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2014-2015

MMOIRE de Diplme d'tudes Spcialises


Pharmacie Industrielle et Biomdicale
Thse pour le Diplme d'tat de Docteur en
Pharmacie

Analyse des diffrentes approches de


validation de mthodes de dosage et
proposition d'un guide de validation
de mthode de dosage en pharmacie
hospitalire

SIAVELIS Armand
N le : 23 juin 1981 Svres (92)

Sous la direction de M. LAGARCE Frdric

M. David GUILET
Pr. Frdric LAGARCE
Dr. Sandy VRIGNAUD
Dr. Antoine DUPUIS

Soutenu publiquement le :
27 novembre 2014

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dclare tre pleinement conscient(e) que le plagiat de documents ou dune
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En consquence, je mengage citer toutes les sources que jai utilises
pour crire ce rapport ou mmoire.
sign par l'tudiant(e) le 12 / 11 / 2014

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tous les rapports, dossiers, mmoires.
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40 rue de rennes BP 73532
49035 Angers cedex
Tl. 02 41 96 23 23 | Fax 02 41 96 23 00

Liste des enseignants


Dpartement Pharmacie
PROFESSEURS

Disciplines

BENOIT Jean-Pierre

Pharmacotechnie - Biopharmacie

DUVAL Olivier

Chimie Thrapeutique

JARDEL Alain

Physiologie

LAGARCE Frdric

Pharmacotechnie-Biopharmacie

LARCHER Grald

Biochimie

MARCHAIS Vronique

Bactriologie - Virologie

PASSIRANI Catherine

Chimie gnrale Chimie analytique

RICHOMME Pascal

Pharmacognosie

ROBERT Raymond

Parasitologie et Mycologie mdicale

SAULNIER Patrick

Biophysique pharmaceutique et biostatistiques

SERAPHIN Denis

Chimie Organique

VENIER Marie-Claire

Pharmacotechnie - Biopharmacie

PAST
BRUNA tienne

Disciplines
Industrie

MAITRES DE CONFERENCES

Disciplines

ANNAIX Vronique

Biochimie Gnrale et Clinique

BAGLIN Isabelle

Pharmaco - Chimie

BASTIAT Guillaume

Biophysique biostatistiques -Rhologie

BENOIT Jacqueline

Pharmacologie et Pharmacocintique

CLERE Nicolas

Physiologie - Pharmacologie

CORVEZ Pol
DERBR Sverine

Communication - Smiologie
Pharmacognosie-

VEILLARD Matthieu

Bactriologie - Virologie

FAURE Sbastien

Pharmacologie Physiologie

FLEURY Maxime

Immunologie

GUILET David

Chimie Analytique

MAITRES DE CONFERENCES

Disciplines

HELESBEUX Jean-Jacques

Chimie Organique

LANDREAU Anne

Botanique

LARCHER Grald

Biochimie

MALLET Marie-Sabine

Chimie Analytique et Bromatologie

MAROT Agns

Parasitologie et Mycologie mdicale

PECH Brigitte

Pharmacotechnie

ROGER milie

Pharmacotechnie

SCHINKOVITZ Andras

Pharmacognosie

TRICAUD Anne

Biologie Cellulaire

A.H.U.
BRIS Cline
SPIESSER-ROBELET Laurence

Disciplines
Biochimie
Pharmacie clinique et ducation Thrapeutique

PRCE (Professeurs certifis affects dans


lenseignement suprieur)
GENARD Nicole

Disciplines
Anglais

ATER (Assistants Enseignement Suprieur

Disciplines

et Recherche).
DESHAYES Caroline

Bactriologie

LEONETTI Daniella

Toxicologie

PACE Stphanie

Biophysique - Biostatistiques

REMERCIEMENTS

Je remercie LAGARCE Frdric, d'avoir accept de diriger ce travail.


Je remercie tous les membres du jury d'avoir accept de faire parti du jury,
VRIGNAUD Sandy, GUILET David d'avoir bien voulu prendre la prsidence, et
DUPUIS Antoine, d'avoir fait le dplacement depuis Poitiers.
Je remercie galement toutes les personnes qui m'ont apports du soutien dans la
ralisation de ce travail.
Bonne lecture tous.

Table des mati`


eres
Liste des abr
eviations

Glossaire

Introduction

1 Les diff
erentes approches

15

1.1

Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.2

Materiel et Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.3

Resultat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.3.1

1.4

1.5

Analyse comparative des techniques de validation . . . . . . . . . . . . . 17

Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.4.1

Les differentes approches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.4.2

Lapproche classique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.4.3

Validation de la methode de dosage par quantification des incertitudes . 30

1.4.4

Validation de la methode de dosage par profil dexactitude comme outil


de decision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

1.4.5

Autres approches comparables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

1.4.6

Les crit`eres decisionnels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

1.4.7

Choix dune methode de validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

2 Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
51
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere
2.1

Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

2.2

Materiel et Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

2.3

Resultat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.3.1

Les crit`eres de validation decisionnels et non decisionnels . . . . . . . . . 54

2.3.2

Pre-validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

2.3.3

Diagramme du dosage dun medicament type


vii

. . . . . . . . . . . . . . . 56

`
TABLE DES MATIERES

viii

2.4

2.3.4 Nombre de series . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


2.3.5 Preparation des medicaments . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.6 Preparation des echantillons de gamme et de validation . .
2.3.7 Obtention du signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.8 Analyse du signal pour obtention des crit`eres decisionnels .
2.3.9 Prise de decision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.10 Post-validation ou finalisation . . . . . . . . . . . . . . . .
Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.1 Les crit`eres de validation decisionnels et non decisionnels .
2.4.2 Quelques r`egles doptimisation lors de la realisation dune
validation de dosage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.3 Pre-validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.4 Diagramme du dosage dun medicament type . . . . . . .
2.4.5 Choix des teneurs en principe actif `a etudier . . . . . . . .
2.4.6 Nombre de repetitions par serie . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.7 Preparation des medicaments . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.8 Preparation des echantillons de gamme et de validation . .
2.4.9 Obtention du signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.10 Analyse du signal pour obtention des crit`eres decisionnels .
2.4.11 Prise de decision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.12 Post-validation ou finalisation . . . . . . . . . . . . . . . .

Conclusions et perspectives
Bibliographie

. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
methode de
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . . . .

58
58
58
60
60
72
74
74
76
76
77
78
79
80
81
81
83
83
89
93
95
101

Liste des abr


eviations

Liste des abr


eviations

AFSSAPS Agence Francaise de Securite Sanitaire des Produits de Sante


AMM Autorisation de mise sur le marche
ANSM Agence Nationale de Securite du medicament et des produits de sante
BPP Bonnes Pratiques de Preparation
C Concentration
CHU Centre Hospitalo-Universitaire
COFRAC Comite francais daccreditation
CSP Code de la sante publique
FDA Food and drug administration
FI Fidelite intermediaire
HPLC High Performance Liquid Chromatography
ICH International Conferences Harmonisation
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
LD Limite de determination
LQ Limite de quantification
OCC Operating characteristic curves
P Proportion
PUI Pharmacie `a Usage Interieur
PH Preparation hospitali`ere
PM Preparation magistrale
SCE Somme des carres des ecarts
SFSTP societe francaise des sciences et techniques pharmaceutiques

Glossaire

Glossaire

Analyte Entite physique ou chimique objet de la procedure danalyse.


Biais Estimation dune erreur systematique.
Blanc Essai realise en labsence de matrice (blanc reactif) ou sur une matrice qui ne contient
pas lanalyte (blanc analyte).
Bruit de fond Signal parasite.
Capabilit
e La capabilite dun processus de production est ladequation dun procede `a realiser
une performance demandee.
Coefficient de corr
elation Le coefficient de correlation lineaire (note R) entre deux variables est egal au rapport de leur covariance et du produit non nul de leurs ecarts types.
Le coefficient de correlation est compris entre -1 et 1. Le fait que deux variables soit
fortement correlees ne demontre pas quil y ait une relation de causalite entre lune et
lautre.
Coefficient de d
etermination Cest un indicateur (note R2 ) qui permet de juger la qualite
dune regression lineaire. Il determine `a quel point lequation de regression est adaptee
pour decrire une distribution de points. Le coefficient de determination le carre du coefficient de correlation et il est compris entre 0 et 1. Plus le coefficient de determination se
rapproche de 1, plus le nuage de points se rapproche de la droite de regression.
Coefficient de variation Rapport de lecart-type `a la moyenne.
Courbe d
etalonnage ou fonction de r
eponse Relation existante entre la reponse (signal)
et la teneur (quantite) en substance `a examiner de lechantillon `a linterieur de lintervalle
de dosage.
Dosage Determination de la quantite de mati`ere, la fraction, ou la concentration dune substance precise (lanalyte) presente dans une autre ou dans un melange (la matrice).

Ecart
type Param`etre statistique indiquant la dispersion des valeurs au niveau de la moyenne
dune serie de mesures.

Echantillon
d
etalonnage Echantillons,
avec ou sans matrice, de concentration connue qui
permettent detablir les points de gamme.

Echantillon
de validation Echantillons,
reconstitues dans la matrice, dont la valeur vraie a
pu etre etablie et qui sont utilises pour la validation de la procedure danalyse.

Etalon
Molecule de reference.

Etalon
interne Molecule de reference ajoutee dans les echantillons detalonnage et les echantillons
de validation avant leurs traitement.

Etalonnage
ou calibration Operation qui concerne les appareils de mesure ou de restitution
de donnees. Reglage ou caracterisation de la reponse de lappareil par rapport `a un etalon.
Essais de dosage Un dosage `a une concentration definie

Exactitude ou erreur de mesure Etroitesse


de laccord entre un resultat dessais et la valeur
de reference acceptee.

Fid
elit
e ou erreur al
eatoire Etroitesse
de laccord entre une serie de mesures prises sur un
meme echantillon homog`ene.
Fid
elit
e interm
ediaire Fidelite obtenu dans la condition dans laquelle, les resultats sont
obtenus par la meme methode sur des echantillons dessais identiques dans le meme
laboratoire, par differents operateurs et avec du materiel different.

Fonctions de r
eponse Equation
de lintensite du signal analyse en fonction de la concentration.
Gamme Intervalle de dosage ou serie de concentration.
Grandeur physique Toute propriete de la science de la nature qui peut etre quantifiee par
la mesure ou le calcul, et dont les differentes valeurs possibles sexpriment `a laide dun
nombre reel quelconque ou dun nombre complexe, souvent accompagne dune unite de
mesure.
Incertitude Marge dimprecision sur la valeur de la mesure dune grandeur physique. Le concept est relie `a celui derreur, qui est lecart entre la valeur mesuree et la vraie valeur, par
essence toujours inconnue, seulement estimee.
Interf
erence Interaction entre des signaux.
Intervalle de dosage Region entre niveau superieur et inferieur o`
u lexactitude et la linearite
sont appropriees pour une methode decrite.

Justesse ou erreur syst


ematique Etroitesse
de laccord entre la valeur moyenne dune serie
de resultat dessais et une valeur acceptee comme vraie. (dans le cas de mesures multiples)
Lin
earit
e Capacite `a obtenir un resultat directement proportionnel `a la quantite en analyte
de lechantillon `a linterieur de lintervalle de dosage.
Limite de d
etection Plus petite quantite danalyte de lechantillon pouvant etre detectee.
Cest-`a-dire, se differenciant du bruit de fond.
Limite de quantification Plus petite quantite danalyte de lechantillon pouvant etre dosee
avec une exactitude definie.
Loi normale ou courbe de Gauss Fonction de densite de probabilite, appropriee pour enormement
de distributions naturelles en metrologie.
Loi g
eom
etrique Une forme geometrique plus adaptee `a la situation, remplace la courbe de
Gauss.
Loi rectangulaire La loi rectangulaire repond `a une fonction de densite de probabilite de
forme rectangulaire centree sur la moyenne. La loi rectangulaire est consideree comme

Glossaire
appropriee pour certaines incertitudes-types, comme par exemple, pour les balances analytiques `a lecture numerique. Lincertitude est calculee par lecart-type multiplie par
racine de 3.

Loi triangulaire isoc`


ele La loi triangulaire isoc`ele repond `a une fonction de densite de probabilite de forme triangulaire centree sur la moyenne. La loi triangulaire isoc`ele est consideree comme appropriee pour certaines incertitudes-types, comme par exemple, pour de
nombreuses verreries volumetriques (en parlant que de letalonnage, pas des effets de la
temperature et de la repetabilite des volumes distribues). Lincertitude est calculee par
lecart-type multiplie par racine de 6.
Matrice Ensemble des constituants de lechantillon autre que lanalyte.
Mesurande Grandeur que lon veut mesurer.
Mesure Processus consistant `a obtenir experimentalement une ou plusieurs valeurs que lon
peut raisonnablement attribuer a` une grandeur.
M
ethode des ajouts dos
es Comparaison des signaux obtenus avec et sans ajout de quantites
connues de lelement `a doser.
Mod`
ele de r
egression Un mod`ele qui relie une ou plusieurs variables `a expliquer Y `a des
variables explicatives X, par une relation fonctionnelle Y = F (X)
Qualification Verification du bon fonctionnement dun appareil, `a savoir sil est capable de
produire les resultats pour lesquels il est concu tout au long de sa vie.
R
ep
etabilit
e Fidelite obtenu dans la condition dans laquelle, les resultats sont obtenus par la
meme methode sur des echantillons dessais identiques dans le meme laboratoire, par le
meme operateur et avec du materiel identique.
Reproductibilit
e Fidelite obtenu dans la condition dans laquelle, les resultats sont obtenus
par la meme methode sur des echantillons dessais identiques dans des laboratoires differents,
par differents operateurs et avec du materiel different.
Robustesse Capacite `a ne pas etre affectee par des variations faibles mais deliberees des
param`etres de la methode, et qui fournit une indication sur la fiabilite dune mesure.
S
electivit
e Notion relative de specificite
Sensibilit
e Rapport variation de la reponse (signal) sur la variation de la quantite danalyte
(concentration). Plus generalement, un appareil est dautant plus sensible quune petite
variation de la grandeur `a mesurer (concentration) provoquera un changement plus grand
de lindication donnee par lappareil de mesure (signal).
S
erie de dosage Ensemble dessais de dosage `a concentrations definies
Signal Grandeur extraite dun phenom`ene complexe, qui varie, et sur laquelle op`erent les
procedes de traitement du signal.

7
Sp
ecificit
e analytique Capacite dun syst`eme de mesure `a mesurer une concentration sans
interference. Le manque de specificite analytique est appele interference analytique.

Unit
e de mesure Etalon
necessaire pour la mesure dune grandeur physique.
Valeur de r
ef
erence accept
ee Valeur qui sert de reference pour une comparaison.
Validation Operation destinee `a demontrer, documents `a lappui, quune procedure, un procede
ou une activite conduit effectivement aux resultats escomptes. Elle comprend la qualification des syst`emes et des equipements.

Glossaire

Introduction

11
Le Centre Hospitalo-Universitaire (CHU) dAngers est un etablissement public de sante,
pavillonnaire, organise en 7 poles et 59 services. Il comprend 1464 lits et places, emploie 4856
agents hospitaliers et 979 medecins. Il a accueilli au cours de lannee 2012, 163410 patients
(consultants et hospitalises), 60005 hospitalisations compl`etes, 33938 hospitalisations de jour
et 400539 consultations(C.H.U., 2014).
La Pharmacie `a Usage Interieur (PUI) du CHU dAngers emploie 18 pharmaciens et 6 internes en pharmacie. Elle est chargee de repondre aux besoins pharmaceutiques de letablissement.
Elle doit notamment assurer, dans le respect des r`egles qui regissent le fonctionnement de
letablissement, la gestion, lapprovisionnement, la preparation, le controle, la detention et la
dispensation des medicaments, produits ou objets mentionnes `a larticle L. 4211-1 ainsi que
des dispositifs medicaux steriles et, le cas echeant, des medicaments experimentaux tels que
definis `a larticle L. 5121-1-1 et den assurer la qualite (Article L5126-5 du CSP). La PUI du
CHU dAngers fabrique des medicaments destines aux services de lHopital pour sadapter aux
differents besoins du personnel medical et surtout des patients ayant des besoins particuliers.
Elle dispose pour cela de locaux adaptes, dun personnel forme et des autorisations necessaires
(Legifrance, 2013).
` lHopital, il existe deux categories de preparations : les preparations magistrales, preparees
A
extemporanement pour un patient, et les preparations hospitali`eres, preparees en serie selon
les indications de la pharmacopee et dispensees `a la demande (Pharmacopee, 2013; Legifrance,
2013).
La PUI du CHU dAngers fait partie de la liste des structures autorisees par lANSM pour
realiser des preparations hospitali`eres, article R. 5126-9-1 du CSP. Elle realise aussi preparations
rendues necessaires par les recherches biomedicales, article R.5126-9-2 du CSP (Legifrance,
2013).
Les preparations magistrales et hospitali`eres sont preparees dans les locaux de la PUI du
CHU dAngers, selon les Bonnes Pratiques de Preparation (BPP), texte opposable redige par
lAgence Nationale de Securite du medicament et des produits de sante (ANSM) (A.F.S.S.A.P.S.,
2007; Legifrance, 2013; A.N.S.M., 2013).
La PUI du CHU dAngers prepare differents types de medicaments, et dispose pour cela, de
six salles, physiquement separees en fonction des exigences necessaires aux preparations. Pour
toute preparation sterile, en fonction de lexigence de la qualite de lair ambiant et des surfaces,
on parle de zones en classe A, B, C et D, respectivement du plus exigeant au moins exigeant
(A.F.S.S.A.P.S., 2007).
` la PUI du CHU dAngers, le laboratoire de controle est en charge de controler les gaz
A
medicaux et eaux dhemodialyse de letablissement, les locaux de preparation de medicament
de la PUI et les preparations de medicaments de la PUI, de la mati`ere premi`ere `a la liberation
du produit fini.
Le controle des preparations hospitali`eres et des preparations magistrales est realise selon

12

Introduction

plusieurs etapes. Les mati`eres premi`eres servant `a la fabrication des preparations hospitali`eres
et des preparations magistrales sont controlees `a leur reception. En attendant le resultat du
controle, elles sont stockees en zone de quarantaine. Les locaux destinees `a la preparation
sont soumis `a des controles bacteriologiques de surface. Les controles sont effectues avant fabrication, pendant fabrication et avant conditionnement par le laboratoire de controle. Avant
fabrication sont controles, les mati`eres premi`eres et le materiel qui vont servir `a la preparation
du medicament. Pendant la fabrication, chaque etape critique est controlee avant la poursuite
de la preparation. Par exemple, la verification des pesees, des volumes et la mesure du pH,
sont des controles `a effectuer avant de poursuivre la preparation. Avant conditionnement, un
controle terminal est effectue sur le produit fini. Les controles terminaux sont caracterises par
des controles detiquetage, des dosages et des controles bacteriologiques.
Chaque lot de preparation hospitali`ere et de preparation magistrale `a externaliser, est
systematiquement dose lors du controle terminal. Tous ces dosages sont realises `a laide de
techniques manuelles en opposition aux techniques automatisees, plus rapides.De plus, un large
panel de dosages differents est realise. Toute nouvelle methode de dosage est validee avant son
utilisation en routine.
De plus en plus de nouveaux dosages sont mis au point par le laboratoire de controle du
fait de laugmentation du nombre de preparations proposees `a lexternalisation vers dautres
centres hospitaliers. Cependant, un nombre croissant de ces dosages doivent etre refaits car
controles en dehors des limites imposees. Ainsi, des medicaments sont parfois detruits.
Seulement, il est difficile de savoir si le probl`eme vient de la fabrication du medicament,
du dosage, ou bien de letroitesse de la limite dacceptation du dosage, imposee. Si lon veut
repondre `a cette question, il faut se demander si la validation dune methode de dosage ne
doit pas prendre en compte tous ces crit`eres. Actuellement, ce nest pas le cas. Toute nouvelle
methode de dosage est validee selon des crit`eres analytiques et statistiques qui peuvent varier.
Aucune methode preferentielle na reellement ete definie et justifiee pour la validation des
methodes analytiques.
Pourtant, les methodes de dosage et de preparation des medicaments sont validees par le
laboratoire. Les preparateurs sont habilites et le personnel du laboratoire controle etroitement
chaque etape de la fabrication des medicaments. La situation des dosages non conformes est
parfois difficilement explicable hormis un probl`eme concernant leurs crit`eres de validation.
Afin de reflechir `a ce probl`eme, il est necessaire davoir une bonne connaissance des methodes
permettant de valider une methode de dosage. Il semble aussi judicieux de rechercher sil nexiste
pas une methode plus adaptee `a la situation, methode qui validerait le dosage sur tous les aspects
de son utilisation en routine.
Dans un second temps, lobjectif est de proposer une methode et des outils permettant de
mettre directement en application une validation de methode de dosage dans un laboratoire de
controle de pharmacie hospitali`ere. Cette methode proposee est basee sur une association de

13
methodes existantes. Elle doit permettre doptimiser la validation de methodes de dosage, afin
de sadapter au mieux `a la situation dun laboratoire de controle de pharmacie hospitali`ere.

Chapitre 1
Les diff
erentes approches
Sommaire
1.1

Introduction

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

17

1.2

Mat
eriel et M
ethode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

17

1.3

R
esultat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

17

1.3.1
1.4

Analyse comparative des techniques de validation . . . . . . . . . . . . 17

Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4.1

20

Les differentes approches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20


Validation de methode par ses crit`eres de performance . . . . . . . . . 20
Validations de methodes alternatives (quantification des incertitudes,
profil dexactitude, capabilite) . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.4.2

Lapproche classique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Definition de lexactitude et de la justesse . . . . . . . . . . . . . . . . 20
ICH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
IUPAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
SFSTP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
COFRAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

1.4.3

Validation de la methode de dosage par quantification des incertitudes 30


Eurachem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
IUPAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
COFRAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

1.4.4

Validation de la methode de dosage par profil dexactitude comme


outil de decision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
SFSTP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

1.4.5

Autres approches comparables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42


Capabilite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
OCC, lapproche ideale ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

15

16

Les diff
erentes approches

1.5

1.4.6

Les crit`eres decisionnels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

1.4.7

Choix dune methode de validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Conclusion

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

49

1.1 Introduction

1.1

17

Introduction

Afin de reflechir `a une methode de validation de methodes de dosage dans le domaine de


la pharmacie hospitali`ere, une etude de la litterature concernant la validation de methodes de
dosage etendue aux autres domaines `a ete realisee.
Cette analyse est basee sur des crit`eres objectifs, permettant de mettre en evidence les
methodes proposees, les crit`eres de validation, les plans danalyse et les methodes de calcul
utilisees.
Cette analyse fait ressortir trois types de validation de methode, validation de methode par
ses crit`eres de performance, par quantification des incertitudes et par profil dexactitude comme
outil de decision.
Cette partie est destinee `a bien comprendre ces trois types de validation de methode. Cela
permettra par la suite de faire un choix parmi ce que propose la litterature. Lenjeu est de
selectionner la methode qui sera la plus adaptee `a la situation de la PUI du CHU dAngers et
de la pharmacie hospitali`ere en general.

