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LABORATORIO INTEGRADO DE GENTICA

2016-2017

Profesores:
Daniel Aguirre de Crcer (daniel.aguirre@uam.es)
Miguel Pita (miguel.pita@uam.es) (Coordinador)
Mara Villa (maria.villa@uam.es)
Objetivos:
Se pretende que los alumnos desarrollen un trabajo de investigacin ntegro, incluyendo el
diseo y el desarrollo experimental, la obtencin de los resultados y su procesamiento, as
como la interpretacin y la transferencia de los mismos. El trabajo de investigacin est
diseado de forma que se empleen tcnicas diversas de uso rutinario en gentica para extraer
resultados y conclusiones que permitan su discusin desde una perspectiva gentica,
evolutiva y funcional.
Experimento propuesto:
Aislar, identificar y comparar empleando aproximaciones moleculares y citogenticas:
1) la secuencia de genes humanos en diferentes individuos, detectando los distintos
polimorfismos.
2) La localizacin cromosmica de un gen o secuencia en el complemento humano.
Para ello:
1- Se aislar ADN genmico humano.
2- Se amplificar por PCR un fragmento de cada gen estudiado.
3- Se clonar en un vector de tipo plsmido (pGEM-T-Easy, Promega).
4- Se seleccionar un clon y se purificar la construccin recombinante.
5- Se secuenciar el fragmento del gen estudiado.
6- Se analizarn los resultados con herramientas bioinformticas
Por otro lado:
1- Se sintetizarn sondas de ADN del gen o secuencia a estudiar.
2- Se obtendrn preparaciones con cromosomas humanos metafsicos.
3- Se realizar Hibridacin in situ Fluorescente para identificar la localizacin del gen o
secuencia sobre los cromosomas metafsicos.
4- Se analizarn los resultados y se capturarn imgenes con el microscopio de
fluorescencia.

PLAN DE TRABAJO:
SEMANA 1
Lunes:
Extraccin de ADN genmico humano a partir de muestras de saliva.
Cuantificacin por espectrofotometra.
Obtencin de cromosomas metafsicos humanos a partir de sangre perifrica (Da
1).
Preparacin de geles de agarosa.
Martes:
Anlisis del ADN genmico extrados por electroforesis en gel de agarosa.
Amplificacin de un fragmento de los genes AR y DRD2/ANKK1 mediante PCR.
Digestin con enzimas de restriccin (gen DRD2/ANKK1).
Preparacin de muestras para electroforesis capilar (gen AR)
Buscar el protocolo de purificacin de los productos de la PCR (Tarea para casa).
Mircoles:
Anlisis de los productos de PCR y digestin por electroforesis en gel de agarosa.
Purificacin de los productos de PCR.
Cuantificacin por espectrofotometra de los productos de PCR purificados.
Clculos para determinar las cantidades de inserto y vector en la reaccin de ligacin
(Tarea para casa).
Jueves:
Obtencin de cromosomas metafsicos humanos a partir de sangre perifrica (Da
2).
Viernes:
Preparacin del seminario y del pster.
SEMANA 2
Lunes:
Clonacin (1): Construccin del plsmido recombinante mediante ligacin de inserto
y vector.
Exposiciones por los alumnos de un artculo cientfico (1).
Martes:
Festivo
Mircoles:
Hibridacin in situ Fluorescente (1): sntesis de sondas y preparaciones
Exposiciones por los alumnos de un artculo cientfico (3).
Jueves:
Festivo
Viernes:
No hay clase

SEMANA 3
Lunes:
Clonacin (2): Transformacin de bacterias y crecimiento en medio slido selectivo.
Martes:
Clonacin (3): Crecimiento en medio lquido de clones recombinantes.
Exposiciones por los alumnos de un artculo cientfico (2).
Buscar el protocolo de purificacin de ADN plasmdico (Tarea para casa).
Mircoles:
Clonacin (4): Purificacin de ADN plasmdico recombinante.
Cuantificacin por espectrofotometra del ADN purificado.
Preparacin de muestras de ADN para secuenciacin (gen DRD2/ANKK1).
Examen del bloque 1.
Jueves:
Prctica de Bioinformtica 1 (Sala 1)
Viernes:
Prctica de Bioinformtica 2 (Sala 1)
SEMANA 4
Lunes:
Hibridacin in situ Fluorescente (2)
Exposiciones por los alumnos de un artculo cientfico (4).
Martes:
Hibridacin in situ Fluorescente (3): revelado y captura de imgenes
Mircoles:
Cmo hacer un pster?
Examen del bloque 2.

BLOQUE 1: AMPLIFICACIN Y CLONACIN DE UN GEN HUMANO

AISLAMIENTO DE ADN GENMICO

Existen diversas metodologas que permiten aislar cido Desoxirribonucleico a partir de
muestras de tejidos.
Todos los procedimientos poseen fundamentos semejantes y existen metodologas caseras
muy eficientes, aunque tambin numerosas casas comerciales ofrecen kits que facilitan el
procedimiento y una mayor precisin en la reproducibilidad del proceso.
En cualquier caso, el aislamiento de ADN requiere una lisis celular para exponer el ADN, el
empleo de detergentes para la retirada de los lpidos de membrana, el uso de proteasas para
la retirada de protenas, y finalmente la purificacin del ADN (con etanol, fenol-cloroformo
y/o columnas).
Para las presentes prcticas utilizaremos el kit comercial QIAmp DNA Mini kit (Qiagen).

