PS
Polisacridos sulfatados
IV
GLOSARIO
Absorbancia
Medida de la fraccin de luz que es absorbida por una

muestra.
Aerocistos
Estructuras vegetativas que contienen gas nitrgeno y

contribuyen a la flotacin del alga.
Antibacteriano
Qumicos que ayudan a eliminar bacterias patgenas para los

organismo.
Anticoagulante
Sustancia que prolonga el tiempo de coagulacin de la sangre.
Antioxidante
Cualquier sustancia, ya sea sinttica o natural, que al

encontrarse concentraciones menores en relacin a las del
sustrato oxidable retrasar o inhibir de manera significativa la
oxidacin de ste.
Ciningeno
Protena plasmtica que existe normalmente en el plasma.
Estipe
Eje principal cilndrico y ramificado que le proporciona

flexibilidad y rigidez al talo.
Espectroscopia
Tcnica analtica experimental que se basa en detectar la

absorcin de la radiacin electromagntica, y relacionarla con
los niveles de energa implicados en la transicin cuntica
Extrnseca
Va dependiente del factor tisular (FT).
Filoides
Estructuras fotosintticas con apariencia de hojas.
Hemodilisis
Paso de la sangre a travs de membranas semipermeables

para liberarla de productos nocivos de bajo peso molecular,
como la urea.
Hemostasia
Fenmeno fisiolgico que detiene el sangrado.
Hirudina
Polipptido de 65 residuos aislado de las glndulas salivales

de las sanguijuelas. Es un inhibidor especfico de la trombina.
Intrnseca
La va intrnseca recibi este nombre debido a que todos los

componentes necesarios se encontraban presentes en la
sangre.
Precalicrena
Protena plasmtica precursora de la calicrena, enzima que a

su vez activa el factor FXII, su ausencia en plasma produce
anormalidades en la formacin de tromboplastina y en la
generacin de cinina.
Radicales libres
tomos o
molculas con
un
electrn impar
que
es
extremadamente reactivo y capaz de participar en cadenas de

reaccin rpida que desestabilizan otras molculas y generan
la formacin de muchos otros radicales libres.
Sujetador
Parte del talo que sirve para el anclaje del mismo al sustrato.
Zimgenos
Precursores enzimticos. Durante las diferentes etapas de la

coagulacin se convierten de pro-enzimas a enzimas activas.
Trombocitopenia
inducida por
heparina (TIH)
Trombosis inducidas por el uso de heparina.
VI
I. INTRODUCCIN
Sargassum C. Agardh es un gnero de algas caf (Phaeophyceae) que cuenta
con al menos 335 especies aceptadas taxonmicamente (Guiry y Guiry, 2013), lo
que lo convierte en el ms abundante dentro del orden de los Fucales (Rindi et al.,
2012). ste gnero se extiende a lo largo de casi todos los ocanos del mundo,
por lo que incluye especies tropicales, subtropicales y templadas, las cuales
suelen formar densos bosques submarinos, constituyendo as un hbitat clave en
el suministro y refugio de muchas especies (Surez Castillo et al., 2013). En el
Golfo de California, son consideradas de gran importancia por su alta dominancia
en biomasa, as como por su capacidad para la sntesis de metabolitos
secundarios, entre los que
destacan los terpenoides, florotaninos, polifenoles,
hidrocarburos voltiles, polisacridos sulfatados y productos de origen biogentico

mixto. Lo anterior, les proporciona una composicin qumica nica y las convierte
en un recurso altamente cultivable de potencial uso como fertilizante, forraje,
suplemento alimenticio o
materia prima para la obtencin de ficocoloides y
compuestos de inters farmacutico (Mascheck y Baker, 2008; Echeverra et

al.,2009).
Existen 5 especies de Sargassum conformando los bosques submarinos del Golfo
de California: S. johnstonii, S. herporhizum, S. sinicola,
lapazeanum
S. horridum y S.
(Surez Castillo et al., 2013), siendo la gran mayora de stas
estudiadas para el anlisis de su composicin qumica. No obstante, an no se

cuenta con ningn registro de actividad biolgica para S. lapazeanum, un alga
endmica del Golfo que podra representar un recurso de potencial explotacin
para la zona (Andrade-sorcia, 2008). Por lo anterior, se seleccion el alga
Sargassum lapazeanum (Anexo I) para el anlisis de su actividad biolgica como
fuente de compuestos antibacterianos, antioxidantes y anticoagulantes.
II.
ANTECEDENTES
Fue a principios de 1960 que los investigadores comenzaron a concentrarse en los

ocanos como un novedoso e inexplorado recurso con gran potencial para la
obtencin de compuestos bioactivos. Como resultado de esto, ms de 10,000
metabolitos marinos se han aislado y caracterizado a lo largo de las ltimas cinco
dcadas, demostrando tener diferentes tipos de actividad biolgica (Attaway y
Zaborsky 1993). Actualmente son muchos los organismos marinos a partir de los
cuales se han aislado e identificado compuestos con actividad biolgica, sin
embargo de entre todos destacan las macroalgas por su capacidad para la
sntesis de metabolitos secundarios (Mascheck y Baker, 2008).
La biotecnologa con macroalgas comenz a desarrollarse a mitad del siglo
pasado, sin embargo en Mxico no ha avanzado lo suficiente, pues representa el
estudio de una comunidad compleja, de alta diversidad biolgica en la que an
hace falta una mayor dedicacin de esfuerzos e inversin econmica (ZertucheGonzlez, 1993). Es probable que lo anterior sea la razn por la cual la mayora
de los trabajos realizados con macroalgas en el Pas se enfocan principalmente en
su ecologa, diversidad, variaciones espacio-temporales, su aprovechamiento
como bioindicadores, as como su caracterizacin y descripcin taxonmica (ej:
Calva et al., 2008; Mateo-Cid et al., 2013; Saad y Riosmena, 2005), siendo an
ms escasos los trabajos para la obtencin de compuestos bioactivos a partir de
stas. Esto tambin pudiera deberse a la necesidad de conocer y clasificar
adecuadamente los organismos con los que trabajamos,
ya que nos permite
reconocer con mayor exactitud la procedencia del compuesto aislado, as como

comprender parte del ciclo de vida y la ecologa qumica de los organismos
estudiados.
Por su parte, las algas caf (Phaeophyceae) han sido altamente estudiadas
debido a que producen una amplia variedad de metabolitos secundarios.
Actualmente se han reportado al menos 1,140 compuestos qumicos obtenidos a
partir esta clase de algas, los cuales ofrecen un amplio espectro de actividades
farmacolgicas tales como: antimicrobiana, antioxidante, o anticoagulante

(Mascheck y Baker, 2008; Echeverra et al.,2009). No obstante, al menos un tercio
de lo que se conoce de la qumica de stas algas proviene tan slo del estudio del
gnero Dictyota, mientras el resto corresponde a estudios en su mayora con el
gnero Cystoseira, Padina y Sargassum (Mascheck y Baker, 2008).
En ese sentido, los estudios realizados con Sargassum lapazeanum son muy
escasos (Tabla I), estos comienzan con su descubrimiento en 1924 (Setchell, W.A.
& Gardner, 1924). y han mejorado conforme el avance de la tecnologa con
estudios de biogeografa (Phillips, 1995), dinmica poblacional (Rivera y Scrosati,
2006), taxonoma (Norris, 2010; Andrade-Sorcia et al. 2008) y capacidad de
bioadsorcin de cadmio (Patrn-Prado et al., 2011), hasta un replanteamiento
actual de su sistemtica (Andrade-Sorcia et al., 2013). Cabe destacar que a pesar
de los avances tecnolgicos, no se ha reportado an ningn estudio sobre la
actividad biolgica de sta alga, no obstante, existen referencias bibliogrficas que
demuestran la actividad biolgica de algas pertenecientes al gnero Sargassum, lo
que hacen del presente estudio un trabajo novedoso que contribuir al desarrollo
del conocimiento sobre la qumica en las algas pertenecientes a ste gnero.
1. Potencial de las algas como agentes antibacterianos.
La mayora de los antibiticos que se utilizan en la actualidad son de origen

terrestre, por lo que el anlisis se ha enfocado mayoritariamente a este ambiente,
lo que sugiere que la probabilidad de encontrar nuevos compuestos antibiticos a
partir de ambientes distintos como el mar es mucho mayor (Song et al., 2011).
Algunos estudios indican que el potencial antibacteriano de las algas se debe a su
capacidad para la sntesis de diterpenos en plantas chlorophytas, terpenos
halogenados en rodophytas y metabolitos mixtos de origen terpeno-aromtico en
las algas phaeophytas (Magallanes et al. 2003).
Ao
Tabla I. Estudios realizados con el alga Sargassum lapazeanum.

Autor
Tipo de estudio
1924 Setchell, W.A. & Gardner
Taxonoma
1955 Phillips, N.
Biogeografa
2006 Rivera, M. & Scrosati
Dinmica Poblacional
2008
2008
2010
2011
2013
1.1.
Andrade-sorcia, G., Riosmena-Rodrguez, R., & PalChvez, L.

Rivera, M. & Scrosati, R.. Journal of Phycology 44(1):
45-49.
Norris, J.N. Smithsonian Contributions to Botany 94: i-x,
1-276.
Taxonoma
Dinmica Poblacional
Taxonoma
Patrn-Prado M., Casas-Valdez M., Serviere-Zaragoza

E., Zenteno-Savn T., Lluch-Cota D. B. y L. MndesBiotecnologa
Rodrguez. Water Air Soil Pollution. 221:137 144.
Andrade-sorcia, G., Riosmena-Rodrguez, R., Lee K.M,
Boo G.H., Muniz-Salazar R., Lopez Vivas J. M., G.
Gonzlez-Barba & S.M. Boo.
Biologa Molecular
Antibacterianos y su clasificacin.
Los agentes antibacterianos son qumicos que ayudan a eliminar bacterias

patgenas para el paciente que los consume (Sussman y Bates, 2007). De
acuerdo a Goering et al. (2012), existen al menos tres modos de clasificar a los
agentes antibacteriales, uno es por el efecto que tienen sobre las bacterias
(bactericidas y bacteriostticos). Si el agente antibacteriano elimina las bacterias,
entonces se denomina bactericida y es un proceso irreversible. En cambio, los
agentes bacteriostticos producen un efecto reversible, slo previenen el
crecimiento de la poblacin bacteriana. Otro modo de clasificacin consiste en
identificar su sitio de accin, es decir en qu parte de la clula acta, ya sea la
sntesis de la pared celular, de protenas, de cidos nucleicos, en rutas
metablicas o sobre las funciones de la membrana celular. Finalmente, tambin
pueden clasificarse en base a su estructura qumica, sin embargo no suele ser una
clasificacin prctica debido a la diversidad de estructuras observadas en ste tipo
4
de compuestos. No obstante el presente estudio se limita a realizar el anlisis de

la actividad antibacteriana de los extractos analizados y con ello elucidar el posible
potencial de estos contra ciertas bacterias marinas como terrestres.
1.2.
El gnero Sargassum como fuente de compuestos con actividad

antibacteriana
Son muchos los estudios que demuestran el potencial antibacteriano de algas

phaeophytas, entre los que destacan estudios con especies pertenecientes al
gnero Sargassum, como lo son S. tenerrimum (Kumar et al., 2013), S. boveanum
(Khan y Qari, 2012), S. oligocystum (Tajbakhsh et al. 2012), S. latifolium
(Dashtiannasab et al. 2012) y S. wightii (Vijayabaskar y Shiyamala, 2011). No
obstante, son pocos los compuestos antibacterianos que se han logrado aislar y
caracterizar a partir de este gnero de algas, destacando el dioctil ftalato (Figura
1) (Sastry y Rao, 1995) y
el sulfoglicerolpido 1-0 palmitoil-3-0 (6-sulfo--
quinovopiranosil)-glicerol (Arunkumar et al., 2005), ambos obtenidos a partir del

alga Sargassum wightii. Cabe destacar que esta alga presenta un gran potencial
en este campo, ya que trabajos como los de Vijayabaskar y Shiyamala (2011) han
demostrado que los polifenoles aislados de S. wightii son activos contra al menos
9 patgenos diferentes, pudiendo inhibir cepas de Escherichia coli y Aeromonas
hydrophila, unas de las bacterias ms patgenas para el hombre.
Figura 1. Estructura qumica del dioctil ftalato.
En Mxico se ha estudiado el potencial antibacteriano de algas del gnero