1.2

Mat
eriel et M
ethode

En recherchant dans la litterature les documents de reference dans le domaine de la validation de methode, en les classant par organisme, date, pays et domaines dapplication, sont
etudies, les plans danalyse, les methodes de calcul permettant la determination de chaque
crit`ere de validation ainsi que lanalyse du resultat pour chaque crit`ere.

1.3
1.3.1

R
esultat
Analyse comparative des techniques de validation

Lanalyse des resultats est resumee dans le tableau ci dessous. Il represente les crit`eres de
validation proposes par les differents organismes scientifiques de renommee internationale.
Seul les crit`eres necessaires `a la validation de la methode sont decrits. Le tableau donne une
information `a la fois sur la determination et sur lanalyse de chaque crit`ere.
` la fin du tableau, figurent les organismes proposant des exemples concrets dapplications
A
de validations de methodes.
La description des crit`eres de validation est classee par une valeur allant de 1 `a 5, de la
facon suivante :
1, signifie que le crit`ere `a determiner pour valider la methode de dosage est juste cite dans
le document.

18

Les diff
erentes approches

2, signifie que la description permettant de determiner le crit`ere de validation est incompl`ete


et ne permet pas de determiner ce crit`ere dans un cas precis. La description sapplique seulement
`a un cas general et aucune methode danalyse de ce crit`ere nest decrit.
3, signifie que la description dobtention du crit`ere est compl`ete et precise, mais son analyse
nest toujours pas decrite.
4, signifie que la description dobtention du crit`ere est incomplete, de lordre du cas general,
et une methode danalyse de ce crit`ere est proposee dans le but de valider la methode `a partir
de ce crit`ere.
5, la description de la determination et de lanalyse du crit`ere de validation de la methode
est compl`ete pour etre utilisee telle quelle (voir table 1.1).

1.3 R
esultat

19
Table 1.1 Analyse comparative des techniques de validation

G.E.R.P.A.C. (2013)

COF- GERRAC PAC

C.O.F.R.A.C. (2013)

Hubert et al. (2003, 2006a,b)

SFSTP

Algranti et al. (1992)

Ellison et Williams (2012)

EURACHEM

Wood et al. (2002)

Fajgelj et Ambrus (1999)

Dennis Pocklington (1990)

IUPAC

Horwitz (1988)

Publications

F.D.A. (2001)

ICH

I.C.H. (1997)

Organismes

les crit`eres de validation


Justesse

Repetabilite

FI

Reproductibilite

LQ

LD

Linearite
letalonnage

de

3
2

Recouvrement

Sensibilite

Specificite

Stabilite reactifs

5
1

1
1

1
3

Robustesse

Incertitude

Limites dexactitude

Capabilite

5
Description dexemple(s) concret(s) de validation de methode
non

non

non

oui

non

non

oui

oui

oui

non

non

Table 1.1 classement de la description des crit`eres de validation permettant de valider


la methode de dosage, allant de 1 `a 5. - 1 : aucune description. - 5 : description compl`ete
de la determination et de lanalyse du crit`ere de validation de la methode. - FI : Fidelite
intermediaire ; LQ : limite de quantification ; LD : limite de determination.

20

1.4
1.4.1

Les diff
erentes approches

Discussion
Les diff
erentes approches

Validation de m
ethode par ses crit`
eres de performance
Lapproche classique consiste `a valider la methode de dosage selon des crit`eres de performance definis `a lavance. La methode est declaree valide si elle a par exemple, une bonne
sensibilite, une bonne specificite, etc...
Validations de m
ethodes alternatives (quantification des incertitudes, profil dexactitude, capabilit
e)
Ce sont des approches globales qui se basent sur des crit`eres decisionnels objectifs, comme
par exemple, lestimation de limites dans lesquelles se trouve le resultat par rapport `a la vraie
valeur, ou bien, les limites dans lesquelles se trouve la vraie valeur par rapport au resultat. La
confrontation de ces limites aux limites imposees en routine, permettent de valider ou de rejeter
la methode de dosage.

1.4.2

Lapproche classique

Lapproche classique consiste `a definir des crit`eres qui vont servir `a valider le dosage, estimer
ces crit`eres et confronter ces estimations aux limites fixees ou imposees. Ce type de validation
est la plus communement utilisee. Cest dailleurs celle utilisee actuellement `a la PUI du CHU
dAngers. Cependant dans la litterature on trouve bon nombre de facon de valider une methode
de dosage par ses crit`eres de performance. Deux crit`eres reviennent systematiquement, ce sont
la fidelite et la justesse. La fidelite se mesure soit par un ecart type, soit par un coefficient
de variation. Plus lun ou plus lautre est eleve et moins la methode de dosage est fid`ele. La
justesse se mesure par le biais. Plus le biais est eleve et moins la methode de dosage est juste.
La representation graphique de lapproche classique descriptive `a une concentration definie,
peut etre estimee comme une distribution des resultats dun dosage repete `a linfini, dans des
conditions definies, `a une concentration danalyte definie et fixe (voir figure 1.1).
En realite, lorsquune methode de dosage est validee, lecart type et le biais sont estimes :
leurs vraies valeurs ne sont pas connues. Dans lapproche descriptive, une bonne methode de
validation de dosage est une methode qui permet lestimation la plus fine, entre autre, de la
justesse et de lexactitude aux concentrations dosees.
D
efinition de lexactitude et de la justesse
Il est necessaire de faire un point sur la definition de la justesse qui est un peu controversee
du fait de lhistorique de son usage.

1.4 Discussion

21

Figure 1.1 Representation graphique de lapproche descriptive `a concentration definie. T


represente lecart type relatif ou coefficient de variation et T la moyenne
Historiquement, pour lICH il ny a pas de distinction entre les deux termes exactitude et
justesse. Ils ont la meme definition (I.C.H., 1997) et sont definis comme etant letroitesse de
laccord entre la valeur moyenne dune serie de resultats dessais et une valeur acceptee comme
vraie. Tous les travaux qui se basent sur lICH reprennent cette definition (Bervoas-Martin
et al., 1997; Vander Heyen et al., 2000; P. et al., 2003; F.D.A., 2000, 2001).
Aujourdhui, lIUPAC, lEurachem, la Cofrac, les normes ISO 5725 et la SFSTP distinguent
la justesse de lexactitude. Ils definissent la justesse comme etant letroitesse de laccord entre
la valeur moyenne dune serie de resultats dessais et une valeur acceptee comme vraie. Ils
definissent lexactitude comme letroitesse de laccord entre un resultat dessais et la valeur de
reference acceptee.

22

Les diff
erentes approches

Figure 1.2 Representation visuelle schematique metrologique de la distribution de resultats.


En fonction des distributions, le resultat du dosage sera juste ou et fid`ele. Un resultat juste et
fid`ele est un resultat exact.
Ce sont les definitions les plus recentes de la justesse, qui seront utilisees par la suite pour
comparer les methodes de dosage entre elles, car elles sont plus compl`etes pour decrire tous les
cas de figure proposes( voir figure 1.2).
` ce jour, dautres derives existent. On peut voir les termes exactitude de la mesure et
A
exactitude moyenne pour differencier les deux definitions.
Il est important de bien comprendre que ces deux termes ont des definitions differentes en
fonction des sources dont ils proviennent. Il faut donc bien faire la distinction entre les deux.
ICH
LICH (International Conferences Harmonisation), cree en 1990, sest donne comme mission
de realiser des recommandations pour lindustrie pharmaceutique redigees sous forme de guides,
dans le but dharmoniser les pratiques. Il fait cooperer au niveau international des acteurs
appartenant aux autorites et des acteurs appartenant `a lindustrie pharmaceutique (I.C.H.,
2013).
LICH propose une validation de methode basee sur la validation de nombreux crit`eres
qui sont : la justesse confondue avec lexactitude, la fidelite, la limite de quantification avec
une fidelite et une justesse definies, la linearite et lintervalle de dosage avec une fidelite et
une justesse definies. Pour le calcul de chacun des crit`eres, il est propose un nombre minimum dessais et de series dessais pour les echantillons de validation, sans preciser comment
preparer ces echantillons, ce qui rend le plan de preparation des echantillons incomplet. La
reproductibilite est determinee par des essais inter-laboratoires. Sa determination permet de
proposer des procedures analytiques `a harmonisations internationales et de realiser les monographies de la pharmacopee. Plusieurs approches sont decrites pour determiner les limites de
detection et de quantification. Le calcul du coefficient de correlation, sur cinq series, permet
de valider la linearite de la droite detalonnage, meme si le coefficient de correlation nest pas

1.4 Discussion

23

un crit`ere de linearite. Lintervalle de dosage propose doit etre compris entre 80 et 120 % de la
(des) concentration(s) recherchee(s) (I.C.H., 1997).
Les resultats des calculs sont bruts, ils ne sont pas retravailles pour permettre une estimation
rapportee `a une population. Les resultats trouves sont propres `a la methode utilisee pour
preparer les echantillons et au nombre dessais et de series dessais. Autrement dit, en fonction
du choix de la methode de preparation des echantillons et du nombre dessais, pour une meme
methode de dosage, les crit`eres de validation calcules ne sont pas identiques et donc difficilement
comparables. A contrario, sils avaient ete retravailles pour obtenir une estimation rapportee
`a une population, ils seraient comparables dun laboratoire `a un autre sans se preoccuper du
mode de preparation des echantillons, du nombre dessais ou de series dessais.
LICH ne propose pas de methode danalyse des resultats des crit`eres de validation, charge
`a loperateur de se fixer les limites pour tous ces crit`eres. Il ny a pas non plus dinformation sur
limpact des crit`eres de validation sur la performance reelle attendue du dosage. Aucun exemple
nest propose pour illustrer une validation de methodes de dosage. Ce document presente une
liste de crit`eres de performance devant permettre la validation dune methode de dosage, leurs
definitions, et un mode de calcul de ces crit`eres, base sur un nombre minimal de series dessais et
de concentrations. Cependant, il ne permet pas de savoir comment valider tous ces crit`eres. En
suivant les recommandations de lICH, la validation dune methode passe par la determination
` partir du moment o`
de crit`eres de validation, mais pas par une validation de ces crit`eres. A
u
ces crit`eres sont calcules, la methode est validee.
Pour la validation dune methode de dosage en milieu biologique, la FDA (qui fait partie
de lICH) cite les crit`eres de validation suivants : fidelite, justesse, selectivite, sensibilite, reproductibilite et stabilite. Elle propose surtout des definitions et des recommandations generales et
reprend les donnees de lICH. Dans certaines conditions, comme par exemple pour une HPLC
(High Performance Liquid Chromatography), un changement de ratio des solvants delution ou
de petits changements de temperature, il est possible de realiser une validation partielle ou seuls
deux crit`eres sont determines : la fidelite et la justesse. Par contre dans le cas dun changement important de la temperature, du syst`eme de solvants, dappareillage ou de detecteur, la
methode de dosage doit etre revalidee en totalite (F.D.A., 2001). Pour un dosage de produit
issu de la chimie, la FDA reprend les standards de lICH (F.D.A., 2000).
IUPAC
LIUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) creee en 1919 par des
chimistes de lindustrie de la chimie et duniversitaires, est une structure non gouvernementale, reconnue pour participer `a lavancee de la science de la chimie au niveau mondial. Il
participe `a un grand nombre de projets `a travers le monde, notamment sur lharmonisation des
methodes de mesure appliquees `a la chimie (I.U.P.A.C., 2013).
Jusque dans les annees 90, lIUPAC met laccent sur le caract`ere inter-laboratoires des

24

Les diff
erentes approches

methodes de validation, dans le but de valider des methodes de dosage qui serviront ensuite de
reference (Fajgelj, 2007).
En 1988 lIUPAC a pour objectif de proposer une harmonisation des pratiques et, `a ce titre
de permettre la comparaison de nouvelles methodes de dosage par rapport `a une methode de
reference. Seul le crit`ere de fidelite est etudie car il est le seul servant `a comparer les methodes
entre les laboratoires. LIUPAC accorde peu dimportance aux autres crit`eres de validation
en donnant uniquement leurs definitions. Lattention est centree plus particuli`erement sur la
reproductibilite, mais aucune methode danalyse de ce crit`ere nest proposee. La repetabilite
est obtenue grace `a trois series de deux essais. La repetabilite de la methode est fixee `a 2,8 fois
lecart-type de repetabilite obtenue, probablement pour tenir compte dune estimation pour
une population. La reproductibilite est determinee `a laide dun essai inter-laboratoires sur,
au minimum huit laboratoires avec trois series de deux `a six essais par laboratoire. Les tests
de Grubbs et de Cochran (1 % - 1 %) permettent de rejeter les valeurs aberrantes. Le test de
Cochran (1 %) permet de detecter les valeurs aberrantes en termes de dispersion et il sapplique
sur les ecarts-types des mesures. Cest principalement un test de variabilite inter-laboratoires
et il convient de lappliquer en premier pour supprimer un `a un les laboratoires rejetes. Le
test de Grubbs (1 %) permet de detecter les valeurs aberrantes en termes de dispersion de
moyennes. Le principe de ce test est de comparer les valeurs absolues des ecarts reduits qui
aboutit `a la suppression des laboratoires non conformes. La valeur de reproductibilite est rejetee
si plus de deux laboratoires sur neuf sont rejetes par les tests de Grubbs et de Cochran (1 %
- 1 %). La valeur de reproductibilite est recalculee si moins de deux laboratoires sur neuf sont
rejetes. La reproductibilite de la methode est fixee `a 2,8 fois lecart-type de la reproductibilite
obtenue et est rendue avec deux chiffres significatifs. Lobjectif nest pas de fixer une limite de
reproductibilite mais de determiner finement sa valeur (Grubbs, 1969; Cochran, 1941; Horwitz,
1988).
En 1990, des exemples de validation de methode bases sur la validation des conditions
dapplication des tests statistiques permettent de determiner la reproductibilite de la methode.
Des limites de reproductibilite sont proposees en lien avec la courbe de Horwitz : reproductibilite
en fonction de la concentration de lanalyte (Horwitz, 1988; Dennis Pocklington, 1990).
Lelaboration de methodes de reference sav`ere tr`es utile, mais la complexite de leurs mise
en place ainsi que le nombre croissant de nouvelles techniques analytiques rend lutilisation
de ces methodes de reference de moins en moins utilisables en pratique. De plus en plus de
laboratoires cherchent `a valider chaque methode de dosage en fonction de leur utilisation, et
des nouvelles techniques analytiques disponibles. De plus, les laboratoires qui cherchent `a valider
une methode de dosage inter-laboratoires, doivent au prealable la valider dans leur laboratoire,
en utilisant une methode fiable. Pour ces deux raisons, lIUPAC sest penchee sur la question
de la validation de methodes de dosage dans un seul laboratoire appele aussi validation de
methode maison ou validation de methode intra-laboratoires (Fajgelj, 2007).

1.4 Discussion

25

Il apparat clairement, que lelaboration dune methode de dosage de reference, universelle,


pour un analyte donne, pour tout type de matrice et de methode analytique, est trop longue,
compliquee voire impossible. La recherche soriente donc vers des methodes de validation intralaboratoires. Deux principales voies sont abordees, la methode classique avec la validation de
multiples crit`eres de performance, et la validation par quantification des incertitudes proposee
par lEurachem qui sera abordee plus tard (Horwitz, 1988; Fajgelj et Ambrus, 1999).
En 1999, lanalyse dune methode de dosage en vue de sa validation se complexifie, en
utilisant toujours lapproche classique. Les crit`eres de validation sont : justesse, fidelite, linearite,
limite de detection, robustesse et specificite. La fidelite et la justesse sont comparees par des
tests statistiques, `a des valeurs de references. Le plan de preparation pour la determination de la
justesse et de la fidelite, requiert au minimum quatre series de cinq essais, pour lesquels, chaque
serie utilise un lot different de lanalyte. La justesse et la fidelite sont determinees `a au moins
deux niveaux de concentration. Il est recommande que linterval de dosage couvre au moins
50 `a 150% de la concentration recherchee. Il commence `a apparatre un nombre important
de tests statistiques. Un test de Student permet de comparer les biais calcules aux biais de
reference. Un test danalyse des variances doit permettre de determiner la repetabilite et la
fidelite intermediaire, ainsi quun intervalle de confiance autour de la moyenne. Cependant ces
calculs ne sont pas decrits. La limite de detection est calculee sur vingt blancs, par un test de
Student `a 3 degres de liberte (dll = 3) avec un p limite de `a 0,05. La limite de quantification,
` une concentration proche de la
est estimee entre deux `a cinq fois la limite de detection. A
limite de quantification, le coefficient de variation calcule sur vingt echantillons independants
doit-etre inferieur `a 10%. La linearite ne doit pas etre determinee par le calcul du coefficient
de correlation, comme le preconise lICH, ni par le calcul du coefficient de determination.
Malheureusement, lIUPAC ne propose pas dalternative pour la determination de la linearite
(Wood et al., 1999).
La specificite doit etre reservee aux cas o`
u une matrice, variable, inconnue et complexe est
utilisee. Si la matrice est connue, un simple test permettant de verifier en pre-validation que
rien dans la matrice na dimpact important sur le signal, devrait suffire. Dans un medicament,
la matrice est connue et comporte rarement dautres molecules similaires au medicament. Dans
ce cas, le risque dinterference entre la molecule `a doser et une autre molecule est assez faible
et previsible.
En 2002, lIUPAC apporte quelques precisions sur certains points. La linearite est validee par
comparaison de lordonnee `a lorigine et des pentes des droites de regression. La comparaison
des droites de regression est realisee en presence et en absence de matrice. Souvent, il y a
confusion dans la litterature entre la limite de detection instrumentale et la limite de detection
de la methode de dosage. Pour les situations o`
u lintervalle de dosage ninclue pas ou napproche
pas cette valeur, la limite de detection ne doit pas servir lors de la validation de la methode de
dosage. Concernant lanalyse et la determination de la limite de quantification, trop dapproches

26

Les diff
erentes approches

differentes sont retrouvees dans la litterature, et il serait preferable de sen affranchir en utilisant
une approche passant par lanalyse de lincertitude (Wood et al., 2002).
SFSTP
La SFSTP (societe francaise des sciences et techniques pharmaceutiques) est une association
des industries de la sante, cree en 1946, elle rassemble les connaissances des industries et de
luniversite, et contribue `a la progression des sciences et techniques pharmaceutiques. La SFSTP
publie son travail dans sa revue Sciences et Techniques Pharmaceutiques depuis 1970.
En 1992, la SFSTP publie un article destine `a permettre la validation de procedure analytique en vue dun depot de dossier dAMM (autorisation de mise sur le marche). Les crit`eres
de validation sont : justesse, fidelite et linearite. Les plans de preparation des echantillons sont
bien decrits. Pour chacun des crit`eres de validation, les formules des calculs statistiques sont
donnees, ainsi que leurs conditions de validite avec leurs formules de calcul. Un vrai schema
statistique detaille permet daffirmer la linearite de la droite detalonnage.
La justesse est determinee en realisant au minimum cinq series de trois essais en partant
du principe actif seul. Pour chaque essai, les pesees de principe actif sont independantes. Apr`es
changement de variable, un test dhomogeneite des variances liees, par le test de Cochran,
permet de voir si on peut considerer les variances comme homog`enes. Un test de validite
des moyennes (test de Fischer), permet de savoir si les variations entre les observations des
differentes series sont dues uniquement aux erreurs experimentales. Apr`es avoir realise ces tests,
il est possible de calculer une estimation du recouvrement moyen, ainsi que son intervalle de
confiance.
La fidelite est determinee en realisant au minimum trois series de six essais, sur un echantillon
initial homog`ene. Un changement de variable `a partir de lequation de la droite de regression
permet de determiner les pourcentages de recouvrement. Ils servent de base pour le calcul de
la variance de repetabilite, de la variance intergroupe, de la variance de reproductibilite, et
des coefficients de variation correspondants. Ces calculs sont valides, grace au test statistique
dhomogeneite des variances `a linterieur des groupes par un test de Cochran, et grace `a une
recherche des mesures aberrantes `a eliminer par un test de Dixon.
La linearite est determinee en realisant au minimum cinq series de trois essais, en partant
de la forme pharmaceutique, et `a partir des series (celles avec le principe actif seul) qui servent `a determiner la justesse. Pour chaque essai, les pesees de la forme pharmaceutique sont
independantes. Les equations des droites de regression sont obtenues par la methode des moindres carre, puis leurs coefficients de correlation sont calcules. Les ordonnees `a lorigine sont
compares `a la valeur zero par un test de Student. Les droites detalonnages obtenues avec le
principe actif seul, sont comparees aux droites obtenues en partant de la forme pharmaceutique.
Leurs ordonnees `a lorigine sont comparees, ainsi que leurs pentes, toutes deux `a laide dun
test de Student. Apr`es changement de variable, dautres tests statistiques sont realises sur tous

1.4 Discussion

27

les essais, recherche dhomogeneite des variances par test de Cochran, recherche de lexistence
dune pente significative par test de Fischer et recherche de la validite des droites de regression
par un test de Fischer. Si tous ces tests sont conformes, il est possible de conclure `a la linearite
de la droite detalonnage.
Enfin il faut determiner la coherence entre les erreurs de fidelite et dexactitude par comparaison des variances de reproductibilite, et verifier lerreur experimentale par un test de Fischer.
Les variances doivent etre egales(Algranti et al., 1992).
Ce document est tr`es complet pour creer un plan de validation de methodes intra-laboratoires,
cependant, tout ces test statistiques sont assez complexes et leurs analyse parfois peu aisees. Il
faut par exemple faire appel `a un statisticien si les variances de lanalyse de la coherence des
erreurs de fidelite et exactitude ne sont pas egales. Aucune autre alternative nest proposee, si
les conditions de calcul de la justesse ou de la fidelite ne sont pas remplies, que de recommencer
la procedure de validation de methode, car une condition non remplie, invalide la procedure
de validation de methode. De plus il r`egne une confusion entre les r`egles de diagnostic et de
decision, autrement dit, lattention ne se porte pas suffisamment sur lobjectif primaire de validation de la methode de dosage mais beaucoup trop sur les r`egles de condition dapplication
des tests statistiques. Ceci aboutit parfois `a une situation absurde o`
u, lanalyste est penalise
si il developpe une procedure trop fid`ele (Hubert et al., 2003). Ce document de 1992 est tr`es
complet, il a servit de reference pendant de nombreuses annees, et a fait lobjet de nombreuses
publications (Bervoas-Martin et al., 1997; Vander Heyen et al., 2000; P. et al., 2003).
COFRAC
(2011)
Le COFRAC (Comite francais daccreditation), cree en 1994, est lunique organisme national
charge daccrediter, il est notamment en charge de laccreditation des laboratoires de biologie
medicale (C.O.F.R.A.C., 2013).
Le COFRAC propose un guide destine aux laboratoires de biologie medicale pour valider
leurs methodes de dosage. Il introduit la notion de verification (appele portee A) et de validation (appele portee B) de methodes de dosage. La verification de methodes de dosage (portee
A) concerne les methodes de dosages commercialisees par des industriels, aux laboratoires danalyse medicale. Les laboratoires de controle de pharmacie hospitali`ere ne travaillent pas sur
ce type de methodes de dosage. La portee A ne concerne donc pas le laboratoire de controle de
la PUI du CHU dAngers. La portee B decrit un grand nombre de crit`eres de validation, notamment certains qui sont specifiques `a la biologie medicale et qui ninteressent pas les laboratoires
de controle de pharmacie hospitali`ere. Lincertitude de mesure du dosage est determinee, pour
pouvoir la mettre `a disposition des prescripteurs lorsquils en font la demande. Si les prescripteurs nen font pas la demande, lincertitude de mesure du dosage nest pas recherchee. La
comparaison avec une methode de reference ou une methode dej`a utilisee dans dautres labo-

