ANLISIS DE ANTIOXIDANTES:

QU Y CMO SE DEBEN MEDIR?

El amplio reconocimiento cientfico de que un mayor consumo de

alimentos ricos en antioxidantes redunda en claros beneficios para la
salud de la poblacin ha llevado a que los consumidores se interesen,
cada vez ms, en conocer cual es efectivamente la riqueza
antioxidante de los productos que el mercado les ofrece?
Si bien hasta hace poco la sola mencin del trmino antioxidante,
sea a travs de una campaa de promocin o inscrito en el envase de
un producto, fue suficientemente atrayente para que los
consumidores se inclinen por dicho producto, recientemente, y en
forma creciente, los consumidores buscan distinguir entre aquellos
productos
cuyo
marketing
simplemente
reclama
tener
antioxidantes y aquellos en los cuales el contenido de estos
compuestos es debidamente sustentado y cuantitativamente descrito
en su rotulacin.
En el marco de lo anteriormente mencionado, en la presente seccin
se aborda, entre otras, interrogantes como las siguientes: Que
Antioxidantes deben medirse en un Alimento?, Cules son los
principales ensayos y mtodos analticos disponibles para su
medicin?, Por qu es importante medir y rotular el contenido de
polifenoles y el valor ORAC en los Alimentos? Qu diferencia existe
entre medir y certificar el contenido y la actividad antioxidante de un
alimento?
Para enfrentar la interrogante Qu Antioxidantes deben medirse
en un Alimento?, es preciso responder previamente a lo siguiente:
Cules son los principales antioxidantes presentes en los
alimentos?La riqueza antioxidante de los alimentos est
generalmente dada por la suma e interaccin de numerosas
molculas. Si bien la estructura qumica de tales molculas puede ser
significativamente diferente, entre los principales antioxidantes
presentes en los alimentos es posible distinguir:
i) Las Vitaminas antioxidantes, que comprenden al Acido ascrbico
(o Vitamina C); la Vitamina E, un trmino que incluye no solo al alfa
tocoferol, sino adems, a las isoformas, alfa, beta, gama y delta, de
los tocoferoles y los tocotrienoles; y los compuestos Pro-Vitamina A
(representados por el beta-caroteno, el alfa-caroteno y la
beta- criptoxantina).
ii) Los Carotenoides, entre los cuales destacan la lutena, el
licopeno, la zeaxantina y la astaxantina. Bajo la denominacin de
carotenoides se incluyen tambin aquellos compuestos que son ProVitamina A (arriba mencionados). Desde un punto de vista qumico,
los carotenoides comprenden los carotenos (alfa-caroteno, betacaroteno y licopeno), que no incluyen tomos de oxgeno en su
estructura, y las xantofilas (beta-criptoxantina, lutena, astaxantina y

zeaxantina), que s lo presentan, mayormente bajo la forma de

hidroxilos.
iii) Los Polifenoles. Los polifenoles dan cuenta de la riqueza
antioxidante de la parte mayor de los alimentos habitualmente
consumidos por la poblacin. Todos los polifenoles exhiben en su
estructura, a lo menos, uno o ms grupos hidroxlos unidos a un
anillo aromtico. Entre los polifenoles es posible distinguir dos tipos
mayores de compuestos: los flavonoides, para los cuales se han
descrito varios miles en el reino vegetal) y cuya estructura
comprende dos anillos aromticos unidos un heterociclo de tres
tomos de carbono y uno de oxgeno (C6-C3-C6), y los llamados noflavonoides (algunos cientos) que comprenden, mayormente,
alcoholes
mono-fenlicos,
cidos
fenlicos
y
estilbenos.
Detallada informacin respecto a cual es la composicin antioxidante
de los principales alimentos ingeridos por la poblacin, se encuentra
la seccin Antioxidantes en alimentos: Principales fuentes y sus
contenidos.
Ahora bien, conociendo cuales son los tipos de antioxidantes que ms
predominan en un determinado alimento, es posible volver a la
interrogante de Que antioxidantes deben medirse en un
alimento? Aunque la respuesta a esta interrogante est sujeta a la
naturaleza del alimento a analizar, en trminos generales ser posible
medir en los alimentos:
(I) el contenido especfico de aquellos antioxidantes que dicho
alimento ms concentra, o la de aquellos cuya presencia es ms
relevante para su distincin como fuente o aporte de dicho
compuesto; por ejemplo, el contenido de cido ascrbico, el de alfatocoferol, el de licopeno, o el de algn flavonoide en particular;
(II) el contenido total de un determinado tipo de antioxidante, por
ejemplo, el contenido total de polifenoles o el contenido total de
flavonoides presentes en un alimento;
(III) la actividad antioxidante del alimento. A diferencia de la sola
medicin del contenido de un antioxidante determinado, la medicin
de la actividad antioxidante de un alimento permite cuantificar la
capacidad que tendran todos los compuestos antioxidantes
presentes en ste (vitaminas + carotenoides + polifenoles + otros
que no responden a las categoras anteriores) para actuar
simultneamente como una mezcla de compuestos antioxidantes.
Pero entonces, Qu debe medirse?
Si se pretende realizar una caracterizacin de un alimento desde el
punto de vista de su riqueza antioxidante, idealmente se debera
cuantificar el contenido individual de cada uno de aquellos
antioxidantes que a priori se sabe que dicho alimento contiene, y se
debera medir la actividad antioxidante que -como resultado de la