Sargassum tales como S. cymosum, S. filipendula y S. vulgare en el Golfo de
Mxico y el Caribe Mexicano (Lara-Issasi et al., 1999), S. liebmani en las costas
5
de Oaxaca (Lara-Issasi et al., 1995) y S. filipndula en las costas de Yucatn

(Freile-Pelegrn y Morales, 2004). No obstante la mayora de los extractos
obtenidos a partir de estas algas mostraron un bajo potencial antibacteriano contra
cepas de Staphylococcus aeureus, Shygella sonnei, Streptococcus pyogenes,
Streptococcus faecalis y Micrococcus luteus, ya que slo dos algas mostraron
actividad significativa: Sargassum liebmani contra cepas de S. aeureus (LaraIssasi et al., 1999)
y S. pyogenes (Lara-Issasi et al., 1995) y Sargassum
filipndula contra cepas de S. aureus (Lara-Issasi et al., 1999), y Bacillus subtilis

(Freile-Pelegrn y Morales, 2004).
Finalmente, cabe destacar que los trabajos
realizados con algas del gnero Sargassum en la zona del Golfo de California en
Mxico son escasos y slo estudian las especies S. horridum y S. sinicola, la
primera de ellas activa contra Mycobacterium tuberculosis (Pardo-Fuentes, 2012),
S. aureus y S. pyogenes (Muoz-Ochoa, 2010), mientras que la segunda contra
Pseudomona aeruginosa, S. aureus y B. subtilis (Castro-Reyes, 1997).
2. Anlisis del potencial antioxidante
2.1. Radical Libre DPPH.
La molcula 2,2 Difenil-1-Picrilhidracilo, tambin conocida como DPPH (Figura 2),

es un radical libre estable que se caracteriza por la deslocalizacin de un electrn
libre. Dicha deslocalizacin provee a la molcula de cierta estabilidad, lo que
provoca que esta no se dimerice como es el caso de la mayora de los otros
radicales libres. Esta caracterstica tambin da lugar al color violeta oscuro del
DPPH, sin embargo, cuando una solucin de este se mezcla con una sustancia
capaz de donar un tomo de hidrgeno, el DPPH se reduce (Figura 3) y suele
presentar una coloracin amarillo plido debido al grupo picril que an se
encuentra presente (Molyneux, 2004). De esta manera, los ensayos realizados
con DPPH, se basan en el cambio de coloracin de la molcula, monitorizando la
disminucin de la absorbancia en funcin de la capacidad antioxidante de los
extractos a diferentes concentraciones y a un tiempo fijo (Mendiola-Len, 2008)
Figura 2. Difenilpicrilhidracilo (radical libre)
Figura 3.Difenilpicrilhidracina
2.2. Algas del gnero Sargassum como fuente de compuestos antioxidantes

Las algas marinas, al igual que todos los organismos fotosintticos, se encuentran
expuestas a diferentes combinaciones de luz y altas concentraciones de oxgeno
que conllevan a la formacin de radicales libres y otros agentes oxidantes. Los
cidos grasos poliinsaturados son componentes estructurales de la membrana
tilacoide, esto hace que los elementos de los aparatos fotosintticos se encuentren
vulnerables al dao fotodinmico. No obstante, la ausencia de este tipo de dao
en las algas, indica que las clulas de sus aparatos fotosintticos cuentan con
diferentes mecanismos y compuestos antioxidantes protectores, entre los que
destacan compuestos terpenoides, especialmente de tipo sesquiterpeno y
diterpeno, de los cuales muchos contienen grupos bromofenol (Echeverra et al.,
2009; Vadlapudi, 2012).
Las algas pardas son reconocidas por la produccin de una amplia variedad de
metabolitos secundarios, todos ellos con una amplia gama de actividades
farmacolgicas, de entre las que destaca su actividad antioxidante (Echeverra et
al., 2009). Un ejemplo de stos compuestos activos es el sargothunbergol A
(Figura 4A) un nuevo cromeno obtenido por Seo et al. en el 2007 a partir del alga
Sargassum thunbergii. El sargothunbergol A, los tetrapreniltoluquinoles (Figura 4B
y 4C), y los monogalactosil-diacilgliceroles (Figura 4D y Figura 4E) aislados de
sta misma alga (Seo et al., 2006; Kim et al., 2007), funcionan como eliminador de
7
radicales libres por el ensayo de DPPH. Asimismo se han aislado diferentes

cidos grasos, polifenoles y florotaninos a partir de especies pertenecientes a ste
gnero, como lo son S. kjellamanianum y S. siiquastrum (Vadlapudi, 2012).
Figura 4. Estructura de algunos compuestos qumicos aislados a partir de especies del

gnero Sargassum: A) sargothunbergol-A, B y C) Tetrapreniltoluquinoles, D Y E)
monogalactosil-diacilgliceroles.
8
Aunque son pocos los compuestos antioxidantes ya aislados, identificados y

caracterizados obtenidos a partir de algas marinas, existen muchos estudios
dedicados al anlisis de sta actividad, destacando en Mxico los trabajos
realizados por Zubia et al. en el 2007, quienes estudiaron la actividad antioxidante
en macroalgas marinas tropicales de la pennsula de Yucatn, Mxico, analizando
con ello dos especies de Sargassum, S. pteropleuron y S. ramifolium.
3. Anlisis del potencial anticoagulante en algas.
3.1.
Polisacridos sulfatados: Fucoidan y actividad anticoagulante de

Phaeophytas.
Los polisacridos sulfatados (PS)
constituyen una clase de macromolculas
biolgicas con estructuras diversas en la que algunas unidades de monosacridos

cuentan con grupos semister sulfatado (Stewart, 1974). Estos se encuentran en
la pared celular y algunas regiones intercelulares de los organismos, por lo que es
posible aislarlos a partir de
fuentes naturales como
los tejidos de animales,
plantas superiores, invertebrados marinos, cianobacterias y algas marinas

(Senthilkumar et al., 2013). Entre las propiedades ms estudiadas de los
polisacridos sulfatados estn la actividad anticoagulante y antitrombtica. Autores
como Matsubara (2004) han reportado que algunas algas presentan PS con
actividad moduladora de la coagulacin sangunea, por lo que su estudio
representa una alternativa para el desarrollo de frmacos anticoagulantes ms
seguros.
Cada divisin de algas sintetiza su propio tipo caracterstico de polisacridos, no
obstante, existen variaciones importantes en la estructura, composicin y
secuencia monomrica, peso molecular, configuracin anomrica, posicin del
enlace glucosdico y densidad de cargas, entre cada grupo. Estas diferencias
estructurales dependen en gran medida del entorno y la presin ambiental a la que
estos organismos se encuentran sometidos, ya que le confieren a los polisacridos
sulfatados distintas propiedades fisicoqumicas responsables de los diferentes
tipos de actividad biolgica que son la base de sus aplicaciones en medicina y
9
farmacologa. De esta manera las plantas marinas del filo Rodophyceae suelen
distinguirse por la produccin de agar, carragenanos, galactanos, xilanos y
porphyran, mientras que las Chlorophytas por presentar estructuras complejas
como los arabinanos sulfatados, galactoarabinoxilanos, galactanos sulfatados y el
ulvan (Stewart, 1974; Muoz, 2006).
Por su parte las Ochrophytas del orden Phaeophyceae (tambin conocidas como
algas pardas), se caracterizan por la produccin de cido algnico, laminaran (1,3 glucano), sargassan y principalmente fucanos o fucoidan. Son muchos los
estudios que demuestran la presencia de polisacridos sulfatados con actividad
anticoagulante extrados a partir de ste orden de algas (Athukorala et al., 2007;
Gupta y Abu-Ghannam, 2011; Jiao et al., 2011; Garca-Ros et al., 2012),
destacando el anlisis del fucoidan. ste ltimo (Figura 5) es un heteropolisacrido
de L-fucosa sulfatada que se encuentra en la pared celular o matriz extracelular de
las phaeophytas pudiendo alcanzar hasta el 40% de su peso seco (Hold y Kraan,
2011). No obstante tambin se han aislado fucoidanos similares a partir de
invertebrados marinos como medusas, huevos de erizos marinos y pepinos de
mar (Cumashi et al., 2007).
Figura 5. Estructura qumica promedio del fucoidan
El trmino fucoidan, se utiliza para definir a una familia de polisacridos

sulfatados
de
peso
molecular
altamente
variable.
Estn
compuestos
principalmente de L-fucosa, sulfato y cidos urnicos, con menor contenido de

otros azcares como xilosa, galactosa, arabinosa, manosa, glucosa e incluso en
10
ocasiones puede llegar a contener protenas. No obstante, a pesar de los estudios

sobre su composicin y estructura qumica, an no ha sido posible definirle
completamente. Esto se debe a que tanto su heterogeneidad y complejidad
estructural se encuentran condicionadas no slo a diferencias entre las especies,
sino tambin entre partes de un mismo organismo, por las variaciones
estacionales, las condiciones climticas locales e incluso por el mtodo de
extraccin empleado (Garca-Ros et al., 2012). Por lo anterior, cada que se
describe un nuevo fucoidan, se le considera como un compuesto nico en cuanto
a sus caractersticas estructurales y composicin qumica, siendo posible tambin
observar variaciones en la actividad biolgica (Gmez-Ordez, 2012).
Ya que existe una correlacin entre el nmero y la posicin de los grupos sulfato
con la actividad biolgica de los fucoidanos, es importante el anlisis de su
estructura. Este anlisis se realiza en el laboratorio por medio de espectroscopa
de infrarrojo, lo que permite determinar la posicin de los grupos sulfato en los
polisacridos, as como la diferenciacin de bandas caractersticas de sulfatos en
posicin axial o ecuatorial dentro de la molcula (Li et al., 2008; Garca-Ros et al.,
2012).
De acuerdo a Shanmugam y Mody, para el ao 2000 se haban registrado una
mayor cantidad de estudios de actividad anticoagulante en las algas phaeophytas
con ms de 60
especies reportadas, en comparacin con las rodophytas y
clorofhytas de las que slo se tena registro de 40 y 10 especies respectivamente.

