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IDENTIFICACION DE BACTERIAS
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1. OBJETIVOS:
Identificar bacterias Gram positivas y negativas de inculos conocidos en
medios selectivos.
2. FUNDAMENTO TEORICO:
TINCION DE GRAM:
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en
microbiologa para la visualizacin de bacterias. Debe su nombre al bacterilogo
dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder
referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a
las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que
se visualizan de color rosa o rojo.
Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares
de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna
de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el
peptidoglucano (tambin conocido como murena).
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se
encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin
distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de
peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipo-protenas. La membrana
exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipo-polisacrido.
material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo
poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la
membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como
por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se
form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin
azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular
ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la
accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos,
lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la
coloracin azul-violcea.
causan
la
gonorrea
(Neisseriagonorrhoeae),
meningitis
principalmente
Klebsiellapneumoniae
enfermedades
urinarias
Serratiamarcescens)
enfermedades
respiratorias
Legionellapneumophila,
(Escherichiacoli,
enfermedades
(Haemophilusinfluenzae,
Pseudomonasaeruginosa),
Proteusmirabilis,
gastrointestinales
Enterobactercloacae,
(Helicobacter
pylori,
nosocomiales (Acinetobacterbaumanii).
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Estructura
La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas est compuesta por una
membrana citoplasmtica (membrana interna), una pared celular delgada de
peptidoglicano, que rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre la pared
celular de estas bacterias.[] Entre la membrana citoplasmtica interna y la membrana
externa se localiza el espacio periplsmico relleno de una sustancia denominada
periplasma, la cual contiene enzimas importantes para la nutricin en estas bacterias.
La membrana externa contiene diversas protenas, siendo una de ellas las porinas o
canales proteicos que permiten el paso de ciertas sustancias. Tambin presenta unas
estructuras llamadas lipo-polisacridos (LPS), formadas por tres regiones: el
polisacrido O (antgeno O), una estructura polisacrida central (KDO) y el lpido A
(endotoxina).
BACTERIA GRAM POSITIVA
En microbiologa, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se
tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram: de aqu el nombre de "Grampositivas" o tambin "gran positivas". [] Esta caracterstica est ntimamente ligada a la
estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organizacin
bacteriana. La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la
membrana citoplasmtica y una pared celular compuesta por una gruesa capa de
peptidoglicano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana
citoplasmtica mediante molculas de cido lipo-teicoico. La capa de peptidoglicano
confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte
presentan una segunda membrana lipdica externa a la pared celular y esta pared es
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mucho ms gruesa.[]
Incluyen especies tanto mviles (va flagelos) como inmviles con forma de bacilo
(Bacillus,
Clostridium,
Corynebacterium,
Lactobacillus,
Listeria)
coco
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Membrana citoplasmtica.
Capa gruesa de peptidoglicano.
cidos teicoicos y lipo-teicoicos, que sirven como agentes quelantes y en
Membrana citoplasmtica.
Peptidoglicano.
Fosfolpidos.
Protenas.
cido lipo-teicoico.
Membrana citoplasmtica.
Espacio peri-plasmtico.
Membrana externa.
Fosfolpidos.
Peptidoglicano.
Lipoprotena.
Protenas.
Lipo-polisacridos.
Porinas
3. MATERIAL DE PRACTICA
Mechero Bunsen.
Asa de siembra esterilizada.
Placas petri.
Pipetas.
Tubos con cultivos bacteriano crecidos
Agua destilada.
Lugol.
Lavado con acetona: agua (80) y acetona (20).
Safranina.
Laminas para objetos.
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
a) Todos los materiales deben ser esterilizados por dos minutos por lo menos.
b) Preparar la muestra para identificar las bacterias gram positivas o gram
negativas.
c) Esterilizar el asa de siembra en el mechero por unos dos minutos.
e) Extender la muestra como una capa fina sobre la lmina porta objetos. Se deja
secar la preparacin, se fija la colonia al calor suave (mechero).
f)
Adicionar una gota del colorante cristal violeta, dejar reposar por un minuto y
luego enjuagar con agua destilada.
h) Tincin de
contraste
safranina.
Las
gram
positivas
estn
teidas
con
bacterias
ya
con
6. CONCLUSIONES
Para la primera muestra que dio una coloracin azul o violeta, nos da una
bacteria gram positiva.
Para la segunda muestra, tambin nos dio una coloracin azul o violeta e
indica una bacteria gram positiva.
Se logr comprobar que la tincin gram nos ayuda a diferenciar por
coloracin las bacterias gram positivas de las gram negativas.
7. RECOMENDACIONES
Se debe extender la suspensin con mucho cuidado hasta conseguir una
capa fina.
Al secar la preparacin acercndola a la llama del mechero, evitar que se
caliente demasiado para no afectar a la estructura y forma de los
microorganismos.