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica desarrollada por Kary Mullis
en 1984 (Mullis et al. 1986), y que le vali el Premio Nobel de Qumica en 1993.
Est basada en la copia repetida de forma exponencial de una secuencia de ADN mediante
una ADN polimerasa termoestable, como la de la bacteria Thermus aquaticus (Taq
polimerasa), hasta reproducir millones de copias idnticas de esa misma secuencia. El
mtodo utilizado se basa en someter la reaccin a ciclos de temperatura, utilizando para
ello un termociclador.
1- La reaccin comienza con la desnaturalizacin de la doble cadena de ADN a 94-95C,
para romper los puentes de hidrgeno que las mantienen unidas.
2- Se baja la temperatura a unos 50-60C para permitir la hibridacin (anillamiento) de los
cebadores o primers - secuencias cortas de ADN (tpicamente 20 nucletidos),
complementarias a los extremos del segmento de ADN a amplificar, tambin llamado ADN
molde.
3- Se sube a 72C, temperatura ptima de polimerizacin de Taq, aadiendo nucletidos en
el extremo 3 de cada primer, de modo que la extensin de la cadena se produce en sentido
53.
Este proceso se repetir habitualmente unas 20-35 veces.
La temperatura de anillamiento es crtica dado que depende de la secuencia de los primers y
que suele estar unos 5-10C por debajo de su temperatura de fusin (Tm, del ingls melting).
sta puede calcularse de forma aproximada con la frmula:
Tm=4x(G+C) + 2x(A+T)
En la reaccin de PCR necesitamos aadir, adems del ADN molde, los primers y la Taq
polimerasa, los cuatro desoxinuclesidos trifosfato (dNTPs) y Mg2+, esencial para la catlisis,
en un tampn que proporcione las condiciones adecuadas de pH y salinidad.
La PCR tiene muchsimas aplicaciones en Biologa Molecular: secuenciacin, clonacin,
anlisis funcional de genes, diagnstico de enfermedades hereditarias o infecciosas, tests de
paternidad, medicina forense, etc.
Para ver en una animacin cmo funciona la PCR, pincha en alguno de los siguientes
enlaces:
http://www.thehealthnews.org/news/06/08/02/pcr.html
http://www.sigmaaldrich.com/content/sigma-aldrich/areas-of-interest/lifescience/molecular-biology/pcr/learning-center/pcr-amplification-animation.html

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

El producto de PCR se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa. Este mtodo
permite separar molculas de ADN lineales en funcin de su tamao, de modo que la
movilidad electrofortica de un fragmento es inversamente proporcional al logaritmo en base
decimal de su longitud, por lo que los fragmentos ms pequeos migran ms que los
fragmentos grandes. En el caso de molculas de ADN circular, la movilidad no es
proporcional al tamao, ya que influye el grado de superenrollamiento.
Dado que los cidos nucleicos tienen carga negativa en presencia de un campo elctrico se
movern hacia el polo positivo a travs de una matriz de agarosa consistente en un entramado
formado por la polimerizacin de molculas alternantes de D- y L-galactosa, mediante
enlaces glicosdicos -(13) y -(14) de la manera siguiente:
.

El porcentaje de agarosa determina el tamao de poro que tendr el gel y por tanto el rango
de resolucin. Suelen emplearse porcentajes de entre el 0.7% y el 3%. Para la resolucin de
fragmentos pequeos (<100-200 pb) se utiliza electroforesis en gel de poliacrilamida.
Aunque la agarosa es insoluble en agua puede fundirse y al enfriarse gelifica. El tampn
utilizado para preparar el gel suele ser TAE (Tris-Acetato-EDTA) o TBE (Tris-BoratoEDTA). El TAE tiene peor capacidad tamponadora que el TBE, pero ofrece mejor
resolucin de los fragmentos grandes.
La visualizacin de las molculas de ADN en el gel de agarosa se hace mediante el uso de
agentes intercalantes fluorescentes como el Bromuro de Etidio, el SYBR green (Invitrogen),
el GelRed (Biotium), etc. Su excitacin con luz ultravioleta provoca la emisin de parte de la
energa absorbida dentro del espectro visible, a unos 590 nm.
Antes de la electroforesis las muestras se mezclan con un tampn de carga que contiene:
- Glicerol: para que la muestra vaya al fondo del pocillo.
- Azul de bromofenol: colorante que permite visualizar la muestra mientras la aplicamos al
pocillo, y permite el seguimiento de la electroforesis, ya que en nuestras condiciones migra
como una molcula de ADN lineal de doble cadena de unos 300 pb.
- Xylen-Cianol: colorante verde, igual que el caso anterior, aunque migra como un ADN de
unos 4 kb.

DIGESTIN CON ENZIMAS DE RESTRICCIN

Las enzimas de restriccin de tipo II son endonucleasas que reconocen y cortan en una
secuencia especfica del ADN. Las secuencias que reconocen (dianas) son palindrmicas y
tienen 4-8 pb; algunas producen cortes que generan extremos cohesivos (complementarios
entre s), mientras que otras generan extremos romos. En su nomenclatura, la primera letra
procede del organismo del que se aisl, las dos siguientes la especie, la cuarta letra si la tiene

indica la cepa, y si en el mismo organismo hay ms de un sistema, se distinguen con nmeros

romanos. Por ejemplo, EcoRI procede de Escherichia coli RY13.
El descubrimiento de las enzimas de restriccin supuso el Premio Nobel de
Fisiologa/Medicina en 1978 a Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith (Arber
1974, 1978; Nathans & Smith 1975; Smith et al. 1981).
Desde su descubrimiento, su empleo supuso una revolucin para la Biologa Molecular, tanto
por su papel fundamental en el proceso de clonacin, como por suponer la primera
herramienta que permiti segmentar de forma controlada los genomas. En este sentido, una
de sus utilidades es la de permitir localizar polimorfismos, es decir secuencias de ADN con
un patrn de corte de las enzimas diferenciable entre individuos, uno de los empleos que se
les dar en esta prctica.