En Mxico los estudios de la actividad anticoagulante son escasos en
comparacin a los realizados en lugares como Europa, Asia y Estados Unidos. A
pesar de ello,
se encontraron ms referencias de estudios sobre actividad
anticoagulante realizados con algas pertenecientes al gnero Sargassum en

Mxico que en otras partes del mundo (Tabla II). No obstante cabe sealar que
todos los trabajos consistan nicamente en el registro de actividad.
11
Tabla II. Listado de algunas especies del gnero Sargassum que han
presentado actividad anticoagulante.
Especie
rea de estudio
Sargassum cinctum
Sargassum fulvellum
Sargassum horneri
Sargassum coreanum
Sargassum siliquastrum
Sargassum thunbergii
Sargassum stenophyllum
Sargassum hystrix
India
Isla Jeju, Korea
Isla Jeju, Korea
Isla Jeju, Korea
Isla Jeju, Korea
Isla Jeju, Korea
Suramrica
Golfo de Mxico
Sargassum cymosum
Sargassum filipendula
Sargassum pteropleuron
Sargassum vulgare
Sargassum horridum
3.2.
Referencia bibliogrfica
Shanmugam y Mody, 2000

De Zoysa et al., 2008
Athukorala et al., 2007
Duarte et al., 2001
Lara-Issasi
y
lvarezHernndez, 1994
Golfo de Mxico
Lara-Issasi
y
Golfo de Mxico
Lara-Issasi
y
Golfo de Mxico
Lara-Issasi
y
Golfo de Mxico
Lara-Issasi
y
Golfo de California, Muoz-Ochoa, 2006
Mxico
Mecanismo de coagulacin sangunea.
En 1904 Morawitz descubri que los tejidos vasculares liberan una tromboplastina
tisular (Factor III, o Factor Tisular) necesaria para que se inicie el proceso de
coagulacin y propuso los cuatro componentes principales para la coagulacin en
plasma: Protrombina, fibringeno, calcio y tromboplastina, ideas que prevalecen
en la actualidad (Martnez-Murillo, 2003).
Los estudios realizados para la determinacin de la actividad anticoagulante se
han desarrollado conforme los avances en la investigacin hemosttica, de
manera que actualmente se cuenta con un mejor entendimiento de los diferentes
procesos fisiolgicos y bioqumicos que dan lugar a la coagulacin, descrita en la
dcada de los 60 como un proceso enzimtico en cascada, mejor conocido
actualmente como cascada de coagulacin (Figura 6), la cual consta de una
12
serie de cambios bioqumicos y enzimticos modulados por diferentes factores y

zimgenos que participan en las diferentes etapas del mecanismo de coagulacin
para la formacin de trombina. La trombina obtenida, acta sobre el fibringeno
liberando fibrina que es el material cementante que genera una red o cogulo
que refuerza el tapn hemosttico plaquetario, dando lugar a la coagulacin
(Rosenberg y Rosenberg, 1984; Martnez-Murillo, 2003).
Los zimgenos que participan en la coagulacin reciben el nombre de cofactores
y son los encargados activar las protenas plasmticas denominadas factores de
coagulacin. Estos ltimos se identifican con nmeros romanos de acuerdo al
orden en que fueron descubiertos, adems se les aade el sufijo a despus del
nmero romano para indicar la forma activa del factor (Martnez-Murillo, 2003). En
la Tabla III se puede consultar una lista de los diferentes cofactores y factores de
coagulacin, as como sus respectivas funciones.
Figura 6. Diagrama que muestra la cascada de coagulacin (Martnez-Murillo, 2003).

13
Tabla III. Nombre y funcin de los diferentes factores y cofactores que actan en
las diferentes etapas de la cascada de coagulacin
Factores y
cofactores
Sinnimo
Funcin
FI
FII
FT (FIII)
Fibringeno
Protrombina
Factor tisular o Tromboplastina
FIV
FV
Ca2+
Proacelerina o factor lbil
FVI
FVII
FVIII
-Autoprotrombina
Factor antihemoflico
FIX
FX
FXI
FXII
FXIII
Globulina antihemoflica
Factor de Stuart-Prower
Antecedente tromboplstico del plasma
Factor de Hageman
protransglutamidasa, fibrinasa o
fibrinoligasa
Factor de Fletcher
Precursor de fibrina
Zimgeno de proteasa
Iniciador, cofactor de FVIIa
en activacin de FIX y FX.
Cofactor pro-coagulante
Cofactor de Xa en activacin
de FII
-Zimgeno de proteasa
Cofactor de los factores Ixa
en activacin de X.
Zimgeno de proteasa
Zimgeno de proteasa
Zimgeno de proteasa
Zimgeno de proteasa
Factor estabilizante de la
fibrina
Cofactor
Factor de Fitzgerald-Williams-Flaujeauc
Cofactor
Precalicrena
Ciningeno
de alto peso
molecular
La coagulacin suele ser descrita por dos vas diferentes: intrnseca y extrnseca.
El modelo tradicional de cascada de coagulacin describe ambas vas como vas
independientes para la generacin del factor FXaA. La va intrnseca inicia la
coagulacin cuando existe un dao en el sistema vascular y las superficies
cargadas negativamente interactan con los zimgenos FXII y precalicreina (PK) y
el cofactor denominado ciningeno de alto peso molecular (CAMP) (MartnezMurillo, 2003).
Por lo tanto la auto-activacin del FXII y la PK tienen lugar en el momento en que
la sangre entra en contacto con una superficie artificial como lo son los tubos de
hemodilisis. Esta es la razn por la cual la sangre formar cogulos en una
jeringa que no contenga ningn agente anticoagulante. Cabe destacar que
14
mientras ms negativa sea la carga de la superficie, ms rpida ser la formacin

de cogulos. Se habla de una auto-activacin del FXII y PK ya que stos
zimgenos no son dependientes de calcio por lo que seguirn activndose a pesar
de que exista citratro en el anticoagulante (McMichael, 2012).
Por su parte, la va extrnseca se activa cuando se daa algn tejido diferente al
vascular, provocando la liberacin del factor tisular (FT). El FT inmediatamente se
une al FVIIa en plasma, formndose el complejo FT/FVII, mientras que la
autoconversin cataltica del FVII a FVIIa amplifica la respuesta hemosttica,
generando as ms complejos FT/FVIIa. El complejo FVIIa/FT acta como
iniciador de la coagulacin activando a los factores FIX y FX en una etapa inicial
de activacin. Como resultado de esto se obtienen los factores FIXa y FXa. El
primero es necesario para que exista suficiente produccin de trombina, mientras
que el segundo es requerido en la activacin plaquetaria. El FXa acta activando a
la protrombina en presencia del factor FVa, fosfolpidos y calcio (complejo
protrombinasa). El resultado de esta reaccin es la formulacin de la trombina, la
cual al estar presente en la superficie celular, activa otros procesos enzimticos
como lo son los factores FV, FVIII, FXI y las plaquetas, que a su vez dan como
resultado la formacin de fibrina. Cuando el complejo FT/FVIIa da lugar al factor
FX, se activa un inhibidor de la coagulacin mediante la va de inhibicin del FT
(IVFT), por lo que se requiere de una va alterna para producir cantidades
suficientes de trombina (Martnez-Murillo, 2003). Para explicar esto, actualmente
se cuenta con otros modelos de coagulacin como es el modelo celular, el cual
describe la coagulacin por etapas. Ya que durante la etapa de iniciacin la
trombina producida es escasa por la presencia del factor de inhibicin (IVFT),
mientras que en las fases de amplificacin y propagacin se produce una mayor
cantidad debido a la participacin de los factores FXI, FVIII y FIX (DazConcepcin y Almagro-Vzquez, 2001)
En la actualidad, se sabe que los sistemas intrnseco y extrnseco de la
coagulacin no pueden funcionar de manera independiente uno del otro, ya que
todos los factores de coagulacin se interrelacionan entre s. Adems se ha
15
descubierto que algunos pro-coagulantes son realmente cofactores y no poseen

actividad enzimtica, como es el caso de los cofactores FV y FVIII (MartnezMurillo, 2003; McMichael, 2012).
Por lo anterior, los modelos originales en
cascada han sido subsecuentemente modificados para incluir nuevos conceptos y

observaciones, sin embargo ninguno logra explicar el modelo real de la
coagulacin in vivo. No obstante, el conocimiento actual del mecanismo de
coagulacin sangunea nos permite comprender de mejor manera el inicio de la
coagulacin sin la necesidad de dividir el sistema en vas separadas, sino en una
sola va que inicia con diferentes factores de coagulacin los cuales actan entre
s para realizar de manera adecuada el sistema de coagulacin sangunea
(McMichael, 2012).
3.3.
Evaluacin de la actividad anticoagulante
A pesar de que el modelo de cascada de coagulacin no explique completamente

el sistema de coagulacin sangunea, el esquema sigue siendo til para explicar
las pruebas de laboratorio empleadas para el monitoreo de la hemostasia, o su
prevencin. Siendo sta ltima de importancia particular para el presente trabajo.
Esto se debe a la posibilidad de simular la cascada de coagulacin en condiciones
de laboratorio por medio de dos ensayos: Tiempo de protrombina (TP) para la va
extrnseca y tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) para la intrnseca
(Quintana-Gonzlez, 2002).
El ensayo de TP es sensible a los factores FV, FVII y FX y en menor medida al FII
(Protrombina). El reactivo utilizado en ste ensayo, a menudo denominado
tromboplastina, contiene factor tisular y fosfolpidos. La figura 7 muestra la va que
mide el tiempo de protrombina, sta se basa en las reacciones para generar el
activador del FX, el activador de protrombina, la generacin de trombina y el paso
de fibrgeno a fibrina donde intervienen los factores antes mencionados. El tiempo
normal en plasma humano para este ensayo suele variar dependiendo del reactivo
utilizado y las condiciones en que se realiza el ensayo, no obstante el tiempo para
este ensayo suele encontrase entre los 11 y 14 segundos. En las condiciones de
la mayora de las pruebas de TP, la activacin del factor X es tan potente, que el
16
ensayo no resulta sensible a la deficiencia de los factores IX u VIII (Kitchen et al.,

2010).
Por su parte la prueba de TTPA consiste en un anlisis no especfico de la va
intrnseca. Aunque al utilizarse con otras pruebas resulta eficiente para la
deteccin en la deficiencia de los factores FVIII, FIX, FXI y FXII. Por si sola, sta
prueba puede detectar la presencia de anticoagulantes si el tiempo normal para
plasma humano, que suele oscilar entre los 35 y 45 segundos, se ve prolongado
(Kitchen et al., 2010).
Cabe destacar que ambas pruebas se vern alteradas y los tiempos de
coagulacin prolongados dependiendo no slo de los aumentos o deficiencias en
factores de coagulacin, sino tambin de la presencia de inhibidores de la
coagulacin como lo son los anticoagulantes (Kitchen et al., 2010).
Figura 7. Va afectada por la prueba de tiempo de protrombina. Imagen tomada de

Kitchen et al. 2010.
17
III.
JUSTIFICACIN
Muchos de los tratamientos actuales para los padecimientos trombticos,

infecciosos y crnico degenerativos son muy efectivos, no obstante con el uso
prolongado suelen generar efectos secundarios nocivos para la salud. Un ejemplo
de esto es la heparina, utilizada para el tratamiento de enfermedades trombticas,
que si bien es efectiva, su uso por largos periodos de tiempo puede llegar a causar
problemas de infeccin, as como trombocitopenia, osteoporosis y hemorragias
(Muoz, 2010). Otro ejemplo son los antioxidantes sintticos como el Butil-hiroxianisol (BHA), Butil-hidroxi-tolueno (BHT), -tocoferol y galato de propilo, utilizados
para la reduccin de los daos oxidativos en el cuerpo humano, los cuales pueden
provocar diversos efectos secundarios tales como dao heptico y carcinognesis
(Lee et al. 2010). Adems, el uso indiscriminado, as como la prescripcin
incorrecta de antibiticos han contribuido al problema de la resistencia bacteriana,
que si bien corresponde a un proceso natural, estos factores lo han acelerado,
conduciendo as al uso de tratamientos que son cada vez ms agresivos, de
mayor costo y adems pueden generar peligrosos efectos secundarios como lo
son arritmias, hepatotoxicidad o insuficiencia renal aguda (Granowitz y Brown,
2008; Muoz, 2010).
El dao celular producido por las ERO puede generar una serie de
enfermedades crnico degenerativas, entre las que destacan enfermedades
coronarias, ateroesclerosis, cncer, diabetes mellitus, envejecimiento prematuro y
enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer (Dorado-Martnez et al. 2003;
Li et al. 2007). Este tipo de enfermedades son responsables de la muerte de ms
de 36 millones de personas cada ao (OMS a, 2013), siendo causa de mortalidad
en todas las edades y constituyendo ms de la mitad de la carga mundial de
morbilidad, provocando muchas veces invalidez y deterioro de la vida de las
personas (Castillo-Guzmn et al. 2008). Adems la secretara de Salud (INEGI
2011) declar que estas enfermedades representan uno de los ms importantes
problemas de salud en Mxico, causando la mayor cantidad de muertes al ao
principalmente con padecimientos como enfermedades cardiovasculares (ECV) y
18
diabetes mellitus, siendo las ECV consideradas la principal causa de muerte en

todo el mundo. Se calcula que en 2008 murieron por esta causa 17,3 millones de
personas, lo que representa un 30% del total de muertes registradas en el mundo,
de las cuales 7,3 millones de se debieron a la cardiopata coronaria, y 6,2 millones
a los accidentes vascular cerebral (AVC) los cuales pueden ser ocasionados por
hemorragias de los vasos cerebrales o cogulos de sangre (OMS b, 2013).
Lo anterior ha despertado el inters de los investigadores por la bsqueda de
nuevos compuestos bioactivos de origen natural como una alternativa para el
tratamiento de stos padecimientos. Las algas, al tratarse de organismos
fotoautrficos expuestos a una mayor cantidad de estrs, han desarrollado
sistemas de defensa eficientes, como lo son la sntesis de metabolitos secundarios
protectores (Mascheck y Baker, 2008), lo que las ha convertido en una de las
principales fuentes de compuestos bioactivos con un amplio espectro de
actividades biolgicas de potencial uso en el tratamiento de enfermedades
trombticas, infecciosas y crnico degenerativas. Es por ello que en la actualidad
los estudios dirigidos al aislamiento de nuevos compuestos biolgicamente activos
a partir de macroalgas han incrementado en diferentes partes del mundo (Frikha
et al., 2011).
Utilizando estrategia principal la bsqueda de actividad
y el
fraccionamiento guiado por bioensayo (Murillo-lvarez et al., 2001).

