O Bsico: RT-PCR

por subbu Dharmaraj, MS

RT-PCR (reaco em cadeia da polimerase de transcrio-reversa) a tcnica mais sensvel para a deteco e quantificao de mRNA
disponveis no momento. Em comparao com as duas outras tcnicas vulgarmente usadas para quantificar os nveis de mRNA, anlise de Northern
Blot e do ensaio de proteco de ARNase, RT-PCR pode ser utilizada para quantificar os nveis de mRNA a partir de amostras muito menor. Na
verdade, esta tcnica sensvel o bastante para permitir a quantificao de ARN a partir de uma nica clula. Este artigo discute as vantagens da
primeira em tempo real de RT-PCR em comparao com mtodos de ponto final. Esta discusso seguido por uma descrio dos diferentes
mtodos para a quantificao da expresso de genes por em tempo real de RT-PCR no que diz respeito aos diferentes produtos qumicos
disponveis, os mtodos de quantificao utilizados e as opes de instrumentao disponvel. Posteriormente, os mtodos "tradicionais" de
expresso do gene a quantificao por RT-PCR, isto , tcnicas de ponto final, so apresentados.

Links Rpidos
Porque em tem po real de RT-PCR?
Real-Tim e PCR Qum icas
A quantificao dos resultados
Instrum entao para Real-Tim e PCR
Ferram entas para a Real-Tim e RT-PCR
Ponto final RT-PCR: vs. Relativa Com petitiva vs. Com parativo
Relativa de RT-PCR
Com petio por RT-PCR
RT-PCR com parativa
Ferram entas para qualquer tcnica de RT-PCR

Porque em tempo real de RT-PCR?

Ao longo dos ltimos anos, o desenvolvimento de novos qumicos e plataformas de instrumentao que permite a deteco de PCR , numa base de tempo real foi levado a adopo generalizada de
tempo real de RT-PCR tal como o mtodo de escolha para quantificar as alteraes na expresso de genes. Alm disso, em tempo real RT-PCR tornou-se o mtodo preferido para a validao dos
resultados obtidos a partir de matriz analisa e outras tcnicas que avaliam as mudanas de expresso de genes em uma escala global. Para apreciar verdadeiramente os benefcios de PCR em tempo
real, uma reviso dos fundamentos PCR necessrio. No incio de uma reaco de PCR, so reagentes em excesso, do molde e do produto so em baixas concentraes suficientes que a
renaturao do produto no compete com a ligao do iniciador e prossegue de amplificao, a uma taxa constante, exponencial. O ponto em que a taxa de reaco deixa de ser exponencial e entra
numa fase linear de amplificao extremamente varivel, mesmo entre as amostras replicadas, mas parece ser principalmente devido a renaturao do produto competir com a ligao (iniciador
uma vez que a adio de mais reagentes ou enzima tem pouca efeito). Em algum ciclo mais tarde, a taxa de amplificao cai para perto de zero (planaltos), e pouco mais produto feito. Por motivos
de exactido e preciso, necessrio recolher dados quantitativos referentes a um ponto em que cada amostra na fase exponencial de amplificao (j que somente nesta fase que a
amplificao extremamente reprodutvel). Anlise de reaces durante a fase exponencial em um determinado nmero de ciclo deve, teoricamente, proporcionar vrias ordens de grandeza de
gama dinmica. Alvos raras ser provavelmente abaixo do limite de deteco, enquanto alvos abundantes ser passado a fase exponencial. Na prtica, uma gama dinmica de 2-3 logs podem ser
quantificado durante a-ponto de extremidade relativa de RT-PCR. A fim de alargar esta gama, replicar reaces podem ser realizadas por um maior ou menor nmero de ciclos, de modo que todas as
amostras podem ser analisados na fase exponencial. -PCR em tempo real automatiza o processo de outra forma laboriosa quantificando produtos de reaco para cada amostra em cada ciclo. O
resultado uma surpreendentemente amplo alcance dinmico 107 vezes, sem interveno do usurio ou de repeties necessrio. A anlise dos dados, incluindo a gerao de curva padro e
clculo do nmero de cpias, realizada automaticamente. Com um nmero crescente de laboratrios e instalaes nucleares adquirindo a instrumentao necessria para anlise em tempo real,
esta tcnica est se tornando a tcnica de quantificao baseado em RT-PCR dominante.