CLONACIN I: Construccin del ADN recombinante

El uso de enzimas de restriccin permite la generacin de un ADN recombinante. Por
ejemplo, un fragmento de ADN digerido con una enzima de restriccin se puede unir a un
vector apropiado (como por ejemplo un plsmido) que haya sido cortado con la misma
enzima, mediante el uso de ADN ligasa, que cataliza la formacin del enlace fosfodister
entre los extremos 3OH y 5P adyacentes en un ADN.
Por el desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante fue concedido el Premio Nobel de
Qumica en 1980 a Paul Berg (Singer & Berg, 1976).
Los plsmidos bacterianos son molculas de ADN bicatenario extracromosmico,
generalmente circulares, que se replican de forma autnoma aunque necesitan algunas
protenas bacterianas. En su uso para el clonaje, requieren la presencia de ciertas secuencias
caractersticas:
1) Origen de replicacin, para poderse mantener de forma estable.
2) Sitio de clonaje mltiple (MCS), secuencia sinttica que contiene dianas nicas para
enzimas de restriccin, donde se une el fragmento deseado de ADN, en nuestro caso
interrumpiendo el gen lacZ para facilitar su seleccin.
3) El sitio de clonaje mltiple puede estar flanqueado por promotores, generalmente de fagos
como T7 o SP6, que dirigen la expresin del gen clonado y facilitan su secuenciacin usando
primers universales.
4) Marcador de seleccin, generalmente un gen de resistencia a antibitico, ampicilina en
nuestro caso.
No obstante, la formacin de un ADN recombinante puede hacerse sin emplear enzimas de
restriccin. Por ejemplo, se pueden ligar dos fragmentos de ADN que porten en sus
extremos 3 colas compatibles, como poli-A en una molcula y poli-T en la otra. En este
laboratorio utilizamos como vector de clonaje pGEM-T-Easy (Promega), plsmido
linearizado que porta una timina en sus extremos 3. Dado que ciertas enzimas como la Taq
ADN polimerasa incorporan una adenina en los extremos 3 de los productos de PCR
amplificados, pueden ser directamente ligados en plsmidos como pGEM-T-Easy sin
necesidad de digerir previamente con enzimas de restriccin.

http://www.promega.com/tbs/tm042/tm042.pdf
http://www.promega.es/resources/multimedia/cloning-and-dna-markers/pgemt-vectorsystems-video/
Animacin relacionada con la clonacin:
http://www.jove.com/science-education/5069/dna-ligation-reactions

CLONACIN II: Transformacin de bacterias E. coli competentes

Una vez generado el ADN recombinante, hay que introducirlo en una bacteria para que lo
amplifique. El proceso por el que un ADN exgeno se incorpora y expresa en una clula
bacteriana se llama transformacin. Para facilitar la entrada del ADN recombinante en la
bacteria, se emplean mtodos qumicos o fsicos que hacen a la bacteria competente, es
decir, preparada para la entrada del ADN.
El mtodo qumico consiste en tratar a las bacterias con una solucin de CaCl 2 en fro, y a
continuacin someterlas a un choque trmico a 42C (Mandel & Higa 1970). Esto mejora
sustancialmente la eficiencia de transformacin de las bacterias (106-109 transformantes/g
de ADN plasmdico). El mtodo fsico ms utilizado es la electroporacin, que utiliza una
descarga elctrica para formar poros en las membranas de las bacterias.
Animaciones:
http://www.dnalc.org/resources/animations/transformation2.html
http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shockmethod

CLONACIN III: Seleccin y anlisis de clones recombinantes

Las bacterias transformadas se crecen en un medio selectivo que permita distinguir aqullas
que han incorporado el ADN recombinante de las que no. En presencia de antibitico
(ampicilina) crecen nicamente aqullas que han incorporado el plsmido. La presencia del
inserto puede determinarse mediante el color de las colonias (azul o blanco). El plsmido
utilizado porta la secuencia del fragmento (N terminal) de la -galactosidasa interrumpido
por el sitio de clonaje mltiple. La cepa bacteriana utilizada para la transformacin porta la
secuencia del fragmento (C terminal) de la -galactosidasa. Por complementacin entre

los fragmentos y aquellas bacterias que hayan incorporado el plsmido sin inserto,
sintetizarn una -galactosidasa funcional, no as las que tengan el inserto.
El medio de crecimiento contiene IPTG y X-Gal:
El IPTG (isopropil--D-tiogalactopiranosido) es un anlogo no hidrolizable de la lactosa
que induce la sntesis de -galactosidasa, enzima que degrada la lactosa en glucosa y galactosa.
El X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galacto-piranosido) es un sustrato que al ser
hidrolizado por la -galactosidasa libera el compuesto 4-cloro-3-bromo-ndigo, de color azul
intenso.
Las bacterias que contienen el plsmido sin inserto en presencia de IPTG expresan galactosidasa que hidroliza X-Gal y dan lugar a colonias azules. Las bacterias que contienen
el ADN recombinante, al no sintetizar el fragmento intacto, no sintetizan -galactosidasa
activa y dan lugar a colonias blancas.