Mxico presenta una gran riqueza y diversidad de macroalgas, a pesar de ello los
estudios de su uso para la obtencin de compuestos activos con actividad
biolgica
an son muy escasos, desaprovechando as la diversidad de este
recurso en el Pas (Zubia, 2007). La pennsula de Baja California cuenta con una
gran variedad de hbitats y condiciones climticas, por lo que alberga una enorme
riqueza de algas marinas (Surez Castillo et al., 2013), destacando la presencia
de los algas pertenecientes al gnero Sargassum debido a la alta dominancia en
biomasa. No obstante, de las 5 especies de Sargassum que se encuentran
conformando los bosques submarinos del Golfo de California, slo S. horridum y
S. sinicola cuentan con registros de estudios para el anlisis de su actividad
biolgica. Por lo anterior, impulsados por la falta de documentacin sobre las
19
propiedades qumicas de S. lapazeanum, se seleccion la especie para el estudio

de
su
actividad
biolgica como
fuente de
compuestos antibacterianos,
antioxidantes y anticoagulantes. stos estudios no slo son esenciales para el

entendimiento de la forma de vida del organismo y su interaccin con el medio
(Amsler, 2008), sino que tambin contribuyen al conocimiento de las algas
pertenecientes al gnero Sargassum y el futuro desarrollo de nuevos frmacos o
productos funcionales como cosmticos y suplementos alimenticios a partir de las
mismas (Querellou et al., 2010).
20
IV. OBJETIVOS
1. Objetivo general
Evaluar el potencial de Sargassum lapazeanum como fuente de compuestos con
actividad antioxidante, antibacteriana y anticoagulante.
2. Objetivos particulares
1) Obtener y fraccionar
el extracto por medio de distintas tcnicas
cromatogrficas.
2) Evaluar la actividad antibacteriana por medio del mtodo de difusin en
agar con discos.
3) Evaluar la actividad antioxidante, utilizando el radical libre estable 2,2difenil-1-picrilhidracilo (DPPH).
4) Obtener el fucoidan y evaluar su la actividad anticoagulante por medio de
los ensayos de tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina
parcial activada (TTPA)
21
V. MATERIAL Y MTODOS
1. Recoleccin e identificacin taxonmica.
El alga Sargassum lapazeanum se recolect manualmente a una profundidad
mxima de un metro, en la zona intermareal de San Juan de la Costa (La Paz,
B.C.S) (Figura 8). Posteriormente fue lavada con agua corriente para eliminar los
epfitos y restos de sedimento presentes, y se dej secar al sol para facilitar su
maceracin y tamizado.
La identificacin taxonmica se realiz en el laboratorio de botnica marina de la
Universidad Autnoma de Baja California Sur, con el apoyo de la Dra. Gabriela
Andrade Sorcia.
Figura 8. Mapa que muestra la zona de recolecta del alga S. lapazeanum en San Juan de
la Costa, Baha de La Paz B.C.S, Mxico. Modificado a partir de NOAA.
http://www.ngdc.noaa.gov/mgg/shorelines/shorelines.html.
22
2.
Anlisis proximal del alga S. lapazeanum.
El anlisis proximal del alga se realiz por medio de servicio externo, determinando el
porcentaje de humedad por diferencia de peso, calentando a 105C durante 4 hrs y el de
cenizas por diferencia de peso y calcinacin a 600C durante 5 hrs. Para la determinacin
de protenas se utiliz el mtodo de Dumas (equipo LECO FP528), mientras que el
clculo del extracto etreo se realiz por el mtodo Soxtec-Avanti 2050 (TECATOR) y el
contenido de fibra cruda por medio de hidrlisis sucesiva (cido/base). Finalmente el
extracto libre de Nitrgeno (ELN) y la energa (cal/g) se calcularon utilizando un
calormetro.
3. Obtencin del extracto

3.1.
Obtencin del extracto etanlico
Se maceraron trescientos gramos del alga previamente seca y molida con EtOH
100 %, realizando recambios cada tercer da durante dos semanas. La mezcla se
separ por filtracin y la solucin obtenida fue concentrada a sequedad a 40 C y
presin reducida en un rotavapor Yamato. Finalmente el extracto crudo (12-009EC) resultante, fue sometido a un fraccionamiento slido-lquido (Figura 9).
3.2 Obtencin del extracto acuoso: Fucoidan
Para la extraccin del fucoidan se pesaron 100 g del alga previamente seca y
molida, a los cuales se les agreg 600mL de agua destilada y se dej en bao
Mara con agitacin continua durante 2 hrs a una temperatura constante de 55C,
Posteriormente se removi el tejido algal por medio de filtracin simple,
obteniendo 500 mL de solucin la cual fue centrifugada durante media hora. El
centrifugado fue recuperado por decantacin y precipitado con 40 mL de una
solucin de Cl2Ca al 10% previamente preparada, con el fin de
remover el
alginato disuelto, el cual fue removido por centrifugacin a 1770 x g durante 30

minutos. La solucin clarificada (400 mL) se precipit con tres volmenes de EtOH
(1200 mL). El precipitado final se recuper por centrifugacin, se dej secar en
una estufa elctrica a 50C durante un da y se etiquet como 12-009-FC (Figura
10).
23
4. Fraccionamiento
4.1 Fraccionamiento por gradiente de polaridad.
Se fraccionaron quince gramos del extracto crudo en una columna cromatogrfica
empacada con slica gel fase normal, eluyendo la columna con un gradiente de
polaridad compuesto por CH2Cl2 100, CH2Cl2 - EtOH 90:10, CH2Cl2 - EtOH 25:75,
CH2Cl2 - EtOH 50:50, EtOH 100, EtOH:H2O 50:50 y H2O 100%. Los eluatos se
compararon analizando la similitud por medio de cromatografa en capa fina
(Anexo III) y se concentraron en siete fracciones de la 1-7 respectivamente (Figura
9).
Figura 9. Obtencin del extracto crudo (EC) y fraccionamiento del alga S. lapazeanum.
24
Figura 10. Esquema que muestra el proceso de obtencin y fraccionamiento del fucoidan.
25
4.2.
Fraccionamiento de F2 en columna cromatogrfica.
La fraccin ms activa en los ensayos de actividad se seleccion para un segundo

fraccionamiento en columna cromatogrfica con slica gel en diclorometano
(Figura 9). Para ello se utiliz una relacin 1:60 de muestra-slica, es decir 600 mg
de la fraccin ms activa se disolvieron en diclorometano para ser adsorbido en
36g de slica gel, utilizando como eluyente una fase mvil en gradiente de
polaridad creciente con los siguientes sistemas: CH2Cl2 100%, CH2Cl2:MEtOH
95:5, CH2Cl2:MEtOH 90:10,
CH2Cl2:MEtOH 80:20, CH2Cl2:,EtOH 70:30,
CH2Cl2:MEtOH 50:50, EtOH 100% y H2O 100%.

4.3.
Purificacin parcial del fucoidan.
La purificacin parcial del
fucoidan (FC) obtenido se realiz por medio de
precipitacin fraccionada con 3 volmenes de etanol, recuperando el precipitado

entre adicin y adicin por medio de centrifugacin. Los slidos obtenidos en cada
precipitacin se secaron en estufa elctrica a 55C y se almacenaron para el
posterior anlisis de su actividad biolgica (Figura 10).
5. Pruebas de Actividad Biolgica.
Tanto el extracto etanlico crudo como sus fracciones fueron sometidas a los
ensayos de actividad antibacteriana por el mtodo de difusin con discos y al
ensayo de actividad secuestrante de radicales libres
utilizando el mtodo del
radical libre estable 2,2-difenil-1-pricilhidracilo (DPPH).

5.1.
Evaluacin de la actividad secuestrante de radicales libres (DPPH):

Ensayo de actividad antioxidante.
Se evalu la actividad secuestrante de radicales libres del extracto crudo, as

como de las fracciones, utilizando el radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo
(DPPH) por medio de dos mtodos:1) Bioautogrfico y 2) Colorimtrico
26
Mtodo bioautogrfico
Para este ensayo se sigui la metodologa descrita por Choi et al. (1994), que
consiste en un anlisis cromatogrfico de placa fina (TLC), depositando 10 l de
una solucin de cada uno de las fracciones a evaluar sobre una placa de slica gel
fase normal, la cual se desarroll en una cmara de saturacin utilizando una
solucin
de
diclorometano-metanol
una
relacin
9:1
como
eluyente.
Posteriormente se dej secar la placa y se roci de manera uniforme con una

solucin metanolica de DPPH al 0.4 %. La placa cromatogrfica se dej reposar
en oscuridad durante 30 min. y despus de este tiempo se registraron las zonas
decoloradas sobre la placa como indicativos de la actividad secuestrante.
Mtodo colorimtrico
Para los ensayos de colorimetra se utiliz una solucin de DPPH al 0.02 % en
metanol. Se prepararon las fracciones por duplicado en una solucin con etanol a
concentraciones de 400, 200, 100, 50 y 25 g mL -1, agregando 4 mL de la solucin
de DPPH. Adems se prepar un blanco con el que se obtuvo el factor de
correccin del color. Una vez hecho esto se dejaron en oscuridad durante media
hora y posteriormente se realizaron las lecturas en un espectrofotmetro Milton
Roy Company SPECTRONIC 20D a una longitud de onda de 517nm. A partir de
estos valores se obtuvieron curvas dosis-efecto graficando el porcentaje de
reduccin del DPPH en relacin a la concentracin de extracto utilizado. Este
porcentaje se obtuvo con la siguiente frmula:
AB: Absorbancia del Blanco

