UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

Facultad de Ciencias Naturales y Matemticas

Escuela Profesional de Biologa

PRACTICA N1 FRAGILIDAD OSMOTICA DEL ERITROCITO

Docente:
Blga. Rossalyn Acua Payano
Estudiantes:
Hidalgo Venegas, Carlos.
Toribio Gamuzo, Csar.
Vsquez Domnguez, Andrs.
Grupo:
Grupo E Viernes 16:20 18:00

2013

FRAGILIDAD OSMTICA DEL ERITROCITO

I.

INTRODUCCIN
La osmosis es un tipo especial de transporte pasivo en el cual slo
las molculas de agua son transportadas a travs de la membrana.
El movimiento de agua se realiza desde un punto en que hay mayor
concentracin a uno de menor para igualar concentraciones. De
acuerdo al medio en que se encuentre una clula, la osmosis vara.
La funcin de la osmosis es mantener hidratada a la membrana
celular. Dicho proceso no requiere gasto de energa. En otras
palabras, la osmosis es un fenmeno consistente en el paso del
solvente de una disolucin desde una zona de baja concentracin de
soluto a una de alta concentracin de soluto, separadas por una
membrana semipermeable.
La membrana celular constituye una interfase entre el compartimento
intra y extracelular que permite el libre recambio de molculas de
agua, establecindose un gradiente osmtico. La membrana celular
de los eritrocitos es flexible, pero prcticamente carece de
elasticidad, lo que significa que la clula se rompe si le entra agua
hasta exceder un volumen crtico.
Cuando la clula enfrenta un ambiente hipotnico se genera un
movimiento neto de agua libre hacia su interior. Segn el grado de
hipotonicidad y la capacidad de la membrana para mantener su
integridad, la clula se hincha y estalla permitiendo, en el caso de los
eritrocitos, la salida de hemoglobina. Esta propiedad es utilizada en
la prueba de la fragilidad osmtica eritrocitaria (FOE), que consiste
en exponer alcuotas de eritrocitos a concentraciones decrecientes
de NaCl, usualmente entre 0,85% y 0%, y luego cuantificar el grado
de hemlisis en cada una de ellas. Por lo tanto, la FOE permite
evaluar la resistencia y estabilidad de la membrana del eritrocito
frente a un estrs osmtico.
La ruptura de la membrana celular produce la salida del contenido de
hemoglobina, por lo que se puede medir la ruptura de los eritrocitos
midiendo y cuantificando la cantidad de hemoglobina liberada al
medio mediante tcnicas espectrofotomtricas.
La fragilidad osmtica del eritrocito depende de caractersticas como
la edad del eritrocito, su tamao, forma y las dems condiciones
propias de la estructura interna de la clula. Como se emplea una

poblacin de millones de clulas, la fragilidad osmtica sigue la

distribucin de una curva normal.
El objetivo de esta prctica, es conocer la fragilidad osmtica de los
eritrocitos frente a diferentes efectos fsicos y qumicos; como la
temperatura y el pH; en concentraciones decrecientes de NaCl.
II.

MARCO TERICO
Eritrocitos
Los eritrocitos son clulas sanguneas anucleadas que miden
aproximadamente 8 m de dimetro (as, unos 3000 eritrocitos en fila
ocupan 2,5 cm de longitud) y tienen forma de disco bicncavo. La
membrana del eritrocito en un complejo de lpidos y protenas
(bicapa lipdica), el cual es importante para mantener la elasticidad
celular y la permeabilidad selectiva.
Los eritrocitos pueden deformarse, sin llegar a lesionarse para poder
pasar por los ms estrechos capilares. Este grado de deformidad o
elasticidad influye en la rapidez del flujo sanguneo por la microcirculacin. Los eritrocitos son los elementos celulares ms
abundantes de la sangre. En el varn adulto existen alrededor de
5.500.000 por cc de sangre, y en las mujeres unos 4.800.000 por cc.
Un eritrocito contiene 200 a 300 millones de molculas de
Hemoglobina (Hb). La Hb consiste en la combinacin de una
molcula proteica de globina, con cuatro molculas de un compuesto
pigmentado llamado grupo hemo. Cada molcula de hemo posee un
tomo de hierro en su centro (Fe2+), por lo que, una molcula de Hb
puede transportar hasta cuatro molculas de oxgeno y formar
oxihemoglobina por medio de una reaccin reversible. La Hb tambin
puede combinarse con dixido de carbono para formar carboxihemoglobina, tambin por una reaccin reversible. El CO 2 se une a
la porcin globina de la molcula de Hb. En un varn adulto normal,
100 cc de sangre contienen 14 a 16 g de Hb; la sangre de una mujer
contiene de 12 a 14 g de Hb por 100 cc.
El proceso de formacin de eritrocitos se denomina eritropoyesis. La
vida promedio de un eritrocito circulante en el torrente circulatorio es
de unos 120 das. Se fragmentan en los capilares y son fagocitados
por las clulas retculo-endoteliales de la cubierta de los vasos
sanguneos en hgado, bazo y mdula sea.
En condiciones fisiolgicas, los eritrocitos se encuentran en equilibrio
osmtico con la sangre que los contiene (valor de osmolaridad del

