3.

Rezultati istraivanja
Multifotonska eksitujua laserska skanirajua mikroskopija predstavlja jednu od najvanijih
metoda razvijenih u posljednje vrijeme, a koje imaju znaajnu primjenu u biomedicinskim
znanostima. Metoda je zasnovana na istovremenoj apsorpciji dva ili vie fotona. Pod
odreenim uvjetima, izlaganjem atoma ili molekula1 laserskim zracima, moe doi do
apsorpcije najee dva ili tri fotona. Promatrani molekularni sistem prelazi u vie pobueno
(eksitovano) elektronsko stanje i bilo koje vibraciono stanje tog elektronskog stanja 2.
Neradijacijskim prijelazima silazi u nia vibracijska stanja pobuenog elektronskog stanja, te
uz emisiju fotona silazi u osnovno elektronsko stanje. Dakle, za razliku od jednofotonske
apsorpcije koja pobuuje atom/molekulu na prelazak u vie kvantno stanje, ovdje imamo
nelinearan proces, proces u kojem umjesto jednog fotona, sistem ''guta'' dva (pogledati sliku
3.1) ili vie fotona manjih energija, ali u zbiru energija ono odgovara razlici izmeu dva
kvantna nivoa. Podsjetimo se da je ovakav fenomen predvidjela Gppert-Mayer, davnih
tridesetih godina prolog stoljea [R]. Ona je predvidjela da atom ili molekula mogu
istovremeno u jednom kvantnom scenariju apsorbirati dva fotona unutar jako kratkog
vremenska intervala kraeg od femtosekunde. Prva primejna dvofotonske apsorpcije je
izvedena poetkom devedesetih godina prologa stoljea [R]. Pravi zamah ova metoda
doivljava u prvom desetljeu naeg stoljea, osobito kada je u pitanju primjena u medicini i
srodnim znanostima. Valna duljina3 ta dva fotona zadovoljavaju uvjet dat relacijom [R]

1 1
, (3.1)
1 2

1
1FP

pri emu je

1FP
- predstavlja valnu duljinu koja bi odgovarali energiji jednog fotona neophodnog za
prijelaz u vie pobueno stanje,

1
- valna duljina jednog od dva fotona u dvotonskom scenariju, i

2
- valna duljina drugog fotona u dvotonskom scenariju.

1 U naem sluaju imamo bioloka tkiva koja se sastoje od razliitih molekularnih

sistema.
2 Pogledati prethodno poglavlje i Odjeljak 2.4.
3 Za intuitivno poimanje date relacije, pogledati relaciju (2.1) u prethodnom
poglavlju.

Mi emo se u ovome diplomskom radu pozabaviti injenicom da su laserski zraci koriteni u

dvofotonskoj laserskoj skanirajuoj mikroskopiji karakterisani veom prodornou u odnosu
na konvencionalne metode, odnosno ureaje koji se koriste u medicini, posebno u
oftalmologiji. U tu svrhu emo na osnovu eksperimentalno dostupnih podataka o
upotrijebljenim valnim duljinama, kao i koritenjem Rayleighovog zakona rasijanja
proraunati odgovarajui intenzitet rasijane svjetlosti. Kao to smo naglasili na poetku sve
izvedene jednadbe e biti prikazane samo u konanoj formi 4. Zanemarujui ovisnost indeksa
refrakcije (prelamanja) o valnoj duljini [R], Raylieghev zakon moemo zapisati u sljedeoj
formi

Ir :

1
, (3.2)
4

odnosno uzimajui u obzir ugao rasijanja

moemo zapisati

1 cos 2
Ir :
, (3.3)
4

gdje smo sa
oznaili valnu duljinu upotrijebljenog zraenja. Napomenimo u ovome dijelu

da je ugao povezan sa rasijanjem unprijed.