PROTOCOLOS DEL BLOQUE 1

Aislamiento de ADN genmico

Voluntariamente, cada alumno/a aislar su propio ADN genmico a partir de una muestra
de saliva, empleando el kit comercial QIAmp DNA Mini kit (Qiagen).
Para ello deber evitar fumar, comer, beber y mascar chicle al menos 30 minutos antes de la
muestra, adems deber enjuagar la boca con agua durante 10 segundos.
El proceso detallado es el siguiente:
Recoger un volumen de al menos 1 ml de saliva en un tubo estril de 15 ml
Depositar 25 l de Protenasa K en un tubo eppendorf de 1,5 ml
Aadir 250 l de saliva
Aadir 250 l de Buffer AL y mezclar en vortex durante 15s (debe quedar mezclado
homogneamente y depositado en la base del tubo, sin gotas por las paredes)
Incubar la mezcla durante 20 min en un bao a 56 C
Centrifugar durante breves segundos para depositar el lquido del interior del tapn
y de las paredes del tubo
Aadir 250 l de Etanol al 100% y mezclar en vortex durante 15 s (Llamamos a
este contenido solucin lisada)
Centrifugar durante breves segundos para depositar el lquido del interior del tapn
y de las paredes del tubo
Tomar una columna montada sobre un tubo colector
Aadir toda la solucin lisada a la columna y centrifugar durante 1 min a 10000xg
(comprobar que todo el contenido ha pasado de la columna al tubo colector, si es
necesario repetir este paso)
Descartar el tubo colector y acoplar uno nuevo a la columna
Aplicar 500 l de Buffer AW1 a la columna y centrifugar durante 1 min a 8000xg
Descartar el tubo colector y acoplar uno nuevo a la columna
Aplicar 500 l de Buffer AW2 a la columna y centrifugar durante 3 min a la mxima
velocidad
Descartar el completamente contenido del tubo colector y volver a acoplarlo a la
columna. Centrifugar de nuevo durante 1 min a 14000xg para asegurar el completo
secado del filtro de la columna. Deshacerse del tubo colector
Colocar la columna sobre un tubo eppendorf nuevo y estril de 1,5 ml
Aadir 30 l de Elution Buffer o H2Odd directamente sobre el filtro de la columna.
Incubar 2 min a RT. Centrifugar durante 1 min a 8000xg
Conservar a 4 C para periodos cortos (menos de una semana) o a -20 C para
periodos ms largos. El tubo debe estar correctamente identificado con el cdigo
de anonimizacin correspondiente.

PCR
Por pareja se amplificar mediante PCR una regin del gen AR y del DRD2/ANKK1).
Se utilizarn los primers:
Gen AR:
Forward: 5-FAM- TCCAGAGCGTGCGCGAAGTGAT -3
Reverse: 5-CGACTGCGGCTGTGAAGGTTG-3
Gen DRD2/ANKK1:

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Forward: 5-CCGTCGACGGCTGGCCAAGTTGTCTA-3
Reverse: 5-CCGTCGACCCTTCCTGAGTGTCATCA-3
Cada pareja preparar un total de ocho tubos eppendorf de 0,2 ml (tres para estudiar el
gen AR y cinco para el DRD2/ANKK1).
En ellos se introducir el ADN genmico (o H2O en el control negativo) junto con la
mezcla de reaccin correspondiente, en un volumen final de 25 l.
Calcular las cantidades que hay que aadir de cada uno de los componentes

Para el gen AR:

H2O
Tampn
MgCl2
dNTPs
Primer Fw
Primer Rv
Taq Polimerasa
ADN ( H2O)

Concentracin
inicial

Concentracin
o cantidad final

10X
50 mM
10 mM
10 M
10 M
5 U/l
x ng/l

Hasta 25 l
1X
2 mM
200 M
10 pmoles
10 pmoles
2,5 U
100 ng

Volumen a
aadir

Mezcla de
reaccin (x
3,2)

Volumen a
aadir

Mezcla de
reaccin (x
5,2)

Asegurarse que el ADN y los primers son los correctos.

Para el gen DRD2/ANKK1:

Concentracin Concentracin
inicial
o cantidad final
H2O
Tampn
MgCl2
dNTPs
Primer Fw
Primer Rv
Taq Polimerasa
ADN ( H2O)

10X
50 mM
10 mM
10 M
10 M
5 U/l
x ng/l

Hasta 25 l
1X
2 mM
200 M
10 pmoles
10 pmoles
2,5 U
100 ng

Asegurarse que el ADN y los primers son los correctos.

Metemos los tubos en el termociclador, programado de la manera siguiente:
1.- 94C, 5 min
2.- 25 ciclos: 94C, 45 s + 62C, 45 s + 72C, 45 s
3.- 72C, 10 min
4.- 10C,

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Digestin con Enzimas de Restriccin

El producto de PCR del gen AR no ser digerido, se conservar adecuadamente identificada
a 4C hasta su observacin mediante electroforesis (y para ser analizado por electroforesis
capilar).
Una de las rplicas de la PCR del gen DRD2/ANKK1 se conservar
adecuadamente identificada a 4C hasta su observacin mediante
electroforesis (y para su clonacin la semana siguiente.
La otra rplica de la PCR del gen DRD2/ANKK1 ser digerida con la
enzima Taq1a (New England Biolabs) siguiendo el siguiente protocolo:
Sobre los 25 l del producto de PCR se aaden el tampn de la enzima
CutSmart (10X) necesario, 20 U de enzima (20 U/l) y H2Odd hasta un
volumen final de 30 l. Se mantiene a 65 C durante 5h, se inactiva a 80
C durante 20 min y se conserva a 4 C.
Al da siguiente, emplear 15 l de esta reaccin para comprobar mediante
electroforesis.