AM: Absorbancia de la muestra corregida (AM= A-FC)
A= Absorbancia
FC= Factor de correccin de color.
27
Adems se calcul la concentracin efectiva media (EC50) mediante la ecuacin

de la recta obtenida en las curvas dosis-efecto realizadas para cada uno de los
extractos, utilizando cido ascrbico como estndar de referencia.
5.2.
Evaluacin de la actividad antibacteriana por medio del mtodo de

difusin en agar con discos.
La actividad antibacteriana fue evaluada por el mtodo de difusin en agar con

discos Kirby-bauer (Jorgensen y Turnidge, 2007) contra 3 bacterias terrestres y 2
marinas. En base a lo anterior, se prepararon pequeos discos de papel filtro
Whatman No.4 de 6.4 mm impregnados con 2mg de las fracciones a probar. Una
vez impregnados los discos, estos se colocaron sobre la superficie de placas de
agar Mueller-Hinton (Bioxon) preparadas con [NaCl 25%] y sin sal, las cuales
fueron previamente inoculadas con una suspensin de los microorganismos de
prueba: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Vibrio harveyi y
Vibrio parahaemoliticus, a una concentracin de 1x10-8 clulas mL-1.
Para la inoculacin se utiliz el mtodo de siembra por estras, realizando dos
replicas para cada extracto. Las placas se incubaron a una temperatura de 37C
durante 24 h y al trmino de la incubacin se midi el halo de inhibicin y se
registr el resultado en una tabla (Tabla VI). En base a los resultados obtenidos
de este ensayo, se repiti el mismo proceso para las fracciones obtenidas a partir
de la fraccin F2, las cuales slo se probaron contra las cepas de bacterias del
gnero Vibrio previamente analizadas (Tabla VII).
5.3.
Anlisis de la actividad Anticoagulante
La actividad anticoagulante del fucoidan, se evalu por medio de los ensayos de

tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA),
utilizando plasma sanguneo obtenido de humanos sanos, siguiendo las
instrucciones del fabricante. Todos los extractos fueron ensayados por duplicado.
La sangre utilizada en ambas pruebas se obtuvo por venopuncin y se mezcl con
una solucin de citrato de sodio al 3.5% en una proporcin de 9 a 1 (v/v). El
28
paquete celular se removi por medio de centrifugacin, mientras que el plasma

recuperado se almacen en refrigeracin hasta el momento de su utilizacin.
El ensayo de tiempo de protrombina (TP) consisti en mezclar 100 L de plasma
humano citrado con 10 L de una solucin del extracto de prueba, dejando incubar
la mecla por 1 min. a 37C. Una vez concluido el tiempo de incubacin, se
agregaron 200 L del reactivo de TP (Biopool by Trinity Biotech, plc)
preincubado a la misma temperatura (37C) por 10 min., y se midi el tiempo de
formacin del cogulo a partir de ese momento.
Por su parte para el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA),
se mezclaron 100 L de plasma humano citrado con 10 L de una solucin del
extracto crudo de prueba e igualmente se dej incubar la mezcla por un periodo de
1 min
a 37C. Despus del tiempo de incubacin, se agregaron 100 L del
reactivo de TTPA (Biopool by Trinity Biotech, plc), la nueva mezcla se dej

incubar por 3 min a 37C y se agregaron 100 L de CaCl 2 al 0.25%, midiendo el
tiempo de formacin del coagulo a partir de ese momento. Finalmente la
inspeccin de la formacin del coagulo en ambos ensayos, se realiz de manera
visual, registrando los tiempos en una tabla (Tabla VIII)
6. Caracterizacin parcial del fucoidan.
Las fracciones obtenidas a partir de la purificacin del fucoidan, se caracterizaron
estructuralmente por medio de espectroscopia de infrarrojo (IR). Adems se
calcul el contenido de sulfatos por el mtodo de lnea base a travs de las
relaciones del rea bajo la curva de las seales a los 1250 y 1040 cm-1 (Lijour et
al., 1994).
29
VI. RESULTADOS
1. Anlisis proximal
El anlisis proximal mostr que Sargassum lapazeanum se encuentra conformado
principalmente por un alto contenido de material inorgnico y carbohidratos y un
bajo contenido de extracto etreo. Esto se observa en la Tabla IV, donde se
presenta que S. lapazeanum cuenta con los valores ms elevados para
ELN
(extracto libre de nitrgeno) y cenizas.
Tabla IV. Resultados de anlisis proximal del alga.
Humedad
(%)
Protena
(%)
Extracto
Etreo
(%)
Fibra
Cruda
(%)
Cenizas
(%)
8.51
0.03
8.54
0.07
0.28
0.03
6.06
0.15
30.52
0.1
ELN
(%)
Energa
Cal/g
85.12 2522.34
4.86
2. Anlisis de la actividad biolgica

2.1.
Actividad antibacteriana
Los resultados del ensayo antibacteriano, indican una actividad selectiva sobre
bacterias del gnero Vibrio (Tabla V), donde el extracto crudo (EC) y la fraccin 2
(F2) mostraron la mayor actividad con un halo de inhibicin de 8.5 0.70 y 8 0
para V. parahaemolyticus, y de 10 0 y 8.5 0.70 para V. harveyi
respectivamente.
Adems las fracciones F6 y F7 presentaron una actividad
comparable contra V. harveyi, con halos de inhibicin de 8.75 0.35 y 9 0

respectivamente. Las fracciones F3 y 4 F4 tambin mostraron halos de inhibicin
aunque menos representativos cuando fueron probados contra V. harveyi,
mientras que las fracciones F6 y F7 tuvieron un efecto similar contra V.
parahaemolyticus.
En base a lo anterior, considerando la relacin entre actividad y rendimiento de la

muestra, se seleccion F2 para su fraccionamiento por cromatografa en columna.
Las fracciones obtenidas a partir de F2 mostraron tener una mayor actividad sobre
30
V. harveyi (Tabla VI), siendo F2F9 la fraccin ms activa con un halo de inhibicin
de 11.75 0.35. Mientras que la fraccin F2F8 result ser ms activa sobre V.
parahaemolyticus con un halo de inhibicin de 8.5 0.71. Cabe destacar que slo
se probaron aquellas fracciones que contaban con muestra suficiente para la
realizacin de las pruebas antibacterianas.
Tabla V. Resultados de la prueba de difusin en agar con discos [2 mg/disco]

del extracto crudo y las fracciones obtenidas a partir de S. lapazeanum. Se
reporta el promedio del halo de inhibicin en milmetros sd, n = 2 .
Halos de inhibicin (mm)
Gram +
Gram Fracciones S. aureus B. subtilis E. coli V. parahaemolitycus
F1
F2
80
F3
F4
F5
F6
*
F7
*
EC
8.5 0.70
V. harveyi
8.5 0.70
*
*
8.75 0.35
90
10 0
- No Activo, * Ligera actividad
Tabla VI. Resultados de la prueba de difusin en agar con discos [2 mg/disco]

del fraccionamiento del extracto F2 obtenido a partir de S. lapazeanum. Se
reporta el promedio del halo de inhibicin en milmetros sd, n = 2 .
Fracciones
F2F1
F2F2
F2F3
F2F4
F2F5
F2F6
F2F7
F2F8
F2F9
F2F10
F2F11
F2F12
F2F13
F2F14
Halos de inhibicin (mm)

V. harveyi
V. parahaemolitycus
N.P
N.P
N.P
N.P
N.P
N.P
N.P
N.P
10.75 1.06
7.75 0.35
N.P
N.P
11.75 1.06
8.5 0.71
11.75 0.35
8 0.71
11.5 0.71
7.75 0.35
10 0
*
N.P
N.P
N.P
N.P
N.P No se prob, - No Activo, * Ligera actividad.
31
2.2.
Actividad antioxidante
El mtodo bioautogrfico revel una franja decolorada a lo largo de la placa

cromatogrfica, indicativo de actividad antiradicalaria en la mayora de las
fracciones (Figura 11). Lo anterior, fue corroborado por medio del mtodo
colorimtrico, el cual demostr el potencial de las fracciones, destacando la
fraccin 6 con la menor EC50 de 39.96 g mL-1 (Figura 12 y 13), mientras que la
ms elevada fue la fraccin F1 con un EC50 de 394.21 g mL-1.
EC
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
Figura 11. Cromatografa en placa fina que muestra la actividad antioxidante de S.

lapazeanum por el mtodo bioautogrfico, revelada con una solucin de DPPH al 0.4%.
EC= Extracto crudo.
EC50 [g mL-1]
400
300
200
100
0
1
E.C.
Fracciones de S. lapazeanum
Figura 12. Grfica comparativa de los valores obtenidos para las EC 50 en las fracciones
obtenidas por gradiente de polaridad a partir de S. lapazeanum. 1= Menor polaridad, 7=
Mayor polaridad E.C.= Extracto Crudo
32
Porcentaje de reduccin del

DPPH (%)
100
80
y = 0.5709x + 27.186
R = 0.9726
60
39.96
DPPH
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
Concentracin del extracto [g mL-1]
Porcentaje de reduccin
del DPPH (%)
Figura 13.- Curva dosis efecto la fraccin F6 de S. lapazeanum, donde se observa el

porcentaje de reduccin del DPPH (%) en relacin a la concentracin del extracto (g mL 1
). En negro: lnea de tendencia y desviacin estndar. En rojo: concentracin efectiva
media (EC50).
85.00
80.00
75.00
70.00
65.00
60.00
55.00
50.00
45.00
y = 23.325x - 14.965
R = 0.9823
DPPH
Lineal (DPPH)
3.2
3.4
3.6
3.8
Concentracin del extracto [g mL-1]
Figura 14.- Curva dosis efecto del cido ascrbico (AA), utilizada como blanco de
comparacin, donde se observa el porcentaje de reduccin del DPPH (%) en relacin a la
concentracin del AA (g mL -1). En negro: lnea de tendencia y desviacin estndar. EC 50,
obteniendo por extrapolacin= 1.5 g mL-1
Finalmente, la curva control realizada con cido ascrbico present una EC 50 de

1.5 g mL-1 (Figura 14); mientras que la fraccin ms activa de S. lapazeanum
(Figura 13) demostr una actividad 26 veces menor a ste valor, con una EC 50 de
39.96 g mL-1.
33
2.3.
Actividad Anticoagulante
A partir del proceso de extraccin y precipitacin fraccionada del extracto acuoso

de Sargassum lapazeanum se obtuvieron un total de 3 extractos (FC1, FC2 y
FC3). Como puede observarse en la Tabla VII los extractos obtenidos, as como el
extracto acuoso de fucoidan (FC) presentaron una alta actividad en ambas
pruebas. Todos los extractos analizados sobrepasaron el
tiempo lmite de
coagulacin establecido (300 segundos) para la prueba de TTPA. Mientras que

para la prueba de TP, el extracto FC2 fue el que mostr una mayor actividad con
un tiempo de coagulacin de 41.93 2.49 s.
Tabla VII. Actividad anticoagulante de los

extractos obtenidos por precipitacin
fraccionada a partir de S. lapazeanum.
Extracto
Control
FC
FC1
FC2
FC3
TTPA
33.54
>300
>300
>300
>300
TP
14
30.25 0.79
24.50 1.30
41.93 2.49
23.079 1.90
En base a lo anterior, se realizaron curvas dosis-efecto (Figura 15) de los

extractos (FC, FC1, FC2 y FC3) las cuales confirmaron el alto potencial
anticoagulante de S. lapazeanum, pues la mayora de los extractos duplic el
tiempo de coagulacin establecido por el control (32.84s) incluso a sus
concentraciones mnimas.
34
250
TTPA (S)
200
150
100
50
0
10
15
20
25
30
Concentracin del extracto [g mL]
FC1
FC2
FC3
FC
Control
Figura 15. Grfico que muestra la relacin entre la concentracin de los extractos
obtenidos a partir de la precipitacin fraccionada del Fucoidan (FC) de S. lapazeanum y
su efecto sobre el tiempo normal de coagulacin segn el ensayo de TTPA.
2.3.1. Caracterizacin parcial del fucoidan