Osim gore navedenog razmatranja cilj ovoga diplomskog rada je i da se na osnovu

eksperimetalno dostupnih podataka o valnim duljinama eksitacije i emisije, izraunaju
energije na osnovu relacije (2.1), te odgovarajui rezultati analiziraju.
U ovome dijelu emo predoiti i numeriki kod kojega smo napravili (osmislili) u
programskum jeziku Fortran 77, a koji omoguava brze i jednostavne kompjuterske proraune
od interesa u biofizici i openito medicinskim aplikacijama.

program TPELM
implicit none
c

---------------------------------------------------------------------------------------

4 Sve navedene formule smo izveli, odnosno reproducirali, te biljeimo ih u onoj formi u
kojoj su koritene za proraune.

c
c
c
c
c

Program koji racuna energije prijelaza (1F I 2F), kao i energije emisije nastale
u slucaju TPELM-a. Takodjer, program racuna i Rayleigheovo rasijanje za razlicite
uglove rasijanja. U prvoj raspodjeli je data i mogucnost proracuna vremena trajanja
prijelaza. Svi proracuni se odnose na fluorofore koji su sastavni dijelovi tkiva oka.
---------------------------------------------------------------------------------------

integer i
integer lg
real*8
real*8
real*8
real*8
real*8
real*8
real*8
real*8
real*8
real*8
real*8
real*8
real*8
real*8
real*8

hp
! Planckova konstanta u Js
c
! Brzina svjetlosti u vakuumu u m/s
Ep1
! Energija 1F pobudjenja
Ee1
! Energija 1F emisije
Ep2,Ep2d,Ep2g
! Energija 2F pobudjenja
Ee2,Ee2d,Ee2g
! Energija 2F emisije
lam,lamd,lamg !Valna duljina upadnog laserskog zracenja izrazena u m
lam2,lam2d,lam2g ! Valna duljina pri emisiji u prve dvije raspodjele.
! Pomocna varijabla u preostale dvije raspodjele.
lam4
! Cetvrti stepen valne duljine u Rayleigheovom zakonu
Ir
! Intenzitet rasijane svjetlosti
theta
! Ugao rasijanja unaprijed
cs
! Varijabla povezana sa cos u raspodjeli 3
cs2
! Varijabla povezana sa cos^2 u raspodjeli 3
pi
! Broj pi
ev
! Energija u eV

parameter
parameter
parameter
parameter

(hp=6.62606896d-34)
(c=2.99792458d8)
(pi=3.141592653589793238d0)
(ev=1.602d-19)

Izbor raspodjele

c
c
c

lg=1 raspodjela po energijama u J 1F ;lg=2raspodjela po energijama za 2F prijelaze u J;

lg=3 raspodjela za intenzitet rasijanja (arb.u.); lg=4 raspodjela za intenzitet
rasijanja za razlicite uglove (theta)

lg=2

open (17,file='Rez33.dat')
open (18,file='Grafik33.dat')
open (19,file='Tabela33.dat')
c
c
c

open (17,file='Rez34.dat')
open (18,file='Grafik34.dat')
open (19,file='T2F_34NADPH.dat')

if (lg.eq.1) then

! U slucaju raspodjele 3 i 4 crtati grafik

! Tabela

! U slucaju raspodjele 3 i 4 crtati grafik

! Tabela

! Jednofotonski prijelazi

lam=351.d-9
Ep1=hp*c/lam

! Valna duljina 1F pobudjenja

lam2=450.d-9
Ee1=hp*c/lam2

! Valna duljina 1F emisije

write
write
write
write
write

(*,*) lam*1.d9,Ep1,lam2*1.d9,Ee1
(17,*) lam*1.d9,Ep1
(18,*) lam2*1.d9,Ee1
(19,*) lam*1.d9,Ep1/ev,Ep1
(19,*) lam2*1.d9,Ee1/ev,Ee1