suma e interaccin de sus componentes antioxidantes- dicho alimento

presenta.
Sin embargo, el propsito de medir en forma individual el contenido
de cada uno de los componentes antioxidantes de un alimento resulta
excesivamente costoso y analticamente complejo, dado que en
aquellos alimentos que son ms ricos en antioxidantes, estos
compuestos comprenden, regularmente, un gran nmero y una
enorme diversidad de estructuras.
Qu alternativa existe a la medicin del contenido individual
de cada uno de los componentes antioxidantes de un
alimento? Como alternativa a la medicin individual, se puede
cuantificar el contenido total que presenta un alimento en trminos
de un tipo determinado de antioxidantes. Por ejemplo, cuando la
riqueza antioxidante de un alimento reside mayormente en una alta
presencia de polifenoles, la medicin se acota a la caracterizacin del
contenido antioxidante bajo la forma de polifenoles totales (PFT). Si
se precisa, junto a la medicin de PFT es posible medir, en forma ms
precisa, el contenido de flavonoides totales, y an ms especfica, el
contenido de determinados subtipos de flavonoides, como seran las
antocianidinas totales, los flavonoles totales o los flavan-3-oles
totales. Mayores detalles respecto a la qumica y presencia de estos
compuestos en los alimentos se describe en la seccin Antioxidantes
en alimentos: Principales fuentes y sus contenidos.
Cmo se determina el contenido de polifenoles totales? El
contenido de PFT es determinado a travs de un ensayo que emplea
el reactivo de Folin-Ciocalteu (F-C). Todos los mtodos hasta ahora
publicados que emplean dicho reactivo miden la capacidad que tienen
los polifenoles para reducir (donar un electrn) el Mo(VI) a Mo(V)
presente en el complejo molibdotungstato que caracteriza el reactivo
de F-C. Como resultado de tal reduccin, el reactivo, de color
amarillo, adquiere un intenso color azul, el cual es cuantificado
espectrofotometricamente a 765 nm. Si bien todos los mtodos
disponibles que emplean el reactivo de F-C aseguran la oxidacin
total de todos aquellos compuestos capaces de reducirlo, stos
difieren en cuanto a las concentraciones de dicho reactivo empleadas,
al tipo de base y concentracin empleada para alcalinizar el medio
(carbonato versus hidrxido de sodio), a los tiempos de incubacin
necesarios para hacer cuantitativa la reduccin del reactivo (3-120
min), y las temperaturas de incubacin de las muestras durante su
anlisis (20-50 C).
Cmo se expresa el contenido de polifenoles totales de una
muestra?El contenido de polifenoles totales resultante de la
aplicacin de cualesquier mtodo que se base en el uso del reactivo
de Folin-Ciocalteu es regularmente expresado como mg de
equivalentes de cido glico (EAG)/100 g de alimento. El cido glico
es un compuesto fenlico simple ampliamente empleado en este