plasma sanguneo: 290 10 mOsm/L), por lo cual se dice que la

sangre es una solucin isosmtica e isotnica. Si la osmolaridad del
plasma llega a disminuir significativamente (plasma hipotnico), el
agua como lquido, entra al interior celular aumentando su volumen.
Si por el contrario, la osmolaridad del plasma se incrementa, este se
torna hipertnico y el agua sale del eritrocito ocurriendo una
reduccin del volumen celular.
La forma y el volumen de los eritrocitos cambian cuando vara la
cantidad de agua contenida en su interior, pudiendo tomar una forma
estrellada o irregular al ocurrir prdida de volumen (fenmeno de
crenacin) o bien aumentar su volumen hasta adquirir la forma de
una esfera. Cuando la clula no puede resistir la carga de agua que
recibe, la membrana se rompe (fenmeno de hemlisis) y se libera la
hemoglobina la cual puede ser cuantificada por mtodos
espectrofotomtricos. La hemlisis es un proceso que ocurre en una
poblacin mixta de clulas por lo que no ocurre en un solo punto y a
la misma velocidad en todos los casos. Como el efecto final es un
tanto difcil de apreciar experimentalmente, debido a que la hemlisis
ocurre en forma que se hace asinttica al 100 % (curva aplanada), se
prefiere analizar el tiempo de hemlisis al alcanzar el 50%.
Membrana del Glbulo Rojo
La membrana del glbulo rojo es la responsable de las propiedades
mecnicas y de la mayora de las funciones fisiolgicas de la clula.
Est formada por una bicapa lipdica plana, donde predominan en el
80 % los fosfolpidos y el colesterol y en menor medida los
glicolpidos y aminofosfolpidos, distribuidos asimtricamente. De
igual forma, se encuentran embebidas parcial o totalmente en ella las
protenas integrales de membrana, unidas fuertemente por enlaces
apolares. Su libre desplazamiento a travs de esta bicapa contribuye
a mantener su fluidez. Las protenas perifricas interactan entre s
para formar una malla o enrejado que recubre la cara interior de la
doble capa de fosfolpidos y son las responsables de la estabilidad y
las propiedades viscoelsticas de la membrana. Entre estas
protenas se destacan la espectrina (Sp), la ankirina (banda 2.1, 2.2,
2.3 y 2.6), la banda 4.1, la banda 4.2, la banda 4.9, la aducina, la
tropomiosina y la banda 7. Otras protenas perifricas se disponen
hacia la cara exterior de la bicapa lipdica y ellas son
fundamentalmente antgenos de grupo sanguneo (fig.1).

Fig. 1. Estructura de la membrana eritrocitaria.

