CURVA DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS LACTICAS Y

CURVA DE SNTESIS DE ACIDO LACTICO

1.

OBJETIVO

Construir y Analizar la curva de crecimiento de bacterias lcticas en cepas

vencidas y normales.
Comparar los resultados de ambas cepas.

FUNDAMENTO TERICO Cultivos lcticos

Las bacterias del cido lctico (BAL), o tambin bacterias cido lcticas y
cultivos lcticos -por razn de sus caractersticas al ser procesadas y
multiplicadas para su utilizacin como grupo- comprenden un caldo de bacterias
fermentadoras y productoras de cido lctico, funcin por la que son empleadas
en la industria para darle ciertas cualidades a los alimentos y protegerlos contra la
accin de otros organismos dainos. Uno de ellos pueden ser los lactobacillios los
cuales aportan al producto un buen cuidado.
Caractersticas
Las bacterias lcticas son gram positivas, cido tolerantes, algunos en rangos de
pH entre 4.8 y 9.6, permitindoles sobrevivir naturalmente en medios donde otras
bacterias no aguantaran la aumentada actividad producida por los cidos
orgnicos1 Son organismos que no forman esporas, son inmviles, cocos o
bacilos con bajo contenido de guanina y citocina, y asociados todos por sus
caractersticas metablicas y fisiolgicas comunes. Estas son bacterias que
generalmente se encuentran en plantas y productos lcteos en descomposicin
produciendo cido lctico como producto metablico final de la fermentacin de
carbohidratos. Esta particularidad ha enlazado, histricamente, a los BAL con la
produccin de alimentos fermentados, pues la acidificacin que producen inhibe el
crecimiento de agentes que causan descomposicin. Ms an, algunas BAL son
productoras de bacterocinas txicas, proveyendo un obstculo adicional para los
microorganismos patognicos. De hecho, el cido lctico y otros productos
metablicos de las BAL contribuyen a las propiedades organolpticas y el perfil
textural de un alimento especfico. La importancia industrial de las BAL se

evidencia tambin porque, por lo general consideradas no peligrosas, debido a

que estn en variados alimentos y por su contribucin como flora saprfita de las
superficies mucosas humanas. Los gneros bsicos que comprenden las BAL son
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, y Streptococcus as como
los Lactobacillales Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus,
Teragenococcus, Vagococcus, y Weisella.
Los medios de cultivo para bacterias lcticas tpicamente incluyen fuentes de
carbohidratos, siendo que la mayora de estas especies son incapaces de
aprovechar la respiracin celular.
Cultivos lcteos
La percepcin con respecto a los microorganismos es que son causantes daos,
tanto para los alimentos como para los humanos, esto es cierto en los grupos de
microorganismos que provocan la descomposicin de alimentos como la carne, la
leche y las frutas. En el caso de la leche las tcnicas de control y el manejo han
hecho que los riesgos en ella disminuyan y la seguridad de sta aumente, en
algunos derivados pueden ser causante de serios perjuicios hasta el punto de
producir metabolitos mortales, como las toxinas, que se pueden evidenciar por la
presencia de manchas en el queso, sabores indeseables, hinchazn. Las
bacterias patgenas ms comunes son Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
otros como los coliformes y algunas enterobacterias.
As como hay bacterias que afectan la salud humana, hay otras que adems de
ser inocuas,2 son necesarias. Dentro de este amplio grupo se encuentran las
bacterias lcteas utilizadas en la elaboracin de queso, yogur y la mantequilla.
Estos microorganismos influyen en el proceso de acidificacin (disminucin de
pH), imprescindible para otorgarle al queso sus caractersticas propias (textura,
sabor y aroma) e impedir el desarrollo de bacterias dainas, en otras palabras
producen cambios benficos en los alimentos, cambios que pueden ser fsicos o
qumicos, en general esto hace que adems la vida til aumente. A estos grupos
se les ha denominado cultivos lcticos, cultivo starter o fermentos lcticos que a
diferencia de los potencialmente patgenos proveen caractersticas particulares
deseadas en forma ms segura y predecible.

