Bioch Prot Integre PDF

Dpartement Sciences et Technologies des
Industries Alimentaires
1re anne
BIOCHIMIE DES PROTEINES

Professeur Jean-Louis CUQ
Septembre 2006
Biochimie des protines Polytech STIA 1
page 1
I. INTRODUCTION
Les protines, macromolcules complexes qualifiables de biopolymres, sont les plus abondantes des
molcules organiques des cellules et constituent souvent plus de 50% du poids sec des tres vivants.
Elles jouent un rle fondamental dans la structure et les fonctions cellulaires et cest par elles que
linformation gntique sexprime. Elles sont intimement lies tous les phnomnes physiologiques
do leur nom substances venant en premier (en grec protos signifie premier).
Elles sont constitues par une ou plusieurs chanes polypeptidiques qui sont des copolymres
denviron une vingtaine dacides amins appartenant la srie L. Ces acides amins sont lis entre eux
par des liaisons amides : les liaisons peptidiques.
Il existe de nombreuses classifications des protines qui reposent soit sur leur composition soit sur
leurs proprits (fonctionnelles ou physicochimiques) soit sur leur forme tridimensionnelle
(conformation).
1. Terminologie fonction de la composition.

Les protines appartiennent une classe de composants organiques du vivant, celle des Protides,
composs organiques contenant C H O N (50, 7, 23, 16 %) et souvent S (0 3 %).
1.1. Protides non hydrolysables.
ils sont issus des protides hydrolysables dans des conditions bien dfinies (HCl 6N, 24 h ou plus,
110C). Il sagit de monomres : acides amins (19 couramment rencontrs).
Il est bon de mentionner que toutes les protines sont composes des mmes acides amins dont
seuls la proportion et lordre denchanement varient.
1.2. Protides hydrolysables.
1.2.1. Condensation dacides amins.
1) Peptides.
Le terme oligopeptide est rserv aux peptides de 10 rsidus au plus (dipeptides, tripeptides, ttra,
penta etc). Certains sont cycliques (tyrocidine, gramicidine etc).
Le terme polypeptide est rserv aux peptides de 100 rsidus au plus (poids molculaire voisin de
10000).
Protoses : obtenues par hydrolyse partielle des protines, hydrosolubles, non thermocoagulables,
prcipitables par une solution de NaCl sature.
Peptones : obtenues par hydrolyse partielle pousse des protines, hydrosolubles, non
thermocoagulables, non prcipitables par une solution de NaCl sature.
2) Holoprotides ou protines simples ou homoprotines.
Protine monomrique avec un nombre de monomres qui dpasse 50 100.
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Protomre sil sagit dune sous-unit dun systme oligomrique (plusieurs chanes
polypeptidiques).
La diffrenciation peptide - protine est toujours dlicate, les peptides pouvant tre considrs comme
des polymres relativement courts qui shydratent de faon rversible tandis que les protines plus
longues sont toujours structures tridimensionnellement de faon unique, les molcules deau
occupant avec des nergies leves de liaison des sites extrmement variables. Les structures
spatiales des protines (conformation) sont sensibles lenvironnement (chaleur, pH, force ionique,
solvants etc.) et changent alors de faon irrversible de forme : dnaturation.
1.2.2. Holoprotides + groupement prosthtique : htroprotides, htroprotines ou protines
conjugues.
1) Nucloprotines : combinaison avec des acides nucliques : ribosomes 50% dARN, virus 5
% dARN (mosaque tabac), nuclohistones etc.
2) Lipoprotines : liaison avec des lipides neutres, du cholestrol, des phospholipides :
lipoprotines plasmatiques avec 80 % de lipides.
3) Glycoprotines (4% glucides) et mucoprotines (>4% glucides): liaison avec un glucide
souvent du type polyoside: par hydrolyse libration de sucres amins comme lhexosamine et dacides
uroniques. Ex: mucine, orosomucode, globuline (2 % galactose + hexosamine + mannose et + acide
sialique).
4) Phosphoprotines: srine et thronine estrifies par un groupement phosphate: les casines
des laits avec environ 4% de phosphate.
5) Hmoprotines avec un groupement prosthtique porphyrinique et un mtal souvent Fe
(hmoglobine 4%, cytochrome C 4%, catalase 3,1%, myoglobine).
6) Flavoprotines avec FAD-flavine adnine dinuclotide. Ex: succinate deshydrognase 2%,
D-aminoacide oxydase 2%. Hmoprotines et flavoprotines sont qualifies de chromoprotines.
7) Mtalloprotines lies un mtal ou un sel. Ex: Cu (cruloplasmine, tyrosine oxydase 0,2
%), Zn (alcool deshydrognase 0,3 %), Fe(OH)3 (ferritine 23%), Fe (sidrophiline).
2. Terminologie fonction de la conformation.

La conformation est la forme tridimensionnelle de la protine dans lespace (ensemble des structures
primaire, secondaires, tertiaires et quaternaires).
La structure primaire correspond lordre squentiel des acides amins (rsidus) dans une protine.
La structure secondaire correspond lorganisation de la chane dans lespace selon un axe
privilgi.
La structure tertiaire correspond lorganisation spatiale de la chane poypeptidique selon les trois
dimensions.
La structure quaternaire est larrangement dans lespace de diverses chanes lies entre elles par des
liaisons non covalentes le plus souvent ou par pont disulfure.
page 3
2.1. Les protines fibreuses.

Elle sont souvent oligomriques, composes de chanes polypeptidiques assembles le long dun axe
commun, ce qui conduit la formation de fibres :
- collagne (tendons, matrice de los)
- kratine (du cuir, des cheveux, de la corne, des ongles, des plumes)
Cheveu (microscope lectronique balayage)

- lastine (tissu lastique)
- cytosquelette avec microtubules, microfilaments et filaments intermdiaires)
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Les microtubules sont de petits tubes creux forms de protines appeles tubulines. Ces tubes se
dfont et se refont constamment dans la cellule. Les microtubules sont responsables des mouvements
des cils et des flagelles de certaines cellules. Les microfilaments, plus petits, sont faits d'une protine
appele actine. Les microfilaments d'actine sont prsents dans toutes les cellules, mais ils sont
particulirement abondants dans les cellules musculaires.
Le cytosquelette forme l'armature de la cellule. Il
contribue aussi rattacher les cellules les unes aux
autres. Certaines protines de la membrane cellulaire
sont solidement rattaches au cytosquelette. Les
protines de deux cellules accoles l'une l'autre
peuvent former des liaisons entre elles reliant ainsi les
deux cellules.
- fibrone (ver soie).
2.2. Les protines globulaires.

Elles sont des protomres ou des oligomres qui forment dans lespace des structures sphriques
ou ovodes. Quelques protines possdent la fois les proprits des protines fibreuses et globulaires
(actine, fibrinogne).
Lysozyme
Hmoglobine
page 5
3.Terminologie base sur la fonction.

Les protines prsentent une extraordinaire diversit de fonction et peuvent tre ainsi classes en trois
principales catgories:
3.1. Les protines de structure.
Ces protines comme la kratine, le collagne, llastine, etc sont prsentes dans tous les tissus comme
le muscle, los, la peau, les organes internes, les membranes cellulaires et organites intracellulaires.
Leur fonction dpend de leur structure. Souvent, il sagit de protines fibreuses.
3.2. Les protines activit biologique.
Dans la nature tous les phnomnes biologiques passent un moment ou un autre par des protines.
Il est possible de citer les :
- Enzymes: plus de 2000 dcrites, activit catalytique spcifique
- Hormones: (insuline, somatotrophine, etc)
- Protines contractiles et du mouvement: (myosine, actine, tubuline , etc)
- Protines de transport dans le sang (transferrine, hmoglobine, myoglobine) ou au travers de
membranes cellulaires
- Protines protectrices: (Anticorps ou immunoglobulines, fibrinogne, thrombine)
- Protines de rserve: (ovalbumine, glycinine, gliadine, zine)
- Protines toxiques: pour lhomme (toxines botuliniques, staphylococciques, venins de serpents,
de scorpion, ricine) ou pour les microorganismes (bactriocines, antibiotiques)
- Protines didentification cellulaire
- Protines anti-nutritionnelles: (inhibiteur trypsique du soja, hmagglutinines)
- Protines allergnes.
3.3 . Protines alimentaires.
Il ne sagit pas dun groupe unique mais dun groupe compos de protines de structure ou
biologiquement actives. Il sagit de protines savoureuses, digestibles, non toxiques, conomiquement
utilisables. Elles permettent de satisfaire aux besoins en acides amins essentiels qui varient en
fonction de lge et de ltat physiologique. Le dficit protique actuel est trs grand au niveau
mondial et plus de 25 % de la population souffre de malnutrition.
4. Terminologie fonction de proprits physico-chimiques.
Cette classification des protines en fonction des proprits physico-chimiques est trs ancienne
(OSBORNE au dbut de ce sicle) est surtout applique aux protines simples.
4.1. Albumines : lactalbumine, la srumalbumine bovine, humaine, etc.
4.2. Globulines : lacto-globuline, srum-globuline, immunoglobulines, etc.
4.3. Glutlines : glutnine du bl.
4.4 . Prolamines : zine du mas, gliadine du bl.
4.5. Albuminodes ou sclroprotines: kratine, collagne; la glatine est une albuminode dnature.
4.6. Histones : nuclo-histones du thymus.
4.7. Protamines: localises dans les cellules (sturine de lesturgeon etc).
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tableau 1 . Classification des protines selon Osborne. S : soluble, I insoluble

SOLUBILITE
PROTEINES
ALBUMINES
GLOBULINES
++
++
S
GLUTELINES
PROLAMINES
ALBUMINODES
HISTONES
PROTAMINES
5. Taille des molcules protiques.

5.1. Dfinitions.
Un chapitre est consacr la dtermination de la masse molculaire des protines (chapitre V).
La masse molculaire est exprim en Dalton. Latome 12C a une masse de 12 daltons. Le dalton a
une masse de 1 g / N = 1 g / 6,02.1023 soit de 1,663.10-24 g.
Le poids molculaire est dfini comme le rapport masse de la molcule / douzime de la masse
dun atome de carbone : nombre sans dimension.
La masse molaire M est exprime en g.mole-1 et est numriquement identique une masse molaire
exprime en Dalton (pour 6,02.1023 molcules vraies).
5.2. Le poids molculaire de quelques protines.
Il varie de 5000 (10000) plus de 1 000 000. Pour les enzymes, les limites sont de 12000 106. La
chane polypeptidique de la plupart des protines comprend entre 100 et 300 400 rsidus (poids
molculaire compris entre 10000 et 40000). La SAB a 550 rsidus et la myosine 1800.
protine
poids molculaire
insuline
5 700
ribonuclase
12 600
lysozyme (blanc duf)
13 900
myoglobine
16 900
chymotrypsinogne
23 200
-lacto-globuline
35 000
hmoglobine
64 500
Srum-albumine
67 500
hexokinase
102 000
aspartate trans-carbamoylase
310 000
glutamine synthtase
592 000
complexe pyruvate dshydrognase
7 000000
virus de la mosaque tabac
4 0 000 000
micelle de casine
150 000 000
nombre de protomres
2
1
1
1
1
2
4
1
2
12
12
160
2 130
10 000
page 7
II. PROTEINES - LES ACIDES AMINES CONSTITUTIFS

1. Structure.
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des
monomres
des
molcules
protiques
comportant
au
moins
un
groupe
amin
primaire
(NH2) ou secondaire (- NH - ) et au moins un groupe carboxylique (- COOH). La fonction amine
occupe une position par rapport au groupe carboxyle. Les acides amins ont la structure suivante:
currentpoint
NH 2
NH 3 +
R
CH
2
ou mieux
CH
COO-
COOH
1
currentpoint
192837465
Proline et hydroxyproline ne rpondent pas cette structure gnrale.

2. Les principaux acides amins.
Environ 20 acides amins sont rencontrs dans les hydrolysats de protines. Dautres plus rares jouent
parfois des rles biologiques importants. Lusage en biochimie leur a attribu un nom commun,
gnralement suffixe ine, rappelant lorigine ou lune des proprits. Les acides amins peuvent
tre classs daprs la structure et les proprits de leur chane latrale, R, chane qui contribue par ses
proprits physico-chimiques, aux proprits de la protine qui les contient (figure 1 et tableau 2).
Parmi les diffrentes classifications possibles, lune des plus utilises repose sur la polarit et les
possibilits dionisation de cette chane.
2.1. Acides amins chane latrale apolaire.
2.1.1. Chane latrale aliphatique.
1 - Glycine. Il sagit du plus simple des acides amins (R = H). Son ancienne nomenclature
de glycocolle (sucre de colle) rappelle sa saveur sucre et le fait quil a t dabord isol dun
hydrolysat de glatine. Trs rpandu, commun la plupart des protines dans lesquelles il peut tre
abondant (40 % dans la fibrone de la soie).
2 - Alanine. Cest le plus simple des acides amins 3 atomes de carbone dont on peut faire
driver les autres par substitution dun ou de deux atomes dhydrogne du radical R.
3 - Valine, leucine, isoleucine.

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neg
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1
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m
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-1
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aL
p
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n
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at
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wy
m
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l12
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1
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e
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ro
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8
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x
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e
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cm
sm
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a
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D
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sg
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p
-m
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g
p
Acides amins
essentiels
1040]B
la
nutrition
de
lhomme.
4 - Proline : iminoacide driv de la pyrrolidine.
currentpoint
N
H
COOH
currentpoint
192837465
Par sa rigidit, elle joue un rle trs important dans les structures protiques.
page 8
currentpoint
Les acides amins neutres
CH 3
leucine
CH
CH 3
CH 3
HS
CH 3
isoleucine
CH 2 CH 3
CH 3
cystine
mthionine CH 3 S
alanine
CH 2
NH 2
Les acides amins soufrs

acide aspartique
valine
COOH
CH
C
COOH
a.glutamique COOH CH 2
OH
-CH3
thronine
les alcools aminoacides
Les acides amins acides
HO
srine
NH 2
C
NH (CH 2 ) 2
arginine
NH
lysine
NH 2
(CH 2 ) 3
histidine
H
N+
phnylalanine
NH
OH
tyrosine
H
tryptophane
Les acides amins aromatiques
Les acides amins basiques
currentpoi
figure 1. Structure des acides amins par rapport lalanine.
2.1.2. Chane latrale aromatique.

1 - Phnylalanine (essentielle en nutrition humaine)
%w0
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6628
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1911
1193
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2026
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5921
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2026]B
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-9.6
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x
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N
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e
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p
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1
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S
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lW
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-1
1623
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xl
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24.6
rO
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p
x
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o
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w
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1
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27
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cm
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n
st
S0
p
9
1
s
b
rO
c
xs
2CopyRight
Tryptophane
:ix
bien
que
le
noyau
indole
porte
azote
pK
lev,
il
est
considr
a
comme apolaire dans la plupart des protines dans des conditions normales de pH.
Certains des drivs du tryptophane possdent des activits physiologiques; la srotonine est un
neurotransmetteur
crbral tandis que les effets de la mlatonine restent mal connus.
currentpoint
H
CH3 O
mlatonine
CH2
CH2
N
H
NH2
srotonine
CH2
CH2
N
H
NH
COCH3
currentpoint 192837465
2.1.3. Chane latrale avec un atome de soufre.

- Mthionine. Donneuse de groupement mthyle, elle est essentielle, peu abondante, elle
est souvent limitante dans les protines alimentaires et est trs sensible aux ractions doxydation.
page 9
2.2. Acides amins chane latrale polaire.

Cette polarit partielle (- ) ou totale (+ ou -) est lie la prsence de fonctions organiques contenant
un htroatome dlectrongativit suprieure celle du carbone et de lhydrogne (O, S, N).
2.2.1. Chane latrale polaire non charge.
Ces acides amins qualifis dhydrophiles possdent une chane latrale groupement fonctionnel
capable de former des liaisons hydrogne avec des molcules comme leau (hydratation) ou avec
dautres rsidus polaires ce qui contribue la structure des molcules protiques.
1 - Srine et thronine (essentielle) possdent une fonction alcool primaire ou secondaire qui
leur permet dtre estrifies (en particulier par lacide phosphorique)
R - OH + H3 PO 4
R - O - PO3 H2 + H2 O
Les acides amins phosphoryls ionisables jouent un rle fondamental dans la technologie laitire.
2 - Tyrosine.
Elle possde une fonction phnol qui ne sionise significativement qu des pH trs levs; pH non
rencontrs en sciences des aliments (pKa ~ 10).
3 - Cystine.
La fonction thiol R - SH peut participer la liaison hydrogne, son ionisation nintervenant
galement que pour des pH levs. Par oxydation, deux molcules se condensent en cystine (pont
disulfure). Ces ponts covalents jouent un rle important dans la stabilisation des structures spatiales
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1
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3340
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3900
4920
2
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4300
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m
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-1
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0
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st
3
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53700
4060
3540
3720
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4360
3260
4320
p
145
n
0
mv
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0
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p
bd
4520
p
LB
3960
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1.2
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m
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2.25
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l-9.6
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2
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p
3679
3640
3960
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1500
5380
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4440
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1
3.375
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1
4300
0
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1
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2
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px
12
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3722
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3380
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m
8
p
6
Scientific
2.2
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m
0
1
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3
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5
180
3860
0
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l-1
g
cm
360
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a
sc
-1
2
lp
sl
dv
px
-1
0
16
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gs
24.6
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-1
p
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3721
12
r2.25
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4300
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sm
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2.2
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16
px
-1
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-2
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p
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lp
16
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cm
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p
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sm
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cm
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p
1
b
g
n
desgr
protines.
La cystine est prsente dans de nombreux tissus de protection, dans des molcules protiques fibreuses
(kratines). Elle joue galement un rle important dans lactivit de certaines enzymes.
4 - Glutamine et asparagine.
Ces acides amins possdent une fonction amide apte, par la prsence simultane doxygne et
dazote, donner deux liaisons hydrogne. Abondantes dans les protines, elles contribuent
ltablissement de liaisons intra et intermolculaires de forte nergie cumule; ces liaisons jouent un
rle dterminant dans les proprits rhologiques des ptes et gels alimentaires. La fonction amide est
facilement hydrolysable en milieu acide des tempratures voisines de 100C. Ces acides amins
jouent un currentpoint
rle important dans le transport et la mise en rserve de lazote.
NH 2
CH (CH 2 ) n
COOH
O
C
N
X et Y donneurs de liaisons hydrogne
currentpoint
192837465
2.2.2. Chane latrale polaire charge (ionisable).

Il sagit de chanes groupement carboxylique caractre acide ou caractre basique (amine,
guanidine, imidazole).
1 - Acides aspartique et glutamique sont chargs ngativement des pH voisins de 7.
2 - Lysine.
Elle est charge positivement des pH voisins et infrieurs de 7, elle est essentielle en nutrition
humaine et limitante dans de nombreuses protines dorigine vgtale.
page 10
3 - Arginine.
Son groupement guanidique peut se combiner lacide phosphorique, le driv form tant impliqu
dans les phnomnes de contraction musculaire des invertbrs. Elle intervient dans le cycle de lure.
Facilement dcompose en milieu alcalin en ure et ornithine.
4 - Histidine.
Son noyau imidazole est dune grande ractivit cause de sa structure lectronique (pKa = 6) et
participe de nombreuses ractions biochimiques et plusieurs processus physiologiques (contraction
musculaire, transmission neuromusculaire).
Les symboles lettres, les poids molculaires et certaines proprits des acides amins sont indiqus
dans le tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 . Acides amins frquemment rencontrs dans les protines
Go : hydrophobicit de la chane latrale Hlice et feuillet : S : stabilisant ; D : destructeur ; I : indiffrent
Nutrition : E : essentiel ; e : essentiel dans certains cas
nom
pKa1 pKa2
symbole
masse
"NH3 +
molaire
"COOH
3 ou 1 lettre
pKaR pI
!Go
kJ.mole-1
codon
hlice
nutrifeuillet
" -tion
alanine
ALA , A
89,1
2,35!
9,69! !
6,02
3,1
GC(U,C,A,G) S I
arginine
ARG , R
174,2
2,17!
9,04! 12,48! 10,76
3,1
AG(A,G)
I I
e
asparagine
ASN , N
132,1
2,02!
8,80! !
5,41 -0,04 AA(U,C)
D D
acide aspartique ASP , D
133,1
2,09!
9,82! 3,86!
2,97
2,25 GA(U,C)
I I
cystine
CYS , C
121,1
1,96!
10,28! 8,18!
5,07
4,2
UG(U,C)
I S
E
glutamine
GLN , Q
146,1
2,17!
9,13! !
5,65 -0,4
CA(A ,G)
S S
acide glutamique GLU , E
147,1
2,19!
9,67! 4,25!
3,22
2,3
GA(A,G)
S D
glycine
GLY , G
75,1
2,34!
9,78! !
6,06
0
GG(U,C,A,G) D I
histidine
HIS , H
155,2
1,82!
9,17! 6,00!
7,58
2,1
CA(U,C)
S D
e
isoleucine
ILE , I
131,2
2,36!
9,68! !
6,02 12,4
AU(U,C,A)
I S
E
leucine
LEU , L
131,2
2,36!
9,64! !
6,00 10,1
CU(U,C,A,G) S S
E
lysine
LYS , K
146,2
2,18!
8,95! 10,53!
9,74
6,25 AA(A,G)
I D
E
mthionine
MET , M
149,2
2,28!
9,21! !
5,75
5,45 AUG
S S
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W
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1
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70
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6400
6535
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2
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px
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-2
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p
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cm
2
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-1
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DLB
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2
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1
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valine
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1 - Hydroxyproline.
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N
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Abondante dans certaines protines comme le collagne.