28

Les diff
erentes approches

ratoires, permet de pouvoir donner des resultats dun patient, comparables dun laboratoire `a
lautre, ce qui nest pas necessaire en pharmacie hospitali`ere (C.O.F.R.A.C., 2011).
Les crit`eres suivants ne sont pas adaptes ou partiellement adaptes aux laboratoires de
controle de pharmacie hospitali`ere :
La recherche du risque de contamination est adaptee `a lutilisation dautomate, et non aux
techniques manuelles utilisees `a la PUI du CHU dAngers. Cependant un petit nombre
de methodes de dosage sont realisees en HPLC. En HPLC, lutilisation dun blanc en
fin de serie permet de sassurer de labsence de signal correspondant `a une absence de
contamination detectable.
Lanalyse des discordances, est utilisee pour les resultats de type qualitatif.
Lintervalle de reference dans un milieu biologique est specifique des dosages en milieu
biologique.
La specificite analytique ou interference, crit`eres similaires, cites par le COFRAC, peuvent
etre determines lors de la pre-validation, car la matrice medicamenteuse est connue (comprenant excipients, diluants et reactifs) et non variable comme pour le sang ou les urines
en biologie medicale. La recherche de specificite analytique ou dinterference se traduit
donc par la recherche dun effet de la matrice sur le dosage du medicament. Comme precise
precedemment, le risque dinterference entre la molecule `a doser et une autre molecule est
assez faible et previsible lors du dosage dun medicament.
Il y a deux cas de figure principaux o`
u la matrice a un effet sur le dosage du medicament. Soit
la matrice modifie le signal en presence du medicament `a doser, ce qui est appele leffet de matrice (ou effet de matrice variable) et la gamme est ajustee. Generalement la gamme est ajustee
par lutilisation de matrice depourvue de medicament comme diluant dans la preparation des
points de gamme. Soit un element de la matrice emet une interference sur le signal (appele
aussi effet de matrice constant), independamment de la presence du medicament `a doser, et
visible par la presence dun signal de la matrice lorsquelle est depourvue du medicament. Lutilisation de la matrice comme blanc ou la soustraction du signal correspondant au blanc, r`egle
generalement ce probl`eme (voir figure 1.3).La methode des ajouts doses permet de quantifier
leffet de matrice en realisant deux gammes et en ajoutant une quantite connue du principe
actif dans les points de la deuxi`eme gamme. Cette methode permet de saffranchir de leffet de
la matrice sur le dosage.
Lextrapolation des crit`eres du COFRAC, appliques `a la pharmacie hospitali`ere, preconise
de debuter la validation de methodes de dosage par une verification de limportance de leffet de
la matrice sur le dosage. Si leffet de matrice est important, il faut proceder a une modification
dans la mise au point du dosage, en rajoutant la matrice dans la preparation des points de
gamme. Si ce nest pas fait, cela cree un biais important et donc une degradation importante
de la justesse. Les crit`eres permettant la validation de methode sont, fidelite, justesse dans
lintervalle de mesure, ainsi que la limite de linearite et la stabilite des reactifs prepares `a

1.4 Discussion

29

Figure 1.3 Visualisation de leffet de matrice par representation graphique du signal obtenu
en fonction de la concentration de lanalyte `a doser.

lavance. Si besoin des tests de robustesse sont realises.


Le COFRAC propose differentes approches pour determiner les crit`eres de validation. La
fidelite est determinee sur au minimum deux niveaux de concentration, avec trente essais par
niveau de concentration, a partir de quoi sont calcules, moyenne, ecart type et coefficient de variation. Le coefficient de variation ne doit pas depasser une limite fixee `a lavance. La difference
observee entre la repetabilite et la fidelite intermediaire est un des reflets de la robustesse de
la methode. Plus cette difference est elevee, plus la robustesse est mauvaise. La justesse est
determinee grace `a lutilisation des controles qualites disponibles pour la methode. Le nombre dechantillon doit etre le plus grand possible, de preference egal `a 30. Le pourcentage de
difference entre la moyenne et la valeur cible refl`ete cette justesse. La limite de linearite est
determinee par dilutions successives dun echantillon `a concentration elevee, avec la matrice
comme diluant. La limite de quantification est determinee par passage de trente blancs (matrice sans substance `a doser), il correspond `a dix ecarts types de ces trente blancs. La limite
de quantification peut aussi etre determinee par realisation dun profil de fidelite, `a partir dun
controle qualite, et correspond `a la concentration correspondant `a 10 % du coefficient de variation (utilisation de la courbe de Horwitz). Limite de quantification et limite de linearite sont
les bornes du domaine de mesure. La stabilite des reactifs prepares `a lavance est determinee
par une etude de stabilite. Les reactifs sont utilises dans des dosages successifs jusqu`a la limite
de leurs duree stabilite. Les reactifs sont consideres comme perimes `a partir du moment ou le
dosage accuse une erreur de plus de 10 % (C.O.F.R.A.C., 2011).

30

Les diff
erentes approches

1.4.3

Validation de la m
ethode de dosage par quantification des incertitudes

La validation de methodes de dosage par quantification des incertitudes, consiste `a identifier lensemble des sources dincertitude dune methode de dosage, de mesurer ou destimer
chacune de ces incertitudes, `a des concentrations choisies, puis de calculer une incertitude totale aux concentrations etudiees. Pour une methode de dosage employee dans un laboratoire
donne, lincertitude sert `a rendre un resultat en donnant une fourchette dincertitude autour
des concentrations rendues. Le resultat dun dosage est rendu avec plus ou moins une valeur
dincertitude. Lincertitude dun dosage ne peut etre etudiee qu`a concentration fixee.
Mais comment ce crit`ere peut-il permettre de valider une methode de dosage ? Il faut se
representer lincertitude dans les memes conditions que precedemment (voir figure 1.1). Il faut
fixer les r`egles suivantes :
1. Realisation dun dosage dans un laboratoire donne.
2. Concentration fixee.
3. Distribution des resultats, `a la concentration choisie, consideree comme une distribution
normale.
Lincertitude moyenne est lintervalle forme autour dun resultat trouve, pour lequel, il y a
une chance sur deux quil contienne la vraie valeur. Autrement dit lorsque le dosage donne un
resultat, il y a une chance sur deux que la vraie valeur se trouve `a plus ou moins lincertitude
moyenne autour du resultat.
Pour le representer sur la figure precedente, il suffit de representer laire, contenant 50 % de
laire totale de la distribution, centree sur la vraie valeur. Les limites aux deux bornes de cet
aire correspondent `a la valeur de lincertitude moyenne (voir figure 1.4).
Lorsque le dosage donne un resultat, il y a une chance sur deux que la vraie valeur se trouve
dans la zone hachuree, puisquelle contient 50 % des valeurs de la distribution. En effet, tous
les resultats se trouvant dans la zone hachuree ont un intervalle dincertitude dans lequel, est
present la vraie valeur. Et `a linverse, lintervalle dincertitude des resultats en dehors de la
zone hachuree, ne contient pas la vraie valeur.
Ainsi, lincertitude moyenne, est comparable `a une estimation de lecart type, non pas
par rapport `a une moyenne de mesures, mais par rapport `a la valeur vraie inconnue.
Il est possible detendre lincertitude `a plus de 50 %, ce qui est appele, lincertitude etendue.
Ainsi il est possible de dire par exemple que 90 % des resultats donnes par la methode sont
compris entre plus ou moins la valeur dincertitude autour de la valeur vraie, `a une concentration
definie.
Ceci sert de base permettant de valider une methode de dosage sur lincertitude etendue
autour de la vraie valeur.

1.4 Discussion

31

Figure 1.4 Representation graphique de lapproche des incertitudes `a une concentration


definie. T represente lecart type total et T la moyenne totale. Laire hachure represente 50
% de laire totale de la distribution. Lamplitude de lincertitude moyenne relative autour de la
valeur vraie est representee

Par exemple, une methode de dosage ayant une incertitude (incertitude etendue `a 90 %) de
9 %, pour une limite imposee `a 10 %, est consideree comme validee pour des concentrations
proches de celle etudiee. La limite de 10 %, correspond generalement `a la limite imposee du
dosage dune preparation hospitali`ere `a la PUI du CHU dAngers. En effet, pour eviter daccepter des medicaments ayant une teneur `a plus de 15 % derreur, la limite a ete resserree `a
10 % pour la plupart des preparations hospitali`eres. Pour les traitements qui ont une marge
therapeutique large la limite de validation dun dosage est fixee `a 15 % `a la PUI du CHU

32

Les diff
erentes approches

dAngers.
Eurachem
LEurachem cree en 1989, est un reseau dorganismes Europeen travaillant dans le domaine
de la chimie analytique. Ils participent notamment `a la redaction de guides concernant, les
dosages en chimie, ainsi que les bonnes pratiques dassurance qualite.
LEurachem a redige un guide, qui sapplique `a toute les methodes de dosage, decrivant de
facon tr`es compl`ete une methode destimation de lincertitude moyenne et etendue. Lestimation
de lincertitude etendue, repose sur les etapes suivantes (voir figure 1.5) :
1. Specifier le mesurande.

2. Etablir
un logigramme pour identifier toutes les etapes du dosage.

3. Etudier
les crit`eres source dincertitude en saidant dun diagramme dIshikawa de
causes et deffets sur le mesurande.
4. Quantifier lincertitude de chacune des composantes dincertitude.
5. Calculer lincertitude moyenne.
6. Calculer lincertitude etendue.
Le logigramme etabli, permet de decrire les differentes etapes de base, par exemple, preparation
de lechantillon, dilution, extraction, preparation des echantillons de calibration, etc... (voir figure 1.6).
La realisation la plus exhaustive possible du diagramme dIshikawa de causes et deffets sur
le mesurande, est basee sur le logigramme precedemment concu (voir figure 1.7).
Dans ce diagramme tous les crit`eres sources dincertitude sont representes, et parfois
plusieurs fois, mais chaque crit`ere na quun impacte unique. Par un jeu delimination des
crit`eres secondaires redondants, au profit des crit`eres primaires impactant directement le mesurande,
il est possible didentifier les composantes dincertitude qui serviront `a calculer lincertitude
moyenne (voir figure 1.8).
Le guide decrit deux facons de determiner les composantes dincertitude. Une methode classique decrite ci dessus et une methode par regroupement. Le regroupement consiste `a rajouter
un crit`ere primaire sur le diagramme dIshikawa qui sera utilise en tant que composant dincertitude et ainsi deliminer les crit`eres secondaires impactant sur celui-ci. Ces crit`eres secondaires
sont regroupes sur un crit`ere choisi, ce qui reduit le nombre de composantes dincertitude `a
determiner. Par exemple lors de la realisation de validation de methode intra-laboratoires il
est recommande dutiliser les param`etres de justesse et de fidelite intermediaire comme crit`eres
primaires `a rajouter sur le diagramme dIshikawa. Les deux composantes dincertitude `a quantifier qui en resultent sont lincertitude du biais et lecart type de fidelite intermediaire. Les
crit`eres secondaires impactant sur la justesse ou la fidelite intermediaire, sont elimines. Les

1.4 Discussion

33

Figure 1.5 Logigramme des etapes permettant une estimation de lincertitude de mesure
dune methode de dosage `a une concentration definie. Logigramme dapr`es (Ellison et Williams,
2012).

34

Les diff
erentes approches

Figure 1.6 Exemple de logigramme reprenant les etapes de base dune methode de dosage.
Exemple danalyse de la teneur en pesticides organophosphores. La methode de dosage en
question est une methode de dosage intra-laboratoire. Logigramme dapr`es (Ellison et Williams,
2012).

Figure 1.7 Exemple de diagramme dIshikawa reprenant letude de cause et deffet dune
methode de dosage. La methode de dosage en question est une methode de dosage intralaboratoire. Diagramme dIshikawa tire de (Ellison et Williams, 2012) representant lanalyse
des sources dincertitude de la teneur en pesticides organophosphores dune methode de dosage.

1.4 Discussion

35

Figure 1.8 Exemple de resultats obtenus apr`es calcul des composantes dincertitude et de
lincertitude moyenne dune methode de dosage intra-laboratoire. P(op) : incertitude moyenne
obtenue `a partir des composantes dincertitude - Composantes dincertitude : incertitudes liees
au biais, `a la fidelite et `a lhomogeneite de la preparation. Schemas tire de (Ellison et Williams,
2012) representant le resultat de lincertitude moyenne obtenue `a partir des composantes dincertitudes calculees du dosage de la teneur en pesticides organophosphores.
autres crit`eres sont identifies comme des composantes dincertitude `a quantifier. Pour valider
une methode de dosage intra-laboratoires, lutilisation des param`etres de justesse et de fidelite
intermediaire sont privilegies compte tenue de la difficulte `a identifier de facon exhaustive,
et `a etudier de facon approfondie, tous les composantes dincertitude. Les composantes dincertitude sont quantifiees par des donnees theoriques (comme par exemple lincertitude sur
la purete et lincertitude de la balance) et des donnees experimentales (comme par exemple
lincertitude du biais et lecart type de fidelite intermediaire). Lincertitude de la balance correspond generalement au chiffre de lunite qui est grise, mais son incertitude peut etre verifiee
de facon experimentale par des pesees successive dune masse etalon. Par cette methode un
dosage pourrait etre, en theorie valide uniquement par des calculs sur des donnees theoriques.
De plus des methodes de dosage differentes, peuvent reprendre une meme etape, dont lincertitude theorique ou experimentale ne sera determinee quune seule fois. Par exemple, une dilution
au un centi`eme, utilisant une fiole jaugee de cent millilitres avec de leau comme diluant est une
etape utilisee dans de nombreux dosages, connatre son incertitude dans un laboratoire peut
etre utilise dans la validation de ces differents dosages.
Les composantes dincertitude sont quantifiees sous la forme dincertitude moyenne relative.
Pour tout type dincertitude, lincertitude relative correspondante se calcule ainsi :
Incertitude
Concentration etudiee
Dans un premier temps, les composantes dincertitude connuees sont identifiees et quantifiees.
Ensuite, `a laide de donnees theoriques connues, les composantes dincertitude inconnues, qui
Incertitude relative =

36

Les diff
erentes approches

peuvent letre, sont quantifiees. Et enfin, celles qui restent, necessitent des experimentions additionnelles pour etre `a leurs tours quantifiees. En ce qui concerne la validation de methodes de
dosage intra-laboratoires, lecart type de fidelite intermediaire est determine de facon experimentale
sur une grande serie de repetitions (environ 30 repetitions), sur une periode etendue, en incluant
le maximum de facteur de variation. Le biais est determine de facon experimental, `a partir de
la repetition de lanalyse dun echantillon de reference (environ 30 repetitions). Lincertitude
liee au biais est determinee `a partir de lecart type des mesures experimentales du biais. Un
test de Student permet de determiner si le biais est significatif, si cest le cas, il est retranche
au resultat final, lors de la validation, ainsi que, lors de lutilisation de la methode de dosage
en routine. Lincertitude moyenne relative, est calculee par la somme quadratique de toutes les
composantes dincertitude quantifiees. Cette incertitude est etendue par multiplication de cette
incertitude par un facteur 2 dans le cadre dune distribution symetrique. Dans le cadre dune
distribution non symetrique, un test de Student permet de determiner ce facteur multiplicatif
(Ellison et Williams, 2012).
Au final, il est possible de connatre `a differentes concentrations, lincertitude etendue de la
methode dans un laboratoire donne. Cela signifie, par exemple, quun resultat obtenu, `a 95 %
de chances, que la difference avec la vraie valeur soit plus faible que la valeur de lincertitude
etendue. Autrement dit, 95 % de chances detre plus proche de la vraie valeur que de lincertitude
etendue.
IUPAC
En 2002, LIUPAC, reprend le travail de lEurachem, et decrit la methode de validation par quantification des incertitudes comme une deuxi`eme approche de la validation de
methode. La quantification des incertitudes peut aussi servir comme un crit`ere supplementaire
complementaire `a la validation de la methode de dosage (Wood et al., 2002).
COFRAC
En 2011, le COFRAC demande de faire une estimation de lincertitude moyenne par la
somme quadratique des composantes dincertitude de la meme facon que le demande lEURACHEM.
qX
Incertitude moyenne =
Composantes dincertitude2

Une incertitude elargie `a deux fois lincertitude moyenne propre `a la methode permet dindiquer
lintervalle dans lequel sera compris la valeur conventionnellement vraie dans 95 % des cas
(environ 1.96 dans le cadre dune distribution normale). Ceci dit, cette estimation est vraie en
considerant que le biais soit nul et que lechantillonnage suive une loi normale. Les composantes
dincertitude proposees sont au choix, soit determinees grace aux valeurs des param`etres de
fidelite intermediaire et de justesse estimees au prealable (correspondant `a lecart type de

1.4 Discussion

37

fidelite intermediaire, et au biais multiplie par racine de 3, dans le cadre dune loi rectangle),
soit determinees grace `a lensemble des incertitudes connues (incertitude de la pipette, de
lautomate, de letalonnage etc...) (C.O.F.R.A.C., 2011).

1.4.4

Validation de la m
ethode de dosage par profil dexactitude
comme outil de d
ecision

La validation de methodes de dosage par profil dexactitude, est une methode basee sur
lestimation dun intervalle, dans lequel se situe le resultat dun dosage, et de verifier quil
ne sorte pas des limites fixes. Lintervalle nest pas centre sur la vraie valeur comme dans la
methode de quantification des incertitudes mais centre sur la moyenne des resultats (voir figure
1.9).
Pour representer schematiquement cette validation de methode de dosage, il faut definir le
pourcentage % des resultats qui doivent se trouver dans les limites - +, definir les limites
- + et les concentrations de validation. Il est recherche un intervalle dans lequel se situe %
des resultats dun dosage, obtenu par une methode de dosage, dans un laboratoire donne, `a
une concentration definie. Cet intervalle est lintervalle de confiance estime, contenant % des
resultats, representant lexactitude de la methode de dosage (voir figure 1.10). La confrontation
entre les limites definies - + et les limites de cet intervalle de confiance, aux differentes
concentrations etudiees, est appele un profil dexactitude et permet de prendre la decision de
validation ou non de la methode de dosage dans un laboratoire (Hubert et al., 2003, 2006a,b).
SFSTP
` partir de 2003, La SFSTP publie de nouveaux articles proposant une alternative `a la
A
methode classique de validation de methodes de dosage (Hubert et al., 2003, 2006a,b). Comme
vu precedemment, la publication de 1992 de la SFSTP pose de nombreux probl`emes dinterpretation. Ceci necessite de rechercher de nouvelles approches, comme par exemple, la validation de la methode de dosage basee sur son exactitude (Algranti et al., 1992; Hubert et al.,
2003). Le principe de la validation de methodes de dosage est largement repandu dans tous les
domaines dactivite ou des mesures sont realisees. Cependant la question simple de lacceptabilite ou non de cette methode de dosage pour une application donnee reste inegalement et
incompl`etement resolue dans bien des cas, et ce malgre les diverses reglementations relatives
aux bonnes pratiques, et autres documents.(Fajgelj, 2007; I.C.H., 2013; Algranti et al., 1992;
C.O.F.R.A.C., 2011; Ellison et Williams, 2012).
Quel est lobjectif dune bonne methode de dosage ? Une bonne methode de dosage doit
pouvoir quantifier, le plus exactement possible, les quantites inconnues danalyte que le laboratoire aura `a determiner. Autrement dit, que la difference entre le resultat rendu et la vraie
valeur inconnue de lechantillon soit la plus petite possible, et en tout cas au moins inferieure `a

38

Les diff
erentes approches

Figure 1.9 Comparaison entre representations graphiques des profils dexactitude et des
profils dincertitude. Les profils sont representes en fonction des concentrations en analyte.

une limite dacceptation note et fixee par lanalyste en fonction de la finalite de la methode
telle quelle sera utilisee en routine.
Concernant la limite dacceptation, elle est centree sur la vraie valeur, cest `a dire que les

1.4 Discussion

39

Figure 1.10 Representation graphique du profil dexactitude `a une concentration definie. IC


represente lintervalle de confiance `a % , la borne limite dacceptation du dosage, T lecart
type total, T la moyenne totale et % le pourcentage choisi de valeurs inclues dans lintervalle
de confiance autour de la moyenne totale.
resultats de mesure doivent se trouver dans lintervalle forme par la vraie valeur de lechantillon
`a analyser plus ou moins la limite dacceptation (limite acceptable).
Concernant maintenant les resultats de mesure, il faut se les representer, distribues selon
une loi normale setendant en theorie jusqu`a linfini, avec une moyenne et un ecart type.
La surface representee par la proportion des resultat notes %, centree sur la moyenne
des resultats, poss`ede une limite `a chacune de ses deux bornes. Comment calculer ces limites
aux differentes concentrations ? La solution proposee, est dutiliser les bornes de lintervalle de

40

Les diff
erentes approches

confiance de lexactitude de la methode de dosage, aux concentrations rencontrees en routine.