El anlisis del fucoidan por medio de IR indic la presencia de diferentes bandas
de absorcin que identifican el fucoidan obtenido como un heterofucano con un
contenido de 27.85% de sulfato para el fucoian crudo FC y de 8.10, 47.48 y 12.98
% para las fracciones FC1, FC2, y FC3 obtenidas por medio de precipitacin
fraccionada.
35
VII. DISCUSIN
1. Anlisis proximal del alga.
Como se puede observar en la Tabla IV, los constituyentes principales de S.
lapazeanum fueron el ELN y las cenizas. El ELN obtenido fue de 85.12%, esta
porcin suele estar conformada principalmente por carbohidratos solubles como
almidn y azcares pero tambin incluye una considerable cantidad de agar, cido
algnico y polisacridos sulfatados (Carrillo-Domnguez, 2002;). Estos son de gran
importancia en la industria alimenticia ya que carbohidratos como el almidn y
laminaran son fcilmente utilizados por los humanos y animales debido a los
enlaces que presentan de tipo -glicosdico 1,4 y 1,6, as como 1,3. Otros
polisacridos como el cido algnico y el agar slo pueden ser utilizados
por
animales que presenten las enzimas especficas para ello. No obstante estos
polisacridos son altamente utilizados en la industria alimentaria y farmacutica
por sus diferentes propiedades gelificantes (Carrillo-Domnguez, 2002). Adems el
fucoidan obtenido a partir de algas pardas se caracteriza por presentar una gran
gama de actividades biolgicas de inters en la industria farmacutica, cosmtica
y alimentaria (Li et al., 2008), un ejemplo de ello es la comercializacin del
fucoidan lquido como aditivo inmuno-estimulatorio para camarones (Casas, 2006).
S. lapazeanum present adems un alto contenido de materia inorgnica, con un
porcentaje de cenizas de 30.52 % esto es comparable con lo obtenido por otros
estudios
en plantas marinas y ocrophytas (Carrillo-Domnguez, 2002; Casas-
Valdez, 2006), los cuales indican que los valores elevados en el contenido de
materia orgnica se deben a la capacidad de estos organismos para almacenar
elementos minerales, los cuales abundan en el ambiente marino.
Los resultados obtenidos mostraron un bajo valor de protena de 8,54%, sin
embargo ste valor sobrepasa lo reportado por Marn (1999), Casas et al. (2002) y
Casas et al. (2006) de 7,0, 7,7, y 6.09% respectivamente para algas del gnero
Sargassum. Estas diferencias observadas podran deberse a factores como la
especie y la poca de recolecta del alga, ya que estos organismos presentan
36
variaciones estacionales que afectan la concentracin de sus constituyentes. A

pesar de que el contenido de protena es reportado en la literatura como bajo
para algas phaeophytas, cabe destacar que estudios realizados con algas del
gnero Sargassum han demostrado que la calidad de estas protenas es buena,
pues presenta una gran cantidad de aminocidos esenciales y su digestibilidad es
mayor al 70% (Casas, 2006 ).
La cantidad de fibra cruda observada fue del 6.06%,, a pesar de ser un valor bajo,
debe considerarse que el mtodo subestima el contenido de fibra diettica, ya que
se disuelve gran parte de la hemicelulosa y lignina, as como cantidades variables
de celulosa y toda la fibra soluble (Marn, 1999), por lo que se sugiere analizar el
contenido de fibra diettica por medio de otras metodologas. Algunos alimentos
de consumo humano como cereales y algunos vegetales contienen valores de
fibra similares, tal es el caso de la avena 7% y algunas leguminosas como el frijol
y el garbanzo con un 5% de fibra cruda (Carrillo-Domnguez, 2002).
La calidad y digestibilidad de las protenas, as como el bajo contenido energtico
y de extracto etreo de S. lapazeanum, le proporcionan al alga un alto valor
nutricional en la industria alimentaria. Lo anterior, aunado a su potencial actividad
biolgica
hacen de esta alga un recurso explotable para la elaboracin de
diferentes tipos de suplementos.

2. Anlisis de la actividad antibacteriana
La mayora de los trabajos realizados con extractos crudos de algas marinas,
mencionan una gran actividad contra bacterias gram positivas, considerando S.
aureus como una de las especies ms susceptibles a los extractos algales (Ros et
al., 2009). Esto probablemente debido a la estructura ms compleja de la pared
celular en bacterias gram negativas (Demirel et al., 2009). No obstante, el extracto
crudo y los extractos obtenidos por medio del fraccionamiento slido-lquido de S.
lapazeanum no fueron activos contra las bacterias gram positivas utilizadas en el
ensayo.
37
Aunque son ms los estudios que demuestran la actividad de las especies

pertenecientes
al
gnero
Sargassum
contra
bacterias
gram
positivas,
particularmente S. aureus (Lara-Issasi et al., 1995; Castro-Reyes, 1997; MuozOchoa, 2010; Vijayabaskar y Shiyamala, 2011; Kumar et al., 2013), tambin hay
estudios que reportan una baja o nula actividad contra ste patgeno. En este
sentido, nuestros resultados concuerdan con lo observado por investigadores
como Lara-Issasi et al., (1999) quienes reportaron que algunas especies de
Sargassum del Caribe y Golfo de Mxico (S. cymosum
y S. vulgare) no
presentaron actividad contra S. aureus, explicando que estas diferencias de

actividad podran no slo deberse a la especie, sino tambin a un
enmascaramiento en los extractos de los metabolitos secundarios responsables
de esta actividad. Por lo anterior, aunque los extractos presentaron una actividad
selectiva contra las bacterias del gnero Vibrio, es probable que al purificar las
otras fracciones, stas incrementen la actividad actual o presenten actividad
contra bacterias que no presentaron antes.
Adems, especies del gnero Sargassum han demostrado presentar un alto
potencial contra bacterias del gnero Vibrio, entre ellas destacan Sargassum
oligocystum (Nuestro-Baleta et al., 2011) y Sargassum latifolium (Dashtiannasab
et al., 2012). En este ltimo estudio se demostr que Sargassum latifolium
presenta halos de inhibicin de 90.7 y 9.21.1 contra V. parahaemolyticus y V.
harveyi respectivamente a concentraciones de 200 mgl -1. Esto es 10 veces mayor
a lo obtenido en el presente estudio. No obstante, estas diferencias de actividad
pueden explicarse por diversos factores, tales como la especie, la variacin
estacional, la variacin geogrfica e incluso el estado reproductivo del alga (LaraIssasi et al., 1999).
Algunos estudios demuestran que Vibrio harveyi suele ser ms sensible a los
ensayos de actividad antibacteriana, presentando en la mayora de los casos
halos de inhibicin ms definidos que Vibrio parahaemolyticus (Nuestro-Baleta et
al. 2011; Dashtiannasab et al., 2012). Lo anterior es similar a lo obtenido en el
presente estudio, donde la mayor actividad observada se registr contra Vibrio
38
harveyi (Tabla V y VI) tanto en el extracto crudo (EC) como en la fraccin F2

obtenida con diclorometano-etanol (9:1). Esto concuerda con estudios previos, los
cuales indican que el uso de solventes orgnicos provee una mayor eficiencia en
la extraccin de compuestos con actividad antibacteriana comparado a aquellos
que utilizan agua (Tney et al., 2006). Adems estudios recientes elaborados por
Al-Saif
et al. (2014) reportan que las extracciones etanlicas permiten la
obtencin de compuestos con una mayor actividad antibacteriana, no obstante

otros autores como Tney
et al. (2006) sugieren el cloroformo como mejor
solvente para la extraccin.

La actividad antibacteriana de S. lapazeanum se present tanto en fracciones
polares como no polares (Tabla V). No obstante, se seleccion una de las
fracciones apolares (F2) para su posterior fraccionamiento debido a que mostr la
mayor actividad con un halo de inhibicin de 8 0 para V. parahaemolyticus, y 8.5
0.70 para V. harveyi. Por su parte, las fracciones obtenidas por cromatografa en
columna a partir de F2, presentaron un incremento en la actividad antibacteriana
con halos de inhibicin ms definidos, siendo F2F9 la fraccin ms activa contra
V. harveyi (11.75 0.35) y F2F8 contra V. parahaemolyticus (8.5 0.71) (Tabla
VI). Esto demuestra que el proceso de fraccionamiento fue efectivo, de manera
que purific el extracto incrementando as su actividad.
Los principales compuestos bioactivos producidos por las algas marinas se
conforman por una gran variedad de metabolitos secundarios, los cuales segn
Magallanes et al. (2003), presentan una funcin especfica dentro de su medio,
entre las que se encuentran la defensa qumica contra herbvoros marinos, as
como la disminucin de epfitos mediante la inhibicin de los organismos
competidores y patgenos microbianos. Se ha reportado que la actividad
antibacteriana en diferentes tipos de plantas y algas marinas se debe a la
presencia
de
metabolitos
de
tipo
terpenoides (sesterpenoides),
fenoles,
polifenoles, o incluso hidroquinonas. Estudios realizados con especies del orden

phaeophyta,
demuestran
la
presencia
de
compuestos
antibacterianos
halogenados como los bromofenoles y compuestos lipoflicos conformados de

39
cidos grasos saturados e insaturados con la predominancia de los cidos

palmtico, mirstico, oleico y eicosapentaenico. Adems, este tipo de cidos grasos
ha demostrado ser efectivo contra un amplio espectro de bacterias patognicas
gram positivas y negativas (Al-Saif et al., 2014). Por lo que la actividad
antibacteriana observada en los extractos ms activos, podra atribuirse a alguno
de los compuestos mencionados anteriormente.
No obstante, los resultados obtenidos no permiten identificar qu compuestos o
mezcla de compuestos se encuentran dando lugar a esta actividad, por lo cual se
sugiere realizar un segundo fraccionamiento con las muestras F2F8 y F2F9. Esto
no slo podra incrementar la actividad registrada, sino que tambin permitir
determinar si la actividad de S. lapazeanum sobre bacterias del gnero Vibrio se
debe a alguno de los compuestos ya reportados para algas del gnero, o si se
trata efectivamente de un compuesto novedoso.
Los compuestos antibacterianos aislados a partir de algas del gnero Sargassum
son muy escasos, ya que slo se encontr registro de la obtencin del cido
mirstico (Muoz-Ochoa, 2010), el dioctil ftalato extrado con cloroformo-metanol
(2:1) (Sastry y Rao, 1995) y
el sulfoglicerolpido 1-0 palmitoil-3-0 (6-sulfo--
quinovopiranosil) -glicerol aislado con metanol (Arunkumar et al., 2005), siendo los
ltimos dos obtenidos a partir del alga Sargassum wightii. Esto sugiere que an
queda mucho por hacer en la investigacin de compuestos antibacterianos en
algas de este gnero. Adems, se debe considerar que las sustancias contenidas
en las algas que presentan propiedades antimicrobianas suelen fluctuar en
cantidad a lo largo del ao, siendo muy probablemente de naturaleza distinta, ya
que se extraen con solventes de diferente polaridad. Por lo que se recomienda
elaborar un estudio de la variacin estacional de stos compuestos que
complemente los resultados obtenidos.
Finalmente, la actividad selectiva contra bacterias del gnero Vibrio observada en
los ensayos, permite considerar a S. lapazeanum
como una alternativa en
acuacultura para la obtencin de compuestos antibacterianos naturales con

aplicaciones en el tratamiento contra la vibriosis, una de las principales causas de
40
enfermedades y prdidas econmicas en granjas acucolas, que suele afectar