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Real-Time PCR Qumicas

Atualmente, quatro qumicas diferentes, TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), faris moleculares, Scorpions e SYBR Verdes (Molecular Probes), esto disponveis para PCR em
tempo real. Todas estas qumicas permitem a deteco de produtos de PCR por meio da gerao de um sinal fluorescente. As sondas TaqMan, Beacons Moleculares e escorpies depender de
Transferncia de Energia de Ressonncia de Frster (FRET) para gerar o sinal de fluorescncia por meio do acoplamento de uma molcula de corante fluorognico e um inibidor moeity para os

mesmos ou diferentes substratos de oligonucletidos. SYBR Green um corante fluorognico que exibe pouca fluorescncia quando em soluo, mas emite um forte sinal de fluorescncia aps a
ligao ao ADN de cadeia dupla.

TaqMan Sondas
As sondas TaqMan dependem da actividade de 5'-nuclease da polim erase de ADN utilizados para a PCR para hidrolisar um oligonucletido que hibridado com o fragmento amplificado alvo. As
sondas TaqMan so oligonucletidos que tm um corante reprter fluorescente ligado ao 'fim e um inibidor moeity acoplado ao terminal 3' 5 fim. Estas sondas so concebidas para hibridar com uma
regio interna de um produto de PCR. No estado no hibridada, a proximidade do flor e as molculas de atenuao evita a deteco do sinal fluorescente a partir da sonda. Durante a PCR, quando a
polimerase de replica um modelo no qual uma sonda TaqMan est ligado, a 5'-nuclease de actividade das polimerase cliva a sonda. Este separa as fluorescentes e extino de corantes e Desgaste j
no ocorre. Assim, aumentos de fluorescncia em cada ciclo, proporcional quantidade de clivagem da sonda sondas TaqMan bem desenhados exigem muito pouco otimizao. Alm disso, elas
podem ser utilizadas para ensaios multiplex atravs da concepo de cada sonda com um par Fluor / tmpera espectralmente distintos. No entanto, as sondas TaqMan podem ser caros de sintetizar,
com uma sonda separada necessria para cada ARNm alvo a ser analisada.

Beacons molecular
Como sondas TaqMan, Molecular Beacons tambm usar FRET para detectar e quantificar o produto de PCR sintetizados atravs de um Fluor acoplado a 'e uma extremidade de arrefecimento rpido
ligado extremidade 3' da extremidade 5 de um substrato de oligonucletido. Ao contrrio de sondas TaqMan, Molecular Beacons so concebidos para permanecer intacto durante a reaco de
amplificao, e deve religar para atingir em cada ciclo para medio de sinal. Beacons Molecular formar uma estrutura de haste-loop quando livre em soluo. Assim, a proximidade do fluor e saciar
molculas impede a sonda fluorescente. Quando um farol molecular hibrida com um alvo, o corante fluorescente e o extintor so separados, se FRET no ocorrer, e o corante fluorescente emite luz
aps irradiao. Molecular Beacons, como sondas TaqMan, podem ser utilizadas para ensaios multiplex utilizando Fluor espectralmente separados / apagar pores de cada sonda. Tal como
acontece com sondas TaqMan, Beacons Molecular pode ser caro para sintetizar, com uma sonda separada exigida para cada alvo.

Scorpions
Com sondas Scorpion, priming especfico da sequncia e deteco do produto de PCR realizada utilizando um nico oligonucletido. A sonda Scorpion mantm uma configurao de haste-lao no
estado no hibridizada. O fluorforo est ligado extremidade 5 'e extinta por um radical acoplado extremidade 3'. A poro 3 'da haste tambm contm uma sequncia que complementar do
produto da extenso do iniciador. Esta sequncia est ligada extremidade 5 'de um iniciador especfico atravs de um monmero no amplificvel. Depois de extenso do iniciador de escorpio, a
sequncia da sonda especfica capaz de se ligar ao seu complemento no interior do fragmento amplificado estendida abrindo assim a estrutura em gancho. Isso impede que a fluorescncia a partir
de se parar a reaco e um sinal observada.