elseif (lg.eq.2) then

! Dvofotonski prijelazi

lamd=730.d-9
Ep2d=hp*c/lamd
lamg=780d-9
Ep2g=hp*c/lamg

! Valna duljina 2F pobudjenja--donja

lam2d=460.d-9
Ee2d=hp*c/lam2d
lam2g=480.d-9
Ee2g=hp*c/lam2g

! Valna duljina 2F emisije--donja

write
write
write
write
write
write

! Valna duljina 2F pobudjenja--gornja

! Valna duljina 2F emisije--gornja

(*,*) lamd*1.d9,Ep2d,lamg*1.d9,Ep2g
(*,*) lam2d*1.d9,Ee2d,lam2g*1.d9,Ee2g
(17,*) lamd*1.d9,Ep2d,lamg*1.d9,Ep2g
(18,*) lam2d*1.d9,Ee2d,lam2g*1.d9,Ee2g
(19,*) lamd*1.d9,Ep2d/ev,Ep2d,lamg*1.d9,Ep2g/ev,Ep2g
(19,*) lam2d*1.d9,Ee2d/ev,Ee2d,lam2g*1.d9,Ee2g/ev,Ee2g

elseif (lg.eq.3) then

lam=0.d0

! Inicijalizacija varijable za valnu duljinu

do i=0,25,1
lam=250.d-9
lam=lam+25.d-9*i
lam2=lam*lam
lam4=lam2*lam2
Ir=1.d0/lam4
write
write
write
write

(*,*) lam,lam2,lam4,Ir
(17,*) lam,lam2,lam4,Ir
(18,*) lam*1.d9,Ir*1.d-26
(19,*) (i+1),lam*1.d9, lam4*1.d28,Ir*1.d-26

! lam u nm, lam4 u 10^{-28} m^4,

! Ir u arb. u.

end do
elseif (lg.eq.4) then
lam=0.d0
! Inicijalizacija
theta=40.d0*pi/180.d0
cs=dcos(theta)
cs2=cs*cs
do i=0,25,1

varijable za valnu duljinu

lam=250.d-9
lam=lam+25.d-9*i
lam2=lam*lam
lam4=lam2*lam2
Ir=(1.d0+cs2)/lam4
write
write
write
write

end do

(*,*) theta*180./pi,cs,lam,lam4,Ir
(17,*) lam,lam2,lam4,Ir
(18,*) lam*1.d9,Ir*1.d-26
(19,*) (i+1),lam*1.d9,lam4*1.d28,Ir*1.d-26

! lam u nm, lam4 u 10^{-28}

! m^4, Ir u arb. u.

end if
end

Tabela 3.1: U tabeli su predstavljene proraunate vrijednosti intenziteta rasijanja na osnovu

(3.2). Za vie detalja pogledati tekst ispod tabele.
Tekst ispod Tabele 3.1
U tabeli su prikazane proraunate vrijednosti intenziteta rasijanja na osnovu (3.2) i
koritenjem numerikog koda prikazanog na prethodnoj stranici (raspodjela lg=3). Kao ulazni
podaci koritene su valne duljine iz ultravioletnog, vidljivog dijela spectra, kao i infracrvenog
dijela elektromegnetnog spectra. U srednjoj koloni su prikazane vrijednosti za etvrti stepen
upotrijebljene valne duljine. U krajnjoj desnoj koloni su predstavljene vrijednosti za intenzitet
rasijane svjetlosti u proizvoljnim jedinicama (eng. arbitrary units).
Grafik 3.1: Na grafiku je predstavljena kriva intenziteta rasijanja kao funkcija valne duljine.
Na apscisi (horizontalna osa) su nanesene vrijednosti valne duljine, dok su na ordinati
(vertikalna osa) nanesene vrijednosti intenziteta rasijanja u proizvoljnim jedinicama. Za vie
detalja pogledati tekst ispod grafika.

