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Pptidos y Protenas

Dos molculas de un aminocido pueden unirse de forma covalente a


travs de un enlace amida sustituido: Enlace peptdico
Composicin de las protenas: son macromolculas muy grandes,
compuestas
de aminocidos unidos entre s mediante enlaces
peptdicos.
Las protenas se forman a partir de la combinacin de 20 aminocidos
distintos, que estn en ellas con un orden y proporcin definidas
genticamente para cada protena es decir la estructura proteica la
establece la informacin gentica.
El termin protena se aplica a los polipptidos, generalmente mayores
a 50 aminocidos capaces de adoptar una estructura tridimensional.
Niveles estructurales de las protenas
Estructura Primaria: Es una descripcin de todos los enlaces
covalentes (principalmente enlaces peptdicos y puentes de disulfuro)
que unen los aminocidos de una cadena poli peptdica
Estructura Secundaria: es el enrollamiento o plegamiento
del polipptido producido por enlaces de hidrogeno.

regular

Tipos de estructuras secundarias


a) Hlice alfa: Es una regin en la que la cadena polipeptdica forma
un enrollamiento en espiral. Esta es la unidad estructural bsica
de algunas protenas fibrosas, como las del pelo la piel y las uas.
b) Lamina plegada beta: los puentes de hidrogeno se forman entre
polipptidos diferentes formando una estructura plegada
semejante a una hoja de papel, que se ha plegado o doblado para
formar un abanico
Estructura Terciaria: Se refiere a la conformacin tridimensional
completa de un polipptido. La mayora de las estructuras terciarias son
globulares o fibrosas.
Estructura Cuaternaria: Se refiere al ensamble de 2 o ms cadenas
polipeptdica o subunidades separadas que se unen por medio de
interacciones de enlace entre ellas.

Estrategias de Estudio

Para el estudiar una protena en detalle es necesario separarla del resto


de las protenas y disponer de las tcnicas que permiten determinar
sus propiedades.
Extraccin y purificacin
Los mtodos clsicos
de separacin
de protenas aprovechan
propiedades que varan de una protena a otra, entre las que se incluye
el tamao, la carga y las propiedades de la unin.
La fuente de una protena
microbianas.

son generalmente

clulas tisulares o

1er pas para cualquier purificacin de protenas


Es la rotura de estas clulas, para liberar sus protenas en una solucin
denominada extracto crudo
Normalmente el extracto se somete a tratamientos que separan las
protenas
en diferentes
fracciones: Proceso denominado
fraccionamiento
Pasos inciales para el fraccionamiento de una purificacin
Utilizan diferencias en la solubilidad de las protenas, que es una
compleja funcin de pH, temperatura, concentraciones de sal y otros
factores.
La solubilidad de las protenas disminuye generalmente a
concentraciones elevadas de sal, un efecto denominado Salting Out
La adicin de estas sales puede en cantidades apropiadas puede
precipitar
selectivamente
algunas protenas, permaneciendo las
restantes en disolucin.
Las protenas a si precipitadas se separan de las que permanecen
disueltas mediante centrifugacin a baja velocidad.
Dilisis: Es un procedimiento que separa las protenas
disolventes aprovechando el mayor tamao de las protenas.

de los

Mtodos ms potentes para el fraccionamiento de protenas


utilizan la cromatografa en columna, que aprovecha las
diferencias de carga, tamao, afinidad de unin y otras
propiedades de las protenas
Mtodos cromatogrficos en la purificacin
1. Cromatografa de intercambio inico: Aprovecha las diferencias
en el signo y la magnitud de las cargas elctricas netas de las

protenas a un pH determinado la matriz de las columnas en un


polmero sinttico (resina) que tiene unidos grupos cargados los que
tienen grupos
anicnicos
se denominan
intercambiadores
catinicos y los que tienen unidos grupos catinicos se denominan
intercambios anicnicos .
2. Cromatografa por afinidad: Se separa las protenas en funcin de
su especificidad de unin
3. Cromatografa
de exclusin por tamao: llamada tambin
filtracin en gel, separa las protenas en funcin de su tamao

Identificacin
La electroforesis es un proceso muy til como mtodo analtico de
protenas. Su ventaja es que adems de separar las protenas, permite
visualizarlas, con lo que es posible hacer una estimacin rpida del
nmero de protenas en una mezcla o del grado de pureza de una
preparacin proteica. Tambin permite la determinacin de propiedades
cruciales de una protena como su punto isoelctrico y su masa
molecular aproximada.
Se lleva a cabo generalmente en geles de poliacrilamida. El gel acta
como un tamiz molecular retrasando la migracin de las protenas de
manera aproximadamente proporcional a su cociente carga/masa.
Aunque puede ser afectada por la forma de la protena. En la
electroforesis, la fuerza que mueve a las macromolculas es el potencial
elctrico, E. Su movilidad electrofortica, , es el cociente de la
velocidad de la partcula, V, y el potencial elctrico. Tambin es igual a
la carga neta de la molcula, z, entre el coeficiente friccional, f, que
refleja en parte la forma de la protena. Por lo tanto, el desplazamiento
de la protena est en funcin de su tamao y forma.
SDS: Generalmente se emplea el dodecil sulfato sdico, SDS, que se une
a la mayora de las protenas, en una cantidad aproximadamente
proporcional a la masa molecular de la protena (una molcula de SDS
por c/ 2 residuos aminocidos). El SDS da una gran carga negativa,
haciendo insignificante la carga intrnseca de la protena y confiere a
todas las protenas un cociente carga/masa similar. Las electroforesis en
presencia de SDS separa casi exclusivamente en funcin de masa, de
modo que polipptidos pequeos se desplazan ms rpido. Despus, las
protenas se visualizan aadiendo un colorante que se fija a estas pero
no al gel. De esta manera, se comparan las posiciones de diferentes