La valeur vraie est encadree par les limites dacceptation, plus ou moins . Le resultat de la
mesure dont la moyenne est encadree par les limites aux bornes de lintervalle de confiance de
lexactitude de la methode sont determines grace `a la notion derreur totale (biais + ecart-type).
Pour que la methode soit valide, il faut que les bornes de lintervalle de confiance de lexactitude de la methode soit contenues dans lintervalle constitue par les limites dacceptation
plus ou moins . Ainsi la validation de la methode consiste `a confronter le resultat rendu en
routine avec la vraie valeur de lechantillon.
En suivant cette logique, la qualite des resultats du dosage, est de loin bien plus importante
que les caracteristiques intrins`eques de la methode de dosage en termes, par exemple, de biais
ou de fidelite. Autrement dit, pour valider une methode de dosage, loperateur ne se demande
plus si le biais est faible, si la methode est lineaire ou bien autre chose, il prend sa decision
uniquement en fonction des ecarts limites maximales entre le resultat du dosage et sa vraie
valeur.
Il est necessaire de distinguer les crit`eres decisionnels, qui permettent de prendre la decision
de la validation de methode, des crit`eres diagnostiques, qui permettent lanalyse des causes
lorsque les crit`eres decisionnels ne sont pas satisfaisants. Les crit`eres decisionnels sont, lintervalle de confiance, la proportion des mesures % de cet intervalle ainsi que la limite dacceptabilite. Les crit`eres diagnostiques sont entre autre, lecart type de la fidelite intermediaire et le
biais, la linearite de la gamme. Donc, si la methode se rev`ele non valide il faut rechercher les
anomalies concernant les crit`eres diagnostiques, par exemple, un biais important, un manque
de linearite de la gamme ou un ecart type de fidelite intermediaire important.
En voulant baser la validation de la methode de dosage sur des crit`eres decisionnels, la question qui se pose est de savoir comment les determiner. Les crit`eres decisionnels `a determiner
sont , % et lintervalle de confiance. Pour la proportion des mesures % et la limite dacceptabilite , comme dit precedemment, ils sont fixes en fonction de la finalite de la methode
de dosage. Par exemple, si on veut quen routine 95 % des dosages ne sortent pas des limites
fixees `a plus ou moins 10 % de la teneur en principe actif, % sera fixe `a 95 % et `a 10 %.
Il reste la question de la determination de lintervalle de confiance.
Dans un premier temps il faut faire le choix des concentrations auxquels cet intervalle de
confiance doit etre calcule, et ceci de facon `a couvrir letendue des concentrations susceptibles
` concentration fixee, chaque intervalle de confiance peut ainsi etre recherche.
detre rencontres. A
Sachant que les vraies valeurs (le vraie biais, la vraie fidelite, lexactitude reelle, la linearite,
etc...) sont des donnees inconnus, ils deviennent des elements de calcul statistiques, permettant
de chiffrer les garanties que la valeur du resultat est suffisamment proche de la vraie valeur.
Lintervalle de confiance est calcule en fonction de lestimation du biais et de la fidelite
intermediaire de la methode de dosage.
Pour estimer le biais et la fidelite intermediaire, il faut faire un plan de preparation des

1.4 Discussion

41

echantillons qui diff`ere en fonction des situations rencontrees, comme par exemple, le type de
dosage et la presence dun effet de matrice. Dans la situation du dosage dun principe actif
dans un medicament, il est recommande de realiser trois series dans chacune desquelles sont
realisees deux etalonnages et quatre repetitions des standards de validation. Letalonnage est
realise scrupuleusement dans les memes conditions quen routine ou conditions reelles, et en cas
deffet de matrice, il est prepare avec la matrice. Dans chaque serie, les standards de validation
sont prepares `a partir de trois preparations medicamenteuses aux concentrations minimales,
` chaque serie, les preparations medicamenteuses sont
maximales et mediannes rencontrees. A
renouvelees. La fidelite intermediaire est determinee grace aux variations observees entre les
series. Par ordre dimportance elle prend en compte la preparation des echantillons, loperateur
et laspect temporel. Lors de la preparation dune serie, il faut renouveler toutes les manipulations permettant la preparation de lechantillon, solutions et reactifs. Il faut aussi, changer
de manipulateur si ils sont plusieurs `a realiser cette technique. Par contre laspect temporel
` la suite de
est facultatif, il nest pas necessaire de faire les series sur trois jours successifs. A
cela, il est obtenu un signal pour chaque concentration connue. Differentes fonction de signal
detalonnage sont simulees. Pour chaque simulation de la fonction de signal de letalonnage, le
signal est transforme en concentration calculee, qui est comparee `a la concentration theorique.
En effet toute comparaison necessite de comparer les memes grandeurs, ici des concentrations,
aux memes unites. Dans le document de la SFSTP il est decrit un mode de calcul tr`es detaille
permettant destimer le biais et la fidelite intermediaire grace aux differences observees entre
concentration reelle et concentration theorique de chaque echantillon de validation.
Il est aussi decrit une methode de calcul permettant une estimation de lintervalle de confiance contenant % des resultats autour de la moyenne. Ceci permet de tracer un graphique de
lerreur relative en fonction de la concentration, appele profil dexactitude (voir figure 1.9).
Sur le profil dexactitude, sont representes, les limites dacceptation plus ou moins autour
de lerreur relative nulle et, `a chaque concentration, les limites de lintervalle de confiance autour
du biais. La valeur du biais etant la valeur de la moyenne `a chaque concentration.
Ainsi le profil dexactitude est un outil visuel, graphique de validation de methodes de
dosage. Cependant la linearite doit etre verifiee pour relier les points entre eux, mais ce nest
quun crit`ere diagnostic. Pour cela, deux echantillons de validation intermediaire entre les
echantillons de validation minimum, medium et maximum, sont rajoutes une fois. Cependant
ils sont proposes uniquement pour repondre aux specifications methodologiques preconisees par
lICH au niveau de la linearite, et les raisons de leurs presence est discutable (Hubert et al.,
2003, 2006a,b).
Un grand nombre dexemples sont proposes, ce qui permet une approche pratique de cette
methode de validation de dosage, et facilite une eventuelle transposition dans un laboratoire.
De plus cette methode est facilement harmonisable `a, `a peu pr`es, toutes les methodes de dosage
effectuees dans un laboratoire.

42

1.4.5

Les diff
erentes approches

Autres approches comparables

De nouvelles approches qui associent les differentes approches entre elles, commencent `a
voir le jour.
Capabilit
e
La capabilite est un indicateur qualite largement utilise dans lindustrie pour analyser la
performance dune methode analytique en routine, elle est decrite depuis 2007 `a la pharmacopee Americaine. Cest une approche mise en place pour eviter de rejeter `a tort des produits
acceptables du fait de lerreur sur le dosage.
La capabilite calculee doit etre superieure `a un seuil defini en fonction de lusage de la
methode. Ce seuil est fixe `a 1,33 dans lindustrie pharmaceutique. Les donnees sont recueillies
sous forme dune carte de controles, par lutilisation de controle qualites lors dune utilisation en
routine (voir figure 1.11). Le seuil de 1,33 fixe par lindustrie pharmaceutique est tr`es restrictif,
et correspond environ `a un risque de faux negatif inferieur `a 0,01 %. Cest le risque de rejeter
un lot avec des limites `a 5 % de la vraie valeur alors que la teneur en principe actif est bien
comprise dans la limite des 5 %. Le calcul de la capabilite est tr`es facile `a realiser mais difficile
`a interpreter. Pour cela il est possible de proposer un tableau classant les performances de la
methode en fonction de la valeur de la cababilite (De Fontenay et al., 2011).
La capabilite est calculee sous forme dun ratio entre lintervalle de tolerance du dosage et
lecart type du procede. Les deux bornes de lintervalle de tolerance sont les limites dacceptation
du dosage. Si il y a un biais, il est pris en compte, et le calcul de la capabilite ne seffectue
plus que sur une seule borne de lintervalle de tolerance. Dans ce cas, le calcul ne prend en
compte que la borne de lintervalle de tolerance la plus proche de la moyenne des resultats
representant le biais. Lorsque le biais est peu important voir inexistant, la capabilite est une
bonne apreciation de la performance de la methode de dosage. Cependant, plus le biais est
important et moins la borne opposee est prise en compte dans lestimation de la capabilite. La
performance est meilleure que ne le laisse presage le calcul de la capabilite. Pour des methodes
de dosage `a performances egales, si le biais est important, la methode aura moins de chance
detre validee. Plus le biais est important et moins lestimation de la performance de la methode
de dosage est exacte.
Si la capabilite est utilisable en routine pourquoi ne pas lutiliser pour valider une methode
de dosage ? Il est possible de representer graphiquement cette methode de validation de facon
unilaterale, ce qui permet de prendre en compte le biais (voir figure 1.12).
Le GERPAC, groupe devaluation et de recherche sur la protection en atmosph`ere controlee
est une association compose dexperts, pharmaciens hospitaliers, universitaires et chercheurs.
Le travail de ce groupement est axe dans le domaine de la pharmacotechnie en pharmacie hospitali`ere, et concerne la manipulation en environnement controle en isolateur et en

1.4 Discussion

43

Figure 1.11 Carte de controle de cent resultats individuels pour des lots ayant une teneur
reelle de 100 %. - UCL : upper control limit LCL : lower control limit. Carte de controle
tiree de (De Fontenay et al., 2011).

salle `a atmosph`ere controlee. Lassociation a pour objet, la diffusion des techniques et des
competences necessaires au developpement des protections biologiques et physico-chimiques
dans le cadre dactions dassurance qualite dans le domaine hospitalier pharmaceutique concernant la preparation en salle `a atmosph`ere controlee en isolateur ou sous hotte `a flux dair
laminaire des medicaments toxiques.
Le GERPAC, en partenariat avec le groupe de travail Stabilite des preparations hospitali`eres de la SFPC, Societe Francaise de Pharmacie Clinique, a redige un guide de soutien
methodologique pour la realisation des etudes de stabilite des preparations en milieu hospitalier en 2013. Dans le cadre de ce guide, la validation des methodes de dosage a ete abordee.
Pour quantifier le principe actif, il convient de definir un intervalle de dosage pour lequel
la methode presente des crit`eres de linearite, fidelite et justesse. Et pour toute quantification,
une calibration est necessaire. La base du travail reprend lapproche classique de validation de
methode (Algranti et al., 1992; G.E.R.P.A.C., 2013). Les conditions de dilution sont importantes, notamment la solubilisation totale du principe actif par le solvant utilise. Le rendement
doit etre de 100 %. Dans le cas contraire la robustesse du dosage peut etre affectee. Lintervalle
de dosage conseille est de 60 % `a 140 %. Cest lintervalle dans lequel la gamme est realisee.

44

Les diff
erentes approches

Figure 1.12 Representation graphique de lapproche capabilite `a concentration definie.


represente une des deux bornes limites dacceptation du dosage, T lecart type total, T la
moyenne totale et 2 % le pourcentage de valeurs inclues dans lintervalle limite entre la moyenne
totale et la valeur limite dacceptation du dosage la plus proche. Plus % tend vers 100 % et
plus la capabilite tend vers linfini.

Pour realiser letalonnage, le principe actif utilise doit avoir un degre de purete predetermine,
et une conservation matrisee (temperature, hygrometrie). Le bulletin danalyse des mati`eres
premi`eres, et le suivi des conditions de stockage en sont les garants. Leffet de matrice est verifie
par labsence statistique de difference entre la gamme realisee avec les excipients, et la gamme
realisee sans les excipients. Cette verification est obligatoire pour pouvoir calculer le biais sur
les donnees de la gamme. En cas de presence deffet de matrice la gamme est realisee avec les

1.4 Discussion

45

excipients. La presence dun effet de matrice rend le dosage peu performant et les calculs de biais errones, si la gamme nest pas realisee avec les excipients. Une gamme avec et sans excipient
ainsi que six controles qualites `a 100 % du principe actif sont realises chaque jour, pendant trois
jours consecutifs. Les tests dhomogeneite de variances de Cochran, sur les trois gammes, avec
excipients et sans excipients, permettent de montrer que les gammes sont lineaires. La justesse
est determinee par le recouvrement de chaque point de gamme. La valeur du biais, est validee
par deux tests : validite des moyennes et intervalle de confiance. La fidelite intermediaire est
calculee `a laide des controles qualites `a 100 % du principe actif. Le calcul permettant dobtenir
la variance de fidelite intermediaire est le meme que celui preconise par la SFSTP pour la validation de la methode de dosage par profil dexactitude comme outil de decision. Les calculs
de la limite de detection et de la limite de quantification ne sont pas necessaires. Le resultat
est interprete par la valeur obtenue de la capabilite. Il est classe dinacceptable `a tr`es bonne en
fonction de cette valeur (G.E.R.P.A.C., 2013).
Le calcul du biais par utilisation du recouvrement oblige lutilisation de tests statistiques
complexes pour lesquels un etalonnage en au moins 5 point est requis. De plus le biais determine
ainsi nest pas representatif du biais de la methode mais uniquement du biais de la calibration.
Ce qui veut dire quen realite la methode est potentiellement moins performante que ce qui est
determine lors de la validation.
Lapproche de la capabilite est interessante, mais ici elle est basee sur des donnees anciennes
decrites par la SFSTP en 1992. Pourquoi ne pas utiliser une methode plus moderne, comme
celle decrite entre 2003 et 2006 par la SFSTP, comme base de travail (Algranti et al., 1992;
Hubert et al., 2003, 2006a,b) ? De plus, pourquoi ne pas remplacer lapproche de la capabilite
par celle des OCC (Operating characteristic curves) qui prennent mieux en compte le biais et
qui sont plus facile dinterpretation ?
OCC, lapproche id
eale ?
Les OCC (Operating characteristic curves) `a la difference de la capabilite prennent en
compte les deux bornes de lintervalle de tolerance et donc en cela sont plus complets. Il est
possible de representer cette approche graphiquement, toujours selon les memes conditions
quauparavant (voir figure 1.13).
Les OCC, Operating characteristic curves, sont des courbes de niveau de risque, sur lesquels
peuvent etre placees graphiquement, les methodes de dosage, en fonction de leurs resultats de
validation (biais et coefficient de variation de repetabilite). Elles sont definies en fonction des
specifications de la methode. Cette approche est basee sur une analyse de risque. Ces courbes
representent un pourcentage de faux negatif. En fonction du pourcentage de faux negatif, la
methode est classee en fonction du niveau de risque dobtenir de faux negatif, cest le risque
de rejeter un lot de preparation conforme en routine. Comme pour la capabilite les donnees
utilisees pour situer la performance du dosage sont issues de cartes de controles qualites, utilises

46

Les diff
erentes approches

Figure 1.13 Representation graphique de lapproche ideale type OCC `a concentration definie.
represente les bornes limites dacceptation du dosage, T lecart type total, T la moyenne
totale et %(OOC) le pourcentage de valeurs incluses dans lintervalle des bornes limites dacceptation du dosage.

en routine (voir figure 1.11). Lapproche OCC est un veritable outil danalyse de risque, et son
caract`ere graphique permet une analyse aisee du risque, mais necessite des calculs additionnels
(De Fontenay et al., 2011).
Lapproche ideale de la validation de methode est la suivante, elle repond `a la question
quelle est la proportion des resultats dun medicament conforme, se trouvant dans les limites
imposees ? Ce qui revient au meme que de se demander quel est le pourcentage des resultats
pour lesquels le lot de medicament est rejete alors que celui-ci est valide ? Lorsquune methode

1.4 Discussion

47

de validation doit etre validee il est possible de partir du principe que la methode est conforme,
donc que le medicament prepare est conforme et si ma methode est validee lhypoth`ese de depart
sera valide. Pour valider une methode de dosage, la question peut aussi devenir quelle est la
proportion des resultats dun medicament prepare selon les recommandations du preparatoire,
se trouvant dans les limites imposees ? (Il faudra prendre en compte pour cela de la preparation
du medicament lors de la validation de la methode)
Lapproche OCC jusque l`a utilisee en routine est une approche adaptee, pouvant etre
integree `a un protocole de validation de methodes de dosage pour repondre `a cette question.
Non seulement cet outil est, `a ce jour le plus adapte, mais en plus la methode de calcul donnant directement le pourcentage attendu de faux negatif (pourcentage de rejet de
preparations medicamenteuses considerees comme bonnes) est un outil tr`es efficace de classement des methodes de dosage, prenant en compte ladaptabilite de la methode `a son usage.
Si en theorie trop de preparations medicamenteuses sont rejetees alors que considerees
comme bonnes, la methode de dosage ne doit pas etre utilisee, elle est donc non validee. Il ne
reste plus qu`a definir un seuil limite de preparations medicamenteuses pouvant etre rejetees.
La connaissance du pourcentage theorique de medicaments rejetes, permet aussi de confronter cette donnee `a la situation reelle.

1.4.6

Les crit`
eres d
ecisionnels

Les crit`eres decisionnels sont des crit`eres permettant de prendre la decision de valider la
methode de dosage sur des crit`eres objectifs. Trois crit`eres decisionnels ressortent dans ce travail,
la capabilite, lincertitude, et lintervalle de confiance du profil dexactitude. Un quatri`eme
crit`ere, bien meilleur, non decrit dans la validation de methodes de dosage, pourrait etre cree
en sinspirant des courbes de niveau (OCC) permettant danalyser le risque de generer un faux
negatif (voir figure 1.14).

1.4.7

Choix dune m
ethode de validation

Pour valider une methode de dosage il faut sinspirer des differentes approches en utilisant
les avantages de chacune des approches. Pour cela, il faut travailler `a obtenir une estimation du
biais de la justesse et de lecart type de la fidelite intermediaire. Et cela pour deux raisons, ils apparaissent dans toutes les techniques de validation de methode sauf dans le cas des incertitudes,
qui decrit une methode pouvant saffranchir de ces crit`eres. De plus la methode qui saffranchi
de ces crit`eres est complexe et ne convient pas `a la validation de methode intra-laboratoires. La
deuxi`eme raison, cest quils font reference `a la validation de methode classique, et beaucoup
de travaux ont ete effectues pour etudier ces deux crit`eres.
Pour choisir parmi les methodes de validation de methodes de dosage `a utiliser en pharmacie
hospitali`ere, le point de depart consiste `a fixer lobjectif commun `a la validation de la methode

48

Les diff
erentes approches

Figure 1.14 Comparaison de crit`eres de validation de methode de dosage en fonction du CV


et du biais. - CV : coefficient de variation.

1.5 Conclusion

49

de dosage. La SFSTP part de ce type dobjectif, de facon tr`es detaille pour creer une methode
de dosage universelle (Hubert et al., 2003, 2006a,b). Une estimation du biais de la justesse
et de lecart type de fidelite intermediaire de la methode de dosage est decrite de facon assez
compl`ete. La methode des incertitudes decrites par la SFSTP a aussi pour avantage deviter
lutilisation de methodes statistiques compliquees et parfois contraire `a la performance de la
methode. Par contre le calcul et lanalyse du crit`ere de validation serait meilleur en sinspirant
des OCC. Pour cela il faudrait realiser quelques modifications dans les calculs decrits, pour
permettre de calculer un crit`ere proche des OCC `a partir du calcul de lintervalle de confiance
de lexactitude.
Un deuxi`eme point doit etre eclairci dans le role joue par les bornes limites dacceptation
du dosage lors de la validation de la methode de dosage. Quelles sont les sources de variabilite
par rapport auxquelles les limites des bornes dacceptation du dosage sont fixees ? Si le resultat
doit etre rendu `a plus ou moins , cet intervalle correspond `a la variabilite `a la fois de la
methode de dosage mais aussi `a la variabilite de la preparation du medicament quil faudra
inclure lors de la validation de la methode de dosage. Ceci est `a prendre en compte lors de
la preparation des echantillons, comme cela `a ete decrit par lEURACHEM pour valider un
dosage par quantification des incertitudes (Ellison et Williams, 2012). Cette approche consiste
`a ne pas valider uniquement la methode de dosage, mais `a aussi, lassocier `a la fabrication du
medicament et considerer comme un tout non dissociable ces deux etapes.

1.5

Conclusion

Ce mode de classement des methodes de validation de methodes de dosage qui sera utilise
par la suite, est une approche personnelle servant principalement `a simplifier la comprehension
de la situation actuelle.
La methode classique est connue de tous, cest la methode historique permettant une comparaison aisee entre les methodes de dosage, mais le nombre eleve de protocoles differents
tend `a rendre les resultats non comparables en fonction des protocoles utilises. De plus lorsque
la methode classique est rigoureusement suivie, les donnees statistiques sont difficilement interpretables pour valider une methode de dosage, car `a lorigine cette methode est prevue
pour comparer des methodes de dosage et que les donnees statistiques ont ete adaptees pour
repondre `a la validation dune methode de dosage. Ainsi les donnees statistiques sont devenues
compliquees et ne sont pas parfaitement adaptees `a la validation de methodes de dosage. Cette
methode ne repond pas non plus aux questions de la validation moderne de methodes de dosage,
qui se base sur des recommandations liees `a la limite dacceptation du dosage et non sur des
recommandations liees `a la limite du biais, de lecart type ou de linearite.
La methode par lincertitude `a lavantage de donner comme resultat une incertitude pouvant
etre comparee `a une limite dacceptation du dosage comme seuil decisionnel. Ce seuil decisionnel

50

Les diff
erentes approches

sert de limite pour la validation ou non de la methode de dosage. Cependant, la creation de


protocole de validation est compliquee, et un protocole de validation doit etre mis en place `a
chaque validation pour chaque methode de dosage, avec un risque derreur possible `a chaque
fois. De plus, le calcul final de lincertitude etendue, est un peu empirique.
La methode de validation de dosage par profil dexactitude comme outil de decision, permet
de valider une methode de dosage en se basant sur les limites dacceptation de la methode de
dosage. La SFSTP propose un protocole tr`es detaille pour mettre en place ce type de methode
de validation de dosage (Hubert et al., 2003, 2006a,b).
La capabilite est aussi un crit`ere facile `a calculer, permettant linterpretation des performances dune methode de dosage, mais cet outil nest pas assez complet et ne permet pas de
confronter directement la methode de dosage `a lusage quil en est fait.
Les OCC par contre permettent de se confronter la validation de la methode de dosage `a
lusage quil en sera fait en routine, de facon plus compl`ete que la methode de validation de
dosage par profil dexactitude. De plus cest une approche tr`es simple dinterpretation.
Pour proposer une methode optimale de validation de dosage qui convienne `a la pharmacie
hospitali`ere, il faut rechercher parmi les differentes approches, sen inspirer et les associer pour
obtenir le meilleur compromis qui sadapte `a la situation des PUI. Actuellement, il ny a pas
de consensus dans ce domaine qui est en perpetuel changement. La recherche dune approche
originale, en partant des differents types de validation, semble pertinente.

Chapitre 2
Proposition dune m
ethode alternative
de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere
Sommaire
2.1

Introduction

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

53

2.2

Mat
eriel et M
ethode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

53

2.3

R
esultat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

53

2.3.1

Les crit`eres de validation decisionnels et non decisionnels . . . . . . . 54

2.3.2

Pre-validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

2.3.3

Diagramme du dosage dun medicament type . . . . . . . . . . . . . . 56

2.3.4

Nombre de series . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

2.3.5

Preparation des medicaments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

2.3.6

Preparation des echantillons de gamme et de validation . . . . . . . . 58


Preparation des echantillons de gamme . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Preparation des echantillons de validation . . . . . . . . . . . . . . . . 59

2.3.7

Obtention du signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Description dune serie de mesure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

2.3.8

Analyse du signal pour obtention des crit`eres decisionnels . . . . . . . 60


etalonnage

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

Prediction des inverses en utilisant les fonctions de reponse des differents


mod`ele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Alignement des concentrations determinees par prediction des inverses 64
Calcul du biais de justesse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Calcul de la variance liee `a la repetition et de la variance liee `a la serie
(voir figure 2.7) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

51

52

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere
Calcul de la variance de fidelite intermediaire relative et de la variance
totale relative, coefficient de variation . . . . . . . . . . . . . 69
Calcul de lintervalle de confiance relatif (voir figure 2.7) . . . . . . . . 70
Calcul de la capabilite (voir figure 2.7) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Calcul du pourcentage dans lintervalle entre les deux limites, OCC
(voir figure 2.7) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.3.9

Prise de decision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

2.3.10 Post-validation ou finalisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74


2.4

Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

74

2.4.1

Les crit`eres de validation decisionnels et non decisionnels . . . . . . . 76

2.4.2

Quelques r`egles doptimisation lors de la realisation dune methode de


validation de dosage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

2.4.3

Pre-validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

2.4.4

Diagramme du dosage dun medicament type . . . . . . . . . . . . . . 78

2.4.5

Choix des teneurs en principe actif `a etudier . . . . . . . . . . . . . . 79

2.4.6

Nombre de repetitions par serie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

2.4.7

Preparation des medicaments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

2.4.8

Preparation des echantillons de gamme et de validation . . . . . . . . 81


Preparation des echantillons de gamme . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
Preparation des echantillons de validation . . . . . . . . . . . . . . . . 82

2.4.9

Obtention du signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

2.4.10 Analyse du signal pour obtention des crit`eres decisionnels . . . . . . . 83

Etalonnage
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
Prediction des inverses en utilisant les fonctions de reponse des differents
mod`ele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
Alignement des concentrations determinees par prediction des inverses 85
Calcul du biais de justesse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
Calcul de la variance liee `a la repetition et de la variance liee `a la serie 86
Calcul de la variance de fidelite intermediaire relative et de la variance
totale relative, coefficient de variation . . . . . . . . . . . . . 87
Calcul de lintervalle de confiance relatif . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
Calcul de la capabilite (voir figure 2.7) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
Calcul du pourcentage dans lintervalle , OCC

. . . . . . . . . . . . . 88

2.4.11 Prise de decision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89


Seuils de toxicite et dinefficacite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
2.4.12 Post-validation ou finalisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

2.1 Introduction

2.1

53

Introduction

Ce chapitre aborde, lexplication et la realisation dun protocole permettant de valider les


methodes de dosage en pharmacie hospitali`ere.