Tekst ispod Grafika 3.1

Na grafiku je prikazana ovisnost stepena rasijanja u ovisnosti o valnoj duljini upotrijebljenog
laserskog zraenja. Sve vrijednosti dobivene i izlistane u Tabeli 3.1 su koritene za pravljenje
grafika. Vano je napomenuti da su vrijednosti inetnziteta rasijanja predstavljene u
proizvoljnim jedinicama. Zelenim strelicama je naznaeno podruje valnih duljina na kojima
operiraju laseri koriteni u eksperimentalnim poduhvatima [R]. Grafik je produkovan u
programu xmgrace unutar OS Linux Ubuntu 11.04.
Tabela 3.2: U tabeli su predstavljene proraunate vrijednosti intenziteta rasijanja na osnovu
(3.3). Za vie detalja pogledati tekst ispod tabele.
Tekst ispod Tabele 3.2
U tabeli su prikazane proraunate vrijednosti intenziteta rasijanja na osnovu (3.3) i
koritenjem numerikog koda prikazanog na prethodnoj stranici (raspodjela lg=3). Kao ulazni
podaci koritene su valne duljine iz ultravioletnog, vidljivog dijela spektra, kao i infracrvenog

250
dijela elektromegnetnog spektra. Ugao je fiksan ima vrijednost
.
Svi
ostali
parametric su kao u Tabeli 3.1. U srednjoj koloni su prikazane vrijednosti za etvrti stepen
upotrijebljene valne duljine. U krajnjoj desnoj koloni su predstavljene vrijednosti za intenzitet
rasijane svjetlosti u proizvoljnim jedinicama (eng. arbitrary units).

Grafik 3.2: Na grafiku je prikazana ovisnost intenziteta rasijane svjetlosti u ovisnosti o

250
valnoj duljini upotrijebljenog laserskog zraenja za fiksnu vrijednost
. Na apscisi
(horizontalna osa) su nanesene vrijednosti brzina, dok su na ordinati (vertikalna osa)
nanesene vrijednosti inenziteta rasijanja. Za vie detalja pogledati tekst ispod grafika.

Tekst ispod Grafika 3.2

Analogno kao i na Grafiku 3.1, samo za

250

i na osnovu izraza (3.3).

Tabela 3.3: U tabeli su predstavljene proraunate vrijednosti intenziteta rasijanja na osnovu

(3.3) i viu vrijednost ugla rasijanja . Za vie detalja pogledati tekst ispod tabele.

Tekst ispod Tabele 3.3:

U tabeli su prikazane proraunate vrijednosti intenziteta rasijanja na osnovu (3.3) i
koritenjem numerikog koda prikazanog na prethodnoj stranici (raspodjela lg=2). Kao ulazni
podaci koritene su valne duljine iz ultravioletnog, vidljivog dijela spectra, kao i infracrvenog

400
dijela elektromegnetnog spektra. Ugao je fiksan ima vrijednost
, i neto je vei
nego na prethodnoj slici, odnosno Tabeli. Svi ostali parametri su kao u Tabeli 3.1. U srednjoj
koloni su prikazane vrijednosti za etvrti stepen upotrijebljene valne duljine. U krajnjoj desnoj

koloni su predstavljene vrijednosti za intenzitet rasijane svjetlosti u proizvoljnim jedinicama

(eng. arbitrary units).
Grafik 3.3: Na grafiku je prikazana ovisnost intenziteta rasijane svjezlosti u ovisnosti o
400
valnoj duljini upotrijebljenog laserskog zraenja za fiksnu vrijednost
. Na apscisi
(horizontalna osa) su nanesene vrijednosti brzina, dok su na ordinati (vertikalna osa)
nanesene vrijednosti intenziteta rasijanja. Za vie detalja pogledati tekst ispod grafika.

Tekst ispod Grafika 3.3

Analogno kao i na Grafiku 3.2, samo za

400

, te na osnovu izraza (3.3). Isprekidanom

250
crvenom linijom je prikazana kriva dobivena za
.
Tabela 3.4: Prikazane su proraunate vrijednosti energija prijelaza/emisije u sluaju
jednofotonske apsorpcije (lijeva kolona). Takoer, prikazani su i odgovarajui rezultati za
dvofotonsku eksitaciju i emisiju za iste molecule od kojih je graeno tkivo oka [R].
Tekst ispod Tabele 3.4:

Prikazane su proraunate vrijednosti energija prijelaza/emisije u sluaju jednofotonske

apsorpcije. Vrijednosti su naznaene u dulima, kao i u eV. Rezultatima za jednofotonsku
apsorpciju odgovaraju dvije lijeve kolone. Takoer, prikazani su i odgovarajui rezultati za
dvofotonsku eksitaciju i emisiju za iste molecule od kojih je graeno tkivo oka [R]. Prorauni
za dvofotonski scenarij su izlistani u dvije desne kolone.
Grafik 3.4: Energija kao funkcija valne duljine u sluaju jednofotonske, odnosno dvofotonske
apsorpcije

Tekst ispod Grafika 3.4

Energija kao funkcija valne duljine u sluaju jednofotonske, odnsosno dvofotonske apsorpcije
za razliite molekule koje ine tkiva oka. Sa kriiima su naznaene pozicije odgovarajuih
energetskih vrijednosti. Pored kriia je naznaeno velikim latininim slovom o kojoj se
molekuli radi. U indeksu je naznaeno da li se radi o jednofotonskom ili dvofotonskom
scenariju.

Tabela 3.5: Prikazane su proraunate vrijednosti energija prijelaza/emisije u sluaju

jednofotonske apsorpcije (lijeva kolona). Takoer, prikazani su i odgovarajui rezultati za
dvofotonsku eksitaciju i emisiju za iste molecule od kojih je graeno tkivo oka [R].

Tekst ispod Tabele 3.5:

Prikazane su proraunate vrijednosti energija prijelaza/emisije u sluaju jednofotonske
apsorpcije, sada za druge molekule. Vrijednosti su naznaene u dulima, kao i u eV.
Rezultatima za jednofotonsku apsorpciju odgovaraju dvije lijeve kolone. Takoer, prikazani
su i odgovarajui rezultati za dvofotonsku eksitaciju i emisiju za iste molekule od kojih je
graeno tkivo oka [R]. Prorauni za dvofotonski scenarij su izlistani u dvije desne kolone.
Grafik 3.5: Energija kao funkcija valne duljine u sluaju jednofotonske, odnosno dvofotonske
apsorpcije samo sada za druge fluorofore.

Tekst ispod Grafika 3.5

Energija kao funkcija valne duljine u sluaju jednofotonske, odnsosno dvofotonske apsorpcije
za razliite molekule koje ine tkiva oka. Sa kriiima su naznaene pozicije odgovarajuih
energetskih vrijednosti. Pored kriia je naznaeno velikim latininim slovom o kojoj se
molekuli radi. U indeksu je naznaeno da li se radi o jednofotonskom ili dvofotonskom
scenariju.
Ovo emo moda staviti [3.6]. Neka sada ostane dolje ispod.
Tabela 3.6: Prikazane su proraunata vremena trajanja dvofotonskih prijelaza. Za vie detalja
pogledati tekst.

Tekst ispod Tabele 3.6:

Prikazane su proraunata vremena trajanja dvofotonskih prijelaza.