La banda 3 representa el 25 % del total de las protenas integrales.
Est constituida por 2 dominios estructurales: el dominio
citoplasmtico, que es el encargado de la unin con las protenas del
esqueleto, y el sitio transmembranoso que mantiene el contacto con
el medio extra e intracelular, proporcionando los canales
responsables del transporte de iones bicarbonato (HCO3-) y cloruros
(CI-). Adems, posee un sitio de glicosilacin capaz de unir
antgenos para el grupo sanguneo I/i e interviene activamente en la
eliminacin de eritrocitos envejecidos.
Las glicoforinas son un grupo de protenas integrales caracterizadas
por su elevado contenido en cido silico. Las glicoforinas A,B,C y D
son las ms importantes y constituyen los sustratos antignicos de
los diferentes grupos sanguneos. La glicoforina C contribuye a la
estabilidad de la membrana gracias a su interaccin con protenas
perifricas, adems de participar en el intercambio inico
transmembranoso.
La Sp es la protena ms abundante y adems la principal
responsable del mantenimiento del enrejado proteico. Est
compuesta por 2 subunidades a y b enrolladas de forma antiparalela,
las que se unen por sus extremos para formar tetrmeros. Estas 2
subunidades estn constituidas por secuencias repetitivas de 106
aminocidos, las que se enlazan para formar una triple hlice (fig.2).

Fig.2. Estructura del tetrmero de espectrina (Sp). Se observa la

triple hlice de las unidades repetitivas, los sitios de autoasociacin
de la Sp y los sitios de nucleacin donde comienza la interaccin
lateral entre las cadenas a y b de la Sp.
La ankirina (ANK) est compuesta por 3 subunidades estructurales
correspondientes a 3 dominios funcionalmente diferentes: regulador,
de unin a la membrana y de unin a la Sp. Su contribucin a la
integridad de la membrana es decisiva, ya que constituye un
importante punto de anclaje a la doble capa lipdica a travs de la
banda 3.1
La actina es una protena organizada en forma de protofilamentos
helicoidales estabilizados por la interaccin con la Sp, la protena 4.1
y la tropomiosina.
Otra de las protenas que integran el citoesqueleto es la protena 4.1,
cuya funcin fundamental es estabilizar la unin espectrina-actina y
contribuir a fijar el esqueleto a la bicapa lipdica.
El mantenimiento de la forma y estabilidad de la membrana
tambin responsabilidad de otras protenas. Entre ellas est
protena 4.2, que acta como modulador para estabilizar
interaccin ankirina-banda 3. La banda 4.9, la aducina y
tropomiosina, protegen la estabilidad de la actina.

III.

MATERIALES:
Tubos de ensayo.
Rejilla.

es
la
la
la

Estufa para Bao Mara.

Termmetro.
Micropipeta y Propipeta.
Pipetas graduadas.
Agua destilada.
Solucin salnica amortiguadora (fosfato salino) a pH 7,4 de
NaCl al 1%
Solucin anticoagulante de ethylen diamine tetra-actico 0,1%
Buffer a pH 5,6; 7,4 y 8,9.
Muestra Biolgica: Sangre de Caballo.

IV.

METODOLOGA:
Experimento N1: Fragilidad Osmtica
Para cada muestra sangunea realizar el siguiente esquema de
evaluacin:
Reactivos
Concentracin
de NaCl %
Sol. Fosfato
salino (NaCl 1%)
pH 7,4 mL
Agua destilada
mL
Sangre total con
EDTA mL.

0,00

0,10

0,35

0,45

0,5

0,55

0,6

0,7

0,85

0,00

0,1

0,35

0,45

0,5

0,55

0,6

0,7

0,85

0,9

0,65

0,55

0,5

0,45

0,4

0,3

0,15

0,01

0,01

0,01

0,01

0,01

0,01

0,01

0,01

0,01

Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente

30 minutos.
Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min.
Leer en espectrofotmetro a 530 nm usando el tubo 9 como
blanco (0% de hemlisis).
Haga una grfica de los valores de hemlisis en % contra la
concentracin de NaCl.

Experimento N2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad

osmtica
Reactivos
Concentracin

1
0,00

2
0,85

3
0,85

4
0,85

5
0,85

de NaCl %
Sol. Fosfato
salino (NaCl
1%) pH 7,4 mL
Agua destilada
mL
Sangre total
con EDTA mL.
Mezcla e
incubar a
C/30 min.

0,00

0,85

0,85

0,85

0,85

0,15

0,15

0,15

0,15

0,01

0,01

0,01

0,01

0,01

ambiente

Sobre
hielo

ambiente

37

45

Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min.

Leer el sobrenadante en espectrofotmetro a 530 nm. Usar
agua destilada como blanco.
Expresar el resultado como el porcentaje de hemlisis a cada
valor de temperatura de incubacin. Se calcula utilizando el
valor de la absorbancia del sobrenadante del tubo donde
ocurre la mxima hemlisis como el 100%.