2.2

Mat
eriel et M
ethode

Le materiel utilise est le meme que celui utilise en routine dans le laboratoire dans lequel
la methode de dosage doit etre validee. Un tableur gerant des feuilles de calcul est suffisant
pour, le calcul, et le traitement des donnees de validation. LibreOffice Calc `a ete utilise pour les
avantages detre libre, gratuit et accessible `a differents syst`emes dexploitation informatique.
La methode utilisee consiste `a associer les differentes approches de validation de methodes
de dosage de facon `a utiliser les avantages de chacune des approches pour en tirer le maximum de potentiel. Ce regroupement se base sur lidentification et la determination de crit`eres
decisionnels necessaires `a la validation de la methode.
Les differentes etapes du dosage sont reprises chronologiquement de la facon suivante :

La pre-validation.
Le diagramme de dosage dun medicament type.
La preparation des medicaments.
La preparation des echantillons de gamme et de validation.
Lobtention du signal.
Lanalyse du signal pour obtention des crit`eres decisionnels.
Letalonnage
La prediction des inverses en utilisant les fonctions de reponse des differents mod`eles.
Lalignement des concentrations determine par prediction des inverses.
Le calcul du biais de justesse.
Le calcul de la variance liee `a la repetition et de la variance liee `a la serie.
Le calcul de la variance de fidelite intermediaire relative et de la variance totale relative
ou coefficient de variation.
Le calcul des differents crit`eres decisionnels :
La prise de decision.
La finalisation de la methode de dosage.

2.3

R
esultat

Les crit`eres proposes pour valider une methode de dosage sont les suivants :
Crit`eres `a verifier en pre-validation :
Les effets de la matrice sur le dosage.

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

54

La linearite.
La limite de linearite.
La limite de quantification.
Crit`eres decisionnels de validation de la methode de dosage :
Intervalle de confiance relatif.
Capabilite.
Pourcentage dans lintervalle entre les deux limites dacceptation du dosage.
Crit`eres additionnels de finalisation de la methode de dosage :
Stabilite des reactifs.
Robustesse.

2.3.1

Les crit`
eres de validation d
ecisionnels et non d
ecisionnels

Deux types de crit`eres sont decrits dans la litterature, les crit`eres non decisionnels et les
crit`eres decisionnels. Les crit`eres decisionnels sont determines lors de la validation de la methode
et doivent letre le plus exactement possible. Pour determiner ces crit`eres, il est necessaire
dobtenir certains crit`eres non decisionnels comme le biais de justesse et le coefficient de variation de fidelite intermediaire.
Les autres crit`eres non decisionnels ne servant pas `a valider la methode sont des crit`eres
informatifs sur la performance de la methode. Ils repondent `a la question de savoir pourquoi la
performance de la methode est mauvaise. Il faut donc avoir de preference une idee approximative
de ces crit`eres. Ils sont explores en pre-validation, lors de la validation et en post-validation de
la methode de dosage.

2.3.2

Pr
e-validation

La pre-validation `a pour objectif de sassurer de labsence derreur grossi`ere, commise lors de


la mise au point du dosage et de preparer la validation de la methode de dosage. Les donnees de
pre-validation sont normalement determinees lors de la mise au point de la methode de dosage.
Lobjectif de la pre-validation est de sassurer que la mise au point est compl`ete et quainsi il
est possible de passer `a letape de validation de la methode du dosage.
Pour cela, preparer une gamme avec matrice et une gamme sans matrice qui serviront `a
obtenir les concentrations de quatre preparations, une `a 50 % une `a 100 %, une `a 150 % et une
`a 200 % du principe actif. Comparer les deux gammes pour verifier labsence ou la presence
dun effet de matrice. Comparer les resultats obtenus avec un blanc matrice (blanc analyte) et
le blanc sans matrice (blanc reactif) pour verifier labsence ou la presence dinterference de la
matrice sur le signal. Verifier que les erreurs sur les concentrations obtenues pour les quatre
preparations ne depasse pas le seuil de conformite du dosage. Ce test sapparente `a un test
` la la PUI du CHU dAngers ce seuil est generalement fixe `a 10 % pour les
preliminaire. A

2.3 R
esultat

Figure 2.1 Representation du logigramme des etapes de pre-validation

55

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

56

preparations hospitali`eres et `a 15 % de la valeur theorique pour les preparations ayant une


marge therapeutique large. En cas de depassement, il est preferable de ne pas poursuivre vers
la validation de la methode de dosage et de repasser `a letape de mise au point de la methode.
Verifier aussi que les signaux obtenus avec les quatre teneurs en principe actif sont lineaires
(pente non nulle et alignes en fonction de la teneur) (voir figure 2.1).
Si les crit`eres cites ci-dessus ont dej`a ete identifies lors de la mise au point de la methode,
il nest pas necessaire de les identifier a` nouveau.
Le bon sens ne fait pas se limiter la pre-validation `a ces quelques etapes. Il faut prendre
en compte aussi certaines caracteristiques propres `a la methode. Il faut sassurer par exemple
dune pente uniquement croissante ou decroissante, du signal en fonction de la teneur en principe
actif, connatre le signal de blanc (dosage du medicament `a teneur zero de principe actif) et de
saturation. Il ne faut pas proceder `a letape de validation dun dosage realise en saturation ou
trop proche du signal du blanc.
Une courbe en cloche entrane, par exemple, un resultat identique pour deux concentrations theoriques tr`es differentes. Dans ce cas il est necessaire de proceder `a une dilution du
medicament pour situer la zone de concentration lors de la validation et lors de lutilisation de
la methode de dosage en routine. La dilution est une des pistes pour resoudre ce probl`eme. Sans
setendre sur le sujet car ce nest pas lobjet de cette th`ese, il est important de bien prendre en
compte les caracteristiques propres du dosage et ne pas negliger letape de pre-validation, qui
est plus basee sur des r`egles de bon sens que sur une marche `a suivre systematique.

2.3.3

Diagramme du dosage dun m


edicament type

Les etapes `a prendre en compte dans le calcul de lincertitude sont :

La preparation du medicament.
Le prel`evement dun echantillon.
Les dilutions de cet echantillon.
Les etapes de preparation de la gamme.
Letape de dosage.

Ces etapes sont `a explorer de facon dependantes ou independantes les unes des autres. Dans ce
travail, ces etapes seront le plus possible explorees de facon dependantes les unes des autres.
Toutes ces etapes seront unclues dans le processus de validation de methode. Cest lincertitude
de lensemble de ces etapes qui est comparee aux seuils de conformite dun resultat de dosage
(voir figure 2.2).
Un autre point `a verifier, est que la pesee du principe actif est compatible avec les performances de la balance et que lerreur relative sur la pesee ne depasse pas 1 %.

2.3 R
esultat

Figure 2.2 Representation du diagramme du dosage dun medicament type

57

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

58

2.3.4

Nombre de s
eries

La SFSTP propose de realiser un minimum de trois series pour determiner lintervalle de


confiance de la methode de dosage `a differentes concentrations. Les differences entre ces series
valident les conditions de fidelite intermediaire. Chaque serie est realisee dans des conditions
faisant varier, dans lordre du plus important au moins important, le materiel utilise, les reactifs,
les personnes et le moment de realisation du dosage au sein du meme laboratoire (Hubert et al.,
2003, 2006a,b). Ces donnees ont ete reprises pour realiser le plan de preparation des echantillons.

2.3.5

Pr
eparation des m
edicaments

Preparer le medicament dans les memes conditions quil le sera en routine lors de la validation de la methode de dosage, permet de prendre en compte le facteur de variabilite de la
preparation du medicament entre les series.
Deux teneurs en principe actif correspondant aux limites dacceptation du dosage, sont
explorees, une teneur maximale et une teneur minimale. Dans le cadre dune preparation hospitali`ere, generalement, les teneurs limites seront 90 % et 110 % de la teneur du medicament.
Dans le cadre des preparations de medicaments ayant une marge therapeutique large, les teneurs
limites seront 85 % et 115 % de la teneur du medicament.
` chaque serie, un preparateur habilite, fabrique chacun des deux medicaments aux teneurs
A
limites en principe actif, selon le mode operatoire pour la preparation du medicament. Si possible, un preparateur different est mis `a contribution `a chaque serie pour preparer les deux
medicaments, soit au total trois preparateurs differents preparant deux medicaments differents.
Les manipulateurs preparant les medicaments doivent etre habilites afin de ne pas fausser le
resultat de validation de la methode de dosage.

2.3.6

Pr
eparation des
echantillons de gamme et de validation

Deux type dechantillon sont `a preparer, les echantillons de gamme et les echantillons de
validation.
Les trois serie de preparation doivent etre realisees le plus proche possible des conditions
reelles et doivent etre les plus independantes possible pour respecter les conditions de fidelite
intermediaire. Toutes les manipulations sont renouvelees en prenant en compte la preparation
des solutions et des reactifs.
Pour preparer les echantillons de gamme et de validation, le diagramme de dosage dun
medicament type est suivi scrupuleusement pour chacune des deux teneurs en principe actif.
La preparation de ces deux types dechantillons permet de realiser les dosages permettant de
valider la methode de dosage.
Trois manipulateurs differents de ceux qui ont prepare les medicaments, preparent les

2.3 R
esultat

59

echantillons de gamme et de validation. Si possible, des personnes differentes realisent les trois
differentes series. Les trois series peuvent etre realisees sur trois jours consecutifs. Dans chaque
serie, il y a un certain nombre de repetitions, realisees dans des conditions de repetabilite. Cest
la meme personne avec le meme materiel qui realise ces repetitions
Pour une serie, un manipulateur realise la preparation de tous les echantillons. Ces preparations
suivent les recommandations faites par la SFSTP (Hubert et al., 2003, 2006a,b). Afin de ne pas
fausser le resultat de validation de la methode de dosage, seul le personnel habilite `a realiser
des dosages peut preparer ces deux types dechantillons.
Pr
eparation des
echantillons de gamme
Ces echantillons servent `a valider le mod`ele de la gamme, propose lors de la mise au point
de la methode.
En cas de presence deffet de matrice, les gammes sont realisees en presence de la matrice.
Dans ce cas, le principe actif est dilue avec lequivalent en matrice contenue dans le medicament.
Les echantillons de gamme sont prepares comme ils le seront en routine.
Les gammes sont repetees deux fois dans chaque serie.
Chaque gamme est preparee depuis le debut.
Il nest pas possible de se servir dun intermediaire dans la preparation dune gamme
pour la suivante. Les gammes sont independantes les unes des autres en ce qui concerne leurs
preparation.
Aucune restriction nest imposee lors de la preparation dune gamme hormis quelle soit
independante des autres gammes.
Pr
eparation des
echantillons de validation
Ces echantillons servent `a valider la methode de dosage.
Chacune des trois series sont independantes et sont conduites au plus proche des conditions
reelles. Dans une serie, le manipulateur ayant realise les deux gammes, realise quatre repetitions
independantes de preparation des echantillons de validation, pour chacun des deux medicaments
fabriques, soit au total huit repetitions par manipulateur. Ces repetitions sont realisees du debut
jusqu`a la fin sans croiser detapes entre eux. Les echantillons de validation sont prepares `a partir
de prel`evements sur le medicament prepare pour la serie (un prel`evement par echantillon de
validation). Quatre echantillons de validation sont prepares `a partir de chaque medicament.
Par exemple, le manipulateur ne peut pas realiser un seul prel`evement du medicament pour
realiser les quatre echantillons mais il est oblige de prelever quatre fois le medicament.
Comme le medicament est prepare `a deux concentrations differentes dans une serie, au total
huit echantillons de validation independants, sont prepares par loperateur qui a prepare les
gammes de cette serie.

60

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

Chacune des trois series est la plus independante possible : le materiel, les reactif, les
medicament de depart et les manipulateurs, sont autant que possible differents entre les series.

2.3.7

Obtention du signal

La methode de dosage mise au point est utilisee pour obtenir un signal `a partir de chaque
echantillon de gamme et de validation.
Par exemple, pour une serie devant etre analysee en HPLC, les echantillons peuvent se
positionner dans lordre suivant : premi`ere gamme, deuxi`eme gamme, premi`ere concentration
minimale, premi`ere concentration maximale, deuxi`eme concentration minimale, deuxi`eme concentration maximale, ..., quatri`eme concentration minimale, quatri`eme concentration maximale,
avant le lancement de la serie permettant dobtenir chaque signal.
Lunite du signal na aucune importance du moment quelle est la meme pour les echantillons
de gamme et de validation. Les intensites des signaux servent `a calculer les crit`eres decisionnels
permettant de valider la methode de dosage. Une valeur algebrique dune grandeur physique est
obtenue comme resultat dun dosage. Cette grandeur a une unite de mesure ou nen `a pas. Une
valeur algebrique dune grandeur physique est obtenue soit directement, soit par lintermediaire
dun signal. Pour simplifier on va faire un raccourci en parlant de signal pour designer une valeur
algebrique dune grandeur physique.
Un signal est obtenu selon la teneur en principe actif et la methode de dosage mise au
point, pour chacun des echantillons de gamme et de validation. Le signal obtenu pour chaque
echantillon sert `a etre etudie pour permettre de valider la methode de dosage. Chaque serie est
independante des autres. Lensemble de la serie peut, si necessaire, etre lance au meme moment,
de la meme facon quil le sera en routine. Par exemple, en HPLC les dosages sont lances par
serie sur lappareillage.
Description dune s
erie de mesure
Dans chaque serie, les signaux sont obtenus pour deux gammes realisees dans les memes
conditions, et deux teneurs en principes actif repetes quatre fois chacune dans les memes conditions.

2.3.8

Analyse du signal pour obtention des crit`


eres d
ecisionnels

Deux series detapes successives pour permettre dobtenir des crit`eres decisionnels sont
realisees : calculs sur les echantillons de gammes et calculs sur les echantillons de validation
(voir figure 2.3).
La valeur de signal obtenue pour chaque echantillon de gamme et chaque echantillon de
validation est reportee dans le tableur en lassociant `a sa teneur consideree comme reelle, la

2.3 R
esultat

61

Figure 2.3 Description des etapes de calcul.

62

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

plus exactement determinee, en saidant generalement de la pesee (voir figure 2.4 et 2.5). Le
changement de variable de ces valeurs (pouvant permettre de lineariser le signal en fonction
de la concentration), et lutilisation dun coefficient de correction des echantillons de validation
(pouvant representer le rendement dextraction du medicament), sont realises avant le report
dans ce tableur.

etalonnage
Dans le tableur, les echantillons de gamme sont traites pour obtenir divers fonctions de
reponse en fonction de mod`eles simules. Dans la pratique, cest le mod`ele lineaire `a cinq points
qui est utilise. Les mod`eles de gammes simules, vont de, deux points (mod`eles `a un point de
gamme) `a six points incluant ou non le zero, jusquau mod`ele lineaire pondere. Le mod`eles `a
un point de gamme est en fait une moyenne de deux points de meme concentration, force en
zero (voir figure 2.4).
Il existe dautres mod`eles qui peuvent etre integres soit par changement de variable avant la
saisie dans le tableur ou soit par saisie directe des valeurs dans la zone appropriee du tableur.
Par exemple saisir la pente et lordonnee `a lorigine directement `a la place du mod`ele lineaire,
permettra de simuler un mod`ele non present dans le tableur.
Lobjectif est dobtenir une fonction de reponse, du type y = ax + b, par serie et par mod`ele,
soit 3 fonctions de reponse par mod`ele. Pour cela, pour un mod`ele donne, et une serie donnee,
lensemble des points des deux gammes sont associes dans le calcul de lequation de la droite.
Lequation de la droite type est determinee par la methode des moindres carres et par regression
lineaire. Ceci permet dobtenir les trois fonctions de reponse pour chaque mod`ele, correspondant
aux series un, deux et trois(voir figure 2.3 et 2.4).
Dans le tableur, la saisie de trois a` six points de gamme, declenche automatiquement le
calcul du coefficient de correlation et de determination entre les points saisis de chaque serie, et
ceci `a titre indicatif. Si le coefficient de determination est faible, cela presage dune mauvaise
performance de la methode de dosage (voir figure 2.4). Il est possible dutiliser le coefficient de
determination comme un crit`ere indicatif darret de la validation de la methode. Si il est trop
faible, la performance de la methode risque detre insuffisante, et la validation de la methode
sera probablement non conforme. Dans le tableur un seuil du coefficient de determination est
fixe arbitrairement `a 0,99. En dessous de ce seuil il y a un risque trop eleve de non conformite
lors de la validation de la methode, lie `a une faible correlation entre les points. Cela ninterdit
en rien la poursuite du dosage mais cela indique quil y a probablement un probl`eme avec la
gamme.
Un deuxi`eme role different peut etre donne au coefficient de determination. Un seuil fixe
`a 0,99 peut etre utilise `a la fois lors de la validation puis systematiquement en routine pour
valider la gamme pour augmenter la performance de la methode et reduire le risque derreur sur
la gamme. Ainsi si le coefficient de determination est en dessous ce seuil, la gamme est rejetee

2.3 R
esultat

63

Figure 2.4 Exemple de remplissage du tableur des echantillons de gamme. Disponible sur :
http://armand2306.free.fr/siavelis/th%C3%A8se.html

64

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

et doit etre refaite. Il faut veiller `a ne pas non plus avoir `a refaire la gamme trop souvent !
Finalement le tableur des gammes a pour entree les signaux des points de gamme ainsi
que leurs concentrations respectives, et pour sortie les pentes et ordonnes `a lorigine des
trois equations des droites detalonnage de chacun des mod`eles. Dans chaque mod`ele, les trois
equations correspondent respectivement `a chacune des trois series. Les donnees de sortie sont
visualisees automatiquement sur le second tableur.
Pr
ediction des inverses en utilisant les fonctions de r
eponse des diff
erents mod`
ele
La prediction des inverses, cest la determination de la concentration correspondant au
signal des echantillons de validation, en utilisant les fonctions de reponse determinees grace
aux gammes obtenues dans le premier tableur pour chaque serie. Ce calcul est reproduit pour
chaque mod`ele de gamme simule, ce qui cree un tableur de grande taille.
Lanalyse des signaux de validation porte conjointement sur la concentration minimale et
la concentration maximale. Lanalyse est identique pour ces deux concentrations. La fonction
de reponse obtenue pour chaque mod`ele et chaque serie est donc utilisee pour determiner les
concentrations calculees correspondantes. Il est ainsi obtenu, pour chaque point, une concentration calculee versus une concentration reelle. Dans le tableur, les concentrations calculees
sont associees aux concentrations reelles correspondantes (voir figure 2.3 et 2.5).
Alignement des concentrations d
etermin
ees par pr
ediction des inverses
Un alignement est realise separement pour la concentration maximale et pour la concentration minimale. Il a pour objectif de simplifier la comparaison entre les concentrations obtenues.
La comparaison des differences entre les concentrations calculees et les concentrations reelles
sapparente `a une comparaison multiple. Ce type de comparaison est complexe. Les concentrations calculees issues de pesees independantes et differentes ne sont pas comparables directement, ce qui justifie la necessite dun alignement. Lalignement des concentrations permet donc
de simplifier lequation pour permettre de comparer toutes les concentrations entre elles en une
fois et non une `a une. Pour cela il faut que les concentrations calculees soient associees `a des
concentrations reelles, toutes identiques. Lalignement consiste donc `a ajouter la difference entre concentration reelle moyenne et concentration reelle `a toutes les concentrations. Ainsi, apr`es
cet ajout, dans les cases des concentrations reelles napparaissent plus que la concentrations
reelle moyenne et dans les cases des concentrations calcules, apparaissent les concentrations
calculees, alignees `a cette moyenne de concentrations reelle (voir figure 2.3 et 2.6).
Calcul de la concentration r
eelle align
ee (C = concentration)
C(reelle alignee) = C(reelle) + C(reelle moyenne) C(reelle)

2.3 R
esultat

65

Figure 2.5 Exemple de remplissage du tableur des echantillons de validation. Disponible


sur : http://armand2306.free.fr/siavelis/th%C3%A8se.html

66

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

Figure 2.6 Exemple de calcul des concentrations dalignement. Disponible sur :


http://armand2306.free.fr/siavelis/th%C3%A8se.html

2.3 R
esultat

67
C(reelle alignee) = C(reelle moyenne)

Par simplification la concentration reelle alignee devient la concentration reelle moyenne.


Calcul de la concentration calcul
ee align
ee (C = concentration)
C(calculee alignee) = C(calculee) + C(reelle moyenne) C(reelle)
Ainsi, une concentration calculee alignee est obtenue pour chaque echantillon de validation.
Elle est associee `a une concentration reelle moyenne. Lalignement permet un gommage de
la variabilite liee aux differences de pesee entre les echantillons de validation. Sans cela, cette
variabilite aurait ete prise en compte dans les calculs et aurait faussement accentue la variabilite
finale. Ceci aurait ete en defaveur de la methode de dosage. La comparaison des concentrations
calculees alignees ainsi obtenues permettent dextraire la variance de fidelite intermediaire.
La comparaison des concentrations reelles moyennes avec les concentrations calculees alignees
moyennes, permettront de determiner le biais de justesse.
Calcul du biais de justesse
Le biais est calcule pour les deux concentrations (la concentration minimale et la concentration maximale). Dans chacun des mod`eles de fonctions de reponse simulees, les deux biais
des deux concentrations sont calcules. La meilleure estimation du biais de justesse de lensemble des etapes decrites dans le diagramme de dosage, consiste `a confronter les moyennes des
concentrations des echantillons de validation reelles `a celles calculees.
Calcul du biais de justesse absolu : Le biais absolu est calcule par la difference entre la
moyenne des concentrations calculees et la moyenne des concentrations reelles (voir figure 2.7).
Biais absolu = moyenne des concentrations calculees moyenne des concentrations reelles
Le biais relatif est le biais absolu divise par la moyenne des concentrations reelles, et sa valeur
peut etre exprimee en pourcentage par rapport `a la valeur reelle.
Biais relatif =

biais absolu
moyenne des concentrations reelles

Calcul du biais de justesse relatif : (C = concentration)


Biais de justesse relatif) =

moyenne des C reelles moyenne des C calculees


moyenne des C reelles

Le biais relatif est utilise pour calculer les differents crit`eres decisionnels de validation de
methode.