ensayo como estndar de comparacin. Sin embargo, ocasionalmente

se emplea tambin como estndar de comparacin y expresin de
resultados polifenoles como catequina o los cidos tnico,
clorognico, cafico, vanlico y ferlico.
Para encontrar un listado completo de los valores de contenido de PFT
en frutas producidas y/o consumidas en Chile, visite nuestra seccin
Base de Datos de Antioxidantes.
Son los mtodos que emplean el reactivo de Folin-Ciocalteu
especficos para la determinacin de polifenoles? Tal como se
menciono anteriormente, en el ensayo de Folin-Ciocalteu se mide la
capacidad que tienen los polifenoles para actuar como reductores de
Mo(VI) en el complejo molibdotungstato. Si bien el ensayo de
reduccin del reactivo es simple, sensible y preciso, debe sealarse
que dicho reactivo es susceptible de ser reducido no solo por todos
los polifenoles, sino tambin por reductores como cido ascrbico,
metabisulfito de sodio, sales de hierro(II), EDTA, ciertos aminocidos,
fructosa y glucosa, entre otros. Esto ltimo es extremadamente
importante ya que cuando se aplica este mtodo a muestras que
contengan uno o ms de dichos interferentes, sin tomarse las
medidas correctivas, se obtendr equivocadamente un resultado que
representa una sobre-estimacin del valor real de polifenoles totales.
Por ejemplo, se ha visto que la aplicacin del ensayo en presencia de
fructosa (5 g/L), un azcar abundantemente presente en frutas, da
lugar a una recuperacin del contenido de cido glico (10 mg/L) que
se ve equivocadamente incrementada en alrededor de 58%.
Como resultado del efecto interferentes que tendran compuestos
como fructosa, glucosa o cido ascrbico, normalmente presentes en
frutas, verduras, y en numerosos alimentos procesados, es de
enorme importancia que, en la aplicacin de cualquier mtodo que
emplea el reactivo de F-C, se tenga presente la incorporacin de
controles adecuados, idealmente, empleando modificaciones al
mtodo original que permitan discriminar analticamente entre la
contribucin que hacen a la reduccin del dicho reactivo los
polifenoles que se desea medir y aquellos componentes
interferentes no-polifenlicos presentes en una muestra.
Que limitaciones de interpretacin supone la sola medicin
de PFT en la caracterizacin de la riqueza antioxidante de un
alimento? Si bien la medicin de PFT es ampliamente empleada y
reconocida como una forma preliminar de caracterizar la riqueza
antioxidante de un alimento, debe tenerse presente que, como tal, la
medicin de PFT no distingue la medida ni la proporcin en que los
diversos subtipos de polifenoles presentes en un alimento estn
individualmente contribuyendo al contenido polifenlico total. Dicho
ensayo tampoco evala el valor que tendra la interaccin entre los
distintos polifenoles presentes en un alimento.
No obstante, la medicin de PFT, cuando es debidamente realizada
(esto es con correccin de interferentes) constituye una aproximacin

buena, simple y prctica al propsito de caracterizar inicialmente a un

alimento en trminos de su contenido antioxidante, especialmente
cuando se trata de aquellos en los cuales los polifenoles dan
mayormente cuenta de su composicin antioxidante. Sin embargo,
cuando los polifenoles solo dan cuenta en forma parcial de la riqueza
antioxidante de un alimento, la sola medicin de los PFT como una
forma de evidenciar tal riqueza podra suponer una sub-estimacin
proporcional a la contribucin que hacen compuestos de naturaleza
no-polifenlica a la riqueza antioxidante total del alimento analizado.
Para evitar tal sub-estimacin, y dado que muchos alimentos ricos en
antioxidantes poseen no slo compuestos fenlicos, sino tambin
antioxidantes de naturaleza no-fenlica (diversas vitaminas
antioxidantes y carotenoides), es muy importante que la
caracterizacin de la riqueza antioxidante de los alimentos
comprenda, adems, la medicin de su actividad antioxidante.
Pero, realmente Qu se mide cuando se determina la actividad
antioxidante de un alimento? Lo primero a destacar es que la
medicin de la actividad antioxidante de un alimento supone la
cuantificacin de virtualmente todas las molculas antioxidantes
presentes en este.
La mayor parte de los ensayos empleados para la determinacin de la
actividad antioxidante de un alimento se basan en la medicin de: (1)
la capacidad que tienen los compuestos antioxidantes para reaccionar
con un radical libre determinado, o (2) el potencial que tales
compuestos tendran para reducir un complejo formado entre iones
Fe(III)
y
el
reactivo
TPTZ
(2,4,6-tripiridil-s-triazina).
Entre aquellos ensayos que se basan en la medicin de la capacidad
de los antioxidantes para reaccionar con un radical libre, cabe
destacar los siguientes:
Ensayo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity, o Capacidad
de
Absorcin de Radicales de Oxgeno)
Ensayo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity, o Capacidad
Antioxidante como Equivalentes Trolox)
Ensayo DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidrazil).
Existe consenso que para caracterizar la actividad antioxidante de un
alimento, el ensayo ORAC destaca entre todos los ensayos disponibles
por su alta sensibilidad, precisin y reproducibilidad.
Qu es el ensayo ORAC?
A diferencia de la simple medicin del contenido de los antioxidantes
presentes en un alimento, el ensayo ORAC mide la actividad o

capacidad global que tienen todos los antioxidantes presentes en una

muestra para apagar o neutralizar (scavenging) radicales peroxilo.