Experimento N3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmtica

Reactivos
Concentracin
de NaCl %
pH
Sol. Fosfato
salino (NaCl
1%) mL
Agua
destilada mL
Sangre total
con EDTA mL.

V.

0,00

0,85

0,85

0,85

5,6

7,4

8,9

0,00

4,25

4,25

4,25

0,15

0,15

0,15

0,01

0,01

0,01

0,01

Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente

30 minutos.
Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min.
Leer el sobrenadante en espectrofotmetro a 530 nm. Usar
agua destilada como blanco.
Expresar el resultado como el porcentaje de hemlisis a cada
valor de pH. Se calcula utilizando el valor de absorbancia del
sobrenadante, del tubo donde ocurre la mxima hemlisis
como el 100%.

RESULTADOS
Clculos

Experimento N1: Fragilidad Osmtica

TUBO

ABSORBANCIA

1
2
3
4
5
6
7
8

0.737
0.715
0.541
0.462
0.251
0.211
0.152
0.065

Concentracion
NaCl
0
0.1
0.35
0.45
0.5
0.55
0.6
0.7

% Hemlisis
100
97.01
73.41
62.69
34.06
28.63
20.62
8.82

9
0
0.85
0
Tabla 1.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotmetro a 530nm

Experimento N1: Fragilidad Osmtica

120
100
80
% Hemolisis

60
40
20
0
0

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Cuadro 1.- Grfico de la concentracin de NaCl respecto al porcentaje de

hemolisis obtenido

Experimento N2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad

osmtica
TUBO

ABSORBANCIA

0.56

Efecto de T
Ambiente (sin
Sol. Salina)

% Hemlisis
84.72

0.482

0.588

4
5

0.661
0.595

Hielo
Ambiente (con
Sol. Salina)
37
45

72.92
88.96
100
90.02

Tabla 2.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotmetro a 530nm con

relacin al efecto de temperatura y porcentaje de hemolisis.

Cuadro N 2: Experimento N 2: Efecto de la temperatura sobre la

fragilidad osmtica; el porcentaje de hemlisis en relacin al
efecto de la temperatura.

Experimento N3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmtica

TUBO
1
2
3
4

ABSORBANCIA
1
0.043
0.166
0.219

Efecto del pH
0
5.6
7.4
8.9

% Hemlisis
----------19.63
75.8
100

Tabla 3.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotmetro a 530nm con

relacin al efecto del pH y porcentaje de hemolisis.

Cuadro N 3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmtica; el % de hemlisis en

relacin al pH.

Cuestionario
1. Una solucin salina que es isotnica para eritrocitos es
necesariamente isotnica para otro tipo de clulas?
El paso del agua hacia dentro o fuera de las clulas es un
proceso biolgico de importancia. Si las concentraciones mol/L de
solutos en ambos lados de la membrana celular son las mismas,
la presin osmtica es igual y las soluciones son isotnicas sin
que haya paso neto de lquido en ningn sentido. Por lo tanto una

solucin salina para eritrocitos o cualquier otra clula, es la

misma.
La concentracin de solutos en la sangre es isotnica con una
solucin de 0,9% de cloruro de sodio. La concentracin de cloruro
de sodio 0,85< 0,9%, se llama solucin salina normal o fisiolgica
o suero fisiolgico.
2. Cules son las causas de la hipernatremia?
El exceso de sodio en la sangre puede ser ocasionado por ciertas
condiciones.
Las causas especficas de la hipernatremia incluyen:

Deshidratacin o prdida de fluidos corporales por vmitos

prolongados, diarrea, sudoracin o fiebre alta.
Deshidratacin por no beber la cantidad suficiente de
agua.
Frmacos tales como esteroides, regaliz y ciertos
medicamentos para disminuir la presin sangunea.
Ciertas enfermedades endocrinolgicas como diabetes
(cuando la orina es muy frecuente) o aldosteronismo.
Ingestin excesiva de sal.
Hiperventilacin (respiracin demasiado rpida).