SYBR Green
SYBR Green fornece o formato mais simples e mais econmico para a deteco e quantificao de produtos de PCR em reaces em tempo real. SYBR Green se liga ao ADN de cadeia dupla, e em
consequncia da excitao emite luz. Assim, como um produto de PCR se acumula, a fluorescncia aumenta. As vantagens de SYBR Green so que barato, fcil de utilizar, e sensvel. A
desvantagem que SYBR Green ir ligar-se a qualquer ADN de cadeia dupla na reaco, incluindo dimeros de iniciadores e outros produtos de reaco no especficos, o que resulta em uma
sobreavaliao da concentrao de alvo. Para reaes individuais de produtos de PCR com primers bem desenhados, SYBR Green pode funcionar muito bem, com espria fundo no-especfico
apenas mostrando-se em ciclos muito tarde. SYBR Green a opo mais econmica para a deteco de produto de PCR em tempo real. Uma vez que o corante liga-se a ADN de cadeia dupla, no h
necessidade de conceber uma sonda para qualquer alvo particular a ser analisada. No entanto, a deteco por SYBR Green requer otimizao extensa. Uma vez que o corante no consegue
distinguir entre produto especfico e no especfico acumulada durante a PCR, ensaios de seguimento so necessrios para validar os resultados.

Reprteres em tempo real para Multiplex PCR

As sondas TaqMan, Beacons Moleculares e escorpies permitir que mltiplas espcies de DNA a ser medido na mesma amostra (PCR em multiplex), uma vez que os corantes fluorescentes com
diferentes espectros de emisso pode ser ligado s diferentes sondas. Multiplex PCR permite controles internos para ser co-amplificados e autorizaes alelo discriminao no single-tubo, ensaios
homogneos. Estas sondas de hibridao permitir um nvel de discriminao impossvel de obter com SYBR Green, uma vez que s ir hibridar com alvos verdadeiros numa PCR e no de dimeros de
iniciadores ou outros produtos esprios.

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A quantificao dos resultados

Duas estratgias so geralmente empregues para quantificar os resultados obtidos por em tempo real de RT-PCR; o mtodo da curva padro e o mtodo comparativo de limiar. Estes so discutidos
brevemente abaixo.

Mtodo curva padro

Neste mtodo, uma primeira curva padro construdo a partir de um ARN de concentrao conhecida. Esta curva ento utilizado como um padro de referncia para a extrapolao de
informaes quantitativas para alvos de ARNm de concentraes desconhecidas. Embora possam ser utilizados padres de ARN, a sua estabilidade pode ser uma fonte de variabilidade nas anlises
finais. Alm disso, utilizando-se padres de ARN iria envolver a construo de plasmdeos de ADNc que tm de ser transcrito in vitro para os padres de RNA e quantificado precisamente, um

processo demorado. No entanto, o uso de padres de RNA absolutamente quantificados ir ajudar a gerar os dados de nmero de cpias absolutos. Alm de ARN, outras amostras de cidos
nucleicos podem ser utilizados para construir a curva padro, incluindo plasmdeo purificado dsDNA, gerado in vitro ADNcs ou qualquer amostra de cDNA expressando o gene alvo.
Espectrofotometria a 260 nm pode ser usado para avaliar a concentrao destes ADNs, que podem ento ser convertidos para um valor de nmero de cpia com base no peso molecular da amostra
usada. plasmdeos de ADNc so as normas preferidos para quantificao curva padro. No entanto, uma vez que os plasmdeos de ADNc no ir controlar as variaes de eficincia do passo de
transcrio reversa, este mtodo s se obter informao sobre as alteraes relativas na expresso do mRNA. Este, e variao introduzida, devido entrada de ARN variveis, pode ser corrigido
por normalizao de um gene domstico.