Pri proraunima je

1FP / (4 c)
koritena formula

4. Diskusija
U prethodnom dijelu ovoga diplomskog rada su detaljno izloeni rezultati istraivanja. Kao
to je ve reeno eksperimentalni podaci pokazuju da lasersko dvofotonska eksitujua
laserska skanirajua mikroskopija ima veu penetraciju, tj. manje gubitke pri interakciji sa
ispitivanim biolokim tkivom (Ref.). Ovo vrijedi openito i u usporedbi sa klasinom
optikom mikroskopijom, kao i konfokalnom jednofotonskom mikroskopijom. Kako je
diplomski rad, zbog irine teme istraivanja ogranien na primjenu u oftamologiji, to ova
eksperimentalno utvrena injenica vrijedi i u usporedbi sa oftamolokim instrumentima
(Ref.). Svi navedeni instrumenti operiraju na valnim duljinama u vidljivom dijelu spektra,
odnosno u ultravioletnom dijelu (Ref.). S druge strane izvori dvofotonske laserske skanirajue
mikroskopije operiraju na valnim duljinama biskim infracrvenom podruju (eng. nier infrared,
NIR).
Koristei dostupne podatke o valnim duljinama, te koristei modificirani Rayleighev zakon, u
kojem smo zanemarili uticaj valne duljine na indeks loma optike sredine 5, moe se pokazati
da je Rayleighevo rasijanje znaajno slabije u podruju NIR dijela spektra nego to je to
sluaj sa podrujem vidljivog dijela spektra ili njegovog UV dijela. To je jasno naznaeno
zelenom strelicom na slici 1. Rasijanje svjetlosti NIR valnih duljina je nekoliko puta slabije
izraeno nego to je sluaj sa drugim dijelovima spektra karakterisanih manjim valnim
duljinama. Odgovarajui podaci na osnovu kojih je generirana kriva prikazana na Grafiku 3.1
su pohranjeni u Tabeli 3.1. Intenzitet rasijanja je izlistan u proizvoljnim jedinicama i skaliran
d=
je sa odgovarajuim faktorom. Pored Rayleighovog rasijanja koje vrijedi kada je
i kao
6
to se vidi na Garfiku 3.1 jako ovisi o valnoj duljini upotrijebljenog laserkog zraenja . Postoji
d
d
i Mieovo7 rasijanje koje vrijedi u sluaju kada je
. Sa je oznaena veliina estice na
kojoj se rasijava upadni snop. Mieovo rasijanje ne ovisi toliko o valnoj duljini. Za ovo
rasijanje je nephodno vriti kompleksne numerike proraune. Vie o ovoj vrsti rasijanja koje
ima slabiju ovisnost o valnoj duljini pogledati 2. poglavlje u knjizi (Ref.) i referencama koje

5 U naem sluaju bilokog tkiva, tj. tkiva koje ine oko.

6 Pogledati relaciju (3.2) u prethodnom poglavlju.
7 Gustav Adolf Feodor Wilhelm Ludwig Mie (29 Septembar 1869 13 Februar 1957) je
Njemaki fiziar po kojem je rasijanje dobilo ime.

su navedene u njoj. Naglasimo jo, da skoro uvijek imamo kombinaciju ova dva rasijanja
(Ref.).
Vano je spomenuti da modificirani Reylighev izraz ne vrijedi kada je apsorpcija znaajna.
Uzimajui da je veina tkiva u ljudskome organizmu izgraena, izmeu ostalog od vode, te da
voda za odreene valne duljine moe predstavljati glavni apsorbent u ljudskom organizmu,
pozabavimo se dijelom i ovim problemom. Kako voda ima pik izraene apsorpcije na 1300
nm, to znai da primjenjena aproksimacija vrijedi, jer se NIR podruje, kao i podruja u
kojima je penetracija laserskog zraenja slabije izraena nalaze ispod 1000 nm. U svakom
sluaju ovakva pristup moe objasniti razloge dublje penetracije u biolokom tkivu u sluaju
upotrebe dvofotonske laserske skanirajue mikroskopije.
Slini rezultati su dobiveni i u sluaju da se ugao rasijanja mijenja. Kada se uzme ugao od 25 i
40 stepeni imao posve analognu situaciju. Ponovno je rasijanje znatno slabije u NIR podruju
nego to je sluaj sa vidljivim dijelom ili UV dijelom spektra (pogledati Tabele 3.2 i 3.3. i
odgovarajue tabele). Kako imamo kvdrat kosinusne funkcije u brojniku izraza (3.3) to sa
poveanjem ugla imamo manju vrijednost kosinusne funkcije, te samim tim i manji broj koji
dodajemo jedinici. Odavde moemo zakljuiti da poveanjem ugla rasijanja imamo istu
tendenciju kao u prethodnim sluajevima samo to intenzitet rasijanja neznatno slabije opada.
Vratimo se na trenutak vodi kao satavnom dijelu veine tkiva. Uzimajui odgovarajue
ekperimentalne podatke za koeficijent apsorpcije i koeficijent refleksije za vodu, te koristei
jednostavne relacije, moe se doi do rezultata koji potvruju veu penetrabilnost
(prodornost) laserskog snopa u NIR podruju kada uz obzir uzmemo i karakteristike tkiva,
odnosno u ovome sluaju vode. Dakle, analizirajui optike karakteristike tkiva moe se doi
do zakljuka da ovi prorauni (Ref.). Kako niti voda niti makromolekule unutar tkiva ne
apsorbiraju mnogo u opsegu valnih duljina od 600 do 1200 nm, moemo zakljuiti da je ovo
podruje, podruje u kojem penetracija raste sa valnom duljinom. Dakle, gubici su manji, te je
mogue prodrijeti dublje u tkivo i dobiti informaciju o njegooj strukturi.
U prethodnom poglavlju smo, na osnovu dostupnih ekspermenatlnih podataka za valnu
duljinu jednosfotonske/dvofotonske eksitacije i emisije za razliite fluorofore, proraunali
odgovarajue energije. Prije svega, usporeujui podatke za energije u sluaju eksitacije
(pobuenja) kao i onih energija emisije, moemo zakljuiti da je ispunjen Stokesov uvjet