Electroforesis en Gel de Agarosa:

Para comprobar el ADN genmico:
Por mesa, hacer un gel de 70 ml de agarosa al 0,7 % (p/v) en TAE 1X.
Una vez fundida la agarosa en microondas, dejar enfriar hasta unos 60 C
y aadir Gel Red (CI=10000X, CF=1X). Mezclar bien agitando el matraz,
y verter en el soporte previamente preparado.
Se analizarn 2 l de cada ADN genmico, as como una muestra adicional de marcador de
tamao de ADN (1 l 100 pb ladder + 4 l de H2O) por mesa.
NOTA: El material sobrante se guardar en el congelador hasta su uso.
Finalmente, a cada muestra, hay que aadirle la cantidad necesaria de Tampn de Carga
6X, de modo que quede a una CF=1X.
Cargamos la totalidad de cada muestra en el pocillo correspondiente.
Condiciones de electroforesis: 100V durante 30-45 min, evitando que salga del gel el azul de
bromofenol.
Para comprobar la digestin enzimtica:
Por mesa, hacer un gel de 100 ml de agarosa al 2 % (p/v) en TAE 1X.
Una vez fundida la agarosa en microondas, dejar enfriar hasta unos 60 C y aadir Gel Red
(CI=10000X, CF=1X). Mezclar bien agitando el matraz, y verter en el soporte previamente
preparado.
Se analizarn 5 l de cada producto de PCR, 15 l de cada reaccin de digestin, as como
una muestra adicional de marcador de tamao de ADN (1 l 100 pb ladder + 4 l de H2O)
por mesa (en el caso del gen DRD2 se corrern tanto una muestra del material digerido como
del no digerido).
NOTA: El material sobrante se guardar en el congelador hasta su uso.
Finalmente, a cada muestra, hay que aadirle la cantidad necesaria de Tampn de Carga
6X, de modo que quede a una CF=1X.
Cargamos la totalidad de cada muestra en el pocillo correspondiente.
Condiciones de electroforesis: 100V durante 30-45 min, evitando que salga del gel el azul de
bromofenol.
NOTA: Los fragmentos amplificados tienen un tamao aproximado de 300 pb. La Figura
indica el tamao de los marcadores.

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Se conservar la imagen para concluir el genotipo para el gen DRD2/ANKK1 de cada

genoma.

Purificacin y cuantificacin del producto de PCR:

Para purificar el producto de la PCR, emplearemos el kit QIAquick PCR purification kit
(Qiagen), cuyo protocolo lo buscarn previamente los alumnos.
Purificaremos slo los productos de PCR del gen gen DRD2/ANKK1 no digeridos (NO
purificaremos los controles negativos, ni los productos digeridos del gen gen
DRD2/ANKK1, ni la amplificacin del gen AR).
Eluiremos todas las muestras en un volumen de entre 15 y 50 l y cuantificaremos el ADN
mediante espectrofotmetro. Conservaremos las muestras a 4 C hasta su prximo uso.
http://www.nanodrop.com/nucleicacid.aspx

Ligacin:
Utilizando los productos de la PCR ya purificados, realizamos la ligacin empleando una
razn molar ADN inserto /ADN vector de 10/1. Para ello hay que calcular los ng de inserto
que hay que poner para 50 ng de vector teniendo en cuenta que la masa molar de un ADN
se calcula multiplicando el nmero de pb de dicho ADN por la masa molar media de 1 pb
(660 g/mol).
Calcular las cantidades que hay que aadir de cada uno de los componentes.
Concentracin
inicial
Rapid Ligation
Buffer (vrtex!)
T4 ADN Ligasa
pGEM-T-Easy
Producto de PCR
purificado

Concentracin
(cantidad o
volumen) final

2X

1X

3U/l
50 ng/l

3U
50 ng

CI ?

x l

H2Od

Volumen a aadir
(l)

Hasta completar 10
l volumen

Cada mesa har adems un control positivo donde el ADN que se liga con el pGEM-T-Easy
es un Inserto control (2 l/reaccin de ligacin) y un control negativo, donde en vez de ADN
se pone H2O. Se dejan los tubos toda la noche en la nevera.

Transformacin bacteriana:
Preparativos previos:
1) Bloque trmico a 42C.
2) Contenedores con hielo.
3) Bao con agitacin a 37C.
Por mesa:
3) 12 ml de medio SOC a 37C en tubo Falcon.

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4) 10 Placas de Petri (2 por pareja ms 2 controles para toda la mesa) con medio de
cultivo LB con ampicilina, IPTG y X-Gal a temperatura ambiente.
Transformacin:
Por mesa, y en condiciones estriles, preparar 10 tubos eppendorf estriles de 1,5 ml
(8 muestras + 2 controles).
Poner 2 l de cada mezcla de ligacin en cada tubo y aadir 50 l de bacterias
competentes JM109 (Promega) por tubo.
Mantener 20 min en hielo.
Choque trmico: 50 s a 42C en el bloque trmico.
Meter el tubo inmediatamente en hielo durante unos 2 min.
Aadir 950 l de Medio SOC precalentado a cada tubo, e incubar durante 1,5 horas
agitando los tubos manualmente de vez en cuando.
Centrifugar 2 min a 5000 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender bien en 200 l
de SOC.
Plaquear 100 l del cultivo de bacterias. Dejar absorber durante unos 10 min, e
incubar toda la noche en la estufa a 37C, boca abajo.

Preparacin del ADN plasmdico recombinante:

Crecimiento bacteriano: En condiciones estriles, picar una colonia blanca y bien separada,
de cada placa problema (las dos muestras de cada gen; los controles no) e inocular en un
tubo con 4 ml de medio de cultivo LB con Ampicilina. Incubar hasta el da siguiente en el
bao a 37C con agitacin intensa (225 rpm).
Para purificar la construccin recombinante, emplearemos el kit Wizard Plus SV
Minipreps DNA Purification System Protocol (Promega), cuyo protocolo lo buscarn
previamente los alumnos y que se realizar en las siguientes condiciones:
1) Material de partida 2 x 1,5 ml del cultivo.
2) Se eluir con 30 l de Elution Buffer.
Cuantificamos el ADN mediante espectrofotmetro.