Fermentacin
Artculo principal: Fermentacin
En la microbiologa se utilizan los trminos fermentacin y fermentaciones
industriales, para caracterizar a los procesos o tecnologas basados en el uso de
microorganismos. El trmino "fermentacin", que deriva del latn fermentar
(hervir), inicialmente solo utilizado en la actividad microbiana anaerobia, se fue
aplicando as mismo a procesos aerobios y finalmente tambin a aqullos que
utilizan clulas animales y vegetales.
La funcin primaria de los cultivos iniciadores lcticos es la produccin de cido
lctico a partir de la lactosa, que consecuentemente produce un cambio en el
estado de la leche, lquido a gel, debido a que la casena alcanza un pH de 4.4 a
4.6, llamado punto isoelctrico (carga neta cero). Este cambio en la acidez
produce inhibicin de microorganismos indeseables.
Desde el punto de vista organolptico los cultivos tiene como funcin: produccin
de sabor, aroma ocasionado por la produccin de etanol, la actividad proteoltica y
lipoltica.
Metabolismo de bacterias lcticas
Existen dos vas bsicas de fermentacin de hexosas que son usados para la
clasificacin de los gneros de BAL. En condiciones de exceso de glucosa y un
limitado uso de oxgeno, las BAL homolcticos transforman un mol de glucosa a
travs de la va glucoltica de Embden-Meyerhof-Parnas para formar dos moles de
piruvato. El balance redox intracelular se mantiene por la oxidacin de NADH con
la concomitante reduccin del piruvato en cido lctico. Este proceso genera dos
moles de ATP por cada mol de glucosa consumida. Los representantes de las
BAL

homolcticas

incluyen

Lactococcus,

Enterococcus,

Streptococcus,

Pediococcus y el grupo I Lactobacilli.

Las BAL heterofermentativas utilizan la ruta de la pentosa fosfato, en la que un
mol de glucosa-6-fosfato es inicialmente deshidrogenada a 6-fosfogluconato y
luego descarboxilada para producir un mol de CO2. El resultante pentosa-5-fosfato

es disociada en un mol de fosfato de gliceraldehdo y un mol de acetilfosfato. El

fosfato de gliceraldehdo se metaboliza luego en cido lctico, tal como en la
reaccin de los homofermentadores, con el acetilfosfato reducindose a etanol va
los intermediarios acetil-CoA y acetaldehdo. Teorticamente, los productos finales
(incluyendo el ATP) son producidos en cantidades equimolares a partir del
catabolismo de un mol de glucosa. Las BAL obligatoriamente heterofermentativas
incluyen: Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, y el grupo III Lactobacilli.
Tipos de cultivos iniciadores
Naturales
Muchas bacterias de origen desconocido, no presentan uniformidad de sus
caractersticas y los productos pueden ser de caractersticas variables. Presentan
resistencia a fagos3 y otros microorganismos. En algunos quesos como el queso
papa4 de origen colombiano se fermenta con la flora natural de la leche. El
riesgo principal al utilizar la flora natural es la inseguridad a la hora del consumo
de estos.
Seleccionados
Poca variedad de bacterias, todas conocidas y de proporciones bien definidas. su
comportamiento es muy conocido, los productos pueden tener siempre las
mismas caractersticas, fcilmente alterados por contaminantes qumicos y
biolgicos, son de menor mano de obra para su manejo se ahorra cantidad
sustancial de leche.
Simple o definido
Constituido por una cepa o un grupo de cepas identificadas. Mezcla o compuesto:
ms de una cepa, aportando cada una caractersticas especiales. Los cultivos
lcticos pueden ser categorizados en mesoflicos o termoflicos: muser nck Los
microorganismos

pueden

multiplicarse

eficientemente

en

funcin

de

la

temperatura; psicroflicos; a temperaturas de refrigeracin e incluso congelacin,

mesoflicos; entre 20 y 35 C y los termfilos entre 35 y 50 C. En el caso de los
alimentos, los ms utilizados son los dos ltimos.

Cultivos mesfilos
En la produccin de derivados lcteos este tipo de cultivo se utiliza en la
elaboracin de quesos madurados y frescos como: Barra, Pategras, Gouda,
Fresco (crema) y Mozzarella, dentro de estos tambin estn incluidos los que se
utilizan en la produccin del kumis.
Algunas de estas bacterias tienen la propiedad de producir gas carbnico, que
queda atrapado en algunos quesos dando caractersticas particulares a estos
como el emmental y gruyer
Cultivos termfilos
Estos cultivos son utilizados para elaborar quesos que se caracterizan por sus
altas temperaturas de coccin como por ejemplo Parmesano, Provolone y Suizo y
la produccin del yogurt y otros como pseudomonas.
Especies comunes
En las variedades de quesos, algunos son producidos sin cultivos; muchos
frescos, otros madurados utilizan cultivos para obtener sus caractersticas:

Quesos madurados por bacterias que modifican el queso en cuanto a

textura, sabor, incluso color; algunos ejemplos:

S. thermophilus y L. bulgaricus; usados en el provolone.

Streptococcus

lactis,

Leuconostoc

cremoris

Streptococcus

diacetylactis; en el queso Gouda.