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currentpoint
NH3 +
CH
COO-
OH
CH2
CH
CH2
NH2
CH2
Cet acide amin est prsent des teneurs leves dans des protines comme le collagne
(Maillard - vieillissement - rides).
page 11
3 - Lacide diaminopimlique est prsent dans des protines microbiennes ou des antibiotiques.
currentpoint
NH3 +
NH3 +
CH2
CH2
CH
CH2
CH
COO- currentpoint 192837465
COO-
4 - 3-mthyl-histidine, -N-mthyl-lysine et -N-trimthyl-lysine sont prsentes dans les protines

musculaires (viande).
currentpoint
NH3 + CH
CH2
2
CH
CH2
CH2 NH2 + CH3
COO- !N-mthyl lysine
CH3
N+
trimthyl lys
CH3
N+
CH2
N
H
CH3
NH2
CH
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CH3
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-2
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-1
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1
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-1
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m
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CH2
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(CH 2)3
CH2
NH
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N+
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CH2
desmosine
CH2
CH2
CO
CH
currentpoint
NH
192837465
3.2. Acides amins nentrant pas dans la composition de protines.

Plus de 150 acides amins ont t identifis dans le monde vivant soit sous forme libre, soit sous
forme lie. Le plus souvent, ces acides amins sous forme libre sont soit des intermdiaires
mtaboliques importants soit des mdiateurs chimiques.
1 - Ornithine et citrulline (cycle de lure).
currentpoint
NH3 +
CH2
CH2
NH3 +
CH
CH2
COO-
NH3 +
CH2
CH
COO-
ornithine
CH2
CH2
citrulline
O
NH
C
NH3 +
2 - Acides et aminobutyriques.
currentpoint
NH3 +
CH2
CH
CH3
COO-
COO-
CH2
CH2
NH2
CH2
page 12
3 - -alanine.
NH2 - CH2 - CH2 - COOH
Il sagit du produit de dcarboxylation de lacide aspartique chez les microorganismes. Chez les
animaux suprieurs elle rsulte de la dgradation de luracile. Elle participe ldification du
pantothnate (pas chez lhomme) et de deux peptides abondants dans le tissu musculaire des animaux
et de lhomme.
Il existe des dipeptides contenant de la -aminoalanine importants parmi lesquels :

%w
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P
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-ac
Acide
-aminoadipique.
HOOC (CH2)3 - CH - COOH

NH2
5 - Dihydroxyphnylalanine (DOPA).
La DOPA est implique dans les ractions de mlanognse: synthse de mlanine. Sa dficience au
niveau du noyau gris entrane
la maladie de Parkinson.
currentpoint
OH
OH
CH2
COOCH
NH3 + currentpoint 192837465
6 Thyroxine, hormone thyrodienne.

currentpoint
I
OH
I
O
CH2
COOCH
NH3 +
7 - Chloramphnicol et acide para aminosalicylique (PAS).

currentpoint
NO2
CH2 OH
CHOH CH
NH
chloramphnicol
8 - Taurine.
C
O
CHCl2
NH2
COOH
OH
acide p-aminosalicylique currentpoint 192837465
NH2 - CH2 - CH2 - SO3H
Elle est originale parce quil sagit dun -amino acide dune part et dun acide sulfonique dautre
part.Elle est synthtise partir de la cystine par lintermdiaire de lacide cystique par
dcarboxylation. Puissant modulateur neuronal et constituant de certains acides biliaires (acide
taurocholique), la taurine est partiellement limine dans lurine.
page 13
Le cerveau, la rtine, le cur, le foie, les plaquettes et les lymphocytes possdent des systmes de
transport actif extra
intracellulaire.
9 - Ciliatine.
Cest la premire
biomcule
avec
une
laison
C
-rad
P
currentpoint
%w0
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b
Isole de cilis (Tetrahymena pyriformis)
cet
aminophosphonate
est
surtout
prsent
chez
des
mollusques et invertbrs marins. Prsente dans les hutres et moules (une moule en contient plusieurs
mg) elle est mal absorbe au niveau intestinal. Le lait et la viande des animaux polygastriques en
apportent beaucoup par suite de sa synthse par des cilis au niveau du rumen. Elle se retrouve au
niveau de lurine mais aussi stocke sous forme de phosphonolipides au niveau hpatique, rnal et
crbral.
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1
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def}bind
st
gr
Db
fill
1
0
1
pp
fill
rad
SA
py
4.8
pp
DA}{270
L/mv/moveto
4
ac
neg
S
rst}]e
lW
wy
st
cm
put
0.4
0
g
gs
gr
ZLB
px
0
4
end
DT}]o
lt{pp
m
xrO
OA}{1
1
p
o
w
px
gr
2
setgray
25.8
x}if
1
cpt
a/py
-1
wb
sm}b/CB{np[{[{CS}{CS}{
0
e
-1
dv
ap
sc
0
o
eq{dL}if
p
ac
dv
gs
r}if
39
py
x
np
gr}b/In{px
xl}{xl
px
xl
m
setdash}d/cR
-1
lsc
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4
2
0
1
mv
round
e
3cp
rad
0
a
0.5
4
cv
px
-0.4
x
sCA
lW
SA
py
pp
g/cX
S}if/lp
1
0
at
sc
ix
180
lW
gg
wx
-1
1
st}{1.0
nH
Bd
1
pp
8
0
3
w
g
lp
ro}ie}b/AA{np
m/aL
sg
pp
OA}{1
ZLB
DA}{180
exec
6
0
-2
0
r2
-0.4
24.6
rO
ix
exec}b/CS{p
a/px
nac
x
1
gr}b/wD
AA}{1
L/m/mul
pp}ifelse
p
4
3
fill
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360
o
dv
p
x
xl
wb
s{nH
ac
gs
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ap
gi
-1
px
o
gr}ie}b/Cr
lp
lxgr
3
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sc
Ac}{0.5
p
w
-1
9.6
xal
lt{e}if
px
5
ne{py
aL
1
lr0
arc
py
-1
12
mv
xcm
e
gs
2
LB
-1
s/wx
dv
pp
g/cY
CA
sc
sg
pdp/c
0
1
n21.6
rm
2
18
cm
1
cX
d/w
mv
sc
rO
L/n
sm
2.2
0
dp
gs
e
s
DS
aR
fill
DA
dv
w
pp
d
13
n
0
rm
d
xc
10
-px
La
lanthionine.
Elle est prsente dans la chair decurrentpoint

la langouste (et les protines de laine) et dans des bactriocines.
COOCH
NH3
CH2
CH2
COOCH
NH3 + currentpoint 192837465
11 - La btane.
Elle est abondante dans la
betterave (Beta vulgaris).
currentpoint
COOH
CH2
N+
CH3
CH3
CH3 currentpoint
192837465
4. Strochimie.
Du fait de latome de C sp3 asymtrique, tous les acides amins (sauf la glycine) possdent deux
stroisomres (figure 2).
Dans les protines les acides amins appartiennent la srie L, ce qui ne prjuge pas de leur pouvoir
rotatoire d ou l.
currentpoint
COOH
COOH
nantiomres
NH2
L amino acide
(S sinister)
NH2
D amino acide
(R rectus)
figure 2 . Les stroisomres dacides amins

Il existe quatre acides amins constitutifs des protines qui possdent deux carbones asymtriques.
Dans ce cas le nombre de stroisomres est gal 2n soit 4.
Les isomres sont alors qualifis de diastroisomres.
Cest le cas de la thronine, de lisoleucine, de lhydroxyproline et delhydroxylysine. Ces drivs sont
qualifis de drivs allo (figure3).
page 14
currentpoint
COOH H
COOH H
H COOH NH2
H COOH NH2
NH2
NH2
%
userdict/chemdict
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L/tr/transform
xl
lpp
SA
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-1
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-8
py
np
fill
e
o
cp
5
a
wy
dp
0
In
x
6
416
24
[1
gs
4
4320
w0
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2
-1
py
1
0
cw
bW
g
-2
dp
pCopyRight
ChemDraw
8
sc
2
7
6
1
dL
gr
fill
cm
pA
m2
0
pp}{sqrt
-1
DA}{cw
/N
p
2
o
ix
dv
1
p
Ct
l58
r9160
3880
2120
4440
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2466
1620
3120
3040
3720
4640
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7140
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6180
8840
9740
8240
-9.6
2
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mv
px
sc
-2
m
p
180
cm
2
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[9
mv
0
-1
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sexec}{al
dp
o
HA}{dL
0
DSt
sm
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m
2
dv
mv
g
dp
dv
73
rO
-.6
dv
x
py
od/B{bs
Isc
WI
6
sm
b2
-1
neg
0
12
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2536
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lp
st
xl
CA
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3280
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3380
4320
3860
[19
wF
n
Ct
p
0
5
mv
p
163
0
1.2
py
LB
bd
at
p
sc
neg
a}{ex
7
a}{ex
px
st
p
gr
mv
-9.6
e
p
1986,
lm
1
arcn
Laser
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5
l2.25
cp
m
p
pp
2
-1
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ln
p
aL
neg}if/py
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mv
Iex
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gr
p
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OB
np
at
sl
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3700
N
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l0
o
p
m
3880
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mv
12
wy
fill
mv
r1
px
8
16.8
3.375
0
Ct
1
n/ex
gs
rot
n
st}{0
ro
ln
lp
counttomark{bs
py
145
90
s
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SA
80
21
bW
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ix
Prep
1987,
aR
sg
dp
gr
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-1
py
e
11
ac
sc
0.3
0.6
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px
1
DSt
ro
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8
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7
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3280]B
3620]B
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3320]B
3380]B
3700]B
3860]B
20
7960
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aL
cv
fill
m1
xn
sc
0
m1
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at
p
0
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0
3
SA
0
x
-1
py
DLB
ey
1.2
1
p
ne{bW
lbd
py
-9.6
m
gr
0
20
p
120
Ct
mt
dp
8
Cambridge
px
m
l}for
x
L/ie/ifelse
sc
m
rot
rm/w
DA}{cw
rO
n/ey
mv
rad
put
N
180
-1
gs
3700
2
bW
cm
ps13
b1
chemdict
0
-1
L/S{sf
py
ro
b1
0
1.5
121.6
0
dv
e
ac
CA
lg1
lt{-1
0
bW
p
st
180
0
-.6
2
chemdict
a
tr/dy
-1
14
sm
a}ie}b/BW{wD
0
5
dp
xbs
a}ie}b/WW{gs
aA
xac
py
lpx
0
12
SA
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dv}{bd}ie
OA}{1
gr}{gs
np
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p
e
DSt
-1
cp
dx
sc
sl
2.2
5
Ct
py
m
rot
-8
st}{Asc
8
sg
1
3
m}b/dA{[3
p
6
py
DA}{dL
5
0
[1
Scientific
rm
cm
n/dx
DLB
180
0
x/dx
L/ix/index
a
2
l-1
sc
19
24.6
lp
[23
begin
dv
type[]type
-1
p
360
g
0
px
sl
16
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dp
412
-1
ac
rsm
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mv
gs
e
2
p23
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neg
r2.25
gi
py
s
gs
0
arc
sIxarray
0
mv
2
dv/bd
sc
wF
0
-4.8
LB
9740
arc
OB
3
o180
SP
st}{0
dp
rO
al
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1
0.6
0
Ct
BW
1
p
eq{DB}{DS}ie
0.5
py
CB
e
1
0
90
begin
SA
Computing,
w
lW
pp
m
gs
wD
lSA
ac
1
ac
gs
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n/dy
S]}b/dL{dA
gr
5
rcw
px
25.8
d
2.2
lp
IL/l/lineto
2
6
cW
sc
CB
sg
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x}if
3860
2
o
eq{dp
0.5
DA}{2.25
-1
dp
16
rO
px
1
DA}{cw
end
xbegin
m
py
-1
0
s-2
cX
dv
np
np[{py
fill
bs
sg
p
1
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p
3
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dp
np
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lp
dv
l1
setgray
lx
0
ne
wy
mv
bW
lBW
e
gr
s16
0
fill
cm
DSt
24
0
cp
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p
o
-1.6
bs
0
ly
fill
arc
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neg
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0
o
sc}b/Ov{OrA
cm
g
wx
gr
l5
n
Inc.
0
pp}{2
0
1
p
5420
cm
p
L/mt/matrix
sm
px
def/b{bind
16
rO
e
w
cY
SA
dp
Db
-1
gr
2
p
m
py
mv
ne{bW
1
p
gs
cm
l27
g
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sm
2
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llp
WI
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sc
mv
gs
sm
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st
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div
sl
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1
2
sc
px
cm
m
1
cp
mt
s
bs
sm
1.6
4
3320
1.5
3
e
st}{Asc
gr}b/OB{/bS
4
p
0
270
cm
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st}{px
0
bL
w
dup
neg
py
gi
pfill}b/SA{aF
lW
lsm
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cp
p
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lSA
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sm
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bd
rO
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al
cp
lmv
AA}{1
m
ltr
2
1
e
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DSt
st
gr
fill
1
0
1
pp
fill
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SA
py
4.8
pp
DA}{270
L/mv/moveto
4
ac
neg
S
rst}]e
lW
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0.4
0
g
gs
gr
ZLB
px
0
4
end
DT}]o
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m
xrO
[18
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1
p
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w
px
gr
2
setgray
25.8
x}if
1
cpt
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-1
wb
sm}b/CB{np[{[{CS}{CS}{cB}{CW}{p
0
e
-1
dv
ap
sc
0
o
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p
ac
dv
gs
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39
py
x
np
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xl}{xl
px
xl
m
dp
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-1
lsc
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2
0
1
mv
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e
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0
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0.5
4
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px
-0.4
x
s
CA
lW
SA
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pp
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S}if/lp
1
0
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sc
ix
13
180
lW
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wx
-1
1
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Bd
1
pp
8
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3
w
g
lp
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pp
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ZLB
DA}{180
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BW
6
0
-2
0
r2
-0.4
24.6
rO
ix
exec}b/CS{p
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nac
x
1
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AA}{1
L/m/mul
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p
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3
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360
o
dv
p
x
xl
wb
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px
o
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lp
ldp
xgr
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sc
Ac}{0.5
p
w
-1
9.6
xal
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px
5
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1
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py
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mv
xcm
15
e
gs
2
LB
-1
s/wx
dv
pp
g/cY
CA
sc
sg
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0
1
n21.6
rm
2
18
cm
1
cX
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mv
sc
BW
rO
L/n/neg
sm
2.25
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dp
gs
e
s
DS
aR
fill
DA}{120
dv
w
pp
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13
n
0
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mv
dict
xcY
120
Ac}{1.0
dp
sm
1
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0
sgr
gr}{dp
n
st}{0
S
7500
0
px
9.6
1
s/wy
bb
rO
cvi/nSq
xsm
0
sg
SA
1.5
p
xl
dv
0
rlineto
360
p
rcm
m
o
px
gs
L/a/ad
d/WI{w
lp
ac
p
4
lAA}{1
e
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lnp
p
16.8
rad
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w
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dp
wF
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332
x
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sm
CA
0
0
np
eq
0
2
px
o
Ov
o
cX
gr
p
bs
sc
18
m
0
lW
sp
g
x
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p
m
lp
o
cm
D
CH3
OH OH
L THR
CH3
OH
D THR
CH3
CH3
OH
D ALLO THRcurrentpoint 192837465
L ALLO THR
figure 3 . Les diastroismres dacides amins

Les ponts disulfure ne sont ni linaires ni dans un mme plan : ils sont lorigine disomres optiques
qui imposent des contraintes striques importantes aux protines (figure 4).
currentpoint
CH2
CH2
S
CH2
CH2
S
figure 4 . Isomres optiques de la cystine

5. Proprits physiques.
5.1.
Cristallisation.
%w
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
py
np
gs
fill
e
o
cp
5
a
wy
dp
0
In
x
6
251
6014
[1
[0
26
15
0
2
bW
dp/cY
g
-2
cw
-1
CopyRight
py
1
ChemDraw
dp
p
12
1
cm
fill
pA
sc
-1
gr
DA}{cw
8
m2
0
pp}{sqrt
14
p
I2
o
1
ix
dv
pl76
1808
2400
2712
2606
2300
1862
2038
2085
2871
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2192
1764
2800
3079
3800
3920
1700
1784
2030
1869
1818
3216
2937
2854
2943
2900
3086
3126
5733
2
rlt{1
mv
-9.6
-2
m
2
p
s
px
sc
mv
cm
180
HA}{dL
1311
I0
gr}{pp}{gs
-1
dp
a}b/PT{8
sm
Ct
o
exec}{al
s{dp
dv
m
4880
g
dv
mv
84
dp
rO
dv
o
x
-.6
WI
py
-1
sc
exec
gr
sm
0
b2
neg
lp
st
12
xl
wF
np
CA
1174
5788
980
620
800
862
935
924
1109
1143
1063
1123
886
1420
1460
1053
1288
1333
1009
1069
1047
1284
1114
1160
1232
1223
1131
p
22
n
0
mv
py
0
at
p
bd
5742
p
LB
end
sc
1.2
px
gr
neg
1986,
m
a}{ex
7
mv
st
p
2.25
e
720
Laser
1
p
l-9.6
m
L/gs/gsave
larcn
OA}{1
2
clip}b/Ct{bs
p
40
-1
gs
ex
pp
aL
p
neg}if/py
n
lL/xl/translate
cp
np
sl
gr
0
at
mv
OB
2712
2606
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2109
2085
2102
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6645
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p
wy
m
st}b/HA{lW
lDSt
12
0o
mv
p
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2192
1808
1818
1855
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2931
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5624
1
3.375
px
1
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DSt
0
n/ex
1182
r8
ro
fill
mv
n
gs
145
90
SA
py
16.8
st}{0
np
lp
l1987,
1
counttomark{bs
Prep
swx
ac
sg
OB/bL
aR
ix
dp
bW
-1
bd
[27
px
py
sc
20
e
0.3
gr
ac
px
ro
DA}{dL
980]B
800]B
620]B
907]B
935]B
985]B
886]B
734]B
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rad
8
1
fill
dict
aL
at
7
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760]B
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1147]B
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m1
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n
0
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m
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2.2
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1
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fil
7
p
sc
2
D
g
c
sd
1
e1
Les acides amins sont pour la plupart cristallisables (figure 5) et les cristaux se dcomposent avant de
fondre.
currentpoint
cystine
leucine
tyrosine
figure 5 . Quelques cristaux dacides amins
currentpoint
192837465
5.2. Solubilit.
Elle varie en fonction des acides amins et est fonction de la polarit de la chane latrale.
GLY, ALA......................... bien solubles
LEU, TYR, CYSTINE............ trs peu solubles et cristallisent spontanment dans les
hydrolysats digestifs ou bactriens et dans lurine ds que leur concentration slve.
5.3. Pouvoir rotatoire.
En raison de leur carbone asymtrique, tous les acides amins (sauf la glycine) dvient le plan de la
lumire polarise.
Le pouvoir rotatoire varie avec la temprature, le pH, la nature du solvant, la force ionique, la
concentration de lacide amin. Sa mesure est ralise partir de la raie D du sodium.
La forme dextrogyre dvie le plan de la lumire polarise vers la droite et la forme lvogyre vers la
gauche. Quand les deux formes sont prsentes gales concentrations dans le mlange qualifi de
racmique, on nobserve pas dactivit optique.
Mesur par polarimtrie , exprim en degr.cm.mole, est gal :
!= !
t
"
.l . c
quation 1
page 15
l est la longueur du trajet lumineux travers la solution (en dm), c est la concentration (en g/ml) et
[]t une constante appele rotation spcifique qui dpend de la longueur donde et de la temprature
t. La rotation molaire [M]t est le produit de la rotation spcifique par le poids molculaire.
t
Si la raie D du sodium est utilise (589 et 589,6 nm) la rotation spcifique est note ! D
Avec l = 1 dm et C = 1 g/ml [ ] = [ ]tD varie selon lionisation de lacide amin (figure 6).
[!]
20
D
20
L-LEU
0
L-HIS
-20
6
20
A 20C, ! = [ ! ] D pour LEU est

gal :
+ 14,6 en milieu HCl N
- 10,7 dans l'eau
+ 7,6 dans NaOH M
10 pH
figure 6. Variation du pouvoir rotatoire d'acides amins en fonction du pH
5.4. Proprits spectrales.

5.4.1. Absorption UV.
Tous les acides amins prsentent une absorption importante aux longueurs donde infrieures 230
nm. Les acides amins aromatiques absorbent 270-280 nm (figure 7,TRP 278-280 nm, TYR 275 nm
pH acide et 280 nm pH > 10, PHE). Applications au dosage. Filtres solaires anti UV. La cystine
absorbe vers 260 nm. La loi de Beer Lambert permet donc leur dosage en UV.
A = .l.c et A = log ( Io / I )
quation 2
coefficient dabsorption molaire (molaire-1.cm-1).