Secuenciacin:
Cuantificamos el ADN mediante espectrofotmetro.
Se envan 2 l mnimo de muestra a una concentracin 100-200 ng/l, por duplicado, ya que
cada muestra se secuencia dos veces usando los oligos genricos T7 y SP6
Animacin de secuenciacin:
http://www.dnaftb.org/23/animation.html

BLOQUE 2: LOCALIZACIN CROMOSMICA DE UNA SECUENCIA

DESCONOCIDA
La localizacin fsica de los genes en su emplazamiento cromosmico es determinante para
su correcta descripcin, as como para la identificacin de las relaciones entre estos, de
mutaciones cromosmicas asociadas o el estudio de los mecanismos que facilitaron sus
orgenes.
La Hibridacin in situ Fluorescente (FISH) es la tcnica ms extendida para conseguir este
objetivo, y presenta numerosas modificaciones alternativas para resolver situaciones
concretas.

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HIBRIDACIN IN SITU FLUORESCENTE (FLUORESCENT IN SITU

HYBRIDIZATION; FISH)
sta tcnica permite la localizacin fsica de secuencias sintticas de ADN o RNA en su
emplazamiento cromosmico, gracias a la unin mediante puentes de hidrgeno que se
produce entre secuencias homlogas de cidos nucleicos.
Para su consecucin se sintetiza una sonda: es decir se modifica la secuencia a localizar de
forma que se pueda localizar posteriormente. La secuencia modificada se llama sonda, el
proceso de sntesis se llama marcado y se lleva a cabo de forma previa al experimento de
FISH. Tambin previamente se sintetizan preparaciones con abundantes metafases fijadas
sobre las que se unir la sonda.
El experimento de FISH comienza con el procesado de los preparados, que son
generalmente permeabilizados y deshidratados. Despus, las muestras son desnaturalizadas
para generar ADN de cadena sencilla en los cromosomas.
La sonda tambin desnaturalizada (cadena sencilla) se pone en contacto con los preparados.
Al estar desnaturalizados sonda y cromosomas, la primera se unir a los segundos en las
regiones donde sus secuencias de nucletidos presenten homologa y se reconozcan, y donde
se puedan formar enlaces mediante puentes de hidrgeno. Para que este proceso se lleve a
cabo se mantienen en contacto preparados y sondas durante un periodo de tiempo largo
(aprox. 12 h).
Al da siguiente se llevan a cabo una serie de lavados en los que se controlar la astringencia
del experimento, que determinar la especificidad de la unin de la sonda al material del
preparado. Posteriormente se proceder al revelado de la sonda, esto es a la deteccin de la
sonda (revelado) con los reactivos que nos permitirn hacerla visible, puesto que al estar
marcada la sonda puede ser localizada.
Generalmente la observacin de la sonda se realiza mediante microscopa de fluorescencia
(o confocal).
Para su proceso completo, la FISH implica procedimientos adicionales, como la elaboracin
de preparados, el marcado, el anlisis de resultados mediante microscopa de fluorescencia,
y en muchas ocasiones anlisis digital de imgenes. Asimismo, la variedad de potenciales
situaciones susceptibles de ser estudiadas mediante este tipo de aproximacin han supuesto
el origen de una gran cantidad de tcnicas que suponen una sutil modificacin de la FISH, y
que permiten resolver situaciones concretas.

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(De Speicher y Carter, 2005)

PREPARACIONES
Los resultados de los experimentos de FISH se pueden observar sobre distintos soportes,
cada uno de los cuales presenta caractersticas propias, entre las que destaca una capacidad
de resolucin distinta que lo hace ms apropiado para una determinada circunstancia o
estudio.
Los soportes ms habituales para observar hibridaciones son: cromosomas, interfases, fibra
extendida o microarrays.
En nuestro caso emplearemos cromosomas e interfases (tradicionalmente el soporte ms
comn). Para ello partiremos de muestras de sangre perifrica que sern tratadas (cultivadas,
colchicinadas, etc).
Una vez fijado el material, existen dos formas principales de producir preparaciones de
cromosomas:
-extendido: una gota del material y en suspensin se lanza sobre el portaobjetos, el impacto
contra el cristal produce la adherencia de los cromosomas. No se emplea cubreobjetos (ste
ser el mtodo que emplearemos).
-aplastado: el material no es susceptible de extenderse por s slo y deber ser extendido
mediante la aplicacin de fuerza externa. Implica el uso de cubreobjetos que tendr que ser
retirado (mediante el uso de N2).
La presencia de cromosomas en el material empleado puede ser natural (meiosis) o forzada
(cultivos colchicinados), y siempre debern estar fijados para su preservacin. La obtencin
de unos adecuados cromosomas para la visualizacin de los resultados resulta indispensable
para la correcta interpretacin de los resultados, y se trata de un proceso comprometido y
delicado en muchos casos (particularmente en algunas especies).

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MARCADO DE SONDAS
El marcado es el procedimiento mediante el cual una secuencia se modifica de forma que se
pueda reconocer tras el experimento de FISH. Para ello se sustituyen algunos nucletidos
por fluorforos o molculas trazadoras que cumplen su misma funcin pero adems son
susceptibles de ser reconocidos.
Existen distintos procedimientos de marcado: Nick Translation, Random Primed, PCR,
DOP-PCR, Rolling circle, PCR
Adems existen dos tipos de marcado:
-directo: la propia sonda emite fluorescencia
-indirecto: se requiere el empleo adicional de uno o ms anticuerpos para detectar la sonda