Mtodo Ct comparativa
Outra abordagem denominado quantificao do mtodo Ct comparativa. Isto envolve a comparao dos valores do Ct de as amostras de interesse com um controlo ou calibrador tal como uma
amostra no tratada ou de ARN a partir de tecido normal. Os valores do Ct de tanto o calibrador e as amostras de interesse so normalizados a um gene endgeno de limpeza apropriado. O mtodo
comparativo Ct tambm conhecido como o 2- [delta] Mtodo [delta] Ct, onde [delta] [delta] Ct = [delta] Ct, amostra - [delta] Ct, referncia Aqui, [delta] CT, amostra o valor Ct para qualquer amostra
normalizada para o gene housekeeping endgeno e [delta] Ct, a referncia o valor Ct para o calibrador, tambm normalizada ao gene housekeeping endgeno. para o [delta] [delta] clculo Ct para
ser vlido, as eficincias de amplificao do alvo ea referncia endgena deve ser aproximadamente igual. Isto pode ser estabelecido olhando como [Delta] Ct varia de acordo com a diluio modelo.
Se a trama de diluio cDNA contra delta Ct prximo de zero, isso implica que os ganhos de eficincia dos genes-alvo e de limpeza so muito semelhantes. Se um gene de manuteno no pode
ser encontrado, cuja eficincia de amplificao semelhante ao alvo, ento preferido o mtodo da curva padro.

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Instrumentao para Real-Time PCR

PCR em tempo real requer uma plataforma de instrumentao que consiste de um term ociclador , um computador, pticas para a excitao de fluorescncia e de recolha de emisso, e a aquisio
de dados e softw are de anlise. Estas mquinas, disponveis de vrios fabricantes, diferem na capacidade de amostra (alguns so de 96 poos formato padro, outros processar menos amostras
ou exigir tubos capilares de vidro especializados), mtodo de excitao (alguns usam lasers, outras grandes fontes de luz de espectro com filtros ajustveis) e sensibilidade global. H tambm
diferenas especficas da plataforma na forma como os dados de processos de softw are. Mquinas de PCR em tempo real no so baratos, atualmente cerca de US $ 25K - $ 95K, mas esto bem
dentro de compra alcance das instalaes nucleares ou laboratrios que tm a necessidade de uma anlise quantitativa de alto rendimento. Para obter uma lista abrangente de tempo real
termocicladores consulte o w eblink no final deste artigo.

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Ferramentas para a Real-Time RT-PCR

Da Ambion Kit MessageSensor RT inclui uma RNase H + MMLV RT que supera claramente as enzimas MMLV RT que aboliram a atividade RNase H em tempo real experincias de RT-PCR. Ao
contrrio de muitos outros kits de qRT-PCR, MessageSensor inclui um controlo de RNA total, um controlo de GAPDH humano conjunto de iniciadores, inibidor de RNase, e nucletidos, assim como um
aditivo tampo que permite a deteco com o corante verde SYBR . O Clulas-a-cDNA Kit II produz ADNc a partir de clulas de mamfero cultivadas em menos de 2 horas. Sem isolamento de
ARN necessria. Este kit ideal para aqueles que querem realizar reaes de transcrio reversa em um pequeno nmero de clulas, amostras de clulas numerosos, ou para os cientistas que
no esto familiarizados com o isolamento do RNA. Kit Clulas-to-cDNA II da Ambion contm um romance celular Tampo de Lise que inativa RNases endgenos sem comprometer reaes
enzimticas a jusante. Aps inactivao de ARNases, o ligado celular pode ser directamente adicionado a uma reaco de sntese de cDNA. Clulas-a-ADNc II compatvel com um passo e de dois
passos em tempo real protocolos de RT-PCR. Contaminao com ADN genmico pode levar a resultados falsos positivos de RT-PCR. Ambion oferece uma variedade de ferramentas para eliminar a
contaminao de ADN genmico a partir de amostras de ARN antes da RT-PCR. Da Ambion Reagentes ADNase tratam ento, elim inao isentos de ADN foram concebidos para a remoo de
contaminantes de ADN a partir de amostras de ARN e para a remoo da ADNase aps o tratamento, sem tratamento de proteinase K e extraco orgnica. Alm disso, tambm tem desenvolvido
Ambion TURBO ADNase , uma enzima hiperactivo engenharia de ADNase bovina do tipo selvagem. A competncia de TURBO ADNase na ligao de concentraes muito baixas de ADN significa
que a enzima particularmente eficaz na remoo de pequenas quantidades de contaminao de ADN. Ambion agora tambm oferece uma alternativa econmica para o elevado custo dos reagentes
de PCR para o tubo ABI 7700 e outros 0,2 ml instrumentos em tempo real baseados. SuperTaq em tempo real um desempenho to bom ou melhor do que as alternativas mais caras, e inclui os dNTP
e um tampo de reaco optimizados para SYBR Green, TaqMan, e qumicas Beacon Molecular.