= 5600 (TRP 280 nm) ; = 1400 (TYR 275 nm) ; = 200 (PHE 257 nm) ; = 4000
8000 (liaison peptidique 190 nm ; = 300 (pont S-S 250 nm).
absorbance
TRP
Acides
amins
TYR > PHE
200
300
figure 7. Spectres UV des acides amins
Longueur donde (nm)
page 16
5.4.2. Fluorescence.
Parmi les acides amins seul le tryptophane, grce la structure de son noyau indolique, est
fluorescent. Ainsi soumis un rayonnement 278 nm il met une fluorescence 348 nm (figure 8).
rponse du PM
spectre mission
! mission max
278
spectre mission
! excitation max
348
longueur d'onde (nm)
figure 8. Fluorescence du tryptophane (spectres dmission et dexcitation)
Cette proprit permet de doser le tryptophane et de juger de linfluence de son environnement : des
shiftsse produisent en fonction des groupements fonctionnels au voisinage de cet acide amin.
6. Dosage et Proprits chimiques.
La plupart des mthodes de dosage des acides amins reposent sur des proprits des fonctions
amins ou carboxyliques qui seront dcrites plus loin. Les proprits chimiques des acides amins
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SA
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3
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sc
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w
-1
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px
5
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aL
1
lr0
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py
-1
12
mv
xcm
e
gs
6060
2
LB
-1
s/wx
dv
pp
g/cY
CA
sc
sg
pdp/cY
0
1
n21.6
rm
2
18
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1
cX
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mv
sc
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L/n/neg
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2.25
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DS
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w
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DA}{90
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m
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nombreuses
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la
prsence
au
sein
mme
de
groupements
carboxyle,
amin
et de groupements varis sur la chane latrale (carboxyle, amine, alcool, amide, phnol, thiol etc).
Nous ne dcrirons que les plus importantes.
6.1. Dosage des acides amins totaux.
6.1.1. Mthode de Kjeldahl.
Aprs minralisation en milieu sulfurique, en prsence de peroxyde dhydrogne, de sulfate de
potassium et de catalyseurs (Se, Cu, Hg), lazote ammoniacal est dos par acidimtrie ou par
colorimtrie. Cette mthode est automatise et la minralisation des tempratures leves raccourcit
le temps danalyse quelques dizaines de minutes . Les ractions impliques sont les suivantes :
currentpoint
H2 SO4 +
(NH4 )2 SO4
COOH
t , Catalyseur
CH
NH2 K2SO4
NaOH
NH3
dos directement
Ractif de Nessler
CO2
+ H2 O + (NH4 )2 SO4
+ Na2 SO4 +
H2 O
entran par la
vapeur d'eau et dos
- dans l'acide borique par H 2 SO4

NH3 + H3 BO3
NH4 H2 BO3
+ H2 SO4
NH4 H2 BO3 (borate d'NH 4 )

2 H3 BO3 + (NH4 )2 SO4
- dans l'acide sulfurique par l'hydroxyde de sodium en retour
page 17
6.2.2. Autres mthodes.

Elles seront dcrites plus loin avec les proprits des fonctions des acides amins . Elles comprennent
par exemple le dosage des groupes NH2 (mthodes la ninhydrine, au TNBS, etc. ), lalcalimtrie
aprs et sans addition de formol (Mthode de Srensen), la mthode de Van Slyke (HNO2 N2), la
mthode de Folin lacide naphtoquinone sulfonique etc.
6.2. Caractrisation et dosage dacides amins sans sparation.
6.2.1. Ractions spcifiques.
Certaines de ces mthodes permettent la fois lidentification et le dosage sans sparation pralable
des acides amins ; elles portent souvent le nom du chimiste dcouvreur:
1. Spectre UV : tryptophane, phnylalanine, tyrosine, cystine.
2. Raction de Millon (nitrate mercurique et mercureux en milieu acide nitreux chaud)
donnant une coloration rouge cerise avec la tyrosine.
3. Raction dUderfriend et Cooper ( nitroso--naphtol) donnant une coloration rouge avec
la tyrosine.
4. Raction de Folin et Ciocalteu (acide phosphomolybdotungstique ) donnant une coloration
rouge avec la tyrosine.
5. Raction dAdamkiewicz - Hopkins (acide glyoxylique ou formol du commerce + acide
sulfurique concentr) : coloration violette avec le tryptophane.
6. Raction dEhrlich (para-dimthylaminobenzaldhyde en milieu acide chlorhydrique
concentr): complexe rouge avec le tryptophane.
7. Raction de Sakaguchi ( naphtol + hypobromite ou hypochlorite de sodium): coloration
rouge orange avec larginine.
8. Raction de Pauly (acide diazosulfanilique en milieu alcalin): coloration rouge avec
lhistidine.
9. Raction xanthoprotique (acide nitrique concentr au point dbullition): les ractions de
nitration des acides amins aromatiques (TYR, PHE, TRP) donnent des drivs jaunes.
10. Le nitroprussiate de sodium dans lammoniaque dilue ragit avec la cystine en donnant
des drivs rouges.
12. La raction de Sullivan (1,2 naphtoquinone-4-sulfonate de sodium et lhydrosulfite de
sodium) donne une coloration rouge avec la cystine.
12. Dcarboxylation enzymatiques spcifiques (LDC) et dosage du CO2.
13. D-amino acide oxydases.
page 18
6.2.2. Dosage microbiologique.

Il repose sur la mesure de croissance (absorbance 540 nm) de souches pour lesquelles le L amino
acide doser est un facteur de croissance (par exemple Leuconostoc mesenterodes P6O pour la Llysine).
Le dosage des acides amins aprs sparation est le plus pratiqu et permet daccder des rsultats
particulirement utiles. Les mthodes seront dcrites plus loin. La sparation est ralise le plus
souvent par chromatographie en colonne (soit dchange ionique soit en phase inverse) et un degr
moindre par chromatographie sur couche mince, sur papier, par chromatographie en phase vapeur ou
par lectrophorse (systmes capillaires).
6.3. Ionisation, proprits acido-basiques.
Il sagit dune proprit essentielle qui conditionne le comportement des acides amins en solution
puis, par gnralisation, celui des protines surtout en fonction du pH du milieu.
6.3.1. Rappels & Dfinitions.
- le point isolectrique est le pH pour lequel la charge de lion dipolaire est nulle.
- le point isoionique est le pH pour lequel le nombre de protons librs par les groupements acides est
gal au nombre de protons capts par les groupements basiques. Ces deux points sont confondus
quand lion dipolaire nchange que des protons.
En se plaant dans des systmes trs dilus nous ngligerons les interactions entre les particules en
solution.
H2O
H+ + OHH+ (ou H3+O)
pour leau 25C
[H+] [OH-] = 10-14
pH = - log [H+]
Un acide est un compos capable de cder un proton et une base un compos capable de capter un
proton.
[A-] [H+]
AH ! A- + H+
donc Ka =
[AH]
AH est un acide et A- la base conjugue : lensemble est un couple acide base dans lequel plus lacide
est fort (quilibre dplac vers la droite) plus la base conjugue est faible (tableau 3).
tableau 3. Valeurs des Ka et pKa de quelques acides
Acide
HCl
H2SO4
HSO4
H3 PO4H PO 2
base
ClHSO42
S0 -
H2PO42
HPO 4
HPO
PO4 -
CH3 COOH
CH3 COOHCO -
H2CO3
HCO 3
NH4+
OH
CH3 CH2 OH
CO3 NH3
OCH3CH20-
+ H+
Ka
>1
<1
3.10
10
pKa
-2
1,6
-2
2.10
2
-7
3,6.10
6.8
-13
1,9-10
3.10
6.10
10
-7
-11
-10
-7 10
10
-18
10
-5
12.4
4,8
6,7
10,2
10
7 10
18
page 19
Si [A-] = [AH] (A demi salification)

[AH] [H+]
Ka =
= [H+]
[AH]
Le pKa correspond au pH de demi salification de lacide faible par une base forte.
Ka =
[A-] [H+]
Alog Ka = log [H+] + log
[AH] si on prend
AH
et
- log [H+] = - log Ka+ log
AAH
on obtient
pH = pKa + log
[A-]
[AH]
quation 3
Cette relation permet le calcul approch du pH dun mlange dacide faible (AH) et de sa base
conjugue (A-) et inversement il est possible de prvoir ltat de dissociation dun acide faible
%w
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1
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g
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1
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0
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5
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cp
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m
8
p
6
Scientific
2.2
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m
0
1
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3
-8
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5
180
0
rn/dx
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g
cm
360
a
sc
-1
2
lp
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px
-1
0
16
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gs
24.6
type[]type
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p
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SP
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12
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SA
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dp
1
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p
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0
0.6
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lW
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m
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1
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pp
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sg
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2
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16
px
-1
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0
py
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np
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0
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cm
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0
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1
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1
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5840
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90
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lW
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m
gs
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lSA
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1
ac
gs
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eCA
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2
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o
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m
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np[{py
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1
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0
ne
wy
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e
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le
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o
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neg
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o
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g
wx
gr
l5
n
Inc.
0
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1
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16
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w
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1
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g
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sl
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s
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st}{Asc
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gi
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lsm
gi
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27
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rO
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al
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S
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lW
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g
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m
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N
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e
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o
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s
CA
lW
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at
sc
ix
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gg
wx
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1
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g
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-2
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ix
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ac
x
1
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p
4
3
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360
o
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p
x
xl
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gs
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ap
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o
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s
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m
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p
gr
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L/a
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g
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e
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c
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currentpoint
currentpoint
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pH = pKa
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-pour
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[A
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w
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y
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A
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1
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cw
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g
-2
dp
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8
sc
1
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fill
cm
pA
m2
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DA}{cw
p
2
o
ix
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1
p
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2540
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7020
-9.6
2
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mv
px
sc
-2
m
p
180
cm
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0
-1
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6140
3480
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dp
o
HA}{dL
sm
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m
dv
mv
g
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dv
126
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x
py
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sm
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12
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6180
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p
0
5
mv
p0
1.2
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bd
at
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4960
p
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neg
a}{ex
7
a}{ex
283
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p
gr
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-9.6
e
p
1986,
lm
1
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pp
2
-1
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ln
p
aL
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p
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sl
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p
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3480
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wy
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1
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gs
n
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ro
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s
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SA
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Prep
1987,
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sg
dp
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0.3
0.6
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px
1
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ro
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8
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5900]B
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6580]B
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sc
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m1
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p
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py
DLB
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1.2
1
p
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-9.6
m
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p
3440
120
mt
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8
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m
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x
L/ie/ifelse
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m
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-1
2
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p
p
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0
1.5
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st
180
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-.6
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aA
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12
SA
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-1
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m
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-8
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1
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p
6
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5
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cm
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DSt
DLB
180
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a
2
l-1
sc
24.6
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dv
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-1
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360
g
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sl
16
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412
-1
ac
rsm
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mv
gs
2
pbegin/version
neg
r[3
2.25
5720
gi
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s
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2
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OB
3
o180
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0.6
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p
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0.5
py
SP
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1
0
90
begin
SA
Computing,
w
lW
pp
m
gs
wD
lSA
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1
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gs
rev{neg}if
n/dy
S]}b/dL{dA
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5
6300
rcw
px
25.8
2.2
lp
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2
6
cW
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2
o
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0.5
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16
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px
1
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m
py
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cX
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np
np[{py
fill
bs
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1
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p
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cv
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23
lp
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lx
0
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bW
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gr
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0
fill
cm
24
0
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p
o
-1.6
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0
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fill
arc
g/wb
Ar
neg
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0
o
sc}b/Ov{OrA
g
wx
gr
l5
n
Inc.
0
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1
pcm
p
L/mt/matrix
sm
px
16
rO
e
w
cY
DSt
SA
dp
-1
gr
2
7
p
m
py
mv
ne{bW
1
p
gs
cm
l27
g
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at
sm
2
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lsoit
lp
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WI
ac
clippath
sc
mv
gs
sm
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st
ac
x
div
sl
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1
2
sc
px
cm
m
[4
1
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mt
s
bs
sm
1.6
4
1.5
3
e
st}{Asc
gr}b/OB{/bS
4
p
0
270
cm
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0
bL
w
dup
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py
6
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pfill}b/SA{aF
lW
lsm
gi
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0
2
ro
p
dp
st
cp
p
27
IlSA
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bd
rO
0
dv/bd
7700
cp
lmv
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m
ltr
2
1
e
def}bind
st
gr
fill
1
0
1
pp
fill
rad
SA
py
4.8
pp
DA}{270
L/mv/moveto
4
ac
neg
S
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lW
wy
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cm
put
0.4
0
g
gs
gr
ZLB
px
0
4
end
DT}]o
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m
xrO
N
OA}{1
p
o
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px
gr
2
5780
setgray
25.8
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1
cpt
a/py
-1
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0
e
-1
rot
dv
ap
sc
0
o
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p
ac
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39
py
x
np
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px
xl
m
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2
0
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e
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a
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px
-0.4
x
s
CA
lW
SA
py
DSt
pp
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S}if/lp
1
0
at
sc
ix
180
lW
gg
wx
-1
1
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Bd
1
pp
8
0
3
w
g
lp
ro}ie}b/AA{np
m/aL
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pp
OA}{1
ZLB
DA}{180
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0
-2
Db
0
r2
-0.4
24.6
rO
ix
exec}b/CS{p
n]N
ac
x
1
gr}b/wD
AA}{1
L/m/mul
pp}ifelse
p
4
3
fill
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360
o
dv
p
x
xl
wb
1
s{nH
ac
gs
dx
ap
gi
-1
px
lp
lxgr
3
def}b/d/def
a
sc
Ac}{0.5
p
w
-1
9.6
x
al
lt{e}if
px
5
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1
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12
mv
xcm
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LB
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pp
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sg
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0
1
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cm
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cX
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mv
sc
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0
dp
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w
pp
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n
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mv
dict
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n
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360
p
rcm
m
o
px
gs
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d/WI{wx
lp
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w
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dp
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a
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dx
0
d/aF
ssg
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0
np
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o
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gr
p
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sc
180
m
0
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px
mv
m
p
lp
o
cv
mv
DA}
st
arc
opy
dv
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cm
0
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bL
3
e
o
cm
m
10
at
d
ac
c
-1
p
g
iY
lW
L
dg
p
9
1
e
log
=
-cm
2def/b{bind
=
soit
[A
=
1ogr}ie}b/Cr{0
%
100
Pour une constante de dissociation basique Kb

H2O
NH3
NH4+
H+
acide
NH4+
OH-
ou
NH3
+
base
conjugue
Ka.Kb = Keau = 10-14

pKa + pKb = 14
6.3.2. Les deux ionisations des acides amins.

Les acides amins
possdent une fonction carboxylique protonisable
currentpoint
O
O
C
base conjugue O
O H
acide
+ H+
et une fonction
amine pouvant fixer un proton par liaison coordinative
currentpoint
H
base
N+ H
+ H+
N:
H
acide conjugu
En solution un acide amin peut se prsenter sous trois formes (la forme neutre est le switterion):
currentpoint
NH3 +
R
page 20
NH3 +
K1
CH
+ H+
CH
K1
A+
K1 =
COOK2
+ H+
A H+
A+
K2 =
+ H+
CH
COO-
COOH
soit
NH2
K2
A-
H+
A- H+
A
ce qui conduit :
K 1 K2 = H + 2
AA+
au pHi on a [A-] = [A+] do K1K2 = [H+]2 soit encore:
pHi = 1 pK1 + pK2

2
quation 4
Si on reprsente le pourcentage de dissociation en fonction du pH on a (figure 9):
dissociation COOH
NH 3+
COO- + H +
NH2 + H +
50 %
50 %
0%
1
0%
pK 1
pK2
pH
zone isollectrique
dissociation NH 3+
COOH
100 %
100 %
12
figure 9. Pourcentage dionisation des fonctions acides amins en fonction du pH
La courbe de titrage de la glycine est la suivante (figure 10):

pH
12
NH3+ Cl CH2
COOH
NH3+
CH2
+ H + Cl COO-
pK2
+ HCHO
pHi
NH3+
+ NaOH
COO-
CH2
pK1
ml HCl
figure 9. Courbe de titrage de la glycine
NH2
+H2O
CH2
COO- Na+
ml NaOH
page 21
Tous
les
acides
amins
qui
la
glycine,
ne
possdent
quun
COOH
et
un
NH
ont
leur
pH
situ
%w
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
py
np
gs
fill
e
o
cp
5
a
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dp
0
In
x
6
447
2120
[1
[0
gr
0
2
bW
dp/cY
g
-2
cw
-1
CopyRight
py
1
ChemDraw
dp
p
Iend
1
cm
fill
pA
sc
-1
gr
DA}{cw
8
m2
0
pp}{sqrt
p
2o
1
ix
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l24
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2
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2
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sc
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0
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o
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m
g
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1
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m
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1
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DLB
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pp
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p
sc
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DA
g/
cm
sm
dp
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1A
m
1
d
2
im/aL
entre 5 et 6,5 et ils sont qualifis de neutres.
Avec lacide glutamique il y a 3 dissociations mais pas de zone isolectrique car pK1 et pK2 sont trs
voisins
(figure11)
currentpoint
K1
KR
K2
A + H+
A + H+
A+
A = + H+ currentpoint 19
pH
pK 2
10
8
6
pK R
4
pHi
pK1
ml d'HCl
V/2
V'/2
ml d'hydroxyde de sodium
figure 11. Courbe de titrage de lacide glutamique
A H+
A= H+
K2 =
A
A
au pHi on a autant de charge + que de charges - soit :
[A+] = [A] + [A2-] / 2 (puisque une mole amne 2 charges) ; (A a une charge nulle)
K1 =
A H+
A+
KR =
Pour que A+ existe , il faut que le pH soit bas ce qui conduit pH << pK2 soit H+ >> K2
A H+
=
K1
KR A
H+
K2 A
2 H+
quation 5
A partir de A de lquation de KR on tire :

K . A
A = R +
H
On remplace dans le 3me terme de (quation 5) et on a
A H+
=
K1
H+
K1
KR
H+
KR A
H+
K2 .KR. A
2 H+ 2
soit
+ K2 .KR.
2 H+ 2
K2 est gal 10-9,7 et on sait quil faut H+ >> K2 ; le terme en / [H+]2 est ngligeable et on a :
H+
=
K1
KR
H+
H + 2 = KR K1
pHi = 1 pKR + pK1

2
quation 6
page 22
Importance de lionisation.
Les acides amins sont des ampholytes qui en fonction du pH environnant se comporteront soit
comme des acides faibles (donneurs de protons) soit comme des bases faibles (accepteurs de protons).
Dans une solution leur charge sera donc directement lie au pH.
Les acides amins sont solubles dans leau et peu solubles dans les solvants organiques.
Pour doser un acide amin il est donc possible de doser soit le carboxyle soit lamine. Lexamen de
la courbe de titrage montre quen milieu aqueux les points quivalents aux pH extrmes et les zones de
%virage
userdict/chemdict
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lpp
SA
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-1
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-8
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LB
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m
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p
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g
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m
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g
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-1
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S
1
p
B
g
p
sont
peu
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Le formol en excs (mthanal) se fixe sur la fonction amine.
currentpoint
COOR
COO+ 2 HCHO
CH
CH
CH2 OH
NH+
NH3 +
CH2 OHcurrentpoint
Lamine tertiaire obtenue a un pKa gal environ 6,2 ce qui permet le dosage par la soude (formol
titration ou mthode de dosage de Srensen). Dans ces conditions le pHi du N-dihydroxymthyl
glycine form est alors gal 4,3 et le point quivalent basique 8 ce qui est dtectable facilement en
pH-mtrie. Certains auteurs attribuent laction du formol la formation dune imine.
En milieu trs acide ou alcalin, les acides amins sont salifis.
Les sels alcalins (ex glutamate de sodium) sont en gnral bien solubles et les mlanges acides
amins-hydroxyde de sodium sont de bons mlanges tampons.
Les sels acides (chlohydrate de lysine) sont moins solubles et facilement cristallisables (puret
excellente).
2
1p
/gr/grestore
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A
1
8
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p
s
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95
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1
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b1
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p
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1
o
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lp
L
Avec les cations bivalents, les acides amins forment pH alcalin des chlates stables, souvent
colors et peu solubles dans leau.
currentpoint
O
C OR
:NH2
Cu++
CH
H2 N:
CH R
chlate de cuivre
O- C
O
currentpoint
19283746
Les ractions chimiques caractristiques des acides amins sont celles de leurs groupements
fonctionnels ( carboxyle, amin et chane latrale); ces ractions sont utiles dans la biochimie des
protines pour :
- doser individuellement les acides amins prsents dans des hydrolysats de protines
- dterminer la squence
- identifier dans des protines natives les acides amins impliqus dans lexpression dune
fonction biologique
- modifier de faon contrle des aminoacides
- synthtiser des peptides .
page 23
6.4. Proprits des groupements carboxyles.