MICROSCOPA
La observacin de las sondas sobre el material gentico de los preparados requiere
instrumentalizacin adicional. Debido al tamao de stas y a las metodologas empleadas en
su sntesis, la forma ms habitual de visualizar la hibridacin es el empleo de microscopa
fluorescente o confocal, aunque existen medios adicionales para determinados experimentos
(arrays, chips).
En nuestro caso emplearemos microscopa fluorescente. En sta los fluorcromos presentes
en la sonda emiten fluorescencia de una determinada longitud de onda (visible) cuando son
excitados mediante el microscopio de fluorescencia a otra longitud de onda especfica.
Por ejemplo: La fluorescena emite fluorescencia verde (=517 nm) cuando se excita con luz
azul (=494 nm). Asimismo, el conjunto del material gentico ser contrateido
inespecficamente con DAPI (4 ',6-diamino-2-fenilindol), que se excita con luz cercana al UV
(=345 nm) y emite en azul (=455 nm). Por tanto, para la observacin se requerir un
microscopio de fluorescencia con filtros especficos que permitan la excitacin con luz
cercana al UV (=345 nm) y azul (=494 nm).
Animacin sobre Microscopa de Fluorescencia:
http://www.jove.com/science-education/5040/introduction-to-fluorescence-microscopy

CAPTURA, PROCESADO Y ANLISIS DIGITAL DE IMGENES

En muchos casos la observacin de los resultados de visu no es suficiente para interpretar,
corroborar o demostrar un resultado, y es necesaria la toma de imgenes y/o el procesado
y/o anlisis de las mismas.
Para todo ello existe material especfico:
-Cmaras CCD acopladas a microscopios (con soportes informticos de captura): permiten
la toma de imgenes digitales modificando las variables habituales en fotografa: resolucin,
tiempo de exposicin, etc
-Programas de procesado de imgenes: Permiten llevar a cabo modificaciones en las
imgenes obtenidas. Algunos de los ms habituales son Adobe Photoshop y Corel Draw.
-Programas de Anlisis Digital de Imgenes (DIA): permiten valorar caractersticas de las
imgenes, es decir permiten obtener resultados sobre stas, tanto cuantitativos como
cualitativos. Sus capacidades de deteccin son mucho ms sutiles que las humanas y por
tanto su precisin es muy alta adems de objetiva. Algunos de los ms conocidos son ImageJ
(que adems es gratuito), LeicaQwin

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PROTOCOLOS DEL BLOQUE 2

Obtencin de cromosomas metafsicos (cultivos)

Da 1:
Extraer sangre en un tubo de heparina litio (los alumnos la recibirn ya extrada)
Extraer 500 l de sangre a un tubo (de 15 ml de volumen) con 5 ml de PB-MAX
karyotyping medium (GIBCO)(medio de cultivo adecuado con RPMI, Suero, LGlutamina, Fitohemaglutinina y antibiticos). Mantener 72 h a 37C
Da 2 (al cabo de 72h):
(Atemperar KCl 0.075M y Colcemida 37C)
Al cabo de las 72h, aadir 50 l de Colcemida (KaryoMAX Colcemid Solution
GIBCO)(10 g/ml) al tubo. Mantener 30 min-1h a 37C. PRECAUCIN CON LA
COLCEMIDA
Centrifugar 1500 rpm (centrfuga de tubos de 15 ml) durante 10 min
Retirar sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio (dejar ms o menos 0.5 ml)
Aadir KCl 0.075 M (5 ml) primero despacio y luego recoger y soltar violentamente con
una pipeta Pasteur de vidrio.
Mantener a 37C durante 15 min
Centrifugar a 1500 rpm durante 7 min
(Preparar Carnoy; Metanol 3: cido actico 1)
Retirar sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio (dejar ms o menos 0.5 ml)
Deshacer el pellet inyectando aire con la pipeta para dejar las clulas accesibles
Aadir 5 ml de carnoy con la pipeta Pasteur, homogenizar vigorosamente
Dejar 5 min a RT
Centrifugar a 1500 rpm durante 5 min
Retirar sobrenadante
Aadir 5 ml de Carnoy y homogenizar
Dejar 5 min a RT
Centrifugar a 1500 rpm durante 5 min
Retirar sobrenadante (no apurar para evitar perder ncleos)
Aadir 5 ml de Carnoy y homogenizar
Dejar 5 min a RT
Centrifugar a 1500 rpm durante 5 min
Retirar sobrenadante (se puede volcar en un vaso de precipitado)
Aadir la cantidad final de carnoy (depende del tamao del pellet)
Conservar a -20C

Marcado de sondas mediante PCR

Cada pareja de prcticas dispone de un ADN genmico a partir del cual se aislar y marcar
una secuencia repetida especfica del centrmero del cromosoma 17 mediante PCR.
En esta sonda indirecta las timinas estarn parcialmente reemplazadas por Digoxigenina-11dUTP, una molcula trazadora que posteriormente podr ser detectada en el proceso de
FISH y revelada con fluorescencia.

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H2O
Tampn
MgCl2
dNTPs + Dig
Primer Fw
Primer Rv
Taq Polimerasa
ADN ( H2O)

Concentracin Concentracin
inicial
o cantidad final
Hasta 25 l
10X
1X
50 mM
2 mM
1 mM
100 M
10 M
10 pmoles
10 M
10 pmoles
5 U/l
1,25 U
x ng/l
100 ng

Volumen a
aadir

Mezcla de
reaccin

Metemos los tubos en el termociclador, programado de la manera siguiente:

1.- 94C, 5 min
2.- 35 ciclos: 94C, 30 s + 62C, 45 s + 72C, 45 s
3.- 72C, 10 min
4.- 10C,
Tras la reaccin medir la concentracin en espectrofotmetro
Conservar los productos de PCR (en adelante sondas) en congelador hasta su uso

