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Plan
Point de vue clinique
Anamnse
Examen clinique
Recommandations GFHT
Point de vue diagnostic
Tests de dpistage de premire intention
Tests de dpistage de deuxime intention
Tests spcialiss
Anamnse
Premier test de dpistage du risque hmorragique
Mise en vidence de pathologies susceptibles d'entraner une
anomalie de l'hmostase primaire
Antcdents
Familiaux
Personnels
Chirurgicaux et obsttricaux
Anmie, supplmentation martiale
Hospitalisation ou transfusion sanguine
Prises mdicamenteuses
Examen clinique
Rechercher des hmorragies de type cutano-muqueux
Purpura
Saignements prolongs la coupure
Epistaxis, gingivorragies
Mnomtrorragies
Hmorragies digestives
Paramtres
Recommand
Garrot
<1min
Peu serr
Hmoconcentration
Activation de la fibrinolyse
Fibrinogne, facteurs VII, VIII, XII
*Cattaneo M et al. J Thromb Haemost 2013; 11: 11839
**Lippi et al., Blood Coagul Fibrinolysis 2005; 16 : 453-9
***Lippi et al., Clin Lab Haematol 2006; 28 : 332-7
***Tpfer et al., J Lab Med 2000; 24 : 514-20
CHU | UCL Namur
Recommand
Site de ponction
Veineux
Calibre de l'aiguille
19 22 gauge
Remplissage incomplet et
hmolyse
Recommand
Place du tube
Paramtres
Recommand
Remplissage
90%
Recommand
Homoginisation du tube
aprs le prlvement
Hmolyse
Causes
Diamtre de laiguille
Veines difficiles
Units ailettes, KT
Pose du garrot prolonge et garrot trop serr
Mauvaise homognisation du tube
Centrifugation > 1500 g
Consquences
Activation des autres lignes sanguines (leucocytes, PLT)
Release des phospholipides membranaires, de nombreuses enzymes
intra-cellulaires, dADP
Activation ou inhibition des composantes de lhmostase primaire et
de la coagulation
Perturbation de la majorit des tests dhmostase
Loeffen R. et al, J Thromb Haemost. 2012 Dec;10(12):2544-54
Lippi G. et al, Quality standards for sample collection in coagulation testing. Semin Thromb Hemost. 2012 Sep;38(6):565-75
CHU | UCL Namur
Recommand
Tube
Anticoagulant
pH plasma anticoagul
7,3 7,45
Recommand
Non rfrigr
15 25C
! Minimiser les chocs + vibrations
pour viter de dnaturer les
protines et limiter l'activation
plaquettaire
(CLSI 5me dition)
Recommand
Hmatocrite
Recommand
Double centrifugation
L'objectif est d'obtenir un taux de
plaquettes rsiduelles
dans le plasma < 10000/L
Dcantation
Dcantation
Dcantation
Un exemple dans notre laboratoire
Ralisation dun PPP
Vrification du taux de PLT rsiduelles
PPP = PRP sans plaquettes
Pour les milieux sans GR et GB : discordance entre les mthodes
de mesures :
Hmatimtre (Sysmex XN sries)
Cytomtre en flux
Mthode Impdance
Immunocomptage
adapt
Mthode Optique
10.000
13.000
Mthode Fluorescence
14.000
14.200
Recommand
Conditions standards
Centrifugation rapide
(Limite aux TQ, TCA, fibrinogne
et D-dimres)*
Temprature
*Suchsland J., Friedrich N., Grotevendt A., Kallner A., Ldemann J., Nauck M., Petersmann A., Optimizing centrifugation of coagulation
samples in laboratory automation. Clin Chem Lab Med 2014 Aug;52(8):1187-91
Recommand
Rotor
Frein
Frein dsactiv
1x/an
Critres de contrle des plasmas:
plaquettes < 10000/L sur au
moins 6 chantillons conscutifs
analyss
Pipette automatique
PLT-F
Avec frein
Sans frein
30000
29000
29000
25000
15000
9000
18000
14000
Centrifugation
Centrifugation
Recommand
Conglation
Au moins -70C
Tube non mouillable avec
bouchon vis
Capacit adapte au volume du
plasma
Dconglation
Numration plaquettaire
Sur tube EDTA K2 (recommandations ICSH)
EDTA provoque une dformation des plaquettes
Modification du volume plaquettaire moyen (VPM/MPV)
Dtermination du MPV temps bien dtermin aprs prlvement pour
permettre comparaison
Problme MPV : interprtation difficile (manque de standardisation entre
les automates, volution dans le temps)
Numration plaquettaire
par cytomtrie en flux
= Technique de rfrence
Obtention du taux de PLT en fonction du rapport entre le nombre de GR
et le nombre de PLT dtectes par CMF et le taux de GR mesurs par
lautomate de numration
Lanalyse doit tre effectue sur chantillon sanguin EDTA K2
PLT dtectes par le CD41 (AC spcifique)
Test utile si automate en difficult lors de la mesure de la thrombocytose
PLT gantes, schizocytes, dbris de GR ou de GB
Kitchen S, D. Olson J., Eric Preston G., Quality in Laboratory Hemostasis and Thrombosis, 2nd Edition, April 2013, Wiley-Blackwell.