6.4.1. Formation de sels en prsence de bases.
6.4.2. La fonction acide est estrifiable par des alcools.
Ainsi les esters mthyliques (obtenus en milieu acide) sont volatils et permettent des dosages par
%w
userdict/chemdict
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phase
vapeur.
drivs
trimthylsilils
ou
trifluoroactyls
sont
estrifis
par
du 1-butanol en milieu acide chlorhydrique.

currentpoint
O
C
R
OH
CH
C
+ CH3 OH
CH
H3 N+
CH3
+ H2 O
H3 N+
currentpoint
19283
Par ailleurs ces esters sont synthtiss pour protger les carboxyles au cours de la synthse chimique
des peptides.
6.4.3. En prsence de pentachlorure de phosphore ou de chlorure de thionyle ( SOCl2) des
%w
userdict/chemdict
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lpp
SA
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-8
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e
o
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0
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x
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[1
[0
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0
2
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-2
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-1
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1
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4
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0
1
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-1
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8
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0
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2
o
1
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7460
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2
0
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o
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m
g
dv
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-1
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0
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p
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at
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wy
m
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1
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n
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1
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-9.6
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DA}{cw
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m/w
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b1
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0
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gs
e
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2.2
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N
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w
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Ip
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ZLB
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ap
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1
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chlorures
dacide
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(Il est dabord ncessaire de protger le groupement amin par actylation).

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19
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-1
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1
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1
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-0.4
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3
0
1
w
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ix
-1
def}b/d/
1
360
rO
0
pp}ifels
4
n
24.6
o
xo/cX
x
sc
-1
12
dv
ac
s{nH
gr
Ac}{0.
e
gr}ie}b
p
gi
x
p
xl
1
o
wb
dx
sc
ac
lp
L/n/
g
LB
ap
aL
lgs
CA
sg
lt{e
arc
-1
px
cm
al
rp
3
d/w
w
0
2.
9.
Bd
ne
px
5
s/
x
1
m
g
-d
p
1
lc
6.4.4. La fonction COOH peut tre rduite en alcool en prsence de borohydrure de
sodium ou de
lithium.
currentpoint
C OH
R
CH
CH2 OH
+Li BH4
H3 N+
CH
H3 N+ currentpoint
1928374
Cette raction permet lidentification de lacide amin C terminal des protines.

6.4.5. Dcarboxylation.
Cette raction est obtenue par chauffage dans un solvant inerte ou par voie enzymatique
strospcifique (enzymes tissulaires et bactriennes). La raction enzymatique est utilise pour doser
de faon slective un acide amin dans un mlange (mesure gazomtrique du CO2 dgag).
In vivo, ces ractions sont importantes, les amines formes tant soit physiologiquement actives soit
toxiques (histamine, tryptamine, cadavrine, etc).
page 24
6.4.6. Amidation
Elle peut tre ralise en prsence dammoniac.
currentpoint
O
C
R
OH
CH
C
+ NH3
NH2
CH
NH2
+ H2 O
NH2
currentpoint
192837465
Lasparagine et la glutamine sont des amides des fonctions et carboxyliques de ASP et GLU
respectivement qui sont naturellement prsentes dans la plupart des protines. Leur rle dans
ltablissement de nombreuses liaisons hydrogne coopratives contribue de faon dterminante la
structure de nombreux aliments pteux ou glifis.
%w
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L/gr/grestore
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xl
lpp
SA
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-1
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-8
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np
gs
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e
o
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0
In
x
6
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[2
[1
[0
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0
2
bW
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g
-2
cw
-1
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1
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p
3
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0
1
cm
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pA
sc
-1
gr
DA}{cw
8
m2
0
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2
o
1
ix
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2
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-9.6
-2
m
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p
s
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sc
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2
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-1
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dv
m
g
dv
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dv
o
x
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WI
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-1
sc
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sm
0
b2
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lp
st
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xl
wF
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CA
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1140
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p
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n
0
mv
py
0
at
p
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LB
sc
1.2
px
gr
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1986,
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p
l-9.6
m
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p
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n
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mv
OB
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4474
9534
p
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m
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l12
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mv
p
4474
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9534
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1820
4080
4674
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9714
8540
8240
7480
7180
6740
1
3.375
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px
1
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0
n/ex
r8
ro
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mv
n
gs
145
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py
DSt
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np
lp
l1987,
1
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-1
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m
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-9.6
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m
px
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m
8
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bW
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p
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b1
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py
g
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0
e
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1
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1413
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180
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ac
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p
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0
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SA
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gs
e
begin
m
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CB
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2.2
begin
16
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px
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1
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17
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p
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sm
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1
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12
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ne
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gs
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d
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g
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OH
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exec
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n
gs
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lp
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swx
ac
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n
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x
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1
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m
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16
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1
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m
0
py
sg
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np
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0
rx
p
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p
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24
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bW
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11
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cp
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SA
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Inc.
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0
1
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n
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m
l0
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p
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w
at
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gi
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S
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1
L/
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p
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d
g
4
sm
p
c
6.5.1. La fonction amine donne avec les acides des sels.

(Chlorhydrates
, picrates etc.)
currentpoint
O
C
R
OH
+ HCl
CH
OH
CH
NH3 + Cl- currentpoint
NH2
192837465
6.5.2. Diazotation par lacide nitreux .

La mesure
du volume dazote permet le dosage : mthode de Van Slyke.
currentpoint
O
C
R
CH
NH2
OH
+ HNO2
C
R
OH
CH
+
N N
OH
CH
OH
OH
+ N2
page 25
6.5.3. Mthylation par liodure de mthyle.

currentpoint
O
C
R
OH
+ I CH3
CH
O
C
R
OH
+ I CH3
+ HI
CH
OH
CH
+ HI
N CH3
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0
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Ov
rgr
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l4
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1
n
x
w
l
CH3
NH2
NH CH3
6.5.4. Dsamination en milieu hypochlorite.

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O
C
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O
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NH2
OH
CH
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OH
currentpoint
192837465
Cette raction permet le dosage des acides amins (mthode de Polonowski).

6.5.5. Dsamination par voie enzymatique.
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1
360
rO
0
pp}ifelse
4
n
24.6
o
xo/cX
x
sc
-1
12
dv
ac
/N
s{nH
gr
Ac}{0.5
gr}ie}b/Cr{0
p
gi
x
p
xl
1
o
wb
dx
sc
ac
lp
L/n/neg
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LB
ap
aL
lgs
CA
sg
lt{e}if
arc
-1
px
cm
al
rp
3
d/wF
0w
0
2.25
9.6
ne{py
px
5
s/wx
x
18
mv
gs
-1
dv
pp
1
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p
sc
2
py
DA}{120
g/cY
cm
sm
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0
1
Ac}{1.0
mv
1
dict
m
21.6
7
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cY
rO
DS
pp
n
120
gr
1.5
2
SA
0
rad
1mv
ssg
x
st}{0
sm
9
dy
L/a/add
sL/np/newpat
e
w
dv
0
xl
Scm
bd
3
x
dp
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s/wy
m
12
d/WI{wx
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360
N
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x
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9.6
rO
0
p
1
bb
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px
0np
m
p
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px
CA
rot
sm
o
0
rad
lp
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gr
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0
ac
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l4
sg
e
iX
px
p
16.8
np
x
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10
0
w
dx
p
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0
st
-1
cm
g
put/
L/al/
s
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mv
bs
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0
-1
sc
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fill
p
a
x
lW
py
2
ap
g
arc
o
py
m
cX
gr
dx
d/
s
0o
sc
m
b
p
c
e
m
s3
o
cspd
Les deux
types
principaux
de
dsamination
sont
les
:ly
currentpoint
dsamination oxydative qui conduit un acide ctonique selon la raction suivante :
O
C
R
H2
OH
CH
C
R
NH2
O
OH
H 2O
NH
imine
OH
C
O
+ NH3
currentpoint
192837465
Les enzymes sont strospcifiques (aminoacide oxydases). Par exemple la L-glutamate

dcarboxylase
currentpoint joue un rle biologique trs important ; elle catalyse la raction suivante:
1
+
+
ac.
!
ctoglutarique
+
NADH,H
+
NH
L-GLU
+
H
2O + NAD
30
%w0
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-1
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-8
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e
o
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5
a
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0
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6
464
5389
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gr
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2
-1
py
1
0
cw
bW
g
-2
dp
pCopyRight
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8
sc
1
0
Igr
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cm
pA
m2
0
pp}{sqrt
-1
DA}{cw
p
2
o
ix
dv
1
p
4
l87
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1420
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6540
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1735
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4257
2963
6515
6217
9375
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-9.6
2
lt{1
mv
px
sc
-2
m
p
180
cm
2
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0
-1
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4471
1720
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dp
o
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m
dv
mv
g
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sm
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-1
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0
12
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np
lp
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4480
4560
4240
4260
4580
4600
4103
4163
4444
4498
4263
4544
4283
4618
wF
n
p
0
5
mv
p
179
0
1.2
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LB
bd
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4700
p
sc
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a}{ex
7
a}{ex
px
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p
gr
mv
-9.6
e
p
1986,
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1
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p
pp
2
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p
aL
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p
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OB
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sl
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o
p
m
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mv
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4555
4500
2720
6515
6460
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7540
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fill
mv
r1
px
8
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1
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ro
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lp
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145
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1
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dp
gr
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0.3
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1
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aL
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m1
xn
sc
0
m1
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p
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0
x
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DLB
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1
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m
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0
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3
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mt
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8
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m
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x
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m
Ar
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-1
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bW
cm
p
p
sb1
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0
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0
1.5
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p
st
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0
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2
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sm
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5
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0
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5
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2
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0
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SA
10
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w
lW
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m
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1
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cW
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0
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16
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cm
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px
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2
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pp
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sc
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sc
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1
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p
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px
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m
0
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m
p
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cm
0
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cm
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10
at
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ac
cW
-1
p
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lW
L/al/
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9.6
g
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px
p
bb
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19
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sc
px
st}
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2
p
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0
n
rad
lp
2
ne
gs
2
m
rO
O
9
p
m
1
p
4
5
2
Dans le sens 1 lenzyme catalyse la dsamination de lacide glutamique. Dans le sens 2 cest
lamination rductrice de l ctoglutarate qui est catalyse.
Les aminoacide-oxydases sont des flavoprotines auto-oxydables. La L-aminoacide oxydase est une
enzyme FMN, tandis que la D-aminoacide oxydase est une enzyme FAD. Chez certains
organismes vivants lenzyme est parfois NADP+.
La transamination est un transfert direct de la fonction amine un acide ctonique. Les
enzymes impliques sont des transaminases ou amino-transfrases.
currentpoint
O
CH3
OH O
CH
+
C
OH
NH2
ALA
O
OH
(CH2 )2 C
O
acide ! cto glutarique
C
CH3 C
O
OH
+
O
OH
acide pyruvique
C OH
(CH2 )2 CH
NH2
GLU
Ces ractions sont impliques dans les synthses et les dgradations des acides amins.
page 26
6.5.6. Ractions de condensation.

La fonction amine peut ragir avec de nombreux composs pour former des drivs utiliss dans
lanalyse qualitative ou quantitative.
1) liaison avec un chlorure dacide ou un anhydride dacide.
%w
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
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RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
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np
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e
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2
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-1
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1
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1
cm
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0
pp}{sqrt
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1
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-9.6
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m
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-1
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m
g
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sc
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st
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xl
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5
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p
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py
0
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p
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m
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st
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2.25
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1
p
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m
L/gs/gsave
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p
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aL
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p
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m
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mv
p
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1
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px
1
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mv
n
gs
145
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16.8
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lp
l1987,
1
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0
1
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m
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dic
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21
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D
pp
n
1
g2
S0
r1m
s
Ainsi Fischer a ralis les premires synthses peptidiques partir de chlorures dacides.
currentpoint
O
C
OH
R CH
Cl
C
CH
NH2
NH2
OH
R CH
R
NH
C
O
NH2
+ HCl
CH
currentpoint
192837
Ce procd est utilis pour protger la fonction amine au cours de la synthse chimique de
%
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L/gr/grestore
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pp
l
SA
RA}{6
-1
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-8
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m
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1303
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0
1
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aA
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m
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2085
7305
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DLB
5
180
0
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g
5497
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1021
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dv
px
-1
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gs
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SA
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m
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0
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0
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0
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1
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1
1.5
sc
cm
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st}{Asc
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4
m
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g
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x
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p
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-1
39
wb
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SA
25.8
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DSt
dv
m
0
p
sc
r}if
-0.4
xl}{xl
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0.5
cp
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0
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sc
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0
ls4
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3
lW
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wx
a
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0
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mv
S}if/lp
1
pp
Bd
g
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st}{1.0
-1
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lW
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1
py
-0.4
m/aL
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g
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ro}ie}b
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3
0
1
w
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0
pp
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4
n
24
o
xo
x
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g
A
p
g
peptides.0
Ainsi
le
benzylchlorocarbonate
fournit
des
drivs
benzyloxycarbonyl
des
acides
amins
souvent appels drivs carbobenzoxy.
currentpoint
O
H
C
CH2 O
Cl
C
CH COOH
R
benzylchloro carbonate
CH2 O
N
H
CH COOH
R
acide amin
driv benzyloxycarbonyl
currentpoint
Quand lacylation est conduite dans des conditions douces, la configuration de latome est
conserve.
Il existe aujourdhui de nombreuses ractions chimiques de modification/dtection des acides
amins. La plupart de ces ractions ont les particularits suivantes: elles sont rapides,
stchiomtriques, et donnent des drivs dont certains sont trs stables et de dtection facile. La
sensibilit de dtection a t multiplie par un facteur 1000 en comparaison avec la dtection
ninhydrine par lutilisation de produits donnant avec les acides amins des drivs fluorescents.
2) Raction avec l O-phtaldialdhyde (OPA).
LOPA ragit froid, en prsence de mercaptothanol et en milieu alcalin avec les acides amins
%w
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
py
np
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e
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cp
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py
1
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1
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1
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d
2
pour donner des drivs isoindoliques fluorescents (ex = 340 nm, m = 455 nm).
currentpoint
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CHO
HS CH2 CH2 OH
+
N CH COOH
+ 2 H2O
NH
CH
COOH
2
CHO
R
R
currentpo
La proline et lhydroxyproline ne donnant pas directement la raction, il est ncessaire, pour pouvoir
les dtecter, de traiter les hydrolysats par de lhypochlorite de sodium. La stabilit de certains drivs
isoindoliques forms nest pas trs grande ce qui implique donc une analyse extemporane.
3) Raction avec la fluorescamine (4-phnylspiro ( furan-2(3H),1-phtalal)-3,34 dione).
La raction se fait temprature ambiante et est complte entre pH 7 et 9 en environ 1 seconde (ex =
390 nm et m = 475 nm).
page 27
currentpoint
R
O
O
COOH
CH
N
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R
OH O
+ H2 O
COOH
O
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0
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s
D
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D
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p
O
Il sagit dune raction trs sensible (seuil de dtection voisin de la pmole) qui permet des dosages de
quantits dacides amins de lordre de 0,1 nmole. La fluorescamine ne ragit pas non plus avec les
amines secondaires comme la proline ou ses drivs. Pour raliser le dosage de ces acides amins il
faut donc les transformer en amines primaires par traitement lhypochlorite ou la N-chlorosuccinimide.
4) Raction avec le chlorure de dansyle.
Ce ractif permet dobtenir des drivs sulfamides trs fluorescents.
currentpoint
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N
CH3
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CH
CH3
+ HCl
N
CH3
+
COOH
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SO
SO
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currentpoint 19
5) Raction au phnyl-isothiocyanate ( PITC ).

currentpoint
N C S
+ NH2
CH
OH-
NH C NH CH R
COOH
COOH
HCl, CH 3 NO2
S
NH
+ H2 O
O
currentpoint 1928
Le phnyl-isothiocyanate ragit avec les acides amins pour former des drivs facilement dtectables
dans lUV. Les phnyl-thiocarbamyls (PTC) sont transformables en drivs phnyl-thiohydantone
(PTH) en milieu chlorhydrique en prsence de mthyl-nitrosamine.
Cette raction est utilise pour dterminer la squence des protines (raction dEdman).
6) Raction avec le 9,fluornylmthyl-chloroformate (FMOC-HCl).
currentpoint
pH 8 , 60C
+
NH2 - R
5 min
CH2 O
C Cl
O
CH2 O
C NH R
O
currentpoint
page 28
7) Raction avec le chlorure de dabsyl.

currentpoint
CH3
N
CH3
NH2 -R
N
N
SO2Cl
CH3
pH 9
N
70C 10 min
CH3
N
N
SO2 -NH-R
currentpoint 19
8) Raction avec le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzne (raction de Sanger).
Ce ractif donne une arylation quantitative avec les amines libres. Les drivs dinitrophnyls sont
%w0
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lpp
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NO2
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0
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sc
px
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p
O
o
0
D
m
p
e
lg
1
9) Raction avec lacide 2,4,6-trinitrobenzne sulfonique (TNBS).

currentpoint
NO2
NO2
HSO3 + H N
NO2
NO2
H
CH COOH
R
NO2
H
N
NO2
CH COOH
R
+ H2SO3 currentpoint
192837465
Cette raction permet le dosage des acides amins par leur fonction amine, en particulier au cours du
contrle de ractions dhydrolyse de protines.
Il existe donc actuellement beaucoup de mthodes de dtection fluorimtrique des acides amins
(FMOC, etc). Il sagit toujours de mthodes trs performantes dont le choix est fonction de paramtres
comme la stabilit des drivs forms, la simplicit de mise en oeuvre, le cot etc. Il faut signaler que
tous les drivs dcrits (OPA, fluorescamine, dansyl) absorbent dans lUV, ce qui permet leur
dtection et leur dosage avec une sensibilit moindre que par la mthode fluorimtrique.
6.6. Ractions lies la prsence simultane des fonctions amins et carboxyliques.

En prsence doxydants comme le peroxyde dhydrogne ou lhypochlorite, les acides amins sont
dsamins et dcarboxyls avec formation daldhyde.
La ninhydrine ou hydrate de trictohydrindne permet cette raction. Il sagit nanmoins dun
ensemble de ractions complexes. Les composs colors qui apparaissent pH 5,5 aprs traitement
thermique sont variables en fonction de lacide amin ; ainsi la proline et son driv hydroxyl
donnent des drivs jaunes absorbant 440 nm, tandis que les autres acides amins donnent des
mlanges de chromognes absorbant surtout 570 nm.
Cette particularit est mise profit dans la dtection chromatographique des acides amins au cours de
leur sparation / analyse par chromatographie et raction la ninhydrine.
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page 29
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N
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H
currentpoint
192837465
6.7. Proprits des chanes latrales.

De par leur grande diversit fonctionnelle, les groupements des chanes latrales sont mme de
donner de nombreuses ractions.
6.7.1. Les fonctions hydroxyles de SER et THR peuvent tre estrifies.
Les esters phosphoriques de ces acides amins jouent un rle trs important en technologie laitire, les
casines tant des phosphoprotines. Ces acides amins sont oxyds par le priodate de sodium
(Na+IO4-) en milieu alcalin en aldhyde, acide glyoxylique, ammoniac et IO3-.
6.7.2. Les chanes latrales noyau aromatique .
Elles rendent possible des ractions de substitution. Ainsi les drivs iods de la tyrosine sont des
constituants des hormones thyrodiennes et les drivs nitrs aromatiques sont colors en jaune
(raction xanthoprotique).
page 30
6.7.3. Les fonctions thiols.

Les groupements thiols de la cystine jouent un rle fondamental dans la structure et donc lactivit
biologique des protines. Ce groupement peut soxyder en disulfure en prsence doxygne
atmosphrique, de sels de fer ou dautres agents doxydation douce.
La cystine ainsi obtenue rsulte donc dune liaison covalente entre deux molcules de cystine. Le
rsidu cystine joue un rle de pont disulfure entre chanes polypeptidiques intra ou intermolculaires;
ce pont peut tre coup par des rducteurs comme le mercaptothanol avec libration de deux
fonctions thiols.
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CH
OH
CH
SH
2
CH2
SH
CH2
SH
CH
CH2
Rducteurs
OH
mercaptothanol
dithiothritol (ractif de Cleland)
currentpoint 19283
La cystine ou la cystine sont oxydables en acide cystique stable sous laction dun oxydant fort
comme lacide performique.
currentpoint
COOH
CH CH2 SH
NH2
cystine
+ CH3
ou
COOH
COOH
CH CH2 S S CH2 CH
NH2
COOH
CH CH2 SO3 H
O
C
O OH
NH2
acide performique
acide cystique
NH2
cystine
currentpoint
La fonction thiol peut tre mesure par raction avec lacide 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoque (ractif
dEllman). Lacide thio-trinitrobenzoque jaune est dosable pH 8 412 nm.
currentpoint
COOH
CH CH2 SH
NH2
SH
NO2
C OH
O
acide thionitrobenzoque
NO2
OH C
C OH
O
O
acide 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoque
cystine
NO2
COOH
CH CH2 S
NO2
NH2
C OH
O
currentpoint
192837465
La fixation de mtaux lourds comme Mg2+, Ag+, Hg+ avec formation de mercaptides est une raction
caractristique de la fonction thiol.
192837
currentpoint
COOH
CH CH2 SH
NH2
page 31
Ag
COOH
CH CH2 S Ag
NH2
cystine
mercaptide d'argent currentpoint
192837465
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Le N-thylmalimide
ou
lacide
iodoactique
sont
des
ractifs
bloquants
de
fonction
thiol.
currentpoint
O
R
N CH2 CH3
+
O
N-thyl malimide
HS R
cystine
O
N
CH2
CH3
H
C
O
C
H
R S CH2 COOH
driv S-carboxymthyl currentpoint
ICH2 COOH
acide iodoactique
6.7.4. Hydrophobicit et hydrophilicit des chanes latrales des acides amins .