S. lactis y/o S. cremoris - En el queso Cheddar.

L. bulgaricus y S. thermophilus - En el Romano.

Para la produccin de quesos madurados por hongos se utilizan:

Penicillium camemberti, usado para producir los quesos camembert

y brie.

Penicillium glaucum, usado para producir queso gorgonzola.

Penicillium roqueforti, que es usado para producir los quesos

roquefort, danish blue.

Cuando se trata de bebidas lcteas fermentadas adems de utilizar bacterias se

utilizan levaduras. En la bebida lctea fermentada quizs ms conocida, el yogur,
se utilizan una mezcla simbitica 5 de 2 cepas: Streptococcus salivarius subsp.
thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus nombres utilizados hoy
da. Aunque ambos se multiplican de forma independiente, el crecimiento de uno
de cada uno se ve favorecido por los cambios generados por el otro.
Reclasificacin de Streptococcus
En 1985, los miembros del diverso gnero Streptococcus fueron reclasificados en
Lactococcus, Enterococcus, Vagococcus, y Streptococcus basado en las
caractersticas

bioqumicas,

as

como

moleculares.

Histricamente,

los

estreptococos eran segregados principalmente basado en su serologa, el que se

haba comprobado que correlacionaban bien con las definiciones taxonmicas
actualizadas. Los Lactococci -anteriormente clasificadas en el grupo Lancefield N
de los estreptococos- se usan extensamente como iniciadores de fermentacin de
lcteos, estimndose que los humanos consumen 10 18 lactococci anualmente. En
parte por su relevancia industrial, ambas subespecies de Lactococcus lactis
(lactis y cremoris), son ampliamente usadas como modelos genricos de
investigacin. L. lactis ssp. cremoris, usado en la produccin de quesos duros, es
el representante en laboratorios de las sepas LM0230 y MG1363. Igualmente, se
emplea a L. lactis ssp. lactis en las fermentaciones de quesos blandos con el
principal empleado IL1403 para laboratorios de investigacin. En 2001, Bolotin et
al, secuenciaron el genoma de la sepa IL1403, coincidiendo con un cambio
significativo de los recursos para comprender la estructura genmica de otras BAL

y sus aplicaciones. Dos L. lactis ssp. cremoris han sido secuenciados y

publicados.
Bacteriofagos y los BAL
Una gran gama de productos alimenticios, mercanca qumica y productos de
biotecnologa son manufacturados industrialmente por fermentacin bacteriana a
gran escala de variados sustratos orgnicos. Debido a que se estn cultivando tan
grandes escalas de bacterias cada da, en grandes incubadoras para
fermentacin, el riesgo de contaminacin por bacterifagos es una amenaza seria
para estas industrias, de detener las fermentaciones causando prdidas
econmicas. La relacin entre bacteriofagos y sus hospedadores bacterianos es
de gran importancia en el contexto de la industria de fermentacin alimenticia. Es
de inters poder controlar su propagacin y diseminacin, crear medidas para
controlar la contaminacin por fagos y la creacin de estrategias de defensa para
restringir su presencia. La industria de lcteos ha reconocido abiertamente el
problema con los fagos y ha estado trabajando desde hace dcadas con
investigadores acadmicos y compaas de iniciadores para desarrollar estas
estrategias de defensa y sistemas para reducir la propagacin y evolucin de
bacteriofagos.
LACTOBACILLUS BULGARICUS
Lactobacilos blgaros, nombre comn con el que se conoce a las colonias de
las bacterias Lactobacillus

bulgaricus,

las

cuales

son

conglomerados

de bacterias lcticas y levaduras de asociacin simbitica estable embebidas en

una matriz de polisacridos, cuyo tamao vara de entre 5mm y 2.5 mm; de
consistencia elstica y de color blanco-amarillento (Ulloa- Lappe, 1993). A pesar
de que fueron descubiertas por el blgaro Dr. Stamen Grigorov en 1905 (1878
-1945), siendo an estudiante de medicina, las bacterias Lactobacillus bulgaricus
y Streptococcus thermophilus , las responsables de la fermentacin de la leche,
ya eran conocidas por los antiguos tracios que vivan en el territorio de la Bulgaria
moderna desde 6000-7000 a. C. Las utilizaron para inducir la fermentacin de la
leche de oveja para obtener yogur, queso, etc., y que seran los primeros
alimentos probiticos en el mundo.