protenas en el gel, que da informacin importante sobre protenas


desconocidas.
Enfoque Isoelctrico: Separa las protenas segn sus puntos isoelctricos
(pI). Se establece una gradiente estable de pH en el gel. Se coloca una
mezcla de protenas en un pocillo en el gel, y con la aplicacin de un
campo elctrico, las protenas entran en el gel y se desplazan hasta
alcanzar un pH equivalente a su pI.
Enfoque Bidimensional: Combina el uso de SDS con el enfoque
isoelctrico y permite separar protenas de idntica masa molecular por
su pI o viceversa.
Cuantificacin
En el caso de protenas enzimticas, se puede determinar la cantidad de
enzima en funcin del efecto cataltico que esta produce, es decir, el
incremento de la velocidad a la cual su sustrato se convierte en
productos de la reaccin cuando est presente la enzima.
Para esto debe conocerse:
-La ecuacin global de la reaccin catalizada.
-Un procedimiento analtico para determinar la desaparicin del sustrato
o la aparicin de un producto.
-Dependencia de la actividad enzimtica respecto a la concentracin de
sustrato.
-Si se requieren cofactores, como coenzimas o iones metlicos.
-El pH ptimo en el que trabaja la enzima.
-La zona de temperatura donde la enzima sea estable y tenga una
actividad elevada.
La actividad enzimtica se refiere a las unidades totales de enzima en
una solucin, mientras que la actividad especfica es el nmero de
unidades enzimticas por unidad de protena. La actividad especfica
conforme aumenta la pureza de la enzima. Una unidad (1.0) de actividad
enzimtica es la cantidad de enzima que produce la transformacin de 1
mol de sustrato por minuto a 25 C en condiciones ptimas.
Para las protenas que no son enzimas
cuantificacin de acuerdo a su funcin.

se

usan

Determinacin de la Secuencia.

mtodos

de

Gracias a las bases de datos genmicas es posible derivar las


secuencias de un enorme nmero de protenas de forma indirecta a
partir de la secuencia de ADN.
Los polipptidos cortos se secuencian usando procesos automticos por
ejemplo el uso del 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno para marcar el residuo
amino-terminal. Despus se hidroliza el polipptido con HCl 6M para
obtener los aminocidos constituyentes y se identifica el aminocido
marcado.
Para secuenciar un polipptido completo se utiliza la degradacin de
Edman, que marca y elimina solo el residuo amino-terminal. Se
reacciona el pptido con fenilisotiocianato en condiciones alcalinas
suaves, lo que convierte al amino-terminal en un feniltiocarbamilo (PTC).
El enlace contiguo se rompe mediante reaccin con cido
trifluoroactico anhidro, que conlleva la eliminacin del aminocido
amino-terminal. Ese se extrae con disolventes orgnicos, se convierte en
un derivado ms estable y se identifica.
Despus, se repite el procedimiento con el nuevo aminocido aminoterminal. Eso se hace hasta que se determina toda la secuencia. Este
procedimiento se realiza en secuenciadores, que mezcla las cantidades
correctas de reactivos, separa los productos y los registra.
Las protenas grandes deben fragmentarse debido a la dificultad de
secuenciar polipptidos muy largos. Los pasos para su secuenciacin
son:
-Se rompen los enlaces disulfuro si es que existen, debido a que
interfieren con la secuenciacin al mantener unidas cadenas de pptidos
o al interferir con la rotura qumica o enzimtica del polipptido.
-Se rompe la cadena polipeptdica usando enzimas proteasas que
catalizan la rotura hidroltica de enlaces peptdicos, incluso algunas solo
cortan enlaces adyacentes a aminocidos especficos, fragmentando de
manera predecible y reproducible.
-Se secuencian los pptidos por degradacin de Edman.
-Ahora, se determina el orden de los fragmentos tomando una muestra
del polipptido intacto usando una enzima o reactivo diferente, para
obtener fragmentos distintos a los originales. Se separa y secuencian,
estas secuencias se examinan con el fin de encontrar una continuidad
por el solapamiento de aminocidos. Esto se puede repetir varias veces.

-Por ltimo, se localizan los puentes disulfuro tomando una muestra y


fragmentndola dejando intactos los puentes disulfuro, se separan por
electroforesis y se comparan con el conjunto original de pptidos.
Sntesis qumica
Existen tres maneras de obtener un pptido:
1.- Por purificacin a partir de tejidos.
2.- Por ingeniera gentica.
3.- Por sntesis qumica.
La complejidad de las protenas hace que la sntesis a travs de mtodos
orgnicos convencionales
de pptidos de ms de cuatro o cinco
aminocidos sea imprctica. Un problema es la dificultad de la
purificacin en del producto despus de cada paso.
La sntesis ms importante de pptidos se hace adhiriendo un soporte
slido a uno de los extremos. El soporte es una resina contenida en una
columna, evitando el crecimiento por ambos lados. El pptido se hace
crecer un aminocido a la vez, a travs de un juego de estndar de
reacciones en un ciclo repetitivo. A cada paso exitoso, grupos qumicos
protectores bloquean las reacciones indeseadas. Esta tecnologa es
ahora automatizada. Su limitacin ms importante es la eficiencia de
cada ciclo qumico.

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