Une substance hydrophobe est une substance qui ne donne pas d'interaction avec l'eau et inversement
une substance hydrophile est un compos qui donne des interactions avec leau (phobie : peur
engendrant une fuite).
1) lhydrophobicit et got.
Si un compos hydrophobe (sans charge , sans polarit partielle) est mis dans leau, les molcules
d'eau en s'attirant (liaisons hydrogne) vont "chasser" ce compos, toutes les molcules chasses
constituant alors une phase spare de l'eau. Le phnomne est qualifi d'hydrophobicit (fuite de
l'eau).
Pour valuer cette proprit "ngative" on utilise gnralement des solvants dont la polarit est
infrieure celle de l'eau. La variation d'nergie libre de transfert d'une mole de l'acide amin de la
solution aqueuse une solution thanolique est exprime par :
G
RT
ln
S thanol
_______
S eau
o S thanol et S eau sont les solubilits de l'acide amin dans l'thanol et dans l'eau exprimes en
mole.L-1. R est la constante des gaz parfaits et T la temprature absolue, les coefficients d'activit sont
ngligs.
Si la molcule possde une structure complexe, G est une fonction additive de ses diffrentes
parties.
Ainsi, la leucine peut tre subdivise en deux parties en ce qui concerne son nergie libre de transfert
de l'eau vers l'thanol : une partie avec un "isopropyl" et une autre partie avec un groupement aminocarboxylique, groupement qui est, un hydrogne prs, analogue la glycine.
Le G pour la glycine est dtermin par l'quation, le G pour la leucine galement. La diffrence
entre les deux valeurs correspond l'nergie libre de transfert de la chane latrale de leucine.
192837
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m
bd
ne{bW
l0
120
py
8x
dp
rot
N
-9.6
put
sc
m
px
DA}{cw
rO
l}for
chemdict
m/w
mv
n/ey
rad
r-1
180
cm
bW
-1
ro
1.5
1
p
2
L/S{sf
sp
0
b1
py
g
0
1080
CA
ac
chemdict
a0
e
dv
tr/dy
0
1
l-1
lt{-1
180
sm
21.6
bs
0
p
st
2
SA
d}b/bs
-.6
aA
a}ie}b/WW{gs
x
dp
5
0
a}ie}b/BW{wD
py
ac
px
12
OA}{1
ne{bW
0
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5
sc
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-1
dx
rot
pe
st}{Asc
cp
L/ix/index
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DA}{dL
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m
8
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p
6
Scientific
2.2
py
m
0
1
x/dx
3
-8
gbegin
DLB
5
180
0
rn/dx
l-1
g
cm
360
asc
-1
2
lp
sl
dv
px
-1
0
e16
begin/version
gs
24.6
type[]type
-1
[3
p
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2
4
12
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neg}if/px
ac
gs
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p
sm
rarc
x
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LB
rpy
0
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sgi
1
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o
0
x
sc
SP
swF
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2
0
OB
4
0
rO
180
0.5
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dp
1
dy
3
gs
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-4.8
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p
Computing,
0
0.6
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lW
90
L/l/lineto
wD
3420
S]}b/dL{dA
py
SA
gs
e
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m
ac
1
w
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1
cw
pp
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CB
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sg
5px
2
6
rx}if
CA
lp
cW
2
1
sc
DA}{cw
2.2
begin
16
px
-1
25.8
rO
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e
dv
-2
o
-1
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fill
1
sg
m
0
py
sg
340
np
scX
bs
OA}{1
anp[{py
np
setgray
0
rx
p
wy
p
dp
dv
24
re
fill
gr
1
fill
dv
lp
16
lx
0
bW
lmv
scv
ne
e
L/mt/matrix
lbs
0
0o
DSt
cm
0
wx
rlineto
cp
cm
5
p
def/b{bind
0
dp
SA
arc
gr
ac
g/wb
Inc.
ly
neg
gr
0
sc}b/Ov{OrA
0
1
-1.6
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g
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m
l0
rO
16
cm
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px
w
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sm
1
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0
sm
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g
2
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gs
ne{bW
py
sl
lmv
e
sc
ac
l3
2
eq{gs
mt
WI
div
x
Ilp
cm
sm
27
ne
11.5
sc
cm
st
cp
px
st}{Asc
lW
4
m
3380
270
0bs
cm
e
1
bL
sp
ro
gi
gr}b/OB{/b
neg
or{4
dup
1.6
0
fill}b/SA{a
sm
w
st}{px
m
py
st
p
sm
0
2
SA
ldef}bind
e
L/mv/mo
SA
dp
tr
0
sm
bd
al
cp
p
lfill
AA}{1
p
dv/bd
gr
put
g/bb
rO
1040
st
cp
py
27
DA}{2
e
1
wy
st
2
lpp
gs
1lmv
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1
4
fill
ZLB
st}]e
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0
neg
0
0.4
gr
Srac
lW
cm
gr
rO
0
gm
4.8
-1
a/
se
o
DT
4
lt
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p
x
-n
s1
currentpoint
CH3
isopropyl
CH CH2
CH3
Gchane latrale
page 32
NH2
GLY
CH
COOH
currentpoint
192837465
= Gacide amin - Gglycine
Compte tenu de la strospcificit des rcepteurs protiques du got, il est observ que la plupart des
acides amins gnrent un got amer sous forme L et sucr sous forme D (le pouvoir sucrant des D
amino acides est souvent suprieur celui du saccharose). Il semble nanmoins quune bonne
corrlation existe entre lhydrophobicit de la chane latrale exprime par Go et la sensation de got
amer (tableau 4).
tableau 4. Hydrophobicit et got des acides amins
ALA
ARG
ASN
ASP
GLN
GLU
GLY
HIS
ILE
LEU
LYS
MET
PHE
PRO
SER
THR
TRP
TYR
VAL
GLU Na
* 1/2 cystine
G
J.mole-1
caractre
3100
3100
-40
2250
-400
2300
0
2100
12400
10100
6250
5450
11100
10850
170
1850
12550
12000
7050
hydrophobe
basique
polaire non ionis
polaire ionis
polaire non ionis
polaire ionis
polaire non ionis
basique
hydrophobe
hydrophobe
basique
hydrophobe
hydrophobe
hydrophobe
polaire non ionis
polaire non ionis
hydrophobe
hydrophobe
hydrophobe
polaire ionis
got
sucr
amer
acide/sucr
acide
vent/acide/sucr
sucr/sal/acide/amer
sucr
amer
amer
amer
sucr/amer
viande rtie/amer
amer
amer/sucr
sucr
sucr
amer
amer
amer
umami / acide
seuil de dtection
(g/l)
0,6
0,5
1
0,03
0,5
0,05
1,3
0,2
0,9
1,9
0,5
0,3
0,9
3
1,5
2,6
0,9
0,4
0,03
2) Hydrophilicit des acides amins et des protines.

L'hydrophilicit des acides amins libres est d'abord lie l'ionisation des fonctions -amin et carboxylique, puis la prsence sur leur chane latrale de groupements polaires ionisables ( et COOH, NH2, -OH, R-SH) ou de groupements polaires non ionisables (SER, THR, GLN, ASN). Les
pKa des groupements et carboxyliques des acides aspartique et glutamique sont respectivement
gaux 3,86 et 4,25. A des pH voisins de la neutralit ces groupes sont chargs ngativement. Par
contre, dans ces conditions les fonctions -amins et guadinine de LYS et ARG sont encore charges
positivement, leur pKa tant de 10,5 et 12,5. L'hydrophilicit lie aux chanes latrales portant des
groupements carboxyliques ou amins est donc essentiellement fonction du pH du milieu.
7. Sparation et dosage des acides amins.
Il sagit dune analyse de routine lheure actuelle mais qui reste encore complexe ; ses premiers
metteurs au point (MOORE et STEIN) ont obtenu le prix Nobel. Les intrts de telles analyses sont
trs nombreux (nutrition, technologie protique, biochimie des protines etc.). Lanalyse de la
page 33
vingtaine dacides amins naturellement prsents dans les protines ncessite dabord leur sparation
puis leur dosage. Les techniques sparatives les plus utilises sont soit de type chromatographique soit
de type lectrophortique.
Les techniques chromatographiques utilisables sont nombreuses :
Chromatographie en phase vapeur aprs formation de drivs volatils.
Chromatographie en phase liquide avec ses variantes :
- colonne dchange dions.
- colonne en phase inverse.
- couche mince.
Les techniques chromatographiques en colonne sont celles qui sont actuellement les plus utilises;
qualifies de CLHP (chromatographie liquide haute performance).
7.1. Gnralits sur la chromatographie en phase liquide et lHPLC.
Les phases stationnaires utilises donnent des interactions variables en intensit avec les diffrents
acides amins ou leurs drivs ce qui permet leur sparation. Les principaux paramtres prendre en
considration sont, trs rapidement, les suivants :
- le coefficient de distribution
Cs et Cm
K = Cs / Cm
quation 7
tant les concentrations du solut respectivement dans les phases stationnaires et mobiles.
- le volume et le temps de rtention

VR = tR . D
quation 8
dans laquelle D est le dbit et tR le temps de rtention (figure 12).
On a D = s . v avec s section rduite de la colonne et v vitesse linaire de la phase mobile.
s = s.
tant la porosit (= VM / Vt ) et s la section.
VR = VM + K . VS
quation 9
dans laquelle VM et VS sont respectivement les volumes de la phase mobile et de la phase stationnaire.
- le facteur de capacit
k = K . VS / VM
(quation 10)
k est encore gal
(VR - VM) / VM
- le temps de rtention est reli au facteur de capacit par :

tR = to (1 + k)
quation 11
- la slectivit
= ( tR2 - to ) /
( tR1 - to ) = k2 / k1
quation 12
caractrise la distance entre les sommets de 2 pics

- lefficacit dune colonne est caractrise par son nombre de plateaux thoriques N
N = 16 ( tR / )2 , avec largeur du pic sa base.
quation 13
page 34
- la rsolution
Rs = 2 ( tR2 - tR1 ) / ( 2 + 1 )
quation 13
si 1 = 2 on a Rs = 1/4 . ( - 1 / ) . ( k2 / 1+ k2 ) . N2
La sparation est complte quand Rs = 1 ( 2 % de recouvrement des pics).
- la hauteur quivalente un plateau thorique.
HEPT = L / N o L est la longueur de la colonne
quation 14
La hauteur quivalente un plateau thorique est relie au diamtre des particules de la phase
stationnaire et la vitesse de la phase mobile par les relations :
HEPT = B . dp
et
HEPT = A . vn
quations 15 et 16
A et B sont des constantes, dp est le diamtre des particules, est voisin de 1,6 et n compris entre 0,2
et 0,6.
Hauteur
des pics
to
tR1
tR2
temps
figure 12. Schma dun chromatogramme type et paramtres.
La loi de DARCY relie la perte de charge des paramtres tels que viscosit de la phase mobile ( ),
longueur de la colonne L, v vitesse linaire de la phase mobile et une constante Ko qui est gale :
P = L.v. / Ko
quation 17
Ko = ( dp2 / 180 ) . ( 3 / (1 - )2 ) , est la porosit interstitielle
LHPLC repose donc sur lutilisation de phases stationnaires dont le diamtre des particules est
infrieur 10 m (jusqu 1 m). La perte de charge est alors considrable et voisine, pour des
colonnes de 25 cm de longueur, de 300 bars avec des dp de lordre de 5 m. Cest partir de
linstant o la technologie des pompes a permis datteindre ces pressions tout en travaillant des
dbits constants (compris entre 0,5 et 2 mL.min-1) que lHPLC a pris un essor considrable.
page 35
La nature chimique des phases stationnaires sera choisie en fonction de la nature des soluts sparer.
Gnralement on choisit la nature de la phase stationnaire pour quelle soit capable de donner des
interactions avec les soluts (ioniques, polaires non ionises, hydrophobes).
Par exemple la sparation de composs de polarits voisines sera possible sur des phases stationnaires
polaires de type silice ou silice greffe polaire (possibilit dinteractions hydrogne par exemple).
Dans ce cas llution, correspondant la disparition de ces interactions sera obtenue en utilisant une
phase mobile polaire qui donnera des interactions plus fortes avec le solut que celui-ci avec la
phase stationnaire.
Dans la chromatographie dchange dions, ce sont des interactions polaires ionises entre phase
stationnaire et solut qui sont lorigine de la sparation.
De la mme faon, la sparation de soluts hydrophobes sera possible sur des phases stationnaires
hydrophobes. Dans ce cas llution sera dautant plus aise que lluant est apolaire et trs difficile
voire impossible avec de leau qui renforce les interactions solut-phase stationnaire.
7.2. Chromatographie dchange ionique et dtection post-colonne.
Ce type de chromatographie a t pendant longtemps le seul utilis pour sparer et doser les acides
amins (sa mise au point a valu ses concepteurs MOORE et STEIN le prix Nobel). Llment
essentiel dans cette approche analytique est la colonne et sa phase stationnaire.
7.2.1. Gnralits sur lchange ionique.
La phase stationnaire
est
un
support
insoluble
contenant
des
groupements
chargs.
Les
soluts
bs
%w
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
py
np
gs
fill
e
o
cp
5
a
wy
dp
0
In
x
6
54
2940
0
2
bW
dp/cY
g
-2
cw
-1
CopyRight
py
1
ChemDraw
dp
pcm
fill
pA
sc
-1
gr
DA}{cw
8
m2
0
pp}{sqrt
p
11
2
o
1
ix
dv
pl2
rlt{1
mv
-9.6
-2
m
2
p
s
px
sc
mv
cm
180
HA}{dL
1920
0
gr}{pp}{gs
-1
dp
a}b/PT{8
sm
o
92
exec}{al
s{dp
dv
m
g
dv
mv
dp
rO
dv
o
x
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WI
py
-1
sc
exec
sm
0
b2
neg
93
lp
st
12
xl
wF
np
CA
5p
n
0
mv
py
0
at
p
bd
p
1860
LB
sc
1.2
px
gr
neg
1986,
m
a}{ex
7
mv
st
p
40
2.25
eLaser
1
p
l-9.6
m
L/gs/gsave
larcn
OA}{1
2
clip}b/Ct{bs
p-1
gs
ex
pp
aL
p
neg}if/py
n
lL/xl/translate
cp
np
sl
gr
0
at
mv
OB
p
wy
m
st}b/HA{lW
l12
80
0o
mv
p1
3.375
px
1
0
n/ex
1920
r8
ro
fill
mv
n
gs
145
90
SA
py
16.8
st}{0
np
lp
l1987,
1
counttomark{bs
Prep
s
wx
ac
sg
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20
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dp
bW
-1
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px
py
sc
e
0.3
gr
ac
px
ro
DA}{dL
0.6
rad
8
1
fill
dict
aL
at
7
20
x
m1
sc
n
0
23
p
cv
SA
dp
end}b/Db{bs{dp
DLB
0eq{DD}{DS}ie
py
x
-1
1
ey
L/ie/ifelse
Cambridge
mt
1.2
gr
p
m
bd
ne{bW
l0
120
py
8
chemdict
x
dp
rot
-9.6
put
sc
m
px
DA}{cw
Ar
m
rO
l}for
m/w
mv
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rad
r-1
180
cm
bW
-1
ro
1.5
p
2
L/S{sf
sp
0
b1
b1
py
g
1860
0CA
ac
chemdict
0
e
dv
tr/dy
0
1
l0
-1
lt{-1
180
sm
21.6
bs
0
p
st
2
SA
-.6
aA
a}ie}b/WW{gs
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dp
5
0
a}ie}b/BW{wD
py
ac
px
12
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ne{bW
0
ldv}{bd}ie
5
sc
np
gr}{gs
-1
dx
rot
pe
st}{Asc
cp
L/ix/index
m}b/dA{[3
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py
m
8
2000
p
6
Scientific
2.2
py
m
0
1
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3
-8
gDLB
5
180
0
rn/dx
l-1
g
cm
360
a
sc
-1
2
lp
sl
dv
px
-1
0
16
begin/version
gs
24.6
type[]type
-1
p
sqrt
2
4
12
r2.25
neg}if/px
ac
gs
p
sm
rarc
2860
SP
x
mv
neg
LB
rpy
0
dv/bd
s
gi
1
arc
o
0
x
sc
swF
mv
2
0
OB
0
rO
180
0.5
SA
CB
dp
1
dy
3
gs
al
-4.8
st}{0
p
Computing,
0
0.6
eq{DB}{DS}ie
lW
90
L/l/lineto
wD
S]}b/dL{dA
py
SA
gs
e
begin
m
ac
1
w
lac
1
cw
pp
2000
DA}{2.25
CB
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n/dy
rev{neg}if
sg
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2
6
rx}if
CA
lp
cW
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sc
DA}{cw
2.2
begin
16
px
-1
25.8
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e
dv
-2
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x
fill
1
sg
m
0
py
sg
np
scX
bs
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np
setgray
0
rx
p
wy
p
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dp
dv
24
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fill
gr
1
fill
dv
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16
lx
0
bW
lmv
scv
ne
e
L/mt/matrix
lbs
0
0
o
cm
0
wx
rlineto
cp
cm
5
p
def/b{bind
0
Ar
dp
SA
arc
gr
ac
g/wb
Inc.
ly
neg
gr
0
sc}b/Ov{OrA
0
1
-1.6
n
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g
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m
l0
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cm
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px
gr
w
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sm
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g
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e
sc
ac
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cm
sm
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1
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sc
cm
st
cp
px
st}{Asc
lW
4
m
270
0
cm
e
1
bL
sp
ro
gi
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neg
or{4
dup
1.6
0
fill}b/SA
sm
w
st}{px
m
py
st
p
sm
0
2
SA
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e
L/mv/m
SA
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tr
0
sm
bd
al
cp
p
lfill
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ZL
st}
rad
0
ne
0
0.
gr
Srac
lW
cm
g
rO
0m
4
as
o
D
sparer contenus dans la phase mobile sont de signe oppos. Ces derniers peuvent tre changs
rversiblement avec 2940
d'autres
ions
mme
charge
sans
aucun
changement
de
la
partie
insoluble.
Les
%
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
py
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e
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1
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LB
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px
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gs
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16.8
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px
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dict
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m1
sc
n
0
23
p
cv
SA
dp
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py
x
-1
1
ey
L/ie/ifelse
Cambridge
mt
1.2
gr
p
m
bd
ne{bW
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120
py
8
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x
dp
rot
-9.6
put
sc
m
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Ar
m
rO
l}for
m/w
mv
n/ey
rad
r-1
180
cm
bW
-1
ro
1.5
p
2
L/S{sf
sp
0
b1
b1
py
g
1860
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ac
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0
e
dv
tr/dy
0
1
l0
-1
lt{-1
180
sm
21.6
bs
0
p
st
2
SA
-.6
aA
a}ie}b/WW{gs
x
dp
5
0
a}ie}b/BW{wD
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ac
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12
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ne{bW
0
ldv}{bd}ie
5
sc
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gr}{gs
-1
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rot
pe
st}{Asc
cp
L/ix/index
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DA}{dL
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m
8
2000
p
6
Scientific
2.2
py
m
0
1
x/dx
3
-8
gDLB
5
180
0
rn/dx
l-1
g
cm
360
a
sc
-1
2
lp
sl
dv
px
-1
0
16
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24.6
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-1
p
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2
4
12
r2.25
neg}if/px
ac
gs
p
sm
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2860
SP
x
mv
neg
LB
rpy
0
dv/bd
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1
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x
sc
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2
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1
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p
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0
0.6
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SA
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e
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m
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DA}{2.25
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2
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1
sg
m
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py
sg
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scX
bs
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np
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0
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p
wy
p
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gr
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dv
lp
16
lx
0
bW
lmv
scv
ne
e
L/mt/matrix
lbs
0
0
o
cm
0
wx
rlineto
cp
cm
5
p
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0
Ar
dp
SA
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gr
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Inc.
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gr
0
sc}b/Ov{OrA
0
1
-1.6
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g
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e
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m
l0
rO
16
cm
p
p
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gr
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sm
1
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gs
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g
2
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gs
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py
sl
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e
sc
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2
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mt
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x
lp
cm
sm
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ne
1
1.5
sc
cm
st
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px
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lW
4
m
270
0
bs
cm
e
1
bL
sp
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gr}b/OB{
neg
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dup
1.6
0
fill}b/SA
sm
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m
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st
p
sm
0
2
SA
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e
L/mv/m
SA
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tr
0
sm
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al
cp
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p
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1
4
fill
ZLB
st}
rad
0
ne
0
0.
gr
Srac
lW
cm
g
rO
0m
4
as
o
D
groupes ioniques fixes dterminent le type et la force de l'changeur. Leur nombre et leur accessibilit
en dterminent la capacit.
Pour des composs monovalents (ion du solut et contre-ion) le processus d'change peut tre
simplement dcrit par les quilibres suivants :
K
XY
%w
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
py
np
gs
fill
e
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cp
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cw
-1
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1
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px
sc
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cm
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m
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dp
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mv
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1860
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gr
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1986,
m
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p
40
2.25
eLaser
1
p
l-9.6
m
L/gs/gsave
larcn
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2
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gs
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pp
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neg}if/py
n
lL/xl/translate
cp
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m
st}b/HA{lW
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1920
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mv
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SA
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16.8
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lp
l1987,
1
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dict
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DLB
0eq{DD}{DS}ie
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sm
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sc
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px
-1
0
16
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gs
24.6
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-1
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p
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sc
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bL
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a
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sp
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+
+
currentpoint
change d'anions
B Y + X
B X
+ 192837465
Y
K
NM
currentpoint
+
+
currentpoint
change de cations A M + NH
A- NH+ + 192837465
M+
KXY et KNM sont les constantes d'quilibre de la raction d'change.
X- et NH+ sont les soluts , Y- et M+ sont les contre-ions.
B+ et A- sont les groupements ioniss
fixs sur la phase stationnaire.
currentpoint
currentpoint
192837465
Pour des acides on a XH
H+ + Xet des bases NH+
N + H+
Le coefficient de distribution D (rapport des concentrations du solut charg dans la phase
stationnaire sur la somme des concentrations du solut charg et non charg dans la phase mobile) sera
gal :
change d'anions
[B+X-]
DX = ________________
[X-] + [HX]
= KXY
[B+Y-]
x
[Y-]
_______
________
1+
quation 18
+]
[H
____
Ka
page 36
[A-NH+]
change de cations
DN =
[A- M+]
= KNM __________ x
[M+]
______________
[NH+]+[N]
__________
1+
quation 19
Ka
___
[H+]
D est proportionnel la constante d'quilibre de l'change (KXY, KMM) et au nombre de groupes ioniss
de la matrice ([B+], [A-].
D est inversement proportionnel la concentration en contre-ion ([Y-], [M+]) dans la phase mobile. D
est fonction du pH et du pKa.
7.2.2. Principaux types de groupements fonctionnels.
Les groupements changeurs de cations les plus utiliss dans lanalyse des acides amins sont de type
sulfonate (-SO3- ). Les groupements phosphonate (-PO32-) et carboxylate (-COO-) pour les changeurs
de cations et de type ammonium quaternaire (- NR3), tertiaire (- NHR2) ou secondaire (-NH2R) pour les
%122
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
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5177
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-1
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0.6
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4816]B
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at
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1.2
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5223
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SA
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w
lW
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m
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gs
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1
p
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SA
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m
py
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1
p
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g
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sm
2
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sc
mv
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sm
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st
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cm
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p
0
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cm
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Ct
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S
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Ct
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g
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1
st
n
B
1
C
p
8
0
3
w
g
l3
rm
s
changeurs
danions
sont
potentiellement
utilisables.
Les groupements de type sulfonate ou ammonium quaternaire sont des changeurs d'ions forts, les
autres des changeurs faibles.
La fraction charge d'changeurs de type sulfonate ou ammonium quaternaire n'est pas influence dans
une zone large de pH, tandis que les changeurs faibles prsentent des variations importantes de leurs
ionisations entre pH 4 et 8.
7.2.3.Principaux types de matrice.
Il existe des matrices de type polystyrne ou dautres polymres organiques, des dextranes, des
cellulose et des silices.
Les rsines de type polystyrne qui sont les plus utilises dans lanalyse des acides amins rsultent de
la polymrisation de vinylbenzne avec comme agent de pontage du divinylbenzne (DVB 4 8 %).
currentpoint
SO3-
SO3-
CH CH2 CH
CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH
CH2 CH CH2
DVB
-
SO3
CH
CH2 CH CH2 CH
SO3CH2
styrne
CH CH2
SO3-
currentpoint
Ces matrices de type polystyrne sont microsphriques et rsistantes aux pertes de charges leves et
ce dautant plus que leur niveau de rticulation est lev..
7.2.4. Llution en chromatographie dchange ionique.
page 37
1) Influence du pH de la phase mobile.