Los lactobacilos blgaros presentan tres formas estructurales diferentes: laminar,

enrollada y convoluta; los microorganismos que las constituyen presentan una
disposicin de estratos definida. La forma laminar presenta dos superficies, una
lisa, colonizada por lactobacilos cortos y una rugosa, en la que predominan las
levaduras; entre ambas se encuentra una porcin intermedia, donde existe una
sustitucin de bacilos cortos por levaduras. La forma de convoluta presenta tres
capas: la externa, con predominancia de lactobacilos cortos, la media con
lactobacilos largos rectos, lactobacilos largos curvos y algunas levaduras y la
interna con lactobacilos excrementus y abundantes levaduras embebidos en una
matriz cavernosa (Aguilar, 1997).
Se utiliza en la tecnologa tradicional de la fermentacin de la leche empleando
estas bacterias como cultivo iniciador, que puede recuperarse por filtracin y
usarse infinitamente, siempre y cuando se observen algunas medidas mnimas de
higiene. Estos productos han sido importantes en la historia del hombre,
las fermentaciones han sido utilizadas por siglos en muchos pases y su origen se
pierde en los albores del tiempo. Se cree que aparecieron como resultado del
crecimiento espontneo de microorganismos bajo condiciones adecuadas para
efectuar la fermentacin y as evitar la descomposicin.
RELACIONES ENTRE VELOCIDAD DE CRECIMIENTO Y TAMAO CELULAR
Es fcil comprobar en los cultivos bacterianos que cuanto ms rico es un medio, y
por lo tanto menor es el tiempo de generacin (g), mayor es el tamao medio de
las clulas.
Bacterias creciendo en un medio relativamente pobre (supongamos que en este
medio g=60 min, C+D=g);si transplantamos una clula recin dividida procedente
del cultivo anterior a un medio ms rico (por ejemplo, que permite un tiempo de
generacin g=35 min) podemos observar que:
a. La primera divisin ocurre C+D (60 minutos) despus; es decir, con un
tiempo idntico al que tena en el medio anterior;

b.

Pero como en este medio g=35 min, la iniciacin de

una nueva ronda de replicacin ocurre antes de dicha replicacin celular
(es decir, C y D se superponen);

c.

Se observa que se alcanza un nuevo equilibrio, con un

tamao celular mayor que en el medio pobre, y una masa de inicio (tras la
divisin celular) mayor, alterndose igualmente el tiempo de inicio.

2.

MATERIALES

Equipo de incubacin anaerbica

Equipo para determinacin de acidez titulable.
Tubos de ensayo.
Un vaso de precipitado de 1 lt. Estril
Pipetas de 10, 5,5,1 ml.
Placas Petri
Cepas de Lactobacillus.
Agar Rogosa

3.

PROCEDIMIENTO
Se sembr la leche con Lactobacillus. Incubar a 43C. Controlar el
proceso

de

fermentacin.

Realizar

las

siembras

titulaciones

necesarias. La leche se tuvo que recalentar a las 11 :00 a 43 C . La

temperatura ambiente = 15-17 C, obteniendo buen resultado. En un
inicio la temperatura de incubacin era de 37-39 C, lo cual impidi el
buen desarrollo.
Utilizar una cepa con fecha de vencimiento recientemente vencida.
Comparar con los resultados anteriores. Graficar los resultados vs.

Tiempo.
4.

RESULTADOS Y DISCUSION DE RESULTADOS

TABLA N1: Resultados de cepas con fecha de vencimiento no vencida
N

Hora de
anlisis

D (acidez)

Recuento de
Ufc/ml

10:25

18

16*105

11:05

20

42*105

11:30

21

70*105

12:03

30

75*105

12:36

43

85*105

13:08

50

110*105

13:40

55

220*105

14:20

60

530*105

15:00

60

TABLA N 2: Curva de crecimiento de bacterias lcticas. Fecha de vencimiento

vencida
N

Hora de anlisis

D(acidez)

1
2
3
4
5
6
7
8
9

10:25
11:05
11:30
12:03
12:36
13:08
13:40
14:20
15:00

18
20
21
30
43
50
55
60
65

5.