Dempfle C-E., Tpfer G., Pre-examination procedures in laboratory diagnostics, De Gruyter, 2015, 273-281.
Influence de lhmolyse
Obstruction du flux ou allongement significatif des temps docclusion suite
activation et fragmentation des PLTs**
*Lippi et al., Blood Coagul Fibrinolysis 2013; 24(6) : 666-9
** Lippi et al., Blood Coagul Fibrinolysis 2012; 23(1) : 82-6
*Kitchen S, D. Olson J., Eric Preston G., Quality in Laboratory Hemostasis and Thrombosis, 2nd Edition, April 2013, WileyBlackwell
**Dempfle C-E., Tpfer G., Pre-examination procedures in laboratory diagnostics, De Gruyter, 2015, 273-281
Plaquettes
Extrmement ractives
Preuve : microscopie lectronique en transmission
Lagrgomtrie plaquettaire
Cytomtrie en flux
Plusieurs tudes (Yuana et al, Lacroix et al, ...) ont t ralises
concernant les tapes pr-analytiques
Protocole standardis (ISTH) pour les microparticules
Prlvement jeun
Ponction ralise avec une aiguille de calibre > 21 gauge (ou +)
Restreindre lutilisation du garrot
Eliminer les 2-3 premiers mL prlevs
Tubes citrats (109 mM/L)
Les chantillons sont apports directement au laboratoire
Si transport : pas dagitation et transport en position verticale
Cytomtrie en flux
Anticoagulants
ACD: Acid Citrate Dextrose
CTAD: Citrate Theophylline
Adenosine Dipyrimidole
Hparine
Hirudine
Citrate
EDTA
Conservation t ambiante
Si 4C : internalisation/perte de
marqueurs cellulaires, moins de risque
d'agrgation plaquettaire mais
impossible pour tude fonctions PLT
Mullier F. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2013, 11: 14
Lacroix R. et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015
LA Krueger et al. In: Current Protocols in Cytometry (2002) Unit 6.10
Cytomtrie en flux
Lacroix R. Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles : towards standardization of
protocol. J Thromb Haemost. 2012 Mar;10(3):437-46
Cytomtrie en flux
Test la mpacrine
Dcrit pour la 1re fois en 1995 par
Wall et al.
Gordon et al
Cytomtrie en flux
Test la mpacrine
Test de capture
Capture de la mpacrine par les granules denses plaquettaires
Mesure de la fluorescence verte mise par les plaquettes incubes
avec mpacrine 37 C pendant 30 minutes
Test de libration
Activation des plaquettes avec le TRAP-6
Mesurer la diminution de flurorescence et donc
la quantit de mpacrine relche
Reflte la capacit des plaquettes librer le contenu
de leurs granules denses
Cytomtrie en flux
Diagnostic des anomalies quantitatives des
glycoprotines plaquettaires
Une perte dexpression ou un dfaut fonctionnel dun des complexes
glycoprotines majeurs, GpIIb/IIIa ou GpIb/IX/V, peut conduire des
syndromes hmorragiques svres
Thrombasthnie de Glanzmann
Syndrome de Bernard-Soulier
Cytomtrie en flux
Conclusions
Le pranalytique en hmostase primaire
Commence ds la prescription de lanalyse et comprend la
prparation du patient, la qualit du prlvement et les conditions de
transport, de centrifugation et de conservation jusquau moment de
lanalyse et la mise en route de lexamen
Constitue un volet majeur dassurance de la fiabilit et de la validit
des rsultats en hmostase
Constitue les sources les + importantes des rsultats errons ou
ininterprtables
Conclusions
Si mise au point de nouvelles techniques / approches dans
ltude plaquettaire et afin dtre sensible tre rigoureux :
plaquettes = TNT !
Remerciements
Pr Bernard Chatelain
Pr Franois Mullier
Anas Bothy
Nicolas Bailly
Mat Guldenpfennig
Justine Baudar
Maryline Fagnaux
Benjamin Leyder