Avec les acides amins, on utilise une colonne changeuse de cations de type polystyrne sulfon pour
lesquelles le pKa est voisin de 1,5. Au niveau de la phase mobile, on se place initialement dans des
conditions de pH (voisin de 2) pour lesquelles tous les acides amins sont sous la forme cationique (cidessous) et donc retenus.
Aprs avoir dpos ou inject automatiquement (vanne rhodyne boucle externe ou vanne boucle
interne), les acides amins sur la colonne, llution est obtenue en utilisant une phase mobile
constitue par des tampons de pH croissants (systme gradient).
Quandgr
pH
de
la
phase
atteint
le
l'acide
amin
pralablement
fix
par
liaison
ionique
g
iCA
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1
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n
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m
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m
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lp
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dv
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lW
cm
gr
rO
0
m
4.8
-1
a/py
setgray
o
DT}]o
4
lt{pp
0
2660
end
px
x
-1
np
setdash
1px
x}if
o
w
2
cpt
gs
dv
ac
1
def/L{l
sc
p
e
[5
sm}b/
-1
39
wb
eq{dL
SA
25.8
xl
dv
m
0
p
sc
r}if
-0.4
xl}{x
ap
xx
py
0.5
cp
gr}b
0
roun
CA
I2
e
1
sc
px
0
ls4
40
4
3
lW
7
OA
wx
a
18
0
ra
L/
a
m
S
1
p
B
g
p
s-g
i
+
la phase stationnaire (rsine acide amin ) lacide amin se trouvera alors sous forme de switterion
non charg; non retenu il sera alors lu.
currentpoint
COOH
rsine
SO3 -
NH3 +
CH R
interaction ionique solut - phase stationnaire

Quand le pH de la phase mobile augmente et atteint le pHi :
%w
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
py
np
gs
fill
e
o
cp
5
a
wy
dp
0
In
x
6
53
3440
0
2
bW
dp/cY
g
-2
cw
-1
CopyRight
py
1
ChemDraw
dp
pcm
fill
pA
sc
-1
gr
DA}{cw
8
m2
0
pp}{sqrt
p
10
2
o
1
ix
dv
pl2
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mv
-9.6
-2
m
2
p
s
px
sc
mv
cm
180
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4820
0
gr}{pp}{gs
-1
dp
a}b/PT{8
sm
o
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118
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dv
m
g
dv
mv
dp
rO
dv
o
x
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WI
py
-1
sc
exec
sm
0
b2
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lp
st
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xl
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CA
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238
n
0
mv
py
0
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p
bd
p
2380
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sc
1.2
px
gr
neg
1986,
m
a}{ex
7
mv
st
p
2.25
eLaser
1
p
l-9.6
m
L/gs/gsave
larcn
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2
clip}b/Ct{bs
p-1
gs
ex
pp
aL
p
neg}if/py
n
lL/xl/translate
cp
np
sl
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p
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m
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3.375
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1
0
n/ex
4820
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mv
n
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145
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SA
py
16.8
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np
lp
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1
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sc
e
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ro
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0.6
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sc
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0
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SA
dp
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DLB
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py
x
-1
1
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Cambridge
mt
1.2
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m
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l0
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8x
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-9.6
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px
DA}{cw
Ar
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m/w
mv
n/ey
rad
r-1
180
cm
bW
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p
2
L/S{sf
sp
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b1
py
g
2360
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chemdict
0
e
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0
1
l0
-1
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180
sm
21.6
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0
p
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2
SA
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aA
a}ie}b/WW{gs
x
dp
5
0
a}ie}b/BW{wD
py
ac
px
12
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0
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5
sc
np
gr}{gs
-1
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st}{Asc
cp
L/ix/index
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m
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4880
p
6
Scientific
2.2
py
m
0
1
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3
-8
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5
180
0
rn/dx
l-1
g
cm
360
begin
a
sc
-1
2
lp
sl
dv
px
-1
0
16
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gs
24.6
type[]type
-1
p
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2
4
12
r2.25
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ac
gs
p
sm
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0
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1
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p
Computing,
0
0.6
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lW
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L/l/lineto
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S]}b/dL{dA
py
SA
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m
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1
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CA
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cW
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1
sc
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2.2
begin
16
px
-1
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dv
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m
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0
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p
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p
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gr
1
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dv
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0
bW
lmv
scv
ne
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L/mt/matrix
lbs
0
0
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cm
0
wx
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cp
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p
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0
Ar
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SA
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gr
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gr
0
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1
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m
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cm
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p
px
gr
w
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g
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gs
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lW
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m
270
0
bs
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e
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neg
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dup
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0
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p
sm
0
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e
L/mv/moveto
SA
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tr
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sm
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AA}{1
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ZLB
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p
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SA
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xl
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xl}{xl
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cp
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0
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sc
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3
rO
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p
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n
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o
x
COO
rsine
SO3 -
NH3 +
CH R
currentpoint
swittrion lu
192837465
2) Influence du type et de la concentration en contre-ion.

La constante d'quilibre de l'change reflte l'affinit du solut ionique ou du contre-ion pour
l'changeur . En gnral les changeurs d'ions ont une grande affinit pour :
les ions possdant une forte charge.
les ions avec un petit volume d'hydratation.
Il est donc possible de classer les ions en fonctions de leur affinit pour l'changeur, donc de leur
"force d'lution". Avec les rsines changeuses de cations de type sulfonate on a :
Ce3+ > Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Ca2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mn2+ > U2 O2+ > Ti+ > Ag+
> Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+.
Quand le solut et le contre ion sont compltement chargs, la pente de la droite log D(N ou X)
fonction ([contre-ion]) est en gnral gale a/b, avec a valence du solut, b valence du contre ion.
Quand la concentration en contre-ion
augmente (X-)
currentpoint
+
+
+
currentpoint
192837465
A NH + C
A- C+ + NH
on dplace l'quilibre vers la droite.
Avec les acides amins et une rsine sulfone les phnomnes principaux mis en jeu sont les
suivants :
RESINE-SO3- AA+ + OHRESINE-SO3- AA+ + Na+
RESINE-SO3-
AA (effet pH)
RESINE-SO3-Na+ + AA+ (effet sel)
page 38
3) Effet de la temprature et de solvants organiques

Si on augmente la temprature de la colonne, la rtention du solut diminue. De plus la viscosit de la
phase mobile diminue ce qui permet d'augmenter le dbit.
L'addition de solvants organiques la phase aqueuse mobile affecte la rtention. En effet, les effets
secondaires de la matrice (adsorption hydrophobe trs importante dans le cas de polystyrne et
permation) jouent un rle prpondrant dans la distribution des ions et plus particulirement des ions
organiques. Pour un mme pHi les acides amins seront lus un pH donn identique ; leur
sparation dpend alors des interactions hydrophobes quil donnent avec la phase stationnaire.
La rtention de lacide amin swittrion sera dautant plus grande que son hydrophobicit est
leve. Il est ainsi possible de sparer LEU, ILE et norLEU qui ont le mme pHi ; llution trs tardive
du tryptophane rsulte de ce phnomne.
4) Prsence dantioxydants.
La prsence dantioxydants dans les tampons dlution permet dviter loxydation de la mthionine.
Ainsi, lluant doit contenir du thiodiglycol (CH2OH-CH2-S-CH2-CH2OH) jusqu ce que la
mthionine mais aussi la cystine soient lues (la cystine est transforme en cystine en prsence de ce
compos).
5) Ralisation de llution.
Le dbit de lluant est fonction de la longueur de la colonne, du diamtre des particules de la phase
stationnaire, de la viscosit et de la temprature (rgule au niveau de la colonne par circulation deau
ou au moyen dun four). Llution peut tre obtenue :
- au moyen de dispositifs permettant de raliser des gradients de pH, de force ionique, de
concentrations en mthanol ou en thiodiglycol (dispositifs chambres communicantes).
-
au moyen de systmes pilots par ordinateur dont les gradients dlutions permettent la
sparation des acides amins.
Si le gradient est ralis avant le systme de pompage, le systme est qualifi de systme gradient
basse pression .
Une seule pompe suffit alors llution, mais il est ncessaire de bien mlanger les diffrents luants
primaires dans des systmes dont le volume mort peut constituer un handicap.
Si le gradient dlution est ralis par autant de pompes quil y a dluants primaires (au maximum 3
actuellement), le systme est qualifi de gradient haute pression. Les dbits des diffrentes pompes
sont rgls lectroniquement de telle sorte que la somme de leurs dbits respectifs soit gale au dbit
dlution choisi. Un schma de chromatogramme est donn figure13.
page 39
absorbance
ALA
SER
THR
ASP
GLY
GLU
MET
CYS
VAL
570 nm
NLEU
PHE
LEU
ILE
LYS
TYR
ARG
HIS
TRP
NH4 +
INJECTION
PRO
440 nm
temps d'lution
figure 13. Chromatogramme dacides amins (change de cations, raction post colonne ninhydrine)
7.2.5. Dtection colorimtrique en dtecteur continu ( ninhydrine ).

Les acides amins lus individuellement sont gnralement soumis en continu une raction colore
permettant leur dosage. Il sagit le plus souvent dans la chromatographie dchange ionique de la
raction la ninhydrine qui est ralise pH 5,5 en prsence de mthylcellosolve, sous azote et
chaud (cf chapitre II.6.6). Parmi les nombreux drivs qui se forment certains sont violets, dautres
jaunes ou encore rouges, leur formation dpendant entre autre de la nature de lacide amin. La mesure
de labsorbance plusieurs longueurs donde ( 570 et 440 nm ) aide l identification des acides
amins lus (figure 13).
7.2.6. Autres types de dtection post-colonne.
Il existe aujourdhui de nombreuses ractions chimiques de dtection des acides amins lus dun
systme chromatographique donn . La plupart de ces ractions ont les particularits suivantes : elles
%sont
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
py
np
gs
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e
o
cp
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1
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pcm
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p
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sm
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xl
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0
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gr
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eLaser
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p
l-9.6
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L/gs/gsave
larcn
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gs
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p
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cp
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n
gs
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SA
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np
lp
l1987,
1
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sc
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DLB
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x
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1
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8x
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px
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b1
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g
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sm
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bs
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st
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SA
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aA
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a}ie}b/BW{wD
py
ac
px
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ldv}{bd}ie
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sc
np
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cp
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g
cm
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lp
sl
dv
px
-1
0
16
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gs
24.6
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-1
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4
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0
dv/bd
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def/L{load
sc
p
esm}b/CB{np[{[{CS
-1
39
wb
eq{dL}if
SA
25.8
xl
dv
m
0
p
sc
r}if
-0.4
xl}{xl
ap
xx
py
0.5
cp
gr}b/In{px
0
round
CA
2
e
1
sc
px
0
ls4
4
3
lW
OA}{1
wx
a
180
0
rad
L/m/mul
at
mv
S}if/lp
1
pp
Bd
g
px
st}{1.0
-1
g/cX
ix
ZLB
lW
DA}{180
cv
sg
1
py
-0.4
m/aL
nH
exec
g
pp
ro}ie}b/A
a/px
gr}b/wD
pp
3
0
1
w
r6
AA}{1
8
-2
2
fill
exec}b/
lp
gs
3
ix
-1
def}b/
1
360
rO
0
pp}ife
4
n
24.6
o
xo/cX
x
sc
-1
12
dv
ac
s{nH
gr
Ac}{
gr}i
p
gi
x
p
xl
1
o
wb
dx
sc
ac
lp
L/
LB
ap
aL
lg
C
slt
a
p
cr3
d
rapides,
stchiomtriques
et
des
drivs
dont
certains
sont
stables
et
de
dtection
facile . La sensibilit de dtection a t multiplie par un facteur 1000 en comparaison avec la
dtection ninhydrine par lutilisation de produits donnant avec les acides amins des drivs
fluorescents (cF chapitre 6.5.6).
7.3. Chromatographie en phase inverse aprs drivatisation pr-colonne.
Il sagit de la mthodologie qui sest le plus dveloppe au cours de ces dernires annes et qui permet
le dosage des acides amins rendus hydrophobes par condensation avec des ractifs appropris et par
ailleurs trs facilement dtectables (par fluorimtrie le plus souvent ).
7.3.1. Gnralits sur la chromatographie dadsorption.
SNYDER (Principles of Adsorption Chromatography, M. Dekker, NY, 1968) a trait ce sujet en
dtail). Le volume de rtention d'un solut est directement li la comptition entre les molcules de
solvant M et de solut S la surface de l'adsorbant a. On admet gnralement que cette surface est
recouverte d'une couche monomolculaire constitue par des molcules de la phase mobile M et de
solut S. L'quilibre d'adsorption et de dsorption peut s'crire :
currentpoint
currentpoint
S(M) + nM(a)
S(a)
+ 192837465
nM(M)
solut
dans
phase
phase
mobile
adsorbe
solut
adsorb
phase
mobile
"libre"
page 40
mobile
L'adsorption d'une molcule de solut S(M) S(a) se traduit par le dpart de n molcules de solvants de
la surface de l'adsorbant nM(a)
nM(M).
L'nergie d'adsorption est donne par :
Ea = ES(a) + n EM(M) - ES(M) - n EM(a)
quation 20
Les termes des nergies en solution sont faibles et on a :

Ea = ES(a) - n EM(a)
quation 21
ES(a) est constante et ne dpend pas du solvant.

EM(a) dpend du solvant et du support mais pas de l'chantillon .
Une quation reliant le facteur de capacit k' du solut aux proprits de l'adsorbant a t propose par
SNYDER :
Log k = Log Va + (S - As ) + Log VS / VM
soit
quation 22
Log k = A + B
Va
: volume de phase mobile adsorbe par gramme d'adsorbant.
: activit de l'adsorbant (en gnral comprise entre 0,5 et 0,9).