principalmente los cultivos de camarn. Esta enfermedad genera lesiones en la
cutcula, apndices y branquias de los camarones, infecciones localizadas en las
heridas, perdidas de miembros, as como musculatura blanda, que al no ser
tratada adecuadamente puede causar prdidas de produccin aproximados al
100% (Venkateswara, 2008; Limonta y Coffigny, 2012).
3. Anlisis de la actividad antioxidante
Los ensayos de actividad secuestrante de radicales libres, demostraron que S.
lapazeanum presenta un alto potencial como fuente de compuestos con actividad
antioxidante. Esto coincide con diversos estudios que indican el alto potencial de
las algas pertenecientes al gnero Sargassum como fuente de este tipo de
compuestos (Anggadiredja y Andyani, 1997; Budhiyanti, 2012; Zhang et al, 2012;
Agardh, 2013). Los resultados obtenidos en el presente estudio son similares a
aquellos reportados por Zubia y colaboradores (2007) quienes obtuvieron EC 50 de
6.64 y 7.14 g mL1 para S. ramifolium y S. pteropleuron respectivamente, siendo
estos resultados 6.01 y 5.59 veces ms activos que el extracto de mayor actividad
obtenido en el presente estudio, el cual present una EC50 de 39.96 g mL-1.
Estas variaciones de actividad podran deberse a la composicin qumica de las
algas analizadas, as como a los solventes utilizados durante el mtodo de
extraccin, ya que estudios recientes demuestran que la actividad secuestrante de
radicales libres a partir de extractos de Sargassum se ve afectada por diferentes
factores, tales como la especie, la zona y la temporada de colecta, as como el
mtodo de extraccin utilizado (Budhiyanti, 2012).
Adems puede observarse que la actividad antiradicalaria fue mayor en los
extractos ms polares (Figura 14) lo cual, como sugiere Zubia y colaboradores
(2007) podra deberse a la presencia de compuestos polifenlicos ya que stos
han demostrado una correlacin significativamente alta entre el contenido fenlico
y la actividad antioxidante en extractos de algas marinas, tal es el caso de lo
descrito por Wei et al., (2003) quienes demostraron la actividad antioxidante de
compuestos fenlicos puros obtenidos a partir de Sargassum kjellmanianum. Es
41
importante destacar que estudios previos realizados con algas del gnero
Sargassum analizan el contenido de polifenoles en relacin a las variaciones
ambientales, obteniendo variabilidades muy altas en especies como Sargassum
furcatum y Sargassum mangarevense; mientras que en otras especies como
Sargassum hystrix las variaciones eran menores (Gonzlez-Batista, 2009;
Budhiyanti, 2012).
Todas las fracciones analizadas presentaron una menor EC 50 en relacin a lo
obtenido en la curva control de cido ascrbico EC 50: 1.5 g mL-1 (Figura 5). No
obstante, la fraccin ms activa de S. lapazeanum result 26 veces menor a ste
valor, con una EC50 de 36.96 g mL-1. En este sentido, es importante considerar
que los extractos utilizados son extractos que no han sido purificados, por lo que
los compuestos responsables de la actividad observada pudieran incrementar su
efectividad una vez fraccionados. Por lo anterior, podra incluso considerarse el
cido ascrbico, como uno de los compuestos relacionados a esta actividad, ya
que se ha reportado se encuentra presente en algunas macroalgas (GonzlesBatista et al., 2009). Cabe destacar que en la composicin qumica de las algas
existen diferentes metabolitos relacionados en mayor o menor medida a su
capacidad antioxidante, es por ello que realizar los ensayos de actividad se debe
considerar que esta puede atribuirse no slo a una molcula, sino tambin al
efecto sinrgico entre varias (Gonzles-Batista et al., 2009).
Generalmente los organismos fotoautrficos se encuentran expuestos a un gran
estrs por oxgeno, y se han adaptado a este medio desarrollado diferentes
sistemas de proteccin eficientes contra las especies reactivas de este (ERO).
Uno de estos sistemas, constituye en la produccin de potentes antioxidantes
como lo son polifenoles, carbohidratos y compuestos nitrogenados, fitosteroles,
carotenoides, derivados de la clorofila y otros pigmentos fotoprotectores (Gouveia
et al., 2008). Adems, las algas contienen metales como Se, Zn, Mn y Cu los
cuales son componentes fundamentales de enzimas antioxidantes, por lo que
podran contribuir en esta propiedad al ser consumidos por el hombre (GonzlezBatista, 2009).
42
La actividad antioxidante observada, se puede atribuir a tres diferentes tipos de

compuestos que se han reportado como responsables de esta actividad en las
algas: Liposolubles, hidrosolubles y polisacridos. Entre los liposolubles se
encuentran los carotenoides y la clorofila A. No obstante, no siempre es posible
ubicar los metabolitos de acuerdo a su polaridad, ya que Iwashima et al (2005)
aislaron 3 plastoquinonas a partir de Sargassum micracathum que presentaban
actividad antioxidante, la cual poda atribuirse a la porcin polifenlica, el
segmento similar al alfa-tocoferol, o ambos, ya que no pudo ser determinado
(Gonzlez-Batista, 2009).
Por su parte, entre los compuestos hidrosolubles destacan los polifenlicos como
los flavonoides y los cidos fenlicos. Estos constituyen uno de los grupos de
metabolitos secundarios ms numerosos y representativos en las plantas; son de
suma importancia ya que
forman parte de diferentes eventos fisiolgicos y
metablicos. Actualmente se sabe que los compuestos fenlicos son los ms

efectivos en la mayora de las algas pardas estudiadas, conformando entre el 20 y
el 30% de su peso seco, siendo los florotaninos los polifenoles de mayor
presencia, los cules slo se han aislado a partir de diferentes especies de algas
pardas, entre las que destacan Sargassum kjellamanianum,
Sargassum
siliquastrum, y el bifuhalol polimerizado obtenido a partir de Sargassum

ringgoldianum (Nakai et al., 2006; Gonzlez-Batista, 2009; Budhiyanti, 2012).
Finalmente, los polisacridos sulfatados de algunas algas marinas tambin han
demostrado presentar un alto potencial antioxidante en diversos estudios que
incluyen el anlisis hepatoprotector en modelos de ratn, sin embargo an es
escaso el conocimiento que se tiene de estos compuestos y su relacin con la
actividad antioxidante (Gonzlez-Batista, 2009).
43
4. Anlisis de la actividad anticoagulante.

4.1 Caracterizacin parcial del Fucoidan
El espectro de IR de las fracciones present un patrn de absorcin similar del
infrarrojo, sugiriendo que todas las fracciones contienen los mismos grupos
funcionales, no obstante presentan variaciones en su composicin, las cuales
pueden apreciarse por medio de las diferencias de intensidad de los picos de
absorcin (Figura 16).
Las bandas que se encuentran entre 960-970
corresponden a los residuos el grupo metilo de la fucosa (CH 3), confirmando la

presencia de sta. Por su parte las bandas entre el 1417-1616 cm-1 corresponden
al enlace amida N-H y demuestran la presencia de amino-azcares o uronatos
(Gmez-Ordez, 2012), mientras que las bandas ubicadas entre 1210 y 1250
cm1 corresponden a las vibraciones de estrechamiento del S-O. La banda a 830
cm1 fue asignada a la vibracin del grupo C-O-S. Estas vibraciones indican la
presencia del grupo sulfato en posicin axial del C4 con sustituciones menores en
los carbonos C2 y C3 de la fucosa, dadas por un pico de absorcin menos intenso
a los 805 cm-1 (Li et al., 2008).
Adems, la banda de absorcin a los 570 cm-1 confirm la presencia de un
nmero significativo de grupos sulfato (Muoz-Ochoa, 2006). No obstante, a parte
de las vibraciones C-O-S, en la regin de 820-850 cm -1 existen vibraciones dadas
por las uniones C-H de la terminacin de azcares reductores, lo cual podra
afectar el criterio de la posicin del grupo sulfato. En base a lo anterior Li et al.,
(2008) sugieren comparar y complementar los resultados obtenidos por IR con la
estabilidad de los esteres sulfatados
por medio de anlisis de lcali y de
metilacin para determinar la posicin del grupo sulfato. Es por ello que se
recomienda continuar con la investigacin y realizar estudios posteriores, no slo
con el fin de investigar la conformacin de la estructura qumica del fucoidan
obtenido a partir de S. lapazeanum, sino tambin para esclarecer los mecanismos
de accin de este compuesto.
44
45
Figura 16. Principales picos de absorcin de los espectros de FTIR-ATR del extracto acuoso (Fucoidan: FC) de S.
lapazeanum y las fracciones obtenidos por precipitacin fraccionada a partir de ste: FC1, FC2 y FC3 en la regin de los 4002000cm-1.
En base a lo anterior se describe el fucoidan obtenido a partir de S. lapazeanum

como un heterofucano debido a la presencia de cidos urnicos y azcares
neutros detectados en las banas de IR (Gmez-Ordez, 2012). Por lo que se
sugiere hacer un anlisis de su composicin monomrica para la identificacin de
azcares como manosa, xilosa o galactosa.
4.2 Ensayo de actividad anticoagulante
El proceso de coagulacin se lleva a cabo a travs de ciertos factores que
permiten detener el flujo sanguneo en el lugar donde se ha producido dao tisular.
En la medida que los anticoagulantes (endgenos o exgenos), interfieren con
estos factores de coagulacin inactivndolos o limitndolos, la coagulacin de la
sangre se prolonga o se detiene (Gmez-Ordez, 2012). La actividad in vitro del
fucoidan y los precipitados obtenidos a partir de este, fue evaluada por medio del
tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA).
El ensayo de TP sugiere que los heterofucanos obtenidos a partir de S.
lapazeanum actan en la va extrnseca de la cascada de coagulacin ya que
todos los extractos probados prolongaron el tiempo de formacin del cogulo,
siendo este hasta 28 s mayor que el control en FC2 (Tabla VIII).
En base a los resultados observados en los primeros ensayos de TTPA, se
realizaron curvas dosis-efecto con cada uno de los extractos para definir las
concentraciones a las que se presenta esta actividad. Las curvas obtenidas
demostraron el alto potencial anticoagulante de S. lapazeanum, ya que todos los
extractos prolongaron el tiempo de formacin del cogulo, duplicando el tiempo de
coagulacin establecido por el control (32.84 s)
incluso a concentraciones
mnimas de 3.06 g mL-1 (Figura 15), siendo FC2 el ms activo. Las fracciones
de fucoidan obtenidas en el presente estudio mostraron una actividad similar a la
de la heparina. Ronghua et al., (2003) reportaron que el tiempo de coagulacin
para la heparina fue de 125 s a concentraciones de 10 gmL-1, en base a ello es
posible decir que FC2 la fraccin ms activa y de mayor potencial ya que duplic
este tiempo a la misma concentracin (Figura 15).
Esto concuerda con el
potencial observado en otras especies del gnero, ya que Dore-Guerra et al.,

46
(2013) reportaron que el fucoidan obtenido a partir de Sargassum vulgare result

ser hasta 10 veces ms activo que la heparina.
Tabla VIII. Comparacin de actividad de los extractos

acuosos obtenidos a partir de Sargassum lapazeanum en
el ensayo de tiempo de protrombina (TP).
Extracto
TP
Control
FC
FC1
FC2
FC3
14
30.25 0.79
24.50 1.30
41.93 2.49
23.079 1.90
Tiempo prolongado (s)

comparacin al control
16.25
10.5
27.93
9.079
Por su parte, los ensayos de TTPA mostraron tiempos de coagulacin mayores a

los 300 s establecidos para el ensayo, siendo este resultado casi 9 veces mayor
que lo mostrado por el control (33.54 s) (Tabla VII). Esto coincide con lo observado
por diferentes autores (Tabla IX), tales como Athukorala et al. (2007) quienes
registraron valores similares a partir de extractos acuosos obtenidos a partir de S.
horneri (>300 s) y S. siliquastrum (200 s). Asimismo, Lara-Issasi y lvarezHernndez (1999), registraron una menor actividad a partir de algas como S.
cymosum, S. filipndula y S. pteropleuron, as como tiempos igual de elevados
(>300 s) a partir de extractos de Sargassum vulgare. Estas diferencias podran
deberse al tipo de especie estudiada y su composicin qumica que, como lo
indica Garca-Ros et al. (2012), se ve afectada por diversos factores como el
clima y la zona geogrfica. Sus estudios sealan que existe una correlacin entre
el contenido de fucoidan y la profundidad de las algas, obteniendo un mayor
contenido de este compuesto en aquellas que crecen cerca de la superficie. Lo
anterior podra explicar el alto potencial de S. lapazeanum, un alga que habita en
la zona intermareal.
47
Tabla IX. Listado de algunos valores de TP y TPPA reportados para algas del
gnero Sargassum.
Especie
Referencia
TP
TTPA (s)
Sargassum horneri
Sargassum siliquastrum
Sargasum cymosum
Sargassum filipendula
Sargassum
pteropleuron
Sargassum vulgare
Athukorala et al., 2007.