CLCULOS:

Tabla 1:
X
10:25

Y
18

11:05

20

Ln de Y
2,890371
76
2,995732

Recuento de
Bacterias lcticas
Ufc/ml
16x105
42x105
70x105
75x105
85x105
110x105
220x105
530x105

11:30

21

12:03

30

12:36

43

13:08

50

13:40

55

14:20

60

15:00

60

27
3,044522
44
3,401197
38
3,761200
12
3,912023
01
4,007333
19
4,094344
56
4,094344
56

Grfico n 1: Ln Y vs tiempo

70
60
50
40
tiempo vs. Ln D

30
20
10
0
0

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

La mayor produccin de cido lctico se present hasta la 1:00, a partir de este

punto, la produccin es constante.

Grafico para comparacin:
X
10:25
11:05
11:30
12:03
12:36
13:08
13:40
14:20
15:00

Y
1600000
4200000
7000000
7500000
8500000
1100000
0
2200000
0
5300000
0
0

GRAFICO n 2: Tiempo vs. Cant. De producto.

Se observa mayor produccin apartir de 1:50 hasta 2:20

K=

(PinicialPfinal )
( Tiempo finalTiempoinicial ) (Xm )
Xm=

Xm=

Xf Xi
2

5300000+ 1600000
=3450000
2

K=

(1865)
=1.879 106
( 3 :0010 :25 ) (3450000)

Segunda muestra (fecha de vencimiento 2014)

Hora de
anlisis
10:25

D(acidez)
Y
18

11:05

20

11:30

21

12:03

30

12:36

43

13:08

50

13:40

55

14:20

60

15:00

65

Ln Y
2.8903717
58
2.9957322
74
3.0445224
38
3.4011973
82
3.7612001
16
3.9120230
05
4.0073331
85
4.0943445
62
4.1743872
7

Tiempo vs. LnY

16:48
14:24
12:00
9:36
7:12
4:48
2:24
0:00
2.8

3.2

3.4

3.6

3.8

4.2

4.4

Para hacer lectura de la cantidad de bacterias desarrolladas en cada tiempo

tomado tambin se hizo:

Hora

D Produccin
de cido lctico

9:05
9:40
10:20

18
18,5
20

Recuento bacterias lcticas

ufc/ml de leche (X).-----x106
1000000
0
1000000

11:00

32

4000000

11:40

50

6000000

12:20

64

17000000

13:00

72

34000000

13:50

78

68000000

14:20

80

75000000

Acido Lctico vs UFC/ml

80000000
70000000
60000000
50000000
40000000
30000000
20000000
10000000
0

10

De lo que se desprende que la mayor produccin denominada logartmica est

entre el antepenltimo y penltimo punto; despus de este como que cesa un
poco el crecimiento.
K=

(PfinalPinicial)
( Tiempo finalTiempoinicial ) (Xm )
Xm=

Xm=

Xf Xi
2

75000000+1000000
=37000000
2

K=

(1880)
=2.311276794 107
( 3 :0010 : 25 ) (37000000)

Se observe que la cepa vencida tiene mayor produccin de cido lctico que la no
vencida.
CONCLUSIONES
Se observ que la relacin que guardan es muy similar por lo que no

se encuentra diferencias significativas entre la cepa vencida y la normal, esto

indica sugiere que la liofilizacin es un buen mtodo de conservacin para
microorganismos.
La cepa con fecha de vencimiento correcta se desarrollo gradual y

ptimamente hasta llegar a un punto donde empez a descender rpidamente,

esto se puede deber a la muerte de la cepa. En la otra cepa el desarrollo
tambien fue correcto pero lamentablemente se presentaron problemas con la
estufa que retrasaron la produccin por temperaturas bajas.
La actividad especfica de las cepas (K) resulta para cada uno de la

siguiente manera:

Cepa1: 1,879*10-6

Cepa 2: 2,38*10-7
La segunda cepa tuvo menor actividad especfica debido al problema con la
estufa.
6.

BIBLIOGRAFA

Decheco Egusquiza, A. (1990). Microbiologia de la leche. Mexico: UNAM.

Robinson, R. K. (1987). Microbiologia de la leche. Zaragoza: Acribia, S.A.
UNAM.MX. (s.f.). Analisis de Leche y productos lacteos. Recuperado el 25
de 06 de 2016, de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Alimentosricosenprote
inas_8076.pdf
Walstra, P. (2001). Ciencia de la leche y tecnologia de los productos

lacteos. Acribia S.A.