S - AS est li aux proprits de l'luant et du solut.
S
: nergie libre d'adsorption du solut par unit de surface d'adsorbant dans des conditions d'activit standard ( = 1).
As
: surface occupe sur l'adsorbant par une mole de solut.
: nergie libre d'adsorption des molcules de la phase mobile par unit de surface d'adsorbant.
VS
: volume phase stationnaire.
VM : volume phase mobile.
S = G__
2,3 RT
G: variation d'nergie libre d'adsorption.
R:
constante des gaz parfaits.
T : temprature absolue (Kelvin).
SNYDER a galement dcrit une srie luotropique (force luante d'un solvant ) partir des valeurs
de l'nergie libre d'adsorption des molcules de solvant sur la surface d'adsorbants polaires comme
la silice ou lalumine (tableau 5).
tableau 5. Srie luotropique de Snyder pour lalumine ou la silice ( x par 0,77)
n-pentane
isooctane
n-heptane
cyclohexane
cyclopentane
sulfure de carbone
CCl4
chlorure d'amyle
ther isopropylique
tolune
chlorobenzne
0
0,01
0,01
0,04
0,05
0,15
0,18
0,26
0,28
0,29
0,30
benzne
bromure d'thyle
ther thylique
chloroforme
chlorure de mthylne
ttrahydrofurane
mthyl thylctone
actone
dioxane
actate d'thyle
alcool amylique
0,32
0,37
0,38
0,40
0,42
0,45
0,51
0,56
0,56
0,58
0,69
dimthylsulfoxyde
aniline
nitromthane
actonitrile
pyridine
alcool isopropylique
alcool thylique
alcool mthylique
thylne glycol
acide actique
eau
0,62
0,62
0,64
0,65
0,71
0,82
0,88
0,95
1,11
grand
grand
page 41
7.3.2. La chromatographie en phase inverse.
%w
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
py
np
gs
fill
e
o
cp
5
a
wy
dp
0
In
x
6
405
900
[1
[0
gr
0
2
bW
dp/cY
g
-2
cw
-1
CopyRight
py
1
ChemDraw
dp
p
Iend
1
cm
fill
pA
sc
-1
gr
DA}{cw
8
m2
0
pp}{sqrt
p
2
o
1
ix
dv
p
2180
l58
1380
7340
7740
8300
4020
1800
2
rlt{1
mv
-9.6
-2
m
2
p
s
px
sc
mv
cm
180
HA}{dL
0
gr}{pp}{gs
-1
dp
a}b/PT{8
sm
o
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s{dp
dv
m
g
dv
mv
42
dp
rO
dv
o
x
-.6
WI
py
-1
sc
exec
sm
0
b2
neg
1000
lp
st
12
xl
wF
np
CA
1280
5980
1000
p
20
n
0
mv
py
0
at
p
bd
p
LB
sc
1.2
px
gr
neg
1986,
m
a}{ex
7
mv
st
p
2.25
eLaser
1
p
l-9.6
m
L/gs/gsave
larcn
OA}{1
2
clip}b/Ct{bs
p
40
-1
gs
ex
pp
aL
p
neg}if/py
n
lL/xl/translate
cp
np
sl
gr
0
at
mv
OB
7740
8300
8840
DSt
p
wy
m
st}b/HA{lW
l12
1000
0o
mv
p
4020
2180
3560
4560
1
3.375
px
1
80
0
n/ex
r8
ro
fill
mv
n
gs
145
90
SA
py
16.8
st}{0
np
lp
l1987,
1
counttomark{bs
Prep
swx
ac
sg
OB/bL
aR
[1
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dp
bW
-1
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px
py
sc
20
e
0.3
gr
ac
px
ro
DA}{dL
520]B
980]B
1380]B
0.6
rad
8
35
3
1
fill
dict
aL
at
7
540]B
1400]B
1000]B
x
m1
sc
n
0
p
cv
SA
dp
end}b/Db{bs{dp
DLB
0
20
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Ipy
x
-1
1
ey
L/ie/ifelse
Cambridge
mt
1.2
gr
p
m
Ar
bd
ne{bW
4020
l0
120
py
8x
dp
rot
-9.6
put
sc
m
px
DA}{cw
m
rO
l}for
chemdict
m/w
mv
n/ey
rad
r-1
180
cm
bW
-1
ro
6160
1.5
p
2
L/S{sf
sp
0
b1
py
g
0CA
ac
chemdict
0
e
dv
tr/dy
0
1
l0
-1
540
lt{-1
180
sm
21.6
bs
0
p
st
2
SA
-.6
aA
a}ie}b/WW{gs
x
dp
5
0
a}ie}b/BW{wD
py
ac
px
12
OA}{1
ne{bW
0
ldv}{bd}ie
5
1000
sc
np
gr}{gs
-1
dx
rot
pe
st}{Asc
cp
L/ix/index
m}b/dA{[3
DA}{dL
spy
m
8
DSt
p
6
Scientific
2.2
py
m
0
1
x/dx
3
-8
g
begin
DLB
5
180
0
rn/dx
l-1
g
cm
360
a
sc
-1
2
lp
sl
dv
px
-1
0
16
begin/version
gs
24.6
type[]type
[2
-1
p
sqrt
5280
2
4
12
r2.25
neg}if/px
ac
gs
p
sm
rarc
x
mv
neg
LB
rpy
0
dv/bd
s
gi
4
1
arc
o
0
x
sc
SP
swF
mv
2
0
OB
0
rO
180
0.5
SA
ICB
dp
1
dy
3
gs
al
-4.8
st}{0
p
Computing,
0
0.6
eq{DB}{DS}ie
lW
90
L/l/lineto
wD
3560
S]}b/dL{dA
1000
py
SA
gs
e
begin
m
ac
1
w
lac
1
cw
pp
DA}{2.25
CB
0.5
n/dy
rev{neg}if
sg
5px
2
6
rx}if
CA
lp
cW
2
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sc
DA}{cw
2.2
begin
16
px
-1
25.8
rO
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dv
-2
o
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fill
1
sg
m
0
py
sg
1000
2
np
scX
bs
OA}{1
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np
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0
rx
p
wy
p
dp
dv
24
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fill
gr
1
fill
dv
lp
16
lx
0
bW
lmv
scv
ne
e
L/mt/matrix
lbs
0
0
o
cm
0
wx
rlineto
cp
cm
5
p
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0
6460
dp
SA
arc
gr
ac
g/wb
Inc.
ly
DSt
neg
gr
0
sc}b/Ov{OrA
0
1
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n
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g
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m
l0
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16
cm
p
p
px
w
at
sm
1
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sm
gs
cY
g
2
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gs
ne{bW
py
sl
l[5
mv
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sc
ac
lac
3
2
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mt
WI
1340
div
x
lp
cm
sm
27
ne
1
1.5
sc
cm
st
cp
px
st}{Asc
lW
4
m
I270
0
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cm
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1
bL
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sp
ro
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dup
1.6
0
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sm
w
st}{px
m
py
st
p
sm
0
2
SA
9
ldef}bind
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L/mv/moveto
SA
dp
tr
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cp
p
lfill
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cp
py
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lpp
gs
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ZLB
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m
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o
DT}]o
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px
x
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np
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px
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gs
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sc
p
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39
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SA
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CA
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DS
sc
px
0
ls4
4
3
lW
O
w
a
1
0
rL
a
m
S
1
p
B
g
p
s
Les phases greffes apolaires reprsentent les phases stationnaires les plus utilises en HPLC. Ces
phases (qualifies de rverses ou d'inverses) sont prpares partir de silice de la faon suivante :
currentpoint
silice
Si OH
CH3
CH3
+
Cl
Si
CH3
silice
Si
Si
CH3
monochlorosilane
La longueur du greffon alkyde R sert caractriser la phase.
RP 8 implique R = (CH2)7 - CH3
RP18 implique R = (CH2)17 - CH3.
Ce sont les phases les plus rpandues et les plus utilises.
En ralisant une surface hydrophobe on inverse totalement la nature des interactions fournies par la
silice. L'eau n'a pas d'affinit pour le greffon hydrophobe et la force luante des solvants est
exactement l'inverse de celle qui est observe sur supports polaires d'o le terme phase inverse
(reversed phase = RP) appliqu ce genre de support.
Les soluts les plus polaires seront les moins retenus, les soluts apolaires seront retenus dautant plus
fortement que leur hydrophobicit est leve. La rtention des composs apolaires croit avec la
longueur du greffon et avec le taux de greffage de la surface (surface coverage). La taille des
particules n'a pas d'effet sur la rtention exprime par le facteur de capacit k', les effets de la taille ne
concernant que la pression et la HEPT.
1) mcanisme de rtention.
Malgr tous les travaux qui lui sont consacrs, il existe encore beaucoup de flou dans son
interprtation. Dans la thorie solvophobique, ce sont les interactions apolaires dans un solvant polaire
qui sont dcrites. Pour un luant donn et une phase stationnaire greffe donne, on constate que le
facteur de capacit k' augmente avec l'hydrophobicit du solut. L'interaction de Van der Waals varie
avec la surface de contact entre la partie apolaire du solut et la phase stationnaire greffe. Ainsi, les
phases greffes possdent une capacit de reconnaissance suivant la forme de la molcule. Il sera ainsi
possible de sparer certains isomres de position, par contre la sparation des isomres gomtriques
(cis/trans) ou optiques (D/L) est plus difficile avec les phases normalement utilises et ncessite
lutilisation de phases greffes chirales.
En conclusion on peut dire que plus le solut sera soluble dans la phase mobile, moins il sera retenu.
Pour les acides amins, on observe une relation linaire entre ln k' et la surface apolaire de la
molcule. Plus l'ionisation augmente et plus le facteur de capacit diminue.
2) Influence de la phase mobile.
L'eau constitue le composant de base de toute phase mobile en chromatographie liquide sur phases
greffes apolaires. On utilise soit un mlange binaire type eau / mthanol, eau / actonitrile ou eau /
ttrahydrofurane, soit un mlange ternaire eau/actonitrile/mthanol.
Une variation linaire du log k' est fonction du pourcentage d'eau dans la phase mobile.
Llution dun compos sera dautant plus rapide que lapolarit de la phase mobile sera grande
ou le o sera petit.
currentp
page 42
3) Augmentation de k' par modification du solut.

Elle est soit obtenue par fixation sur un solut polaire d'un compos apolaire par liaison covalente soit
par fixation sur un solut ionique dun compos apolaire par liaison ionique (appariement dions).
Cest la premire mthode qui est de plus en plus largement utilise pour sparer les acides amins par
chromatographie en phase greffe apolaire.
Dans cette mthode on fait ragir le mlange des acides amins sparer par des composants comme
l'o-phtaldialdhyde, ou le PITC ou la fluorescamine (cf chapitre II.6.5.6), les drivs obtenus ont alors
des facteurs de capacit beaucoup plus importants que l'acide amin de dpart et il est ainsi possible de
raliser leur sparation (figure14). De plus ces drivs sont dtectables par fluorescence ou par
absorption UV, ce qui facilite leur dosage. La limite de dtection atteint 10-13 g.
14
8
1
3
2
11
16
15
12
17
13
10
18
A
5
10
23
6
4
3
22
temps de rtention
(min)
20
9
8
12 13
2011
10
19 14
17
21
16
15
temps de rtention (min)

5
10
figure 14 Chromatogramme en phase inverse (C18) des drivs dacides amins.

A ractif OPA - drivs isoindoliques ; dtecteur fluorimtrique.
B drivs PTH.
1.ASP, 2.GLU, 3.ASN, 4.SER, 5.GLN, 6.HIS, 7.GLY, 8.THR, 9.ARG, 10.ALA, 11.acide -butyrique, 12.TYR, 13.MET,
14.VAL, 15.PHE, 16.ILE, 17.LEU, 18.LYS, 19.PRO, 20.TRP, 21.NorLEU, 22.acide cystique, 23.CH3 CYS.
Les avantages et inconvnients des principales mthodes de drivation des acides amins sont
indiques dans le Tableau 6.
tableau 6. Comparaison des mthodes danalyse des acides amins en phase inverse
amines 2aires
sensibilit
stabilit
interfrence
du ractif
automatisable
dabsyl
mode de drivation
PITC
OPA
oui
5 pmoles UV
bonne
oui
non
5 pmoles UV 150 fmoles Fluo
moyenne
mauvaise
oui
moyen
oui
mauvais
non
oui
FMOC
oui
100 fmoles Fluo
bonne
oui
moyen
page 43
Il existe des possibilits de combinaisons de certaines de ces mthodes. Ainsi la combinaison OPA FMOC
permet
dobtenir
aprs
chromatographie
en
phase
inverse
et
par
mesure
labsorbance
ac
338
%w0
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
py
np
gs
fill
e
o
cp
5
a
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dp
0
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x
6
391
11
[1
[0
gr
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2
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py
1
0
cw
bW
g
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dp
pCopyRight
ChemDraw
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sc
1
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cm
pA
m2
0
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-1
DA}{cw
/N
p
2
o
ix
dv
1
p
1940
l68
r8220
2180
2260
2840
4800
5500
7440
3020
5800
-9.6
2
lt{1
mv
px
sc
-2
m
p
180
cm
2
gr}{pp}{gs
mv
0
-1
a}b/PT{8
sexec}{al
dp
o
HA}{dL
0
sm
s{dp
m
dv
mv
g
dp
dv
77
rO
-.6
dv
x
py
od/B{bs
sc
WI
sm
b2
-1
neg
0
12
exec
np
6220
lp
st
xl
CA
6220
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p
0
5
mv
p
286
0
1.2
py
LB
bd
at
p
sc
neg
a}{ex
7
a}{ex
px
st
p
gr
mv
-9.6
e
p
1986,
lm
1
arcn
Laser
OA}{1
l2.25
cp
m
p
pp
2
-1
L/gs/gsave
ln
p
aL
neg}if/py
clip}b/Ct{bs
gs
mv
ex
L/xl/translate
gr
p
0
OB
np
at
sl
st}b/HA{lW
DSt
N
40
l0
o
p
m
1940
2840
3020
3340
5400
5800
6100
7860
3440
6180
8520
mv
12
wy
fill
mv
r1
px
8
16.8
3.375
0
1
n/ex
gs
rot
n
st}{0
ro
ln
lp
counttomark{bs
py
145
90
s
1
np
SA
80
bW
ac
ix
Prep
1987,
aR
sg
dp
[1
gr
OB/bL
bd
wx
dp
-1
py
e
ac
sc
0.3
0.6
px
put/N
px
1ro
rad
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DA}{dL
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p
A
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m
g
nm tous les acides amins avec des NH2 primaires jusqu llution de la lysine puis, par lecture 262
nm llution et la dtection de la proline et de lOH-proline.
7.4. Etalons internes.
La prsence dun talon interne en cours danalyse permet de corriger les pertes ventuelles qui
peuvent se produire. Le choix dun bon talon interne doit rpondre certaines exigences :
- il faut que sa structure soit aussi proche que possible des composs analyss. Dans notre cas il doit
donc correspondre un acide amin non naturel ou inhabituel.
- il doit tre stable au cours de lhydrolyse (applique lanalyse des protines).
- il doit tre lu bien isolment et avec un temps dlution voisin de celui des acides amins doser.
Parmi les nombreux talons internes qui rpondent ces exigences on peut indiquer :
currentpoint
CH3
NH2
(CH2 )3 CH
COOH
norleucine
NH2
SO3 H CH2
CH
NH2 (CH2 )3
COOH
COOH
acide cystique
acide ! aminobutyriquecurrentpoint 192837465
- la norleucine pour lanalyse complte des acides amins protiques. Elle est lue aprs la leucine et
lisoleucine.
- lacide cystique, utilisable comme talon interne dans le dosage des acides amins acides.
- lacide amino butyrique, utilisable dans le dosage des acides amins basiques.
page 44
Analyse des acides amins et talon interne - STIA 1
Ralisation du chromatogramme talon (aa et talon interne): application

Analyse de 100 mL
(solution 2,5 mM)
soit 250 nmoles par a.amin
Saa1
Saa3
Sa
a2
Analyse
Phase 1 : association produit

+ talon application
Saa4
S talon
interne
250 nmoles
Saa5
Phase 2 : ralisation de lhydrolyse

et prparation
talon interne
1 mL 2,5 mM
soit 2500 nmoles
produit
+ 2 ml HCl,
110C, 24 h
10 mg
Evaporation
sous vide
partiel
Reprise par 2 mL
HCl N/100
Phase 3 : ralisation du chromatogramme

dosage
Thorique : la S d talon interne
devrait correspondre 1/10me
de laddition initiale soit 250 nmoles
soit S talon interne
et ce pour 1 mg de produit
Analyse
sur 200 mL
Sda
a1
filtration
Sdaa 2
Sda
a3
Sdaa
Sd talon
interne
Sda
a5
Calcul pour lacide amin n1

250
Sdaa1
Stalon interne
=
Saa1
Sd talon interne
nmoles daa1 dans

les 200 mL analyss
Soit dans 1 mg de
produit
page 45
III - LES PEPTIDES
Les peptides sont des composs naturels ou de synthse qui rsultent de lenchanement par une
liaison peptidique dun nombre limit dacides amins (2 50). Il existe une nomenclature
internationale des peptides, certains dentre eux possdant cependant un nom propre. Le nom du
peptide commence par la racine du nom de lacide amin dont le groupement NH2 libre est
additionne du suffixe yl. Suivent ensuite dans lordre la racine du nom additionne de yl des autres
acides amins qualifis de rsidus. Le dernier rsidu dont la fonction COOH est libre garde son nom.
Exemple : Valyl - glycyl - tyrosine. Lcriture dun peptide se fait gnralement dans le sens -CO NH-.
La nomenclature des peptides est possible partir de leur code 3 lettres , le groupement NH2 terminal
tant symbolis par H et le groupement COOH par OH. Exemple : H-VAL-GLY-TYR-OH.
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-1
39
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4740
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m
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p
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0.5
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0
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2
e
1
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0
ls
4
4
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4980
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180
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1
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-1
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57
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-0.4
m/aL
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1
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8
-2
2
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1
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12
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1
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SA
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m
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1
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m
L
a
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p
g
O
d
1
g
lcp
1. Structure de la liaison peptidique.

La structure des peptides rsulte dabord de la nature de la liaison peptidique. Cette liaison possde 4
lectrons ( 2 pour la liaison C=O et 2 du doublet libre de latome dazote). Des orbitales hybrides de
rsonance stablissent et la liaison C(O)-N prsente un caractre partiel de double liaison (40%) et la
liaison C=O un caractre partiel (40%) de liaison simple () (figure 15). La liaison C-N prsentant un
caractre de double liaison partielle a une longueur raccourcie de 1,47 1,325 (figure 15).Cette
structure a t dcouverte
par cristallographie aux rayons X de peptides simples (GLY-GLY).
currentpoint
+"
%DSt
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lpp
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1
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2
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1
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cm
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m
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sm
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st
12
xl
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CA
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9
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4460
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3.375
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1
4460
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n/ex
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fill
mv
n
gs
145
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16.8
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1
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1
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6
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-1
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16
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gr
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1
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5
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1
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1
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mv
1
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gr
1.5
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SA
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sm
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S
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3
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CA
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C
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D
2
0
b
0
lrp
e
1
O !"
orbitales hybrides
currentpoint
192837465
figure 15. Orbitales hybrides et polarit de la liaison peptidique

currentpoint
R
o
angles en degr
distances en A
1,02
C
C
1,325
N:
1,52
116
120,5
1,47
1,24
2,8
111
123,5
O
H
N:
C
122
C
R
H
currentpoint
192837465
figure 16. Distances et angles de la liaison peptidique.
Il en rsulte de nombreuses particularits trs importantes dans la structure spatiale des

peptides et des protines .
Lnergie de la liaison peptidique stabilise par rsonance est voisine de 100 kJ.mole-1 .
Les distances inter-atomes C=O et C-N correspondent des distances hybrides .
La liaison peptidique prsente une polarit partielle qui rend latome dhydrogne mobile
(figure 15). La liaison peptidique peut ainsi donner des liaisons hydrogne avec dautres liaisons
peptidiques, leau, ou des composs susceptibles de donner ce type de liaison. Par ailleurs, entre pH 0
et pH 14, le groupement NH ne se protonera pas.
page 46
Enfin la liaison
peptidique
alarcn
une
structure
telle
que
les
atomes
C,
O,
N,
H
les
deux
C
sont
dans
le
%w
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L/gr/grestore
L/tr/transform
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m
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s
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sc
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cm
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HA}{dL
9
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g
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rO
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dv
o
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p
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c
mme plan. La rotation autour de la liaison C-N est impossible et la configuration trans pour laquelle
les forces de rpulsion des deux atomes de carbone sont minimales est donc stabilise. La chane
polypeptidique est donc une succession de plans rigides spars par des C-HR, les substituants de cet
atome de carbone (chane
latrale) tant dans lespace situs au sommet dun ttradre (figure17).
currentpoint
R3
C
C
H
C
R1
C
O
"
N
C
O
R2
currentpoint
192837465
figure 17. Structure spatiale dune chane polypeptidique.
La libre rotation autour des liaisons C-C(O) et C-N(H) schmatise par les angles et permet un
grand nombre de conformations. La seule variable dans cette structure est lie la chane latrale des
rsidus dacides amins. Le volume ou encombrement strique de cette chane associ ses proprits
chimiques (groupements ionisables ou non, apolaires etc) conditionnent les angles et ce qui
conduit une structure spatiale bien dfinie.
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1
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n
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x
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3
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0
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gs
-1
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pp
1
lcX
fil
p
sc
2
py
D
g
c
sd
8
ea
0
La proline, dont la fonction amine est comprise dans un cycle pyrrolidine, constitue une exception. Ce
cycle prsent dans une liaison introduit une grande rigidit, la rotation C-N(H) tant impossible.
Deux liaisons cis et trans sont possibles par rapport au plan du cycle, et le plus souvent cest la
configuration currentpoint
cis qui est adopte par les liaisons aboutissant ce rsidu.
R
R
CH
CH2
N
C
O O C
CH
NH
CH2
CH
CH2
O
CH2
C
N
CH
O C
cis
NH
CH2
CH2
trans
currentpoint
192837465
Lanalyse structurale dun peptide comprend donc lanalyse des acides amins quil contient et la
dtermination de leur squence ou structure primaire ou ordre denchanement.
2. Dtermination de la composition en acides amins.
La composition en acides amins, exprime en mole par mole de peptide, est gnralement dtermine
aprs hydrolyse acide (acide chlorhydrique 6 N, 24 heures, 110C sous azote) suivie dune limination
de lacide par vaporation sous vide partiel. Les acides amins de lhydrolysat sont alors analyss par
chromatographie liquide haute performance. Dans ces conditions le tryptophane est dtruit et des
oxydations se produisant au niveau des acides amins soufrs. Pour analyser la mthionine et la
cystine/cystine, une oxydation performique stabilisant ces acides amins sous forme de mthionine
sulfone et dacide cystique est dabord ralise. Un peptide est qualifi de rgulier quand son
hydrolyse ne libre que des L-acides amins. Un peptide est dit irrgulier quand lhydrolyse libre
des D aminoacides ou dautres radicaux. Ainsi un GLU N-terminal cyclis en acide pyroglutamique,
un GLU impliqu dans une liaison avec sa fonction carboxylique (glutathion), une mthylation de
HIS ou CYS, une formylation de GLY ou de la fonction NH2 de la MET N-terminale, une actylation
page 47
de la fonction NH2 terminale etc. sont des exemples de peptides irrguliers, de mme que les peptides
cycliques.
3. Dtermination de la squence.
La dmarche exprimentale utilise peut se rsumer par diviser pour vaincre.
3.1. Les acides amins terminaux.
Leur existence et leur nombre permettent de connatre la structure de la chane peptidique (linaire,
semi-cyclique, cyclique).
3.1.1.Mthode chimiques.
Elles consistent traiter le peptide avec un ractif adapt pour former un driv stable caractristique
des fonctions C ou N terminales. Ce driv est isol du peptide par hydrolyse puis spar et dos.
1) Dtermination de lacide amin N-terminal.
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lpp
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-1
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cm
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m
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p
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p
1986,
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2
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ro
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lp
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s
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1
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sc
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L/
sm
2.
0
dp
gs
e
s
DS
aR
fil
D
dw
pd
1
La mthode de Sanger au 1-fluoro-2,4-dinitrobenzne (cf chapitre II.6.5.6.8.) est ralise pH 8 en

milieu thanolique. Le driv dinitrophnyl (DNP peptide) gnralement insoluble est isol puis
hydrolys en milieu acide chlorhydrique. Le(s) DNP-acide amin est extrait par lther dithylique
puis analys par chromatographie. Remarque : les acides amins basiques ragissent avec leur fonction
amine des chanes latrales ( DNP-LYS par exemple ).
La mthode dEdman au phnyl-isothiocyanate (cf chapitre II.6.5.6.5) permet lanalyse rcurrente
par lextrmit N-terminale. Cette mthode est adopte dans de nombreux systmes automatiss
appels squenceurs et permet jusqu une quinzaine de cycles.
currentpoint
N C S
+ NH2
CH
O C
NH
CO
NH
OH-
C NH
NH
peptide n rsidus
CH
CH
R1
CO
NH
CH
R2
driv (N) phnylthiohydantone (PTH)
R
CH
R1
CO
NH
CH
R2
HCl , CH 3 NO2 + H2 O
S
NH
+
O
driv phnylthiocarbamyl (PTC)

identifiable par chromatographie
NH2 CH
R1
CO
NH
CH
R2
reste de n-1 rsidus
currentpoint 192
Cette mthode peut sappliquer des peptides plus petitsissus dune hydrolyse contrle du peptide
initial. Le chlorure de dansyle est galement utilis pour identifier lacide amin N-terminal (cf
chapitre II.6.5.6.4).
page 48
2) Dtermination de lacide amin C-terminal.