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Ponto final RT-PCR: vs. Relativa Competitiva vs. Comparativo

Apesar dos rpidos avanos feitos na rea de real-time PCR qumicas deteco e instrumentao, end-point RT-PCR continua a ser uma tcnica muito comumente usado para medir mudanas no
gene-expresso em pequeno nmero de amostras. End-point RT- a PCR pode ser utilizado para medir alteraes nos nveis de expresso usando trs mtodos diferentes: relativos, competitivos e
comparativos. Os procedimentos mais usados para a quantificao ponto final resultados de RT-PCR confiar na deteco de um corante fluorescente, tal como brometo de etdio, ou quantificao do

produto de PCR marcado com P32 por um Phosphorimager ou, em menor extenso, por contagem de cintilao. Quantificao relativa compara abundncia transcrio em vrias amostras, usando
um controle interno co-amplificada para a normalizao da amostra. Os resultados so expressos como propores do sinal especfico para o gene para o sinal de controlo interno. Isto produz um
valor corrigido em relao ao produto especfico do gene em cada amostra. Estes valores podem ser comparados entre as amostras para uma estimativa da expresso relativa de ARN alvo nas
amostras; por exemplo, 2,5 vezes mais IL-12 na amostra do que 2 na amostra 1. quantificao absoluta, utilizando competidor de RT-PCR, mede a quantidade absoluta (por exemplo, 5,3 x 105 cpias)
de uma sequncia de mRNA especfico na amostra. Diluies de um ARN sintticos (idnticos na sequncia, mas ligeiramente mais curtos do que o alvo endgeno) so adicionadas a amostras de
ARN replica e so co-amplificadas com o alvo endgeno. O produto de PCR do transcrito endgeno depois comparado com a curva de concentrao criado pelo sinttico "ARN competidor." Imita
comparativa de RT-PCR competitiva de RT-PCR, em que a mensagem de destino a partir de cada amostra de ARN concorre para reagentes de amplificao dentro de uma nica reaco, tornando a
tcnica quantitativa de forma fivel. Uma vez que o cDNA a partir de ambas as amostras tm o mesmo local de ligao do iniciador de PCR, uma amostra actua como um competidor para o outro,
tornando-se desnecessrio, para sintetizar uma sequncia de ARN competidor. Ambas as tcnicas relativas e competitivos de RT-PCR de quantificao requerem experincias piloto. No caso da
relao de RT-PCR, experincias piloto incluem a seleco de um mtodo de quantificao e de determinao da gama de amplificao exponencial para cada ARNm em estudo. Para competitivo de
RT-PCR, um ARN transcrito de competidor sinttico deve ser sintetizados e utilizados em experincias piloto para determinar a gama apropriada para a curva padro. Comparativo RT-PCR fornece
sensibilidade semelhante como RT-PCR relativa e competitiva, mas requer significativamente menos optimizao e no requer a sntese de um concorrente.