Athukorala et al., 2007.
Lara-Isassi y lvarez-Hernndez, 1999.
90
16
60
> 300
200
90
82
100
25
> 300
La actividad observada en los ensayos de TTPA sugiere que los heterofucanos

obtenidos tambin podran estar actuando en la va intrnseca o la va comn del
FX, factor que es esencial para la formacin de la trombina y la subsecuente
fibrina. Se ha reportado que los fucoidanos obtenidos a partir de algas pardas
pueden, al igual que la heparina, inhibir la actividad de la trombina actuando de
manera directa en la enzima o mediante la activacin
de los inhibidores de
trombina, incluyendo la antitrombina III y el cofactor II de la heparina. No obstante

algunos activan slo la antitrombina.
La heparina es una biomolcula que
contiene glucosaminoglicano altamente sulfatado que junto con las heparinas de

bajo peso molecular, representan los anticoagulantes de mayor
uso en el
mercado (Gmez-Ordez, 2012). Sin embargo, se ha registrado que el uso

prolongado de estos compuestos puede tener efectos adversos como lo son
trombocitopenia, osteoporosis y hemorragias.
Con respecto al grado de sulfatacin, el contenido de sulfatos en FC2 (47.48%)
fue mucho mayor en comparacin a lo observado en las otras fracciones, siendo
igualmente la fraccin que present ms actividad (Tabla VII y Figura 15). Esto
coincide con estudios previos, los cuales indican el incremento en el contenido de
sulfatos como uno de los factores ms importantes que definen la actividad
anticoagulante, la cual incrementa conforme el grado de sulfatacin de los fucanos
(Muoz-Ochoa, 2006). Adems se ha reportado que pequeas diferencias en la
proporcin y distribucin de los residuos de sulfatos en las cadenas del fucoidan,
48
podran resultar crticas para la interaccin de las proteasas, inhibidores y

activadores del sistema de coagulacin, alterando as el valor observado en los
ensayos de actividad anticoagulante (Gurgel-Rodrigues et al., 2011)
Debido al alto potencial anticoagulante del fucoidan obtenido a partir de S.
lapazeanum, se sugiere continuar con futuras investigaciones enfocadas en el
aislamiento y caracterizacin de este compuesto que permitan complementar el
estudio con mtodos como resonancia magntica nuclear (RMN).
49
VIII. CONCLUSIONES
Los ensayos elaborados en el presente estudio demostraron que Sargassum

lapazeanum es un alga con un alto potencial como fuente de compuestos con
actividad antioxidante, antibacteriana y anticoagulante.
El anlisis de la actividad antibacteriana indic la selectividad de S. Lapazeanum
por bacterias del gnero Vibrio,
como V. harveyi y V. parahaemolyticus y V.
parahaemoliticus
Los ensayos de actividad secuestrante de radicales libres demostraron que S.
lapazeanum es un alga de gran potencial antioxidante con una EC 50 = 39.96 g
mL-1 comparable a lo obtenido en otras especies de algas de este gnero.
Los heterofucanos FC1, FC2 y FC3 obtenidos a partir de la precipitacin
fraccionada de FC, mostraron una actividad anticoagulante comparable a la de la
heparina, siendo FC2 el ms activo. Finalmente el anlisis estructural del fucoidan
demostr que se trata de un heterofucano compuesto por fucosa con sustituciones
de grupos sulfato en posicin C4 principalmente.
50
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63
ANEXO I.
Descripcin de la especie: Sargassum lapazeanum.
Las especies de Sargassum se caracterizan morfolgicamente por presentar un
talo (estructura de forma arbustiva), que se divide en sujetador, estipe, filoides y
aerocistos. No obstante, las estructuras en ste gnero suelen verse modificadas
debido a variaciones espacio-temporales de distintos factores ambientales, y es
precisamente sta plasticidad morfolgica lo que por mucho tiempo complic la
clasificacin taxonmica de Sargassum lapazeanum (Andrade-Sorcia, 2005).
Tabla X. Ubicacin taxonmica del alga

Sargassum lapazeanum.
Taxa
Descripcin
Imperio:
Eukaryota
Chatton.
Reino:
Chromista
T. Cavalier-Smith.
Phylum:
Ochrophyta
T. Cavalier-Smith.
Clase:
Phaeophyceae
F.R. Kjellman.
Orden:
Fucales
Bory de SaintVincent.
Familia:
Sargassaceae
Ktzing.
Gnero:
Sargassum
C. Agardh.
Morfologa
Ls talos de S. lapazeanum llegan a medir entre ~10 a ~1.5 m de largo, estos
surgen de un sujetador discoidal parenquimatoso y slido que inicia como un disco
hasta formar un cono o hapteros. El estipe es cilndrico y liso, presenta adems
numerosas ramas lisas y cilndricas. Las ramas primarias son delgadas y pueden
llegar a presentar ramas secundarias. Los filoides son asimtricos, ms amplios
en la zona apical del filoide, con pedicelos cortos y miden entre 0.5 2.5 cm de
largo. Algunos filoides presentan una corona sobre uno de los lados del filoide (no
64
son completamente planos), otros se encuentran torcidos de la mitad basal del

margen superior, que es liso y cncavo. El remanente del filoide es agudo,
dentado y con una nervadura de poco evidente a evidente. Los criptostomatas
estn presentes y evidentes, mientras que los aerocistos son escasos entre los
receptculos que son elpticos. Los aerocistos en su mayora son similares a la
forma de los filoides, tienen el margen modificado con remanencias de filoides, lo
que forma una cresta. Los receptculos se observan en trinchete con algunas
espinas, entremezclados receptculos de anteridios y oogonias, creciendo en
ramilletes (Andrade-Sorcia et al., 2013)
Figura 17. Fotografas de Sargassum lapazeanum. Valeria Villegas

(vavs.villegas@gmail.com).
Hbitat
Los organismos de esta especie crecen sobre rocas a lo largo de la zona
intermareal a submareal. Adems se ha observado que pueden formar mantos
con S. horridum, S. sinicola, y S. johnstonii.
65
Ciclo de vida
No se cuenta con un registro del ciclo de vida de esta especie en particular, no
obstante se trata de un alga del gnero Sargassum, por lo que su reproduccin es
sexual y asexual. La reproduccin sexual se da por medio de la produccin de
gametos, su fertilizacin y la fijacin de zigotos al sustrato; mientras que la asexual
consiste en la regeneracin de un nuevo talo a partir de un estoln (talo de aos
anteriores, menor a 17 cm y con pocos o sin filoides y aerocistos).
Estudios de la dinmica poblacional de S. lapazeanum (Rivera y Scrosati, 2008)
indican que presenta sus mximos de crecimiento en primavera (Marzo-Abril tasa
de crecimiento mxima) y los mnimos durante el periodo de otoo, con escasez
de plantas reproductivas durante Junio-Agosto y la mayor mortalidad en los meses
de Agosto y Septiembre.
Distribucin
S. lapazeanum fue descrita en 1924 por Setchell y Gardner, con ejemplares de La
Paz B.C.S., ya que slo se tena registro del alga en esta zona la especie se
consider como endmica de la parte Sur del Golfo por mucho tiempo. Estudios
moleculares recientes (Andrade-Sorcia et al., 2013) demuestran que su
distribucin es an ms amplia, pudindose observar en las costas de Sonora,
Baja California y Baja California Sur (Figura 18).
66
Figura 18. Mapa que muestra la distribucin actual de S. lapazeanum. Modificado a partir
de NOAA. http://www.ngdc.noaa.gov/mgg/shorelines/shorelines.html.
67
ANEXO II.
Tabla XI. Extracto crudo (g) y rendimiento (%) obtenido del

alga S.lapazeanum.
Especie
S. lapazeanum
Peso del
alga (g)
300
Extracto
crudo (g)
34.73
Rendimiento
(%)
11.57
Tabla XII. Peso (g) y rendimiento (%) de las fracciones obtenidas por fraccionamiento
slido lquido a partir de S. lapazeanum.
Especie
12-009
Sargassum
lapazeanum
Fracciones obtenidas por extraccin slido-lquido

F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
CH2Cl CH2Cl2- CH2Cl2- CH2Cl2- EtOH
EtOHH2O
EtOH
EtOH
EtOH
100%
H2O
100%
2
100% 90-10% 75-25% 50-50%
50-50%
Peso (g)
Rendimiento(%)
1.52
10.13
0.79
5.26
1.54
10.26
2.04
13.6
0.84
5.6
0.46
3.06
0.078
0.52
68
ANEXO III.
Figura 19. TLC de los eluatos obtenidos por medio del fraccionamiento slido-lquido del
extracto crudo E.E.C.
Figura 20. Cromatografas en placa fina (TLC) de los eluatos obtenidos a partir de la
columna cromatogrfica realizada con F2.
69
ANEXO IV.
Figura 21. Halos de inhibicin de los extractos obtenidos a partir de S. lapazeanum en

cajas de petri inoculadas con Vibrio harveyi.
Figura 21. Halos de inhibicin de los extractos obtenidos a partir de S. lapazeanum en

cajas de petri inoculadas con Vibrio parahaemolyticus.
70
Figura 23. Halos de inhibicin de los extractos obtenidos a partir de F2 en cajas de petri
inoculadas con Vibrio harveyi.
Figura 24. Halos de inhibicin de los extractos obtenidos a partir de F2 en cajas de petri
inoculadas con Vibrio parahaemolyticus.
71

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

REA DE CONOCIMIENTOS DE CIENCIAS DEL MAR

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

LA PAZ, B.C.S., MXICO. JUNIO DE 2014

A mi comit de tesis Dr. Rafael Riosmena

La pennsula de Baja California cuenta con una gran variedad de hbitats y

extracto etanlico de S. lapazeanum, as como sus diferentes fracciones presentan

1. Anlisis del potencial antibacteriano

1.1. Antibacterianos y su clasificacin

1.2. El gnero Sargassum como fuente de compuestos con

2.2. Algas del gnero Sargassum como fuente de compuestos

3.1. Polisacridos sulfatados: Fucoidan y actividad anticoagulante

3.2. Mecanismos de coagulacin sangunea

3.3. Evaluacin de la actividad anticoagulante

1. Recoleccin e identificacin taxonmica

2. Anlisis proximal del alga S. lapazeanum

3. Obtencin del extracto

3.1. Obtencin del extracto etanlico

3.2. Obtencin del extracto acuoso: Fucoidan

4.1. Fraccionamiento por gradiente de polaridad

4.2. Fraccionamiento de F2 en columna cromatogrfica

4.3 Purificacin parcial del fucoidan

Pruebas de actividad biolgica

5.1. Evaluacin de la actividad secuestrante de radicales libres

5.2. Evaluacin de la actividad antibacteriana por medio del mtodo

Caracterizacin parcial del fucoidan

2. Anlisis de la actividad biolgica

2.1. Actividad antibacteriana

2.2. Actividad secuestrante de radicales libres

2.3 Actividad anticoagulante

2. Anlisis de la actividad antibacteriana

3. Anlisis de la actividad antioxidante

4. Anlisis de la actividad anticoagulante

4.1 Caracterizacin parcial del fucoidan

4.2. Ensayo de actividad anticoagulante.

Estructura qumica del dioctil ftalato

Difenilpicrilhidracilo (radical libre).

Estructura de algunos compuestos qumicos aislados a partir de

Estructura qumica promedio del fucoidan.

Diagrama que muestra la cascada de coagulacin. Imagen

tomada de Martnez-Murillo (2003).

Va afectada por la prueba de tiempo de protrombina. Imagen

tomada de Kitchen et al. (2010).

Mapa que muestra la zona de recolecta del alga S. lapazeanum

Obtencin del extracto crudo (EC) y fraccionamiento del alga S.

fraccionamiento del fucoidan.

Cromatografa en placa fina que muestra la actividad

Grfica comparativa de los valores obtenidos para las EC 50 en

las fracciones obtenidas por gradiente de polaridad a partir de

Curva dosis efecto la fraccin F6 de S. lapazeanum, donde se

tendencia y desviacin estndar. En rojo: concentracin efectiva

Curva dosis efecto del cido ascrbico (AA), utilizada como

(g mL-1). En negro: lnea de tendencia y desviacin estndar.

Grfico que muestra la relacin entre la concentracin de los

normal de coagulacin segn el ensayo de TTPA36

Espectros de FTIR-ATR de las fracciones obtenidos por

lapazeanum: FC1, FC2 y FC3 en la regin de los 500-1800cm .

Estudios realizados con el alga Sargassum lapazeanum

Listado de algunas especies del gnero Sargassum que han

presentado actividad anticoagulante.

Nombre y funcin de los diferentes factores y cofactores que

Resultados de anlisis proximal del alga S. lapazeanum.

Resultados de la prueba de difusin en agar con discos [2

mg/disco] del extracto crudo y las fracciones obtenidas a partir de