Protocolo FISH
DA 1. PREPARACIONES:
Todas las incubaciones tendrn lugar en jarras Coplin (volumen aproximado 65 ml).
Por pareja:
Depositar una gota del cultivo fijado con cromosomas metafsicos con una pipeta
Pasteur de vidrio desde unos 15 cm de altura sobre un portaobjetos limpio, exponer
a un ambiente de humedad y dejar secar totalmente a 37 C (en estufa). Comprobar
la calidad de las metafases en un microscopio con contraste de fase (40X)
Una vez identificada las regin del portaobjetos donde se encuentran las fases ms
adecuadas para la visualizacin de los resultados (metafases sin citoplasma y bien
extendidas), se marcar la zona realizando una muesca sobre el portaobjetos con una
punta de diamante. Sobre esta regin de inters (rea de 24 x 24 mm aprox.)
eyectaremos los reactivos en las etapas sucesivas del experimento

(Otro da:)
Una vez secas, depositar las preparaciones en la Solucin de Pepsina durante 5 min
a 37 C (Solucin de Pepsina (50 g/ml): diluir 1/20 la Solucin de Pepsina Stock
en HCl 0,01 M, llevar a 37 C)
Introducir las preparaciones en PBS 1X (Tampn fosfato salino; pH 7.3) para
inactivar la actividad de la pepsina.
Lavar las preparaciones en PBS 1X en agitacin durante 5 min a RT
Deshidratar las preparaciones en una serie de etanoles (70, 90 y 100%) durante 3 min
en cada uno
Dejar secar las preparaciones al aire

DA 2. HIBRIDACIN:
Simultanear el tratamiento de las preparaciones y la sonda:
PREPARACIONES:

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Incubar las preparaciones en Formamida al 70% (en 2XSSC) a 70C durante 3 min
Deshidratar las preparaciones en una serie de etanoles (70, 90 y 100%) durante 3 min
en cada uno
Dejar secar las preparaciones al aire
Aadir la sonda completa previamente completada y desnaturalizada sobre la regin
de inters de la preparacin (cubrir con un trozo de parafilm de 22x22 mm)
Incubar la preparacin en cmara hmeda a 37 C durante al menos 12 h
SONDAS:
En un tubo eppendorf completar la sonda aadiendo:
4,5 l de sonda (entre 1 l y 20 l)
10,5 l Mezcla de Hibridacin al 70%
X l de H2Odd (hasta un volumen final de 25 l)
(mezclar completamente)
Desnaturalizar en un bao a 73C durante 10 min
Incubar en hielo durante 5 min
Depositar sobre la regin de inters de la preparacin (cubrir con cubre de vidrio de
22x22 mm) (ver PREPARACIN)
(Dejar preparado un coplin con 70 ml de Formamida al 50% en 2X SSC)

DA 3. LAVADO Y REVELADO:
Sacar las preparaciones de la cmara hmeda, retirar cuidadosamente el cubreobjetos
de parafilm
Lavar en Formamida al 50% en 2X SSC durante 10 min a 42 C (agitar)
Lavar en 2X SSC durante 5 min en agitacin a RT
Lavar en 4T durante 2 min en agitacin a RT
Escurrir el exceso de lquido, secar la parte inferior del portaobjetos y depositar en
cmara hmeda
Depositar 30 l de Bloqueante de anticuerpos (bajo un cubre de Parafilm) e incubar
en cmara hmeda durante 5 min a 37 C
Escurrir el exceso de lquido
Depositar 30 l del anticuerpo Antidigoxigenina-Fluorescena (Roche). Incubar (bajo
un cubre de Parafilm) en cmara hmeda durante 25 min a 37 C
Escurrir el exceso de lquido
Lavar 3 veces en 4T durante 2 min en agitacin a RT
Montar con 12 l de DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) (1/50) con cubre de vidrio
de 24 x 24
Conservar a 4 C en oscuridad hasta su observacin en microscopio de fluorescencia
(DAPI; exc: 345 emi: 455) (FITC; exc: 494 emi: 517)

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BIBLIOGRAFA CITADA
Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic
amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp
Quant Biol 51: 263-73 (1986)
Arber W. DNA modification and restriction. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 14: 1-37
(1974)
Nathans D, Smith H O. Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of
DNA molecules. Annu Rev Biochem 44: 273-93 (1975)
Smith HO, Danner D B, Deich R A. Genetic transformation. Annu Rev Biochem 50: 4168 (1981)
Mandel M, Higa A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J Mol Biol 53:
159-62 (1970)
Speicher M R, Carter N P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with
molecular biology. Nature Reviews 6: 782-792 (2005)

ENLACES DE INTERS
Diseo de oligonucletidos:
http://www.humgen.nl/primer_design.html
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx
Anlisis de restriccin de molculas de ADN:
http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
http://tools.neb.com/NEBcutter2/
Archivos de secuencias
Chromas Lite http://technelysium.com.au/?page_id=13
http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html
Bases de datos
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.ensembl.org/index.html
Alineamiento de secuencias (ADN, protenas)
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.ch.embnet.org/index.html
http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html
http://web.expasy.org/sim
Alineamiento de secuencias mltiples (ADN, protenas)
Clustal W2 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/
http://www.genome.jp/tools/clustalw
http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW-XXL.html
Traductor ADN Protena:

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http://web.expasy.org/translate/
Manual de Hibridacin in situ no-radioactiva:
https://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/InSitu/InSi_toc.htm
Bases de datos de artculos cientficos:
-PUBMED (del National Center for Biotechnological Information del National Institute of
Health de EE.UU.):
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=PubMed
Gestores Bibliogrficos:
-Refworks (la UAM tiene adquirida la licencia):
http://biblioteca.uam.es/
-Endnote (desde ISI Web of Knowledge. Gratuito gracias a la licencia de FECYT y el
MICIIN): http://www.accesowok.fecyt.es/endnoteweb/