68

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

Calcul de la variance li
ee `
a la r
ep
etition et de la variance li
ee `
a la s
erie (voir figure
2.7)
Pour proceder aux calculs, il faut considerer que les series suivent une distribution normale
et que leurs variances estimees sont egales.
Dans chaque serie il y a quatre repetitions des concentrations de validation. Cette etape
consiste `a determiner la variance entre ces repetitions dans les series et la variance entre les
series de repetition. Ces calculs sont realises pour chaque mod`ele, et dans chaque mod`ele pour
chacune des deux concentrations.
Pour le calcul de ces deux variances, il faut distinguer deux cas de figure :
1. La variabilite entre les repetitions est plus importante quentre les series. Si la variance
residuelle est plus importante que la variance entre les groupes, cela signifie quil y a plus
de variabilite `a linterieur des series quentre les series. Il y a donc moins de difference
observee entre deux echantillons de series differentes quentre deux echantillons de la
meme serie. Dans ce cas, la variabilite exercee par les series est consideree comme nulle.
La variance liee `a la repetition est consideree comme etant la variance totale, les trois
series etant regroupees. Elle est estimee en calculant la variance totale entre les douze
concentrations calculees des echantillons de validation (trois series de quatre repetitions
par concentration).
2. La variabilite entre les series est plus importante quentre les repetitions, cest le cas le
plus frequent.
Le probl`eme vient du fait quil nest pas possible de savoir dans quel cas de figure on se
trouve sans avoir au prealable calcule la variabilite entre les repetitions et entre les series.
Pour savoir dans quel cas de figure se trouvent les concentrations calculees, il est necessaire de
calculer la variance residuelle appelee aussi variance intra-serie (appelee MSE par la SFSTP)
et la variance entre groupes nomme aussi variance inter-serie (appelee MSM par la SFSTP)
(Hubert et al., 2003, 2006a,b).
Calcul de la variance r
esiduelle : notons SCE la somme des carres des ecarts.
SCE residuels = somme des variances des series nb de repetitions par serie
SCE residuels = somme des variances des series 4
SCE residuels
Variance residuelle =
nombre total de valeurs - nombre de series
somme des variance des series 4
Variance residuelle =
12 - 3
somme des variance des series 4
Variance residuelle =
9

2.3 R
esultat

69

Calcul de la variance entre groupes : notons SCE la somme des carres des ecarts.
SCE entre groupes = somme des variances des moyennes des series nombre total
SCE entre groupes = somme des variances des moyennes des series 12

SCE entre groupes


nombre de series - 1
SCE entre groupes
Variance entre groupes =
3-1
SCE entre groupes
Variance entre groupes =
2
somme des variances des moyennes des series 12
Variance entre groupes =
2
Variance entre groupes = somme des variance des moyennes des series 6
Variance entre groupes =

Premier cas de figure : variance residuelle > variance entre groupes


Variance liee `a la serie = 0
Variance liee `a la repetition = variance totale entre les 12 concentrations calculees
Deuxi`
eme cas de figure : variance residuelle < variance entre groupes
Le calcul de la variance liee `a la serie est moins direct. La variance entre groupes, qui a ete
calculee, prend en compte la variance entre les echantillons de deux groupes differents qui ont
`a la fois une composante de la variabilite liee au groupe et une composante de la variabilite liee
`a la repetition. La formule permettant de calculer la variance liee `a la serie en dissociant ces
deux composantes est la suivante :
V ariance =

entre groupes

V ariance + nb de repetitions par serie V ariance

li
ee `
a la r
ep
etition

li
ee `
a la s
erie

Variance liee `a la repetition = Variance residuelle


Variance liee `a la serie =

variance entre groupes variance residuelle


nb de repetitions par serie

Variance liee `a la serie =

variance entre groupes variance residuelle


4

Calcul de la variance de fid


elit
e interm
ediaire relative et de la variance totale
relative, coefficient de variation
Calcul de la variance de fid
elit
e interm
ediaire :
Variance de fidelite intermediaire = variance liee `a la repetition + variance liee `a la serie

70

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

Estimation de la variance dune moyenne


Variance estimee dune moyenne =

variance de la distribution
nombre dechantillons

Calcul de la variance du biais : La variance du biais est en fait la variance de la moyenne


et elle a une composante de repetabilite et de fidelite intermediaire.
Variance du biais =

variance liee `a la repetition


variance liee `a la serie
+
nombre total
nb de repetitions par serie

Variance du biais =

variance liee a` la repetition variance liee `a la serie


+
12
4

Calcul de la variance totale : Il est possible de rajouter une variance additionnelle non
prise en compte dans les manipulations de validation de la methode de dosage.
Variance totale = variance de fidelite intermediaire + variance du biais + variance additionnelle
Au final chaque mod`ele simule poss`ede deux variances totales : une pour la concentration
minimale et une pour la concentration maximale.
Calcul de lintervalle de confiance relatif (voir figure 2.7)
Le calcul de lintervalle de confiance relative se base sur les travaux de la SFSTP (Hubert
et al., 2003, 2006a,b).
Pour calculer la valeur t limite de la loi de Student avec 10 % comme limite du test
(bilateral), il est necessaire de determiner le nombre de degre de liberte du test. La valeur de
t limite est determinee `a laide de la formule de calcul LOI.STUDENT.INVERSE( dans le
tableur.
Calcul du nombre de degr
e de libert
e : Apr`es simplification, la formule de depart etant
trop longue pour la citer.

Nombre de dll =

32 (Variance liee `a la serie/variance liee `a la repetition)2


(4 variance liee `a la serie/variance liee `a la repetition + 1)2 + 2

Calcul de l
ecart relatif de lintervalle de confiance : La concentration moyenne reelle
apparat dans la formule, pour changer lecart absolu en un ecart relatif.

Ecart
relatif = t limite

variance totale
concentration moyenne reelle

2.3 R
esultat

71

Calcul de lintervalle de confiance relatif : Centre sur le biais.


Intervalle de confiance relatif = [ biais relatif ecart relatif ; biais + ecart relatif ]
Au final, chaque mod`ele poss`ede un intervalle de confiance pour la concentration minimale
et un intervalle de confiance pour la concentration maximale.
Calcul de la capabilit
e (voir figure 2.7)
La formule de la capabilite est la suivante, (De Fontenay et al., 2011) :
limite superieure + |biais|

3 variance totale
Pour obtenir une estimation de la capabilite, il suffit dappliquer cette formule avec les
valeurs obtenues precedemment pour le biais de justesse et la variance totale.
Capabilite =

Capabilite =

limite superieure + |biais relatif|


variance totale/concentration moyenne reelle

Calcul du pourcentage dans lintervalle entre les deux limites, OCC (voir figure
2.7)
Pour calculer la proportion entre deux limites, il faut determiner les proportions au dessus
de la limite superieure et en dessous de la limite inferieure, puis retrancher ces deux proportions
`a 100 %.
Calcul de la proportion inf
erieure `
a la limite inf
erieure `a laide de la loi de Student
(n < 30) :


biais relatif limite inferieure

P roportion
=
t
nombre de dll
variance totale/concentration moyenne reelle
inf
erieure `
a la limite inf
erieure


biais limite inferieure

P (X < limite inferieure fixee) = P


t
>
nombre de dll
variance totale

Calcul de la proportion sup


erieure `
a la limite sup
erieure `a laide de la loi de Student
(n < 30) :


limite superieure biais relatif

P roportion
=
t
nombre de dll
variance totale/concentration moyenne reelle
sup
erieure `
a la limite sup
erieure


limite superieure biais

P (X > limite superieure fixee) = P


t
>
nombre de dll
variance totale

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

72

Risque de g
en
erer un faux n
egatif :
Risque de generer un faux negatif = P (X > limite superieure fixee)+P (X < limite inferieure fixee)
Calcul de la proportion entre les deux limites ou Proportion de vrai positif : La
proportion de vrais positifs correspond au risque de generer des resultats entre les deux limites
fixees, donc conformes.
Proportion de vrai positif = 1 Risque de generer un faux negatif
P roportion
entre les deux limites

=1

proportion
inf
erieure `
a la limite inf
erieure

P roportion
sup
erieure `
a la limite sup
erieure

Le risque de generer un faux negatif peut etre directement confronte `a la limite fixee. Il ny
a plus besoin de confronter cette valeur `a des courbes de niveaux.

2.3.9

Prise de d
ecision

La prise de decision se base sur linterpretation des valeurs donnees par la simulation utilisant uniquement le mod`ele lineaire dans un premier temps. Elle se base sur lestimation de la
proportion des resultats entre les limites basses et hautes dacceptation du dosage fixees. Les
niveaux de performance sont les suivants pour les deux concentrations testees :
Proportion superieure `a 99 % des valeurs entre les deux limites fixees : dosage tr`es performant.
Proportion superieure `a 95 % des valeurs entre les deux limites fixees : dosage performant.
Proportion superieure `a 90 % des valeurs entre les deux limites fixees : dosage acceptable.
Proportion inferieure `a 90 % des valeurs entre les deux limites fixees : dosage non valide.
Si la methode de dosage est validee, il ne reste plus qu`a choisir un mod`ele qui donne de
bons resultats pour lappliquer en routine. Le choix preferentiel est le mod`ele teste (mod`ele
lineaire en general), mais il est possible de choisir un autre mod`ele en suivant certaines r`egles.
Il est possible, par exemple, de choisir un mod`ele `a un point, si tous les mod`eles `a un point
sont valides. La concentration du point sera choisie en fonction de crit`eres de simplicite et de
performance. Pour rappel, le mod`ele `a un point est une gamme realisee par une droite passant
par la moyenne de deux points de gamme de meme concentration, independants lun de lautre,
et le zero. Le choix du mod`ele lineaire incluant le zero est possible sil est meilleur que le mod`ele
lineaire classique. Le mod`ele lineaire pondere peut etre choisi si ses performances sont vraiment
meilleures que le mod`ele lineaire, car il est plus complexe `a mettre en uvre. Dans lideal, il
faudrait une amelioration dau moins un niveau de performance pour faire le choix dun mod`ele
pondere.
Si la methode de dosage est non validee, il y a une demarche `a suivre dans lordre suivant :
1. Choisir le mod`ele lineaire pondere si celui-ci est valide.

2.3 R
esultat

Figure 2.7 Exemple de calcul des crit`eres decisionnels.


http://armand2306.free.fr/siavelis/th%C3%A8se.html

73

Disponible

sur

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

74

2. Sinon, accepter exceptionnellement un pourcentage inferieur `a 90 % de valeurs qui restent


dans les limites dacceptation fixees.
3. Sinon, etendre les limites dacceptation fixees (elles seront aussi etendues en routine).
4. Sinon, faire une simulation de ce qui se passerait si, en routine, le dosage etait effectue
deux fois de suite et que la moyenne de ces deux dosages etait utilisee comme resultat.
Cela consiste `a diviser par 2 la variance de repetabilite. Si le dosage est ainsi valide, il
faudra proceder `a deux dosages en routine et faire la moyenne des deux. En theorie, il est
possible detendre `a trois dosages voire plus, ce qui est contraignant car chronophage.
5. Si la solution precedente ne convient toujours pas, il est necessaire de repartir au stade
de la mise au point de la methode de dosage pour lameliorer.
6. En dernier recours, il faudra trouver une autre facon de faire le controle terminal (sous
traitance, modification de la formulation permettant un controle terminal par des pesees,
etc...).

2.3.10

Post-validation ou finalisation

Pour finaliser la validation de methode il est necessaire de faire une etude de stabilite des
reactifs non prepares extemporanement. Pour cela, il faut realiser le dosage du medicament
contenant 100 % du principe actif `a differents temps, jusqu`a la duree de stabilite voulue des
reactifs. Le resultat du dosage ne doit pas depasser 10 % derreur par rapport `a la vraie valeur.
Il est aussi possible de faire des tests de robustesse. Cette robustesse peut etre quantifiee par
la difference entre les variances de repetabilite et de fidelite intermediaire.

2.4

Discussion

Les laboratoires de controle de medicaments en pharmacie hospitali`ere sont de tr`es petites


structures. Elles assurent cependant un panel important de dosages differents. Les methodes de
dosage sont pour la plupart presque totalement manuelles : dosages titrimetriques `a la burette
graduee, dilutions `a la pipette dans des fioles jaugees, spectrometrie UV-visible etc... De plus,
la quantite de personnel est limitee.
En pratique, dans ces conditions, il nest pas possible de realiser trente controles independants
dans des conditions de fidelite intermediaire, ni dans des conditions de repetabilite pour chaque
nouvelle methode de dosage. Cela suffit `a comprendre pourquoi la methode classique de validation de dosage nest pas applicable `a la pharmacie hospitali`ere. La methode classique, dej`a
utilisee par tous, a fait ses preuves. Neanmoins, elle a ses defauts. Il y a peu dinnovations `a
rajouter (il serait difficile de pouvoir lameliorer).
Cest la raison pour laquelle je pref`ere explorer de nouvelles methodes etablies par des
experts en conservant les concepts de biais et de justesse, sans sen servir comme outil decisionnel

2.4 Discussion

75

mais comme des donnees intermediaires necessaires `a la validation. La decision de valider la


methode de dosage devra etre prise en fonction des limites qui doivent etre fixees lors de
lutilisation du dosage en routine.
La question qui se pose est de savoir quel pourcentage des resultats doit etre contenu dans
les limites dacceptation du dosage fixees. Cette proposition sint`egre `a la philosophie de lapproche de la validation de la methode de dosage par profil dexactitude comme outil de decision
decrit par la SFSTP et repris par le guide du GERPAC. Tout cela incite `a sorienter vers
les recommandations de la SFSTP, de lEURACHEM, et du GERPAC (Hubert et al., 2003,
2006a,b; Ellison et Williams, 2012; G.E.R.P.A.C., 2013).
La methode classique requiert le calcul du biais de justesse et du coefficient de variation
de fidelite intermediaire. Ces determinations sont reprises et optimisees par la SFSTP et le
GERPAC de facon `a sadapter aux structures telles que les laboratoires de controle de pharmacie
hospitali`ere. Par contre, ces crit`eres ne sont plus traites comme des crit`eres decisionnels, mais
comme une etape `a partir de laquelle seront determines les nouveaux crit`eres decisionnels.
Dans la suite de la discussion je me refererai preferentiellement aux documents de la SFSTP qui
brillent par la richesse des details apportes `a la validation de methode. La methode de la SFSTP
est basee essentiellement sur la recherche des crit`eres decisionnels correspondant `a un intervalle
de confiance. Le plan de preparation des echantillons est tr`es detaille et lobjectif est centre
uniquement sur le crit`ere decisionnel. Par exemple, la linearite est un crit`ere non decisionnel et
non necessaire au calcul des crit`eres decisionnels. Pour ces raisons, selon la SFSTP, il nest pas
necessaire de tester la linearite (Hubert et al., 2003, 2006a,b). De plus, les tests permettant de
conclure `a la linearite de la gamme sont complexes, ce qui soppose `a la volonte de proposer
une methode de validation de methode de dosage simple `a mettre en uvre.
` cette colonne vertebrale, sont greffees les donnees importantes quil est possible de trouver
A
dans les differentes approches, permettant dameliorer, de completer et de simplifier la validation
de methode. Lobjectif nest pas de reecrire le document de la SFSTP, mais juste de decrire
une facon de le retranscrire sur une feuille de calcul, de le simplifier et de lutiliser pour aller
plus loin et faire dautres tests permettant de donner une valeur de capabilite et mieux encore,
un pourcentage de valeurs en dehors dune limite (Hubert et al., 2003, 2006a,b; De Fontenay
et al., 2011).
LEURACHEM propose aussi un document tr`es detaille, mais complexe `a mettre en uvre donc moins bien adapte `a la situation du laboratoire de controle. Par contre la notion
dincertitude est similaire `a la notion des OCC qui me semble le meilleur crit`ere decisionnel
`a integrer dans la validation de methodes de dosage avec un autre mode de calcul, adapte au
faible echantillonnage. La force de lEURACHEM est aussi de proposer une demarche qualite
permettant de valider une methode de dosage. Elle est `a mon avis trop complexe, mais certains
aspects simples peuvent etre repris (Ellison et Williams, 2012).

76

2.4.1

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

Les crit`
eres de validation d
ecisionnels et non d
ecisionnels

Comme les crit`eres decisionnels sont les crit`eres permettant de valider la methode de dosage,
lobjectif sera centre sur leurs determination. Les crit`eres non decisionnels ne servant pas `a la
determination des crit`eres decisionnels ne seront explores que superficiellement.

2.4.2

Quelques r`
egles doptimisation lors de la r
ealisation dune
m
ethode de validation de dosage

Dune mani`ere generale, les crit`eres decisionnels sont determines de facon preferentielle
en se placant dans les conditions reelles plutot que dans les conditions remplissant les r`egles
statistiques. En effet, il est presque impossible de se conformer en totalite `a toutes les r`egles
de statistique. Il faudrait, par exemple, tester la normalite de la distribution des resultats dun
dosage donne pour une population et cela se rapprocherait de laboutissement de la methode
classique proposee par la SFSTP en 1992. La verification des conditions du remplissage de la
plupart des r`egles statistiques, encourage lapparition de situations incoherentes. Par exemple,
une methode de dosage aux performances superieures serais penalisee par rapport `a une methode
moins performante (Algranti et al., 1992; Hubert et al., 2003).
De plus, modifier la methode de dosage pour permettre de la faire rentrer dans un moule
artificiel de validation, a pour consequence dobtenir des resultats plus eloignes que ceux qui
seront obtenus en routine. En respectant au maximum les r`egles statistiques, les donnees sur
le dosage obtenu sont des donnees theoriques, ce qui est en totale contradiction avec lobjectif
dobtenir des donnees pratiques sur lestimation du comportement du dosage dans les conditions
reelles du laboratoire. Jusquici, pour pallier `a cette situation, les methodes de dosage ont ete
uniformisees afin de sadapter au moule statistique de la validation de methodes de dosage. Le
fait que la methode de dosage doive sadapter `a la validation de la methode a pour consequence
de limiter les possibilites offertes lors de la mise au point de la methode. Sattacher `a respecter de
mani`ere plus importante les conditions reelles plutot que les conditions statistiques augmente
lerreur sur lestimation de la performance ideale de la methode de dosage. Cependant, la
methode de dosage aura moins besoin de sadapter aux exigences de la validation, et lestimation
de la performance sera plus proche de la performance reelle de la methode de dosage lors de
son utilisation en routine. Dans un cas en se mettant dans des conditions statistiques ideales,
on se rapproche de lestimation de la performance ideale en seloignant de la performance reelle
et inversement dans le cas contraire.
Dans la redaction du guide, il est donne une plus grande importance au respect des conditions de fidelite intermediaire, quau respect des conditions de repetabilite. Par souci de simplification, lorsque cela est necessaire, le non respect des conditions de repetabilite est privilegie
car limpact de ce non respect est moins important, par rapport `a limpact due au non respect
des conditions de fidelite intermediaire. Lors de la realisation de serie de manipulation, letude

2.4 Discussion

77

de lerreur entre les repetitions explore lerreur liee `a la repetabilite. Letude de lerreur entre
les series explore lerreur liee `a la fidelite intermediaire.
Si une manipulation est trop lourde et quil est necessaire de reduire le nombre de manipulations, il est preferable de garder les manipulations qui explorent les conditions de fidelite
intermediaire et de sacrifier les manipulations qui explorent les conditions de repetabilite car
lerreur exploree par les conditions de fidelite intermediaire est au moins plus importante. Ainsi,
dans certaines conditions, les repetitions seront supprimees. La consequence est une reduction
de lestimation de lerreur reelle liee `a la methode de dosage et une sous estimation de lerreur
liee `a la methode de dosage. Il faut songer quil nest pas possible de proposer une estimation
parfaitement exacte de la methode de dosage mais quil ne faut pas que cette estimation soit
entachee dune trop grande erreur.
Dans le meme registre, une plus grande importance est donnee `a la reduction significative
des manipulations lors de la validation de la methode de dosage que le respect des conditions
de repetabilite.

2.4.3

Pr
e-validation

En pre-validation il faut explorer les crit`eres qui prouvent que lors de la mise au point du
dosage rien na ete oublie, le choix se porte donc sur les crit`eres non decisionnels non necessaires
au calcul des crit`eres decisionnels en excluent ceux qui ne sont pas obligatoires.
Pour pouvoir preparer les echantillons de gamme et de validation, il est necessaire davoir
une idee de linterference de la matrice et de leffet de matrice. Ces informations normalement
necessaires `a la mise au point du dosage permettent de savoir comment preparer le blanc, et si la
gamme doit etre preparee avec ou sans matrice. Leffet de matrice est determine en comparant
les gammes obtenues avec matrice et sans matrice. Linterference de la matrice est determinee
par comparaison dun blanc avec matrice et dun blanc sans matrice. Cette comparaison nest
pas etudiee statistiquement car ces crit`eres ne sont pas decisionnels. De plus la presence dun
effet de matrice ou dinterference de la matrice a un effet direct sur les crit`eres decisionnels
etudies par la suite.
Lors de la mise au point dun dosage, il est necessaire de connatre la limite de linearite et
de quantification pour se placer au plus loin de ces deux limites, cest `a dire, au plus proche
de la moyenne entre ces deux limites. Il ne faut pas etre proche de la limite de quantification
ou de la limite de linearite mais il vaut mieux etre le plus au milieu entre ces deux limites.
Cela permet davoir le moins dincertitude possible lors du dosage car les incertitudes liees `a
ces deux crit`eres ont le plus de chance detre au plus faible. Tout ceci nest que theorique et il
faut surtout verifier que la zone dans laquelle seffectue le dosage ne se situe pas en dehors de la
zone encadree par ces deux limites. La validation finale sur les deux concentrations, maximale
et minimale, donnera une reponse finale `a cette question, mais il serait toujours interessant de

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

78

faire un test rapide avant dentamer une validation longue et complexe du dosage. Si cela na
pas ete dej`a fait lors de la mise au point du dosage, il est important de realiser un dosage du
medicament sur une concentration faible et sur une concentration elevee en principe actif, pour
verifier quil ny ait pas une difference trop importante entre la valeur theoriquement vrai et la
valeur calculee. 50 % et 200 % de la concentration en principe actif paraissent appropriees.
La linearite de la droite detalonnage sur le domaine de dosage est important pour permettre
dobtenir des resultats de dosage proches de la vraie valeur. Une mauvaise linearite sur cette
zone a pour consequence directe une erreur importante sur les resultats de dosage, et donc, la
non validation de la methode de dosage des deux concentrations etudiees. Il est donc necessaire
de verifier la linearite sur cette zone, mais sans faire de tests statistiques complexes qui napporteraient rien de plus. La question qui se pose, est de savoir si les signaux obtenus pour des
concentrations en principe actif allant de 50 % `a 200 % sont alignes mais il serait preferable de
savoir si les signaux obtenus pour des medicaments aux concentrations en principe actif allant
de 50 % `a 200 % sont alignes. De plus, le mode de realisation de la gamme ne doit pas etre
un obstacle `a la validation de la methode de dosage, donc il est preferable de travailler sur des
echantillons de medicaments que sur des echantillons de gamme. Il faudrait donc travailler sur
la linearite des signaux obtenus avec des echantillons de medicaments `a 50 %, 100 %, 150 %et
200 % de la teneur en principe actif du medicament qui sera prepare en routine. Il faudra verifier
sils sont alignes et si leur pente ne semble pas tendre vers zero. Il est possible de rajouter un
cinqui`eme point pour repondre aux specifications methodologiques preconisees par lICH au
niveau de la linearite mais cela napporte pas vraiment plus dinformation sur laptitude de la
methode `a quantifier (I.C.H., 1997; Hubert et al., 2003).
Si ces signaux ne sont pas lineaires, la methode de dosage a tr`es peu de chance daboutir, et
il nest pas recommande de poursuivre la validation de la methode de dosage. Dans ce cas il est
preferable de reprendre la mise au point de la methode. La strategie la plus simple consiste `a
determiner lequation de la courbe, de la lineariser pour poursuivre la validation de la methode
de dosage.
Certaines methodes de dosage ont des caracteristiques propres qui doivent etre explorees.
En bref, la pre-validation est en fait plus basee sur des r`egles de bon sens que sur une
marche `a suivre systematique. Cette marche `a suivre est une possibilite parmi dautres et nest
pas la partie la plus importante de la validation de methode car elle repose sur des crit`eres non
decisionnels.