Estos ltimos son especies reactivas comparables y por tanto

relevantes a aquellos ROS biolgicamente generados en el organismo.
En el ensayo ORAC, los radicales peroxilo, generados a partir del azocompuesto
AAPH
o
ABAP
([2,2-azobis(2-amidinopropano]),
reaccionan con fluorescena como sustrato. Como resultado de tal
reaccin, la fluorescencia de este ltimo compuesto decrece a travs
del tiempo, configurando un rea bajo la curva (fluorescencia versus
tiempo). Cuando dicha reaccin tiene lugar en presencia de
compuestos antioxidantes, el rea bajo la curva se incrementa en
forma lineal y proporcional a la concentracin de antioxidantes.
Para actuar como tal, los antioxidantes deben, donar ya sea un
electrn (SET), o un tomo de hidrgeno a los mismos (HAT) los
radicales libres que se pretende estabilizar. El ensayo ORAC mide la
capacidad que tienen todos los antioxidantes presentes en un
alimento (o muestra de este) para donar tomos de hidrgeno a los
radicales peroxilo. Por ende, el mtodo ORAC cuantifica la capacidad
que tendra un alimento para actuar como antioxidante a travs del
mecanismo HAT.
El ensayo ORAC comprende la medicin del aporte que hacen a la
actividad antioxidante tanto los polifenoles como aquellos compuestos
de naturaleza no-polifenlica presentes en un alimento dado, y por
tanto permite comparar la actividad antioxidante, valor ORAC, de
alimentos que no necesariamente tienen polifenoles como sus
principales componentes con aquellos que si lo tienen. Por ejemplo,
es posible comparar el valor ORAC de un tomate (rico en licopeno
pero pobre en polifenoles) con el de una manzana (que es rica en
polifenoles pero no contiene licopeno).

El
ensayo ORAC no slo refleja el contenido total de los compuestos
antioxidantes, sino tambin, la interaccin aditiva, sinrgica o de
potenciacin que resulta de la simultnea presencia de estos, dando
como resultado un valor que refleja la capacidad global o actividad
antioxidante de un alimento.
Cmo se expresa el valor ORAC de una muestra? El valor ORAC
se expresa como micromoles de equivalentes Trolox/100 g de
muestra. El Trolox es un anlogo de la vitamina E que, por su fcil
solubilidad en agua es empleado como estndar de comparacin.
Dado que el mtodo ORAC permite comparar alimentos de naturaleza
muy diversa en cuanto a su riqueza antioxidante, el ensayo ORAC
representa en la actualidad la forma ms empleada de evaluar la
actividad antioxidante de alimentos. Como tal, el valor ORAC
constituye el ndice ms reconocido al momento de definir el potencial
aporte que podra suponer el consumo de un alimento a la capacidad
antioxidante de nuestro organismo.
Si bien la confianza que se tiene en torno a los valores de actividad
antioxidante generados a travs del empleo del mtodo ORAC se
desprende, en gran medida, de la alta sensibilidad, precisin y
reproducibilidad del mtodo, es claro que para asegurar tales
caractersticas el ensayo debe ser ejecutado por un laboratorio que
este dotado no solo de una instrumentacin adecuada que permita su
automatizacin, sino que adems, que vele por el cumplimiento del
protocolo analtico estandarizado del mtodo.
Para encontrar un listado completo de los valores de actividad
antioxidante ORAC de frutas producidas y/o consumidas en Chile,
visite nuestra seccin Base de Datos de Antioxidantes.
En que difiere el mtodo ORAC de otros mtodos de
determinacin de la actividad antioxidante? Si bien otros