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Relativa de RT-PCR
Relativa de RT-PCR utiliza iniciadores para um controlo interno que so multiplexados na mesma reaco de RT-PCR com os iniciadores especficos de gene. O controlo interno e iniciadores
especficos para o gene deve ser compatvel - isto , eles no devem produzir bandas adicionais ou hibridam uma com a outra. A expresso do controlo interno deve ser constante em todas as
amostras a ser analisadas. Em seguida, o sinal do controlo interno pode ser usada para normalizar os dados de amostra para explicar as diferenas tubo-a-tubo causados pela qualidade varivel
ARN ou eficincia RT, quantificao imprecisa ou pipetagem. Controles internos comuns incluem -actina e GAPDH mRNAs e 18S rRNA. Ao contrrio northerns e proteco nuclease ensaios, em que
uma sonda de controlo interno simplesmente adicionado ao experimento, o uso de controles internos em relao RT-PCR requer otimizao substancial. Para os dados relativos RT-PCR para ser
significativo, a reao de PCR deve ser encerrada quando os produtos de ambos o controlo interno e o gene de interesse so detectveis e esto a ser amplificado dentro de fase exponencial (ver
Determinao exponencial na Faixa de PCR). Porque RNAs de controlo interno so tipicamente constitutivamente expressa genes de limpeza de alta abundncia, a sua amplificao supera fase
exponencial com muito poucos ciclos de PCR. Por conseguinte, difcil identificar condies compatveis fase exponencial em que o produto de PCR a partir de uma mensagem rara detectvel.
Mtodos de deteco com baixa sensibilidade, como brometo de etdio de gis de agarose, portanto, no so recomendados. Deteco de uma mensagem rara enquanto permanecer na gama
exponencial com uma mensagem abundante pode ser conseguido de vrias maneiras: 1), aumentando a sensibilidade da deteco do produto, 2), diminuindo a quantidade de molde de entrada nas
reaces de RT ou de PCR e / ou 3) por diminuindo o nmero de ciclos de PCR. Ambion recomenda a utilizao de rRNA 18S como um controlo interno, dado que apresenta menor variao na
expresso entre as condies de tratamento de -actina e GAPDH. No entanto, por causa da sua abundncia, difcil detectar o produto de PCR para mensagens raras na fase exponencial de
amplificao de rRNA 18S. Patenteada tecnologia Competimer da Ambion resolve este problema por meio da atenuao do sinal de 18S ARNr, mesmo ao nvel de mensagens raras. Atenuao
resultados do uso de competimers - iniciadores idnticos em sequncia ao funcionais 18S rRNA iniciadores mas que esto "bloqueados" na sua extremidade 3 'e, portanto, no pode ser alargado por
PCR. Competimers e iniciadores so misturados em vrias propores para reduzir a quantidade de produto de PCR gerado a partir do ARNr 18S. A Figura 1 ilustra que os iniciadores de ARNr 18S
sem competimers no pode ser usado como um controlo interno devido a amplificao de rRNA 18S que supera de clatrina (comparar os painis A e B). A mistura de iniciadores com competimers na
proporo de 3: 7 atenua o sinal de 18S ARNr, tornando 18S rRNA um controlo interno prtico (painel C).

Figura 1. Tecnologia Quantum RNA de Am bion no Multiplex RT-PCR quantitativo utilizando 18S rRNA com o um controlo interno.

reaes de RT-PCR no crebro, embrio, fgado e bao RNA total usando) iniciadores A para clatrina, B) iniciadores para primers clatrina e 18S, ou C) para clatrina, primers 18S rRNA e 18S rRNA
Competimers. Note-se que, sem Competimers, 18S no pode ser usado como um controlo interno por causa de sua alta abundncia (B). A adio de Competimers (C) faz PCR multiplex possvel,
fornecendo amostra-a-amostra quantificao relativa.

Da Ambion Quantum RNA 18S padres internos conter 18S rRNA iniciadores e competimers desenhados para amplificar 18S ARNr em todos os eucariotas. Os Universal 18S padres internos
funcionar em toda a gama mais ampla de organismos, incluindo plantas, animais e muitos protozorios. O clssico I e II clssico 18S padres internos podem ser usados com qualquer amostra de
RNA de vertebrados. Todos os padres internos 18S funcionam bem em RT-PCR multiplex. Estes kits incluem ARN de controlo e manual de instrues detalhando a srie de experincias necessrias
para tornar significativo dados relativos de RT-PCR. Para os pesquisadores que tenham validado -actina como um controlo interno apropriado para o seu sistema, os -actina padres internos
Quantum RNA esto disponveis.