2.4.4

Diagramme du dosage dun m


edicament type

En partant de citations des BPP (Bonnes pratiques de preparation), il est necessaire de


valider les methodes de dosage avant leurs mise en uvre ou lors dune modification, et de
tracer ces validations. Toute methode de preparation et de controle est validee avant sa mise

2.4 Discussion

79

en uvre, toutes les modifications de ces methodes sont suivies imperativement dune nouvelle
validation. Les resultats de ces validations sont conserves conformement aux r`egles darchivage.
Les controles realises concernent notamment ... les preparations terminees. Les controles dont
les resultats font lobjet de comptes rendus dates et signes, sont de differents types, notamment : les controles galeniques mentionnes `a la pharmacopee ... tout autre controle possible
rendu necessaire par le caract`ere de la preparation terminee, notamment la teneur en substance
active(A.F.S.S.A.P.S., 2007).
Pour valider une methode de dosage, il faut prendre en compte les limites definies au del`a
` la PUI du CHU dAngers, ces limites sont
desquelles le resultat du dosage est non conforme. A
generalement de 10 % pour les preparations hospitali`eres et de 15 % pour les autres preparations
ayant des marges therapeutiques plus larges.
Comment representer ces limites de mani`ere `a pouvoir sen servir pour valider une methode
de dosage ?
Pour repondre `a cette question, il faut suivre les recommandations de lEURACHEM qui
propose de construire un diagramme dincertitude du dosage pour y visualiser les etapes `a
prendre en compte permettant de valider une methode de dosage (Ellison et Williams, 2012).
Un diagramme `a ete construit pour pouvoir visualiser les etapes de la validation de la
methode de dosage en prenant comme point de depart les pesees du principe actif servant
de valeurs de reference au resultat du dosage (voir figure 2.2). Lobjectif recherche est que
la difference entre la pesee de reference et le resultat du dosage ne depasse pas les limites
imposees rendant un dosage non conforme. Lincertitude de lensemble des etapes representees
sur le diagramme ne doit pas depasser les limites imposees, et cette incertitude correspond `a
la difference entre la pesee de reference et le resultat du dosage. Lincertitude de lensemble
de ces etapes peut etre calculee `a partir des differences existantes entre les pesees de reference
et les resultats des dosages experimentaux. Le diagramme sera utilise comme base permettant
de construire une methode de validation de dosage prenant en compte lensemble des etapes
visualisees.
Seule lincertitude de la pesee en principe actif du medicament correspondant `a la vraie
valeur ne peut pas etre prise en compte par les manipulations de validation de methode. Il
faut donc sassurer que cette incertitude soit negligeable (moins de 1 % semble etre un bon
compromis) sinon il faudrait la rajouter dans le resultat final de validation de methode.

2.4.5

Choix des teneurs en principe actif `


a
etudier

Le diagramme precedent propose les etapes du dosage `a etudier mais idealement, quelles
sont les teneurs en principe actif `a explorer ?
La SFSTP propose dexplorer une teneur correspondante `a 100 % de principe actif (Hubert
et al., 2003, 2006a,b). Ceci permet destimer les limites du dosage en conditions reelles lorsque

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

80

tout va bien, et donne une idee de la proportion des faux negatifs, correspondant au rejet du
medicament alors quil est `a une teneur conforme. Mais cela ne donne quune tr`es mauvaise
estimation des faux positifs, ce qui correspond `a la validation du medicament alors que sa teneur
est non conforme. Pour cela, il faudrait se placer `a une teneur non conforme, mais le choix de
la teneur `a prendre en compte est difficile car il existe une infinite de possibilites auxquelles
il est possible de se positionner. Par exemple, se situer `a la limite imposee `a ne pas depasser
donnera comme resultat, en moyenne, 50 % des resultats conformes et 50 % des resultats non
conformes, ce qui ne permet pas de conclure concernant lestimation des faux positifs.
Pour permettre le meilleur compromis entre faux positifs et faux negatifs, et un nombre
de manipulations minimal, le choix se porte donc vers les deux valeurs limites qui ont pour
avantage de donner de linformation `a la fois sur le faux negatif et sur le faux positif. Ainsi, les
deux teneurs en principe actif correspondant aux limites maximales et minimales, admises, sont
explorees. Dans le cadre dune preparation hospitali`ere, les teneurs minimales et maximales sont
respectivement 90 % et 110 % Dans le cadre dune preparation ayant une marge therapeutique
plus large, les teneurs minimales et maximales sont respectivement 85 % et 115 %. Le crit`ere
decisionnel principal se base sur le taux des resultats sortant des limites imposees pour ces deux
teneurs en principe actif, soit generalement :
+10 % et -10 % pour les preparations hospitali`eres.
+15 % et -15 % pour les autres preparations ayant une marge therapeutique large.
Les teneurs en principe actif `a etudier sont :
La teneur maximale.
La teneur minimale.
` chacune de ces teneurs, correspondant aux valeurs limites du dosage, la proportion de
A
faux negatifs sera etudiee.
La valeur `a 100 % en teneur en principe actif proche de ces deux valeurs apporte peu dinformations complementaires et rajoute beaucoup de manipulations, ce qui dissuade de linclure. Il
faut quand meme rester conscient que les sources de variabilite dun signal obtenu `a une faible
teneur sont differentes par rapport `a un signal obtenu `a forte teneur en analyte. Par exemple,
`a faible teneur le bruit de fond a proportionnellement plus dimpact sur la variabilite dun
resultat qu`a forte teneur en analyte. Autre exemple, `a forte teneur en analyte, la variabilite
du lecteur a generalement plus dimpact sur la variabilite du resultat (saturation, depassement
de la limite de linearite). Pour celui qui le desire, il est toujours possible de rajouter un point
central dans la validation de la methode de dosage correspondant `a 100 % en teneur en analyte.

2.4.6

Nombre de r
ep
etitions par s
erie

En suivant le travail de la SFSTP, le nombre de repetitions minimum par serie demandant


le moins de manipulations, est de quatre. Ces repetitions qui remplissent les conditions de

2.4 Discussion

81

repetabilite sont les plus independantes possible. Elles sont realisees avec le meme materiel, les
memes reactifs et la meme personne au meme moment (Hubert et al., 2003, 2006a,b). Toutefois,
pour des questions de coherence avec la situation reelle, la personne qui fabrique le medicament
est differente de la personne qui realise le dosage (echantillons de controle et de gamme) lors
de la validation de methode. En effet, selon les BPP, la personne qui fabrique le medicament
est differente de la personne qui realise les controles (A.F.S.S.A.P.S., 2007).

2.4.7

Pr
eparation des m
edicaments

Le medicament est prepare `a deux teneurs differentes en principe actif : une teneur maximale
et une teneur minimale. En theorie, en suivant le diagramme, pour une teneur donnee en
principe actif, le medicament doit etre prepare quatre fois par le meme manipulateur. Cela
doit etre realise par trois manipulateurs differents. Le probl`eme reside dans la multiplicite des
manipulations. La variabilite de la preparation du medicament consistant generalement `a la
pesee et au melange du principe actif et des excipients, est a priori moins importante que celle
liee `a lensemble du dosage. De plus, cette variabilite nest presque jamais prise en compte lors
de la validation des methodes de dosage. Le meilleur compromis consisterait `a preparer un seul
medicament par serie au lieu des quatre. Resultant de cela, chacun des trois manipulateurs
fabrique un medicament `a la teneur minimale et un medicament `a la teneur maximale. La
consequence de cette simplification est lobtention dune leg`ere sous estimation de lerreur liee
`a la repetabilite, mais une reduction notable du nombre de manipulations.

2.4.8

Pr
eparation des
echantillons de gamme et de validation

Pr
eparation des
echantillons de gamme
Les echantillons de gamme permettent de realiser les gammes et de pouvoir en tester
differents mod`eles.
Dans le cas o`
u un effet de matrice est suspecte lors de la pre-validation, la gamme est
preparee avec la matrice comme le serait le medicament. En effet, il est necessaire de se rapprocher le plus possible des conditions reelles pour que le resultat soit le plus proche possible
des conditions reelles.
Par exemple, si lors de la validation de la methode il est demande de tester la validite de la
`
gamme, il serait obligatoire de realiser ces tests `a chaque elaboration de gamme en routine. A
linverse, la validation des gammes fait partie des etapes `a valider lorsque cela se fait en routine.
Lobjectif est de valider la methode de dosage de facon globale en incluant toutes les etapes qui
seront suivies en routine.
Dans lideal, chaque point de gamme doit etre prepare independamment des autres, depuis
la pesee jusqu`a lechantillon final servant `a obtenir le signal.

82

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

En pratique, une solution m`ere est souvent preparee `a partir dune pesee unique et de dilutions successives de cette pesee. Cette solution m`ere sert ensuite `a la preparation des differents
points de gamme. Le probl`eme de cette technique est que lincertitude de la solution m`ere se
repercute sur tous les points de gamme, ce qui reduit linteret de la realisation de multiples
points, dautant plus que lorsquils sont parfaitement alignes, un seul point donnerait presque le
meme resultat. De plus, cela reduit les differences entre chacun des points de gamme, donnant
artificiellement une meilleure linearite entre les points de la gamme. Si les points de gamme
sont parfaitement alignes cest quil y a peu dincertitude liee `a la preparation des points de
gamme `a partir de la solution m`ere, mais cela ne donne pas destimation sur lincertitude de
la preparation de cette solution m`ere, ce qui pourrait rendre compl`etement fausse une gamme
apparaissant parfaitement lineaire. Ce type de preparation de gamme ne doit donc pas etre non
plus valide en utilisant une methode de validation classique, il faudrait que chaque point de
gamme soit parfaitement independant.
La gamme doit etre consideree comme un outil servant `a obtenir le resultat dun dosage.
Cest lincertitude de la gamme qui a une repercussion sur le resultat du dosage. Il nest pas
necessaire de dissocier les points de gamme pour les etudier `a part. En suivant le diagramme
du dosage dun medicament type, cest lincertitude de la gamme dans son integralite qui est
etudiee. Cette incertitude sajoutera a` lensembles des incertitudes evaluees. Ainsi, plus les
gammes seront realisees en reproduisant les conditions reelles, plus leurs incertitudes seront le
reflet des conditions reelles, et plus les crit`eres decisionnels de validation de methode auront des
chances de se rapprocher de la realite. Dans ce contexte, la validation de methode ne restreint
pas les possibilites offertes `a la realisation de la gamme en routine, `a condition que la gamme
ne soit pas trop variable ou biaisee, auquel cas la methode ne pourra pas etre validee. Ceci
donne une plus grande liberte de choix `a la realisation de la gamme. Quel que soit le procede
mis en uvre, la gamme sera prise en compte dans lestimation des param`etres decisionnels de
validation de methode. Dans le cas present, pour se rapprocher le plus possible de la situation
reelle, les gammes sont realisees independamment les unes des autres mais les points de gammes
ne le sont pas forcement.
Les gammes sont repetees deux fois dans chaque serie, ce qui permet la simulation de mod`eles
`a 1 point, correspondant `a la moyenne de 2 points de concentration identique, en passant par
zero. Un certain nombre de mod`eles sont simules comme decrit par la SFSTP, donnant le
choix entre plusieurs mod`eles. Une fois la methode de dosage validee, cette simulation permet
lutilisation dune gamme simplifiee en routine (Hubert et al., 2003, 2006a,b).
Pr
eparation des
echantillons de validation
Pour chaque serie, les points de depart de la preparation des echantillons de validation sont
les deux medicaments de la serie, fabriques precedemment. Le suivi des etapes du diagramme
de dosage du medicament type, permet de decrire lobtention des echantillons de validation.

2.4 Discussion

83

Ces etapes suivent la methode de dosage mise au point. Les echantillons de validation sont
prepares comme decrit par la methode de dosage mise au point. Par contre ils doivent respecter
rigoureusement le protocole de validation de methode propose par la SFSTP (Hubert et al.,
2003, 2006a,b).
Les conditions de repetabilite et de fidelite intermediaire doivent etre respectees car ces
etapes sont un des reflets principaux de la methode de dosage mise au point et devant etre
validee.

2.4.9

Obtention du signal

La methode de dosage mise au point est utilisee pour obtenir un signal `a partir de chaque
echantillon de gamme et de validation. Chaque serie est traitee independamment lune de lautre
comme pour des dosages differents. Par contre, dans chaque serie les echantillons de gamme
et de validations peuvent etre traitees en meme temps si cela est decrit dans le protocole de
dosage mis au point. Il est necessaire de respecter ce protocole qui sera utilise en routine pour
que le resultat final se rapproche le plus possible de la routine.

2.4.10

Analyse du signal pour obtention des crit`


eres d
ecisionnels

Lanalyse du signal requiert la necessite de realiser un grand nombre de calculs. Le tableur


est adapte car il est assez malleable et dote doutils statistiques. Dans un souci de simplification,
un premier tableur est utilise exclusivement pour le report et lanalyse des signaux de gamme
versus leurs concentrations considerees comme reelles. Un deuxi`eme tableur est utilise pour
le report et lanalyse des signaux de validation versus les concentrations reelles associant les
resultats obtenus avec le premier tableur. Dans ce deuxi`eme tableur lensemble des calculs
permettant lobtention des crit`eres decisionnels est realise.

Etalonnage
Lanalyse de ces gammes est inspiree de ce qui est propose par la SFSTP. Differents mod`eles
sont simules (Hubert et al., 2003, 2006a,b).
Les mod`eles les plus simples et ceux utilises couramment sont simules dans le tableur : les
mod`eles `a un point, les mod`eles lineaires et les mod`eles ponderes. Le mod`ele lineaire pondere
nest pas habituel ni simple mais sadapte `a certains cas particuliers et il est difficilement
remplacable par un autre mod`ele. De plus les calculs de ce mod`ele sont compliques et ils sont
pre-etablis dans le tableur pour eviter les erreurs et simplifier lanalyse. Le choix de ponderation
est lui aussi modifiable, par defaut il est de 1/concentration, mais il est possible `a titre dexemple de rajouter une puissance de X en exposant de la concentration, 1/concentration2 ,
1/concentration3 . Par defaut, le choix de ponderation donne plus dimpact aux points `a plus

84

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

faible teneur. Plus la concentration est elevee et moins elle a de poids dans lelaboration de
lequation de la gamme. Dans un mod`ele lineaire, en proportion, une erreur sur un point `a
forte teneur a plus dimpact sur lincertitude du resultat donne par la gamme, quune erreur
sur un point `a faible teneur. La ponderation vise `a gommer cet effet de limpact plus important
des points `a forte teneur. Le mod`ele lineaire forcant en zero na pas ete inclus car il donne un
poids trop fort au zero, par rapport aux autres points obtenus experimentalement. Forcer en
zero reduit limpact de leffort effectue pour realiser plusieurs points de gamme.Le resultat de
la gamme obtenu par cette methode tend `a se rapprocher de la methode `a un point (gamme
de la moyenne de deux points de meme concentration forcee en zero), beaucoup plus simple `a
utiliser en routine.
Dans le tableur, pour chaque point de gamme renseigne, un mod`ele `a un point est simule : il
suffit de calculer la pente creee entre la moyenne des deux points de la serie et le zero. Pour les
mod`eles lineaires, il faut que les gammes fassent de trois `a six points. Tous les points des deux
gammes sont utilises pour obtenir lequation de la droite de regression par la technique des
moindres carres. Pour les mod`eles lineaires ponderes, le calcul est sensiblement le meme hormis
que les points de gamme sont ponderes par le rapport inverse de la concentration. Toutes les
equations sont de la forme y = ax + b, ainsi il est plus simple de representer chaque equation
par sa pente et son ordonnee `a lorigine, qui sont ensuite repris dans le deuxi`eme tableur pour
realiser les calculs sur les echantillons de validation.
Un calcul du coefficient de determination est propose uniquement `a titre indicatif avec un
seuil `a 0,99. Deux usages peuvent en etre fait :
Le coefficient de determination peut servir de crit`ere de validation de la gamme et dans
ce cas il sera aussi utilise de la meme mani`ere quen routine.
Le coefficient de determination peut aussi servir dalerte de risque eleve de manque de
performance de la methode de dosage. Ceci dit, cela ninterdit pas la poursuite de la
validation de la methode de dosage, mais peut permettre dans certains cas de visualiser
quil est necessaire de proceder `a un ajustement du signal obtenu, car celui-ci nest peutetre pas lineaire, il ne suit pas lequation obtenue par la methode des moindres carres.
Parfois le signal nest pas directement lineaire, il est necessaire de le lineariser par lutilisation
dun changement de variable. IL na pas ete propose de simuler des changements de variable
dans le tableur car les possibilites sont nombreuses et que cela engendrerait un manque de
lisibilite en rendant le tableur extremement lourd sil fallait le faire pour chaque mod`ele. Dans
ce cas, il est necessaire de realiser les changements de variable avant de rentrer les valeurs dans
le tableur. En general ces transformations sont simples, il sagit de changer le signal (par le
logarithme, lexponentiel, 1/X, 1/X 2 , etc) avant de le rentrer dans le tableur de facon `a obtenir

un seul type de mod`ele simple du type : Y = AX +B. Evidemment,


les signaux des echantillons
de validation seront aussi traites par le changement de variable pour etre de meme grandeur. Il
nest pas non plus exclu de remplir soi meme les equations de la courbe en indiquant directement

2.4 Discussion

85

la pente et lordonnee `a lorigine dans le tableur, mais cela a pour inconvenient de perdre la
simulation offerte pour les autres mod`eles.
En statistique, il est de rigueur de definir une hypoth`ese principale et des hypoth`eses secondaires qui seront observees et interpretees independamment les unes des autres lorsque lhypoth`ese principale sera validee. Il ne sagit pas de tester des hypoth`eses successives jusqu`a
obtenir le resultat recherche. Cela reviendrait `a reduire la validation de methode de dosage
`a un tirage au sort ! Lapplication de cette r`egle consiste `a considerer lhypoth`ese principale
comme etant la validation dun mod`ele basique, par defaut le mod`ele lineaire nincluant pas le
zero. Les hypoth`eses secondaires sont la validation des autres mod`eles qui seront analyses si le
mod`ele lineaire est valide. Pour une raison pratique, une exception `a cette r`egle est envisagee
pour les mod`eles plus complexes, correspondant ici au mod`ele pondere. Dans le cas contraire,
ce mod`ele ne serait jamais envisage car plus complexe. Par exemple, si le mod`ele lineaire nest
pas valide et que le mod`ele pondere est bien meilleur, il sera choisi de valider la methode de
dosage sur le mod`ele pondere. Ce nest pas statistiquement parfait mais cest efficace et cela
rend utile le mod`ele pondere.
Pr
ediction des inverses en utilisant les fonctions de r
eponse des diff
erents mod`
ele
Sur le deuxi`eme tableur sont reportees les valeurs des signaux des echantillons de validation
associees `a leurs teneurs reelles. Parler de teneurs reelles nest pas approprie, car par definition
cette valeur a une incertitude propre et la valeur reelle nest jamais connue. Cependant, par
commodite, les valeurs de reference sont souvent considerees comme les valeurs vraies ou comme
des valeurs reelles.
Alignement des concentrations d
etermin
ees par pr
ediction des inverses
Ce travail de prediction des inverses et de lalignement est inspire de la description detaillee
faite par la SFSTP (Hubert et al., 2003, 2006a,b). Cependant, quelques modifications y ont ete
apportees :
1. Lordre des etapes `a ete inverse et cela sans aucun changement dans la valeur des resultats
rendus. Dans le document initial, lalignement etait effectue avant la prediction des inverses. Pour une meilleure comprehension et pour simplifier, ces deux etapes on ete inversees, ce qui ne change rien au resultat. En effet, les calculs sont plus simples que
ceux proposes. Dans lordre logique, pour comparer les concentrations avec les signaux
respectifs, il sagit dans un premier temps de transformer les signaux en concentration,
cest la prediction des inverses. Dans un deuxi`eme temps, pour simplifier la comparaison
statistique entre les concentrations, les concentrations calculees sont alignees `a une concentration theorique moyenne. Respecter cet ordre logique permet de simplifier les calculs
et de bien comprendre les etapes suivies pour eviter les erreurs.

86

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere
2. Lalignement des concentrations est realise sur toutes les concentrations avec la concentration moyenne et non separement entre les series avec la concentration moyenne de
chaque serie. Si lalignement est different entre les series, il ne devrait pas etre possible
de comparer les series entre elles. Pour pouvoir comparer les concentrations calculees
des series entre elles, il faut que leurs alignements soient realises sur la meme concentration, et le meilleur choix est la concentration moyenne reelle de toutes les series, et
non la concentration de la serie dans laquelle se trouve lechantillon de validation qui
sera different dune serie `a lautre. Les concentrations calculees sont comparees en lien
avec leur concentration reelle. Si toutes les concentrations reelles sont identiques, la comparaison des concentrations calculees est le reflet de la variabilite liee aux etapes decrites
par le diagramme de dosage du medicament. Si par contre, les concentrations reelles sont
differentes, cette difference sajoute `a celle des concentrations calculees, ce qui rajoute une
variabilite au resultat en defaveur de la methode de dosage. La seule difference existant
entre les moyennes des concentrations reelles des series est liee `a la difference entre les
pesees des echantillons preleves sur les medicaments et les pesees du principe actif. Cette
difference nest en rien du domaine de lincertitude du dosage mais uniquement aleatoire,
due au hasard, et sans lien avec la performance du dosage. Lestimation de la variance de
fidelite intermediaire, basee sur la comparaison entre les series, est faussement surestimee
`a hauteur de la difference entre les series de pesees du principe actif et les series de pesees
des echantillons preleves sur les medicaments. La solution qui permet de rendre les series
comparables est daligner les concentrations calculees `a la moyenne totale de lensemble
des concentrations reelles.