mtodos, como el TEAC y el DPPH evalan tambin la capacidad de

los antioxidantes de una muestra para apagar o neutralizar un
radical libre, tanto el TEAC como el DPPH emplean como radicales
libres molculas que difiere totalmente de cualquier radical libre o
especie reactiva generada por nuestro organismo. Mientras en el
primer caso se emplea el catin radical ABTS+, en el segundo se
emplea el radical DPPH. Si bien la alta estabilidad de ambos
radicales hace ms simple su empleo, la misma condicin sita a los
mtodos TEAC y DPPH como aproximaciones analticas muy distantes
de la alta reactividad que tpicamente caracteriza a los ROS
normalmente generados en sistemas biolgicos. Por tanto, la
relevancia de estos mtodos es frecuentemente cuestionada. Ambos
mtodos suelen ser tiles para realizar un ranking de
compuestos/preparados antioxidantes dentro de un batch, un
experimento o un estudio determinado, pero, ms all de su simpleza
tcnica, la relativamente baja sensibilidad y reproducibilidad de
ambos mtodos limita la posibilidad deseable de comparar los valores
TEAC o DPPH.
Puede una igualdad de valores ORAC entre dos alimentos
distintos suponer igual valor nutricional? Es fundamental aclarar
que una eventual igualdad en el valor ORAC entre un alimento y otro
(sean stos de igual naturaleza o no), no necesariamente significa
igualdad en el valor nutricional de ambos. En efecto, este ltimo
estar dado por la presencia (contenido y tipo) de numerosos
nutrientes, entre otros, protenas, grasa, carbohidratos, vitaminas, y
micro/macrominerales.
De modo similar, una igualdad en la actividad antioxidante tampoco
permitira suponer una equivalencia en el potencial beneficio que por
concepto de ingesta de los antioxidantes presentes en dichos
alimentos, tendra para la salud humana el consumo indistinto de
estos. Como se describe en la seccin Antioxidantes y salud:
Evidencias cientficas, si bien todos los polifenoles comparten su
capacidad para actuar como antioxidantes, la existencia de an
pequeas diferencias en sus estructuras suele, a menudo, resultar en
significativas diferencias tanto en la biodisponibilidad (absorcin y
posterior disponibilidad de stos en la sangre) como en el perfil de
accin biolgica de dichos compuestos (ya que stos actan no slo
como atrapadores de radicales libres).
Por qu es importante medir y rotular el contenido de
polifenoles
y
el
valor
ORAC
en
los
Alimentos?
En nuestro pas, advertidos de la excelente disposicin que los
consumidores tambin tienen para optar por productos en los cuales
se destaca la presencia de antioxidantes, diversas empresas
promueven activamente el consumo de productos que, aunque no
certifican su contenido y actividad antioxidante, los rotulan como
ricos en antioxidantes. Ejemplos de esto ltimo son ciertas marcas
de t, de caf y de cervezas que reclaman ser naturalmente ricas en

antioxidantes, as como ciertas marcas de aguas minerales y otras

bebidas que, tras la adicin de antioxidantes a su formulacin, son
tambin
generalmente
promocionadas
como
bebidas
con
antioxidantes. De acuerdo a la opinin de expertos en el rea de
antioxidantes, para seguir avanzando con seriedad en la promocin
del consumo de alimentos ricos en antioxidantes, es esencial
distinguir entre aquellos productos cuyo marketing simplemente
reclama tener antioxidantes y aquellos en los cuales el contenido
de estos es sustentado y cuantitativamente descrito en su rotulacin.
Crecientemente, ciertos actores de la industria nacional han tomado
ya conciencia de esto ltimo, avalando a travs de anlisis
independientes el contenido y actividad antioxidante en el rtulo de
algunos de sus productos. Ejemplos de esto ltimo, son ciertos
chocolates elaborados por importantes empresas del rubro
alimentario, como Costa-Carozzi y Nestl, que por ser elaborados con
un alto contenido de cacao, son en la actualidad debida y validamente
comercializados como fuentes de antioxidantes naturales. Del
mismo modo, empresas como Corpora Tresmontes han sabido validar
tambin el contenido de PFT y la actividad antioxidante ORAC de sus
productos jugos en polvo Livean-Antiox, los cuales incorporan
extractos de t verde como fuente de antioxidantes naturales. Para
tener plena seguridad acerca de la real y continua presencia de un
valor de polifenoles totales y de ORAC en un producto determinado,
es fundamental que ste cuente con el respaldo que supone su
anlisis regular y/o certificacin.
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ttulo de la Referencia):
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