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Competio por RT-PCR

Competio por RT-PCR quantifica precisamente uma mensagem por RT-PCR comparando a intensidade do sinal do produto para uma curva de concentrao gerado por uma sequncia de ARN
competidor sinttico. O transcrito de ARN competidor concebido para a amplificao por os mesmos iniciadores e com a mesma eficincia que o alvo endgeno. O competidor produz um produto
diferente em tamanho para que possa ser distinguido do produto alvo endgeno por anlise em gel. O competidor cuidadosamente quantificada e titulada em amostras de RNA replicadas.
Experincias piloto so utilizados para encontrar o intervalo de concentrao de competidor em que o sinal experimental mais semelhante. Finalmente, a massa de produto nas amostras
experimentais comparada com a curva para determinar a quantidade de um RNA especfico presente na amostra. Alguns protocolos usam concorrentes de ADN ou sequncias aleatrias para
competitiva de RT-PCR. Estes concorrentes no controlam eficazmente as variaes na reaco de RT e para a eficincia de amplificao da sequncia experimental especfico, como o fazem os
concorrentes de ARN.

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RT-PCR comparativa
Enquanto os mtodos extremamente sensvel, ambos relativos e competitivas de qRT-PCR tm desvantagens. Relativa de RT-PCR requer optimizao extensiva para assegurar que a PCR terminada
quando tanto o gene de interesse e um controlo interno so na fase exponencial da amplificao. Competitiva de RT-PCR que requer um "concorrente" exgeno ser sintetizados para cada alvo a ser
analisada. No entanto, comparativa de RT-PCR atinge o mesmo nvel de sensibilidade, estes mtodos padro de qRT-PCR, com significativamente menos optimizao. mRNAs alvo a partir de 2
amostras foram testadas simultaneamente, cada um servindo como um competidor para o outro, tornando-se possvel comparar a abundncia relativa do alvo entre amostras. Comparativo RT-PCR
ideal para a anlise de genes alvo descobertas pelos mtodos de rastreio tais como anlise de arranjo e de apresentao diferencial.

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Ferramentas para qualquer tcnica de RT-PCR

Se voc optar por executar em tempo real, parente, competitiva ou comparativa RT-PCR, oferecemos produtos para simplificar suas experincias de RT-PCR e tornar os dados mais quantitativos. Em
adio aos produtos especficos descritos acima, que oferecem superTaq polim erase , M-MLV Reverse Transcriptase , e tubos de PCR livres de RNase . Para evitar a contaminao
cruzada durante as experincias de PCR, tambm oferecemos DNAZap Solution DNA Degradao e pontas de pipeta de barreira RNase . Para uma lista completa de publicaes que
discutem praticamente todos os aspectos de tempo real RT-PCR visite w w w .w zw .tum .de /gene-quantification/real-tim e.htm l

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Informaes sobre pedidos

Catlogo #

Nom e

Tam anho

Preo de (BRL)

AM1906

DNA- livre Kit Rem oo DNA

50 reaces

536,75

AM2054

SuperTaq Alm disso polim erase (clonado) 5 U / m L

50 unidades

407,31

AM9890

ADN Zap PCR Solues de ADN de degradao

250 ml

419,19

AM1914

Kit de Isolam ento RNAqueous-se o ARN total 4PCR

30 preps

1,026.00

AM1717

Quantu m RNA Classic II 18S padro interno

100 reaces

Nos contate >

AM1718

Quantu ARNm 18S Universal Padro Interno

100 reaces

945,25

AM1710

Kit RETROscript Transcrio Reversa

40 reaces

1,486.75

Qtde

AM12225

De parede fina, a tam pa fosco, tubos de PCR livre de RNase (0,2 m L)

1000 tubos

693,50

AM1720

Quantu ARNm de p-actina padres internos

100 reaces

Nos contate >

AM2238

ADNase TURBO (2 U / m L)

1000 unidades

489,25

AM1722

Kit de clulas-a-cDNA II

40 reaces

2,137.50

AM12640

Barreira (Filter) Dicas, tam anho 10 m L (com patvel com pipetas Pipetm an )

10 prateleiras

817,00

AM1745

Kit MessageSensor RT

50 reaces

Nos contate >

AM12230

PCR Tubos & Caps, RNase, 0,2 m L (8-strip form at)

125 tiras

812,25

AM1716

Quantu m RNA clssico 18S padro interno

100 reaces

969,00

AM12635

Barreira (Filter) Dicas, tam anho 10 m L (com patvel com pipetas Eppendorf)

10 prateleiras

788,50

AM2043

M-MLV da Transcriptase Reversa (100 U / uL)

4000 unidades

503,50

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