Calcul du biais de justesse


Linteret du biais relatif est son pouvoir dinterpretation superieur au biais absolu. En effet,
le biais relatif apporte en plus, une information comparative entre le biais de la methode et la
vraie valeur.
Calcul de la variance li
ee `
a la r
ep
etition et de la variance li
ee `
a la s
erie
Dans le cas de la realisation de series de repetitions, la meilleure estimation de la variance
de fidelite intermediaire est la somme de la variance liee `a la repetition et de la variance liee `a
la serie.
Donc dans un premier temps, il faut faire une estimation de ces deux variances pour les
deux concentrations etudiees dans chaque mod`ele.
Pour cela, il faut utiliser les formules de lanalyse des variances (ANOVA). Lanalyse des
variances consiste `a calculer la variance residuelle appelee aussi variance intra-serie, la variance
entre groupes appelee aussi variance inter-serie, et la variance totale.

2.4 Discussion

87

Calcul de la variance de fid


elit
e interm
ediaire relative et de la variance totale
relative, coefficient de variation
Les formules generales utilisees pour estimer la variance de fidelite intermediaire sont un
peu differentes des formules originales decrites (Hubert et al., 2003, 2006a,b; G.E.R.P.A.C.,
2013). Dans les articles de la SFSTP et du Gerpac, les formules sont peu expliquees et leur
origine etant lanalyse de variance nest pas mentionnee. Les formules proposees dans ces deux
documents sont tr`es differentes les unes des autres mais aboutissent au meme resultat. En
simplifiant les formules proposees, on retrouve les formules danalyse des variances proposees
precedemment. Les formules de lanalyse de variance permettent de calculer et de comparer des
variances inter et intra-groupes. Ces deux documents se basent sur des formules communes, qui
sont celles de lanalyse de variance. Cependant, ces documents ne le presentent pas ainsi.
Si le meme principe actif sert a` la fabrication du medicament et `a la preparation des
echantillons de gamme, lincertitude sur sa purete ne sera pas mise en evidence dans les manipulations de validation de methode. Pour resoudre ce probl`eme, il faut utiliser un lot different du
principe actif servant `a la fabrication du medicament par rapport `a celui servant `a la preparation
des echantillons de gamme. Pour une question de co
ut, en pratique, uniquement un seul lot
de principe actif est disponible pour realiser la fabrication du medicament et pour realiser
les gammes dans un laboratoire de pharmacie hospitali`ere. Dans ce cas, il faudrait rajouter
la variance de lincertitude sur la purete du principe actif. Cette incertitude est cependant le
plus souvent negligeable, donc non pris en compte en routine. Si cette difference netait pas
negligeable, il faudrait trouver un moyen de le prendre en compte en routine et lors de la validation de la methode de dosage, en reduisant par exemple les bornes limites dacceptation
du dosage. Actuellement, aucune methode ne permet de resoudre ce probl`eme. Cependant, la
teneur en principe actif `a usage pharmaceutique na theoriquement pas dincertitude importante. Ce probl`eme ne devrait donc jamais se poser dans une PUI de pharmacie hospitali`ere.
Parfois, lors de la validation de methode de dosage, certaines manipulations ne peuvent
pas etre realisees plusieurs fois, ce qui requiert certaines simplifications lors de la realisation
de la validation de la methode de dosage. Cest le cas par exemple de la pesee dun principe
actif co
uteux. Il peut etre decide de realiser une seule pesee servant `a la fabrication des trois
medicaments. Dans ce cas, la variance de lincertitude de la pesee du medicament est rajoutee
dans le calcul de la variance totale pour permettre une meilleure estimation de la variance totale
reelle du dosage.
La variance du biais est prise en compte par la SFSTP et par lEURACHEM mais elle nest
pas prise en compte par le GERPAC (Hubert et al., 2003, 2006a,b; G.E.R.P.A.C., 2013; Ellison
et Williams, 2012). Il est difficile de trouver des details et des explications sur ce point. Seul
lEURACHEM parle de la variance du biais dans la description des calculs. IL a ete decide de
prendre en compte la variance du biais dans les calculs realises.

88

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

Calcul de lintervalle de confiance relatif


Pour faire ces calculs, les recommandations de la SFSTP ont ete suivies. Les tableurs ont
ete valides en reprenant les valeurs parmi les exemples donnes par la SFSTP.(Hubert et al.,
2003, 2006a,b). Dans le calcul de la valeur t limite du test de Student, il est necessaire de
faire le choix du pourcentage de valeurs en dehors de la limite. 10 % en bilateral soit 5 % de
chaque cote ont ete choisis comme valeur de t limite du test de Student. 5 % aurait ete plus
conforme `a lhabitude mais il risque detre trop restrictif pour des medicaments prepares en
pharmacie hospitali`ere. Lidee de depart est de fixer une limite large meme sil faut par la suite
la restreindre.
Le calcul du nombre du degre de liberte a ete simplifie en remplacant les nombres de series
et de repetitions par leurs valeurs reelles, et la valeur du nombre du degre de liberte est arrondi
`a une decimale. En effet, dans le tableur, le calcul t limite est realisable avec des valeurs de
degre de liberte non entier.
Le calcul de lecart relatif de lintervalle de confiance est realise en utilisant une formule
classique de statistique : il sagit du calcul dun intervalle de confiance pour une nombre dessais
inferieur `a trente, cest `a dire en utilisant la valeur t limite de la loi de Student.
Calcul de la capabilit
e (voir figure 2.7)
Le calcul de la capabilite est realise `a laide des estimations obtenus precedemment du biais
et de la variance totale, en prenant comme mod`ele le GERPAC (G.E.R.P.A.C., 2013).
Calcul du pourcentage dans lintervalle , OCC
Les OCC (operating characteristic curves), sont des outils graphiques correspondant `a des
courbes de niveaux de risque sur lesquelles peuvent etre placees graphiquement les methodes
en fonction des resultats de validation. La courbe de niveau 5 % est une courbe en dessous
de laquelle le risque de generer un resultat faux negatif est inferieur `a 5 %. Ces courbes de
niveau sont construites en prenant en compte le biais de fidelite intermediaire, le coefficient
de variation de repetabilite et les limites fixees, au del`a desquelles le resultat du dosage est
non conforme. Concernant la validation de methode en pharmacie hospitali`ere, les probl`emes
generes par lutilisation de ces courbes de niveaux sont (De Fontenay et al., 2011) :
1. Elles sont `a redefinir si les limites fixees changent.
2. Elles sont approximatives.
3. Elles sont valides pour un nombre dessais devant etre superieur `a trente.
Chaque courbe represente un seuil de performance de la methode de dosage. Au lieu de
representer la methode de dosage sous forme dun point sur un graphique, pourquoi ne pas
calculer le risque de generer un faux negatif et de le confronter `a ce seuil ? Lavantage serait

2.4 Discussion

89

davoir une methode moins approximative, de prendre en compte le fait que le nombre dessais
est inferieur `a trente en remplacant la loi normale par la loi de Student, tout en prenant en
compte dans le calcul les limites dacceptation du dosage fixees. De plus lutilisation de la variance totale incluant la variance du biais permet une estimation plus compl`ete que celle faite par
le GERPAC (G.E.R.P.A.C., 2013). Ce nouveau crit`ere de validation a aussi lavantage detre
facile `a analyser.
Pour realiser ce calcul, il faut se baser sur le biais de fidelite intermediaire, le coefficient de
variation total et les limites fixees, au del`a desquelles le resultat du dosage est non conforme.
Toutes ces donnees ont dej`a ete determinees precedemment. Lobjectif est de savoir quelle proportion se situe entre les deux bornes correspondant aux limites fixees. Il faut rechercher la
proportion de resultats au dessus de la limite superieure et en dessous de la limite inferieure.
La population suit une loi de Student avec une moyenne representee par le biais et un ecart-type
represente par la racine carre de la variance totale. La lecture dans la table de Student permettrait de lire ces deux proportions, mais une formule du tableur est utilisee pour automatiser
le calcul.
Le risque de generer un faux negatif peut etre directement confronte `a la limite que lon
sest fixee. Il ny a plus besoin de confronter cette valeur `a des courbes de niveaux.

2.4.11

Prise de d
ecision

Le calcul des differents crit`eres de decision permet davoir plusieurs points de vue et de
pouvoir ainsi comparer les valeurs obtenues pour ces crit`eres.Le crit`ere donnant linformation
la plus concr`ete est lestimation de la proportion de resultats qui se situe entre les deux bornes
correspondantes aux limites dacceptation fixees lors du dosage. Cest sur ce crit`ere quest
effectuee la validation de la methode de dosage.
Les concentrations maximales et minimales du mod`ele de gamme de reference (mod`ele
lineaire choisi) sont analysees. Elles doivent etre toutes les deux conformes pour valider que le
dosage peut seffectuer dune borne `a lautre.
Pour interpreter le resultat trouve, il est possible de sinspirer de la SFSTP qui decrit les
OCC comme etant la proportion de resultats qui se situe en dehors des deux bornes correspondant aux limites dacceptabilite fixees lors du dosage (De Fontenay et al., 2011). Cette
proportion peut etre utilisee comme un crit`ere de validation de la methode de dosage. La limite
dacceptabilite de ce crit`ere de validation effectue avec des cartes de controles est fixee `a 5%
dans lindustrie pharmaceutique, sachant que la variabilite du procede de fabrication nest pas
prise en compte (voir figure 1.11) (De Fontenay et al., 2011). En prenant en compte la variabilite
du procede de fabrication, il a ete decide de fixer cette limite `a 10 % en pharmacie hospitali`ere.
Cest une valeur arbitraire, mais aussi un point de depart qui pourrait etre adapte autrement
`a lavenir.

90

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

Le GERPAC classe les methodes de dosages par categorie de performance en fonction de


leur capabilite (G.E.R.P.A.C., 2013). En se basant sur ce classement, quatre niveaux de performances sont proposees en Pharmacie hospitali`ere :
1. La methode de dosage est inacceptable si moins de 90 % des resultats se situent entre
les deux bornes limites dacceptation du dosage definies. Dans ce cas, le dosage est non
valide.
2. La methode de dosage est acceptable si 90 % `a 95 % des resultats se situent entre les
deux bornes definies. Le dosage est valide de justesse `a defaut de mieux. Dans lindustrie
pharmaceutique, cette methode de dosage ne serait pas validee. Il sagit donc dun resultat
non totalement satisfaisant et il faudra surveiller les dosages en routine de facon etroite.
3. Le seuil des 95 % passe, le dosage a un bon niveau de performance. Cest la situation
ideale.
4. Un quatri`eme niveau de performance au del`a de 99 % `a ete rajoute, le dosage commence
`a devenir tr`es performant. Il nest pas forcement necessaire que les methodes de dosage
depassent systematiquement un tel niveau de performance.
Lorsquune methode de dosage est trop performante, elle nest pas necessairement la mieux
adaptee, et certaines simplifications pourraient peut etre permettre de gagner du temps lors de
leurs utilisations en routine.
Si le mod`ele de reference (mod`ele lineaire choisi avant de commencer la validation de
methode) est valide, il est possible de choisir un mod`ele qui sera utilise en routine. Il est
possible de regarder, par exemple, si les resultats sont meilleurs en incluant le zero. Si tous les
mod`eles `a un point sont valides, il sera possible de choisir de realiser la gamme `a un point en
utilisant deux points independants de meme concentration. Je pref`ere regarder tous les points
et verifier sils sont bien tous valides. Ceci afin deviter de prendre un point pour valide alors
quil ne lest peut-etre que par le hasard. De plus, le resultat est renforce si tous les mod`eles `a
un point sont valides et le risque dobtenir un resultat errone en choisissant ce type de mod`ele
est reduit.
Si la methode est non validee, ce peut etre lie `a un probl`eme degalite des variances. Si tel
est le cas, le mod`ele lineaire pondere pourrait etre valide car il reduit cette inegalite. Dans ce
cas, la methode est validee sur le mod`ele lineaire pondere et sera utilise dans ces conditions en
routine.
Si la methode nest toujours pas validee, il y a deux solutions alternatives : La premi`ere
consiste `a etendre les bornes limites dacceptation du dosage. Par exemple, il sagit de valider
la methode avec des limites fixees `a 16 % au lieu des 15 % habituels pour une preparation
magistrale. La deuxi`eme solution consiste `a valider la methode avec une proportion de plus de
10 % de resultats en dehors des limites fixees. Dans ce cas, il faudra proposer une surveillance
supplementaire de la methode de dosage lors de son utilisation en routine.

2.4 Discussion

91

Une solution demandant un peu plus de manipulations en routine serait la suivante : Il


suffit de simuler la situation o`
u le dosage est effectue deux fois consecutivement. La moyenne
des deux resultats sert de resultat final. Repeter deux fois le dosage, cest diviser par deux la
variance de repetabilite. Par exemple, repeter une infinite de fois le dosage dans des conditions
de repetabilite et en donner une moyenne, cest reduire `a zero la variance de repetabilite. Pour
simuler cette situation `a partir des calculs effectues precedemment, il suffit de diviser par deux
la variance de la repetabilite. En cas de dosage triple, il aurait suffit de diviser par trois la
variance de repetabilite. Cela devient cependant trop complique en routine de realiser trois fois
le dosage.
Si la methode de dosage nest toujours pas validee, il ny a pas dautre choix que de revenir
`a la mise au point de la methode ou de trouver une autre facon de realiser le controle terminal
de la fabrication du medicament (sous traitance, pesees des unites etc...).

Seuils de toxicit
e et dinefficacit
e
Il ne faut pas oublier un point important que sont les seuils de toxicite et dinefficacite dans
la validation de methode de dosage. Pour qun dosage soit valide il faut que le resultat du
dosage soit entre 2 limites dacceptation du dosage. Cependant, pour que le medicament soit
libere par le pharmacien il nest plus question de seuil de validation du dosage mais defficacite
et de non toxicite du medicament. Si le resultat du dosage se situe entre les deux bornes limites
dacceptation du dosage, il faut sassurer quil y ait tr`es peu de chances que la teneur en principe
actif depasse les seuils de toxicite ou defficacite.
Comme decrit precedemment, pour valider une methode de dosage il a ete choisi de travailler
sur les deux concentrations situees au niveau des limites dacceptation du dosage. Par exemple,
pour la concentration minimale, il a ete estime la proportion des resultats se trouvant entre
les limites autour de cette concentration. Ces limites sont egales aux limites dacceptation du
dosage. Si bien que la limite defficacite devrait se trouver en dessous de deux fois la limite
dacceptation du dosage par rapport `a la vraie valeur. La meme demarche est realisee pour la
limite de toxicite (voir figure 2.8).
Par exemple, pour une preparation magistrale dont le dosage a une limite dacceptation `a
10 %, le seuil de toxicite devrait etre `a plus de 120 % de la teneur en medicament prescrit.
Si les limites dinefficacite et de toxicite sont `a plus de deux fois les limites dacceptation
du dosage par rapport `a la vraie valeur, il est possible de conserver les limites dacceptation
du dosage ou de les elargir. Si les limites dinefficacite ou de toxicite sont `a moins de deux fois
les limites dacceptation du dosage par rapport `a la vraie valeur, il est necessaire de reduire les
limites dacceptation du dosage.
Par exemple : si les seuils dinefficacites et de toxicite dun medicament sont respectivement
en dessous de 70 % et au dessus de 130 %, il est possible detendre les limites dacceptation du

92

Proposition dune m
ethode alternative de validation de m
ethode de dosage
appliqu
ee `
a la pharmacie hospitali`
ere

Figure 2.8 Representation en parall`ele des limites de validation dun dosage et des limites
de validation de la methode de ce dosage.

2.4 Discussion

93

dosage `a 15 %. Dans ce cas le medicament est considere comme ayant une marge therapeutique
large.
` linverse, un medicament ayant une marge therapeutique etroite verra ses limites dacA
ceptation du dosage reduite `a 5 % voir moins si necessaire.

2.4.12

Post-validation ou finalisation

Certains crit`eres non decisionnels ne sont pas explores systematiquement. Si necessaire, ils
sont determines en fin de validation. Ces crit`eres sont la robustesse et la stabilite des reactifs
prepares extemporanement. Une fois que la methode de dosage est validee, il se pose la question
de savoir si ces crit`eres doivent etre explores.
Concernant la stabilite des reactifs, si aucun reactif nest prepare `a lavance, letude de
stabilite des reactifs nest pas necessaire. En revanche si lon veut pouvoir preparer des reactifs
`a lavance il est necessaire de valider la stabilite du dosage lorsque ces reactifs sont prepares
extemporanement. Pour cela il faut suivre les recommandations du COFRAC (C.O.F.R.A.C.,
2011).
Concernant la robustesse, en suivant les recommandations du COFRAC, il nest pas obligatoire de lestimer (C.O.F.R.A.C., 2011). Cependant toutes les donnees necessaires `a son
estimation sont dej`a calculees. Au final, il est possible de faire une estimation de la robustesse
pour presager de la stabilite de la methode de dosage dans le temps mais comme cela ne valide
pas la methode, cette estimation nest pas obligatoire.

Conclusions et perspectives

95

96

Conclusions et perspectives

Lobjectif de depart consistait `a realiser un mode operatoire permettant de valider les


methodes de dosage mises en place en PUI hospitali`eres. Pour cela, il etait envisage de selectionner
une methode de validation de methode de dosage parmi celles existant dans la litterature. Il
existe cependant trop de methodes differentes et aucun consensus, ce qui rend ce choix difficile. Dans un premier temps, ces methodes de dosage ont ete classees. Differents courants en
sont ressortis et leurs origines ont ete determinees. Ces courants ont ete analyses et compares
pour savoir lequel serait le plus adapte `a la pharmacie hospitali`ere. Les differents avantages et
inconvenients de toutes ces methodes ont rendu ce choix impossible. De plus, au sein meme
dun courant, il existe de multiples facon de valider une methode de dosage. Pour palier `a
ces probl`emes, des methodes tr`es recentes de validation de methode de dosage sinspirent de
differents courants en les associant. Ces nouvelles methodes insistent plus sur lutilisation qui
est fait de la methode de dosage en routine. Ces methodes ne sont cependant pas compl`etement
abouties. Elles sont parfois insuffisamment detaillees (manque dexemples concrets, doutils pratiques...), ce qui rend difficile leurs utilisation. Cependant, elles sont prometteuses. Jai repris
lidee dassocier les differents courants pour realiser un guide permettant de valider une methode
de dosage en pharmacie hospitali`ere en detaillant au maximum toutes les etapes.
Ce travail est rendu possible par le fait que le principe de depart des differents courants
consiste presque toujours `a determiner un biais de justesse et un ecart type de fidelite intermediaire. Il doit etre possible de tirer avantage des differentes approches, dans la realisation
dune methode de validation de methode de dosage, adaptee `a la pharmacie hospitali`ere.
Lune des principales difficultes de la validation de methode resulte dans la presentation des
calculs. Cette difficulte a ete resolue par lutilisation dun tableur, ce qui a permis dharmoniser
la validation de methode de dosage au sein dun laboratoire. De plus, cet outil pratique est
potentiellement utilisable par tous, moyennant quelques modifications propres au laboratoire
lutilisant.
La validation de methode de dosage a ete divisee en differentes etapes qui ont ete etudiees
comparativement aux connaissances apportees par chaque approche de validation de methode
de dosage. Lobjectif etait dapporter tous les avantages possibles donnes par les differentes
approches. Pour cela, la methode la plus detaillee decrite par la SFSTP a servi de base. Ont ete
rajoutees les idees importantes extraites des autres courants de pensee. Certaines modifications
sont personnelles comme par exemple lajustement sur toutes les series et non lajustement par
serie, ou bien la possibilite dajouter un coefficient de variation additionnel. Les plans de validation de methode, manipulations, calculs, des differentes approches ont ainsi ete imbriques. Les
calculs des crit`eres decisionnels de validation de methode ont ete adaptes au plan de validation.
Par exemple, la capabilite est calculee en utilisant une loi de Student (n < 30) `a la place de
la loi Normale prevue au depart pour un echantillon plus grand (n > 30). Des ajouts ont ete
proposes. Par exemple, pour une methode de dosage non valide : la simulation de la realisation
la moyenne de deux dosages dans des conditions de repetabilite en routine permet de pouvoir la

97
valider sans refaire toutes les manipulations. Des ameliorations ont surtout ete apportees dans
lanalyse du resultat afin de conclure sur la validite de la methode pour lutilisation qui en sera
faite en routine ; ou bien pour pouvoir simplifier une methode de dosage trop performante afin
de gagner en temps et en securite lors de lutilisation en routine. Un dosage requerant moins de
manipulations est moins sujet aux erreurs de dosage car il permet de realiser les dosages avec
` linverse, proposer plusieurs simulations permettant
un peu moins de contraintes de temps. A
de valider la methode de dosage dune autre mani`ere, meme plus complexe, permet de pouvoir
valider la methode de dosage sans avoir besoin de tout recommencer. Dans certains cas, le
dosage en routine sera plus long mais il sera plus performant pour etre plus adapte `a la situation. De plus, lutilisation de crit`eres decisionnels de validation de methode permet de situer
la performance de la methode relative `a son utilisation. Cela permet deviter de valider `a tort
une methode de dosage trop peu performante, ce qui etait `a lorigine de non conformites trop
frequentes pour certaines methodes de dosage. Ces non conformites entranaient des situations
decisionnelles compliquees, potentiellement dangereuses, car il etait difficile de savoir si lerreur
etait ponctuelle ou si elle etait liee `a lutilisation dune methode non adaptee. En routine, la
validation de methode utilisant un crit`ere decisionnel, permet finalement de gagner en securite.
De plus, une uniformisation de la technique de validation de methode de dosage avec
tracabilite devient de plus en plus obligatoire dans le contexte actuel dassurance qualite.
` lusage, la presence de trois crit`eres decisionnels permettra de pouvoir les comparer et
A
eventuellement den tirer des conclusions quand `a leurs utilisations.
Certains crit`eres ont ete fixes arbitrairement, comme par exemple la limite dacceptabilite
du crit`ere de validation (fixee `a 10%). En pratique, ces limites seront-elles suffisamment pertinentes ? Avec lexperience, il sera possible dajuster ces crit`eres pour permettre une meilleure
validation de la methode de dosage.
Lutilisation en routine de cartes de controle devrait permettre une comparaison de la situation reelle avec les donnees theoriques obtenues lors de la validation de la methode de dosage.
Cette comparaison permettra de verifier les resultats obtenus lors de la validation de methode,
et, si necessaire, dameliorer les calculs de validation de methode. La non utilisation de controles
connus pour la realisation de ces cartes de controle laissera neanmoins subsister un biais lors
de leur realisation. De plus, les cartes de controle servent `a la visualisation de deviation dans
le temps des resultats des methodes de dosage.
Si les resultats obtenus en routine sont le reflet de ceux obtenus par la validation de la
methode de dosage, il serait envisageable de proposer une externalisation de cette pratique
dans dautres laboratoires de pharmacie hospitali`ere, et eventuellement de sen servir dans
dautres domaines comme lindustrie pharmaceutique, la chimie analytique ou meme la biologie
medicale.

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