En todos los casos, la hipernatremia y por lo tanto la

hipertonicidad plasmtica, induce la salida de agua del espacio
celular al extracelular, lo que produce disminucin del volumen
celular. La disminucin del volumen neuronal se manifiesta
clnicamente por sntomas neurolgicos: letargia, reflejos
hiperactivos, temblor muscular, convulsiones y coma. Con
frecuencia, sobre todo en personas ancianas, se producen
trombosis de los senos venosos craneales, y, al disminuir el
tamao del cerebro, hemorragias cerebrales por traccin de las
estructuras vasculares. La salida del agua celular al espacio
extracelular tiende a preservar la volemia, por lo que al principio
no son aparentes los sntomas y signos de hipovolemia, que
pueden aparecer, hasta la situacin de shock, en fases
avanzadas.
3. Cmo se comportara el eritrocito en un estado de
hipernatremia?
Cuando sobreviene la hipernatremia, todas las clulas del
organismo se reducen en tamao, que es proporcional al grado
de reduccin del volumen celular; sin embargo, los mecanismos

regulatorios internos permiten restaurar, en muchas clulas, su

volumen casi normal. Los eritrocitos y las neuronas tienen esta
habilidad para regular su volumen. Una vez que han pasado ms
de 48 horas de hipernatremia; es decir, el inicio de considerarse
crnica, tendr un volumen normal a expensas del contenido de
solutos intracelular aumentado. En ese momento, rpidamente se
restaura la osmolaridad que originar una hinchazn celular, lo
que en la mayor parte de los rganos del cuerpo no tendr mayor
consecuencia; sin embargo, en el cerebro es devastadora, pues
aparecen: edema cerebral, herniacin y la muerte. De ah la
importancia del tratamiento cauteloso en la hipernatremia crnica.

VI.

CONCLUSIONES
A menor concentracin de NaCl se incrementa el porcentaje de
hemolisis, debido a que ingresa agua al eritrocito liberando
hemoglobina. La variacin del porcentaje de hemolisis influye
directamente con la lectura de las absorbancias.
En un ambiente salino se produce mayor cantidad de hemolisis
comparado con un ambiente normal. La temperatura del hielo obtiene
la menor hemolisis debido a que conserva a los eritrocitos sin ningn
cambio y por consiguiente no hay liberacin de hemoglobina.

VII.

DISCUSIONES
Para sta evaluacin tomamos en cuenta que los resultados
obtenidos son de una especie de caballo sana y joven. Los efectos
de temperatura, salinidad y pH frente a una muestra de sangre se
ven influenciada de acuerdo a las condiciones inmunolgicas del
animal (Forchetti, 2006).
Los mrgenes de error para nuestros resultados se obtuvieron en las
lecturas de las absorbancias, para i) la temperatura: sabemos que la
temperatura fisiolgica es 37C y el porcentaje de hemolisis debe ser
mnimo o nulo; sin embargo en los resultados obtenidos no se
coincide esta afirmacin; ii) el pH: de la misma forma, sabemos que
el pH fisiolgico es 7,4 y su hemolisis debe ser mnima; pero nuestras

lecturas nos indican lo distinto comparadas con lo normal (Chihuailaf,

2006).
VIII.

REFERENCIAS BILIOGRFICAS

Granados J, Fragilidad osmtica de los eritrocitos de carnero en

relacin con su uso en el laboratorio clnico, Hospital de San Juan
de Dios, Costa Rica, 1993.

Hariharan S.: Nutrition of laboratory animals. LAIS Centre News

1984; 12: 2- 35.

Lovelock J, La hemolisis de clulas sanguneas por congelacin y

descongelacin, Instituto Nacional para la investigacin mdica,
Londres Inglaterra, 1953.

Zou CG, Haemolisis of human and sheep redblood cells in glycerol

media: the effect of pH and the role of band 3. School of biological
science. Inglaterra. 2000.

Forchetti, O.; Maffrand C.; Vissio C.; Boaglio C.; Cufr G..
Hipofosfatemia y fragilidad osmtica eritrocitica en cabras. Revista
Electrnica de Veterinaria, Vol. VII, n 01, Enero/2006

Chihuailaf R H . Variaciones de la Fragilidad Osmtica Eritrocitaria

en Bovinos a Pastoreo sobre praderas con bajo contenido de
Selinio y Suplementados o no con Selenio, Instituto de Ciencias
Clnicas Veterinarias. Chile, 2006

http://scielo.sld.cu/scielo.php?
pid=S08642892002000100001&script=sci_arttext