E1 E2 , (4.1)
E1

E2

pri emu smo sa

oznaili energiju eksitacije, dok smo sa
oznaili energiju emitovanog
fotona, nakon to s esistem vratio u nie kvantno stanje (Refs.). Kako je energija obrnuto
proporcionalna sa valnom duljinom, to se slian zakljuak moe izvesti i razmatranjem druge
kolone u Tabeli 3.4. Energije su izlistane u J, kao i eV za sve fluorofore koji su naeni u ivim
organizmima. Interesantno je primijetiti da u sluaju jednofotonske eksitacije, gdje se prijelazi
odvijaju pri valnim duljinama u vidljivom dijelu ili UV diejlu spektra dolazi do djelominog
preklapanja za razliite molekule koje ine tkivo oka. S druge strane, kada se ostavri

dvotonska eksitacija, takvog preklapanja nema. Ovo je pogodnost koja vodi ka mogunosti da
se odgovarajue strukture u tkivu mogu analizirati se veom rezolucijom nego to je bio
sluaj sa jednofotonskom eksitacijom.

Takoer, u ovome radu su procijenjena vremena skal trajanja procesa dvofotonske eksitacije
koritenjem Heisenbergovog principa neodreenosti (Refs.)

t2FP

1FP
, (4.2)
4 c

c
gdje su veliine na desnoj strani definirane na strani ... , dok je brzina svjetlosti u vakuumu.
Neto preciznija i fizkalno pravdaniji prorauni mogu se nai u referencama (Refs.).

5. Zakljuci
Na osnovu teroijske postavke i odgovarajuih numerikih prorauna, te na osnovu
eksperimentalnih podataka moemo doi do sljedeih zakljuaka:
1. Dvofotonksa eksitujua laserska skanirajua mikroskopija ima veu prodornost unutar
tkiva. Valna duljina NIR podruja spektra izvora vodi ka veoj penetrabilnosti. Koritenjem
modificiranog Rayleighovog rasijanja moe se doi do analognih rezultata: u NIR podruju
spektra gubici usljed rasijanja su manje izraeni.
2. S poveanjem ugla rasijanja ne dolazi do kvaliatativnih promjena.
3. Proraunate su energije eksitacije/emisije za jednosfotonsku i dvofonski scenarij za
razliite fluorofore u bilokom tkivu. Koriteni su dsostupni eksperimentalni podaci za valn
eduljine. U svim sluajevima je zadovoljen Stokesov uvjet.
4. Dvofonski scenarij omoguava veu mogunost analize razliitih struktura unutar tkiva u
odnosu na konvencionalne metode mikroskopije koje se koriste u medicini i ostalim srodnim
prirodnim zannostima.
5. Vremenska skala procesa je kraa od femtosekunde.

Mada je prolo punih 60 godina od kada je ovaj fenomen teorijski predvien do njegove prve
eksperimentalne primjene, te jo dodatnih deset godina do prve aplikacije u medicni, nadatis e
da e u narednim godinama dvofotonska eksitujua laserska skanirajua mikroskopija biti
neizostavan dio mediscinske klinike prakse.