Aprs rduction par le borohydrure de lithium et hydrolyse acide, le driv alcool amin est
identifiable par chromatographie (cf chapitre II.6.4.4.).
%w
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lpp
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-1
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1
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m2
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2
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1
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dp
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x
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1620
1640
p
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n
0
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py
0
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6860
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LB
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1.2
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7
mv
st
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p
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aL
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Lhydrazinolyse permet la coupure des liaisons peptidiques avec formation dhydrazides sauf au
niveau du rsidu C-terminal qui apparat sous forme dacide amin facilement identifiable.
currentpoint
COOH
CH
NH CO CH
R
COOH
acide amin
C-terminal
CH
NH CO CH
R1
NH2
NH2
R2
NH CO CH
NH2
NH2 NH2
hydrazine
NH2
R1 (R2 )
amino acyl hydrazides
currentpo
3.1.2.Mthode enzymatiques.
Elles reposent sur lutilisation dexopeptidases qui hydrolysent, selon leur spcificit, la liaison
peptidique dans laquelle est impliqu lacide amin N ou C terminal. Ainsi les amino-peptidases et les
carboxypeptidases hydrolysent les peptides respectivement partir de leurs extrmits N et C
terminales.
1) Amino-peptidases.
La leucine amino-peptidase (3.4.11.1) hydrolyse ainsi les liaisons peptidiques partir du rsidu Nterminal (sauf celles dans lesquelles la proline est implique). Lamino-peptidase (3.4.11.2) est
utilisable de mme que la proline-amino-peptidase (3.4.11.5) qui est spcifique de la proline.
2) Carboxypeptidases.
Les carboxypeptidases A (3.4.12.2) ou B (3.4.12.3) hydrolysent les liaisons peptidiques partir du
rsidu C-terminal. La carboxypeptidases A est une mtallo-enzyme du suc pancratique nhydrolysant
pas si lacide amin C-terminal est ARG , LYS ou PRO.
La carboxypeptidase B agit sur les ARG et LYS C-terminales.
La carboxypeptidase C (3.4.12.1) dtache tous les acides amins C-terminaux.
La proline carboxypeptidase (3.4.12.4) dtache spcifiquement la proline C-terminale.
Lacide amin N (ou C) terminal est extrait et identifi. Lenzyme pouvant poursuivre son hydrolyse
sur le peptide n-1 rsidus, plusieurs cycles peuvent tre ainsi raliss.
page 49
3.2. Les mthodes classiques de squenage.

Le nombre total de rsidus ainsi que les acides amins N et C terminaux dtermins (ainsi quune
squence partielle partir de lextrmit N-terminale) tant connus, il faut dterminer leur ordre
denchanement. Pour cela, le peptide est cliv au moyen dhydrolyses partielles spcifiques en
fragments plus petits qui sont soumis leur tour la dtermination de leur composition et des rsidus
N et C terminaux comme dcrit dans les chapitres III.3.1 et III.2. Le clivage spcifique peut tre
effectu par voies chimiques ou enzymatiques.
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-2
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Ar
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0
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n
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12
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1
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5920
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DSt
ac
lp
L/n/ne
LB
2040
ap
aL
lgs
CA
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-1
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3
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w
0
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px
5
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gs
-1
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pp
1
[42
lcX
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p
sc
2
py
DA
g/
cm
sm
dp
e3
a
0
1
A
m
1
d
2
3.2.1. Mthode chimiques.
Parmi les nombreuses mthodes chimiques utilisables, celle mise au point par Witkop et Gross
concerne les rsidus de mthionine, la coupure par le bromure de cyanogne de la chane peptidique
nintervenant que du ct carboxylique de ce rsidu de MET.
Un peptide qui contient 2 mthionyls (sauf C terminale) donnera 3 peptides de clivage.
currentpoint
XX CO NH CH
CH2
CH2
NH CH
C
O
R2
S
CH3
Br
XX
CO NH
O
O
R2
CO NH CH
CH2
CH2
NH CH
C
O
XX
CO NH
CO
R2
S+ CH3
C
H2 O
CH2
CH
XX
bromure de
cyanogne
CH C
peptidyl homosrine
lactone
CH2
NH2
amino acyl peptide
CO
+ Br-
NH CH
CO
CH C
CH2
R2
O
CH2
CO
N C S CH3
mthylthiocyanate
currentpoin
3.2.2. Mthode enzymatiques.

Une des mthodes de choix est une hydrolyse enzymatique par une endo-peptidase dun lien
peptidique dans lequel un acide amin donn est impliqu, cette hydrolyse pouvant intervenir au
niveau de la partie C ou N du rsidu dacide amin.
Les peptides obtenus par clivage enzymatique ou chimique sont spars par des mthodes
chromatographiques ou lectrophortiques, leur squence tant ensuite dtermine par la mthode
dEdman. Les spcificits de quelques protases utilises dans le squenage sont indiques dans le
tableau 7.
page 50
tableau 7. Mthodes dhydrolyse spcifiques de la liaison peptidique.
currentpoint
CO NH
acide amin 1
NH
CO
CH
CH
R1
R2
acide amin 2
liaison peptidique scinde
mthode d'hydrolyse
Chimique
bromure de cyanogne
hydroxylamine
2-nitro,5-thiocyanobenzoate
Enzymatique
trypsine (3.4.21.4)
chymotrypsine (3.4.21.1)
pepsine (3.4.23.1)
thermolysine (3.4.24.4)
clostripane
protase staphylococcique
CO
MET
entre ASN-GLY
!
LYS , ARG
PHE , TRP , TYR
PHE , TRP , TYR et autres
ARG
GLU , ASP!!
CYS
VAL , LEU , ILE
currentpoint
Les peptides rsultant de ces clivages chimiques ou enzymatiques sont ensuite spars et purifis. A
leur tour ils sont soumis la dtermination de leurs acides amins C et N-terminaux et la dgradation
dEdman ou dautres hydrolyses slectives.
Lanalyste dispose alors de la squence de segments et il lui reste en dterminer lordre.
Certains de ces segments se recouvrent : peptides de recouvrement. Cest lassemblage des
fragments comme un puzzle qui conduit la squence.
3.3. Les mthodes automatises de squenage.
Ces mthodes sont bases sur la dgradation squentielle ou rcurrente dEdman. Les squenceurs
permettent de dterminer lordre denchanement jusqu une quinzaine de rsidus. Ce sont souvent
des peptides issus dhydrolyses partielles qui sont soumis cette opration automatise.
3.4. Les mthodes de squenage issues du gnie gntique.
Le squenage de lADN est plus facile que celui des peptides (et protines). Si le fragment dADN
codant (unit de transcription) pour le peptide (ou la protine) est isol, sa squence sera facilement
dtermine. La structure primaire du peptide sera alors dduite partir du code gntique (cf tableau 2
chapitre II.5.4.2).
Des atlas de squence sont disponibles aux chercheurs du monde entier. Leur informatisation permet
une comparaison rapide des squences et de remarquables analyses (structure-fonction, volution).
page 51
4. Proprits des peptides.

4.1. Proprits physiques.
Elles dpendent de leur masse molaire et de la nature et de la squence des acides amins quils
contiennent. Gnralement, il sagit de solides de couleur blanche, cristallisables pour la plupart, et
plus ou moins solubles dans leau. Ils prsentent un caractre amphotre et possdent un point
isolectrique. Par exemple le peptide H-LYS-ALA-HIS-GLU-MET-OH prsente une charge nette qui
volue en fonction du pH de la faon suivante (tableau 8):
tableau 8. Variations de la charge nette du pentapeptide en fonction du pH
pH 2,5 ptquiv pH 4,3 ptquiv pH 6,0 ptquiv pH 8,9 ptquiv pH 10,5 ptquiv
fonction ionisable pKa

!-COOH
"-COOH
imidazole
! -NH 2
#-NH 2
2,5
4,3
6,0
0,5 0
+
+
+
0
+
+
+
0,5 +
+
+
+
+
+
0,5+
+
+
0
+
+
2,5+
2+
1,5+
1+
0,5+
8,9
10,5
charge nette
0
0,5+
+
0
0
+
0,5-
1-
0
0
0,5+
1,5-
0
0
0
2-
Le pHi de ce pentapeptide est gal (6 + 8,9) / 2 = 7,45.

4.2. Proprits chimiques.
Elles sont fonction de la nature des acides amins du peptide. Du fait de la mobilit de lhydrogne de
%w
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
st}b/OrA{py
-8
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e
o
cp
5
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In
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6
465
5714
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20
27
0
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bW
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g
-2
cw
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CopyRight
py
1
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p
1
0
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dL
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-1
gr
DA}{cw
8
m2
0
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3279
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9073
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7720
2
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-9.6
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2
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cm
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Ct
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2434
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I12
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np
CA
5
2167
2424
2357
2224
2509
2135
2633
2455
1905
2005
1122
2623
2262
2432
2057
1704
2284
1860
2184
2521
1132
2817
2558
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p
n
0
44
mv
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47
0
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LB
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2.25
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Laser
1
p
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m
L/gs/gsave
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8716
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5894
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SA
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lp
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px
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3360]B
1001]B
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1
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1382]B
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1
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m
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3069
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p
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b1
py
4758
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CA
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29
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42
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31
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m
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p
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Scientific
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5
32
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l-1
g
cm
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a
sc
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2
lp
sl
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px
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16
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gs
24.6
type[]type
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0
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18
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s
sg
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3
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dv
x
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x
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p
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st
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cm
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py
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s
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sc
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cv
sc
px
dv/m
cW
6
gr
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o
0
mv
p
eq
lp
gs
180
g
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ne{w
eq{2
at
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166
dp
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nSq
8
mv
o
lW
py
90
9.6
rad
lcur
st}
py
2
CA
ac
2
0.
bb
0.
lp
ro
9
p
e
14
n
la liaison peptidique
et
de
la
prsence
dun
doublet
dlectrons
libres,
les
peptides
donnent
en
milieu
alcalin, des complexes bleus avec les ions cuivriques : raction du Biuret. La raction nest positive
qu partir de tripeptides.
currentpoint
O
C
CH
N
CH
N
H
R1
CH
Cu++
OC
OHCH
C
O
..
Cu++
..
R1
CH
CH
Ocurrentpoint
192837465
5. Synthse chimique.
Cette synthse prsente un grand intrt au plan biologique mais aussi aux plans technologiques. Il est
en effet ncessaire dactiver au moins lun des groupements datomes qui participent la
condensation. La difficult majeure de cette synthse rside alors dans le fait que les groupements
activs ncessaires la formation de la liaison peptidique ragissent avec certains des groupements
fonctionnels non impliqus dans cette liaison (fonctions NH2 terminale ou NH2, fonction COOH
terminale, etc). Il faut donc protger certaines fonctions des chanes latrales pour procder la
synthse. Il existe de nombreuses mthode de synthse comme celle au carbodiimide. La technique de
Merrifield en phase solide repose sur la condensation dacides amins dont la fonction amine (et
latrale si ncessaire) est protge et la fonction carboxylique active.
5.1. Activation et prparation des acides amins.
Les groupements carboxyliques sont activs par formation desters mthyliques et les groupements
amins protgs par formation de drivs benzyloxycarbonyl (cf chapitre II.6.5.6.1). Le groupement
NH2 est protg par actylation, la fonction thiol est estrifie, la fonction guanidique est nitre etc.
page 52
5.2. Condensation.
Elle est schmatise sur le schma ractionnel indiqu figure 18.
O
CH2 Cl
polystyrne
C
CH3 O
CH NH C O CH2
O
BOC
O
C
CH2
CH NH C O CH2
lavage
BOC
et dmasquage de la fonction amine
H2 O
+ OH C O CH2
O
C
CH2
lavage
CH NH2
+ CH 3 Cl
C
CH3 O
CH NH C O CH2
O
R1
BOC
CH3 OH
O
C
CH2
CH NH
CH NH C O CH2
R1
BOC
et dmasquage de la fonction amine
lavage
H2O
OH C O CH2
O
C
CH2
CH NH
CH NH2
R1
O
C
CH3 O
CH NH C O CH2
O
R2
CH3OH
O
O
C
CH2
CH NH
C
O
lavage
CH NH
R1
CH NH C O CH2
O
R2
et dmasquages des fonctions amine et ester

H2 O
+ OH C O CH2
CH2 OH
tripeptide de synthse
O
O
O
C
OH
CH NH
CH NH
R1
CH NH2
R2
figure 18. Synthse peptidique en phase solide selon Merrifield
page 53
6. Quelques exemples de peptides.

Nous ne citerons que quelques peptides importants en biologie, les peptides usage alimentaire
seront dcrits dans le chapitre IV.
La carnosine et lansrine (cf chapitre II.3.2.3) sont des dipeptides extraits de la viande (tissu
musculaire) qui interviennent dans des ractions de phosphorylation.
Le glutathion (-glutamyl-cystinyl-glycine) est un tripeptide cellulaire qui par sa fonction thiol peut
tre oxydant ou rducteur de faon rversible. Il est plus actif que la cystine du fait dune plus grande
et dune plus grande mobilit de lhydrogne de la fonction thiol. Il est oxydable par
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a
1
sp
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loxygne, par le ferricyanure, le 2,6-dichlorophnol indophnol. Il est rduit par le sulfure
dhydrogne, lhydrogne naissant ou par voie enzymatique.
currentpoint
COOH
CH
CH2
O
CH2
O
NH
CH
NH
CH2
COOH
CH2
NH2
currentpoint
SH
19283
Hughes isola en 1975 deux pentapeptides appels mthionine enkphaline et leucine enkphaline
impliqus dans lintgration des sensations douloureuses :
H-TYR-GLY-GLY-PHE-MET-OH et H-TYR-GLY-GLY-PHE-LEU-OH
Guillemin isola une -endorphine aussi puissante que la morphine pour calmer la douleur :
H-TYR-GLY-GLY-PHE-MET-THR-SER-GLU-LYS-SER-GLN-THR-PRO-LEU-VAL-THR-LEU-PHE-LYS-ASN-ALA-ILE-VAL-LYS-ASN-ALA-HIS-LYS-LYS-GLY-GLN-OH
Les peptides hormonaux comme les hormones hypophysaires et pancratiques sont des nonapeptides
semi-cycliques comportant un pont disulfure.
La vasopressine et locytocyne ont des structures voisines mais les effets physiologiques sont trs
diffrents. La vasopressine augmente la pression artrielle et a un effet antidiurtique ; locytocyne
provoque des contractions utrines.
La corticotrophine, hormone anthypophysaire adrnocorticotrope (ACTH) contient 39 rsidus
dacides amins. Elle dtermine lhypertrophie de la glande corticosurrnale.
%520
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1660
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tr
0
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st
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660
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ZLB
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CA
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0
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1
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1580
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gs
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0
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4
n
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5560
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0
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px
5
s/wx
x
18
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gs
-1
5480
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pp
1
lcX
fill
800
p
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py
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1
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21.
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n
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gr
1.
18
2
SA
0
ra
1m
sIx
sd
Ls1
e
w
Les structures de locytocyne et de la vasopressine (ADH) sont les suivantes :

currentpoint
Cystine
N-terminale
H-CYS
TYR
H-CYS
CYS
TYR
PHE
GLN
PRO
ILE
ASP
LEU
PRO
CYS
GLN
ASN
ARG
GLY NH2
ocytocyne
Gly C terminal
amidifi
GLY NH2
vasopressine
currentpoint
19283746
page 54
Quelques hormones hypothalamiques ont des structures peptidiques. Le TRF (thyreostimulin

releasing factor) scrt en cas de froid a la structure suivante :
pyroGLU-HIS-PRO-NH2 , la proline C terminale est amidifie.
Le glucagon scrt par les cellules A des lots de Langerhans du pancras est un peptide de 29 acides
amins qui agit sur les hpatocytes, les adipocytes et les cellules B des lots de Langerhans qui
scrtent alors linsuline. Le glucagon est hyperglycmiant. Sa squence est la suivante:
H-HIS-SER-GLU-THR-PHE-THR-SER-ASP-TYR-SER-LYS-TYR-LEU-ASP-SER-ARG-ALA-GLU-ASP-GLU-ASP-PHE-VAL-GLU-TRP-LEU-MET-ASN-THR-OH
Linsuline pancratique est hypoglycmiante et comporte deux chanes peptidiques A et B de 21 et 30
rsidus runies par 2 ponts disulfure. Sa masse molaire est de 6000. Elle est considre comme la
premire protine dont la structure a t dtermine.
GLY 1
ILE
GLU
VAL
TYR
LEU
CYS SER
GLU
GLN CYS
LEU
GLN
ILE
Chane A
CYS
THR SER
S
S
S
ASN
TYR
CYS
S
21
ASN
GLU
S
HIS
CYS GLY
VAL
ALA
CYS
LEU
VAL
GLN
LEU
LEU
GLY
SER
LEU
VAL
PHE
TYR
ASN
HIS
GLU
1
PHE
ARG
Chane B
GLY
PHE
THR
LYS
TYR
PRO
30 THR
Il existe de nombreux polypeptides activit antibiotique, certains dentre eux contiennent des acides
amins sous forme D ou inhabituels et se trouvent sous forme cyclique. On peut citer la nisine et la
subtiline utilises en technologie alimentaire dans la conservation de certains produits et les
polymyxines, la bacitracine, la thyrothricine.
Les bactriocines sont synthtises par des microorganismes pour simposer vis vis de flores
concurrentes . Ainsi Pediococcus acidolactici excrte une pdiocine trs active contre Listeria
monocytogenes.
La nisine est active sur les bactries Gram positif et sur les spores . Soluble pH 2, elle prcipite
pH 7; elle est stable la chaleur en milieu acide. Elle provoque la lyse de la membrane cytoplasmique.
Produite par Streptococcus lactis, elle est utilise dans la fabrication de certains fromages et en
conserverie des doses voisines de 500 5000 UI / g.
%37
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lpp
SA
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-1
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1
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p
1
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3140
2080
2900
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4020
3440
3720
4140
4740
5280
5480
6180
6580
6780
5340
6640
7020
7400
7220
7780
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8660
8900
7600
8860
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9960
10160
9760
2
rlt{1
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m
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cm
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-1
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m
g
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dp
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sm
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lp
st
4
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xl
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np
CA
5
39
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2080
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3020
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2320
2520
2000
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1500
1820
2360
2680
2740
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3440
3820
4160
4040
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4620
4880
4980
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5720
5560
4680
3700
p
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0
mv
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LB
5
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10120
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1
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3020]B
3440]B
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SA
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g
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sc
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0
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x
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2
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p
e
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ZLB
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-0.4
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360
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12
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px
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1
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1
di
m
21
rdp
cY
rO
D
p
n
1
g
2
S
0
r1
page 55
La subtiline est stable de pH 2,5 7. Elle est active sur les bactries Gram positif et sur quelques
bactries Gram ngatif. Son activit sporostatique la fait utiliser dans lindustrie des conserves. Elle
est produite par Bacillus subtilis.
currentpoint
NH2
ILE DHB ALA

S
ILE DHA
LEU
ALA
MET
LEU
ALA
GLY
S
ABA
ALA
PRO
LYS
GLY
ABA
ALA
ALA
GLY
COOH
MET
34
LYS
ABA
ABA :acide amino butyrique

DHA : dhydroalanine
ALA-S-ALA : lanthionine
DHB : -mthylDHA
ABA-S-ALA : - mthyl lanthionine
DHA
ALA
ALA
LYS
S
VAL
HIS
ABA
S
HIS
ALA
SER
ILE
currentpoin
%
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e
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0
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w
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bW
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1
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pA
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2
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1
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m
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x
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-1
129
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5p
n
0
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0
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p
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p
LB
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1.2
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eLaser
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m
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17
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clip}b/Ct{bs
p-1
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aL
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OB
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Les pnicillines comprennent aussi des structures voisines de peptides.

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192837465
Il existe aussi des toxines comme la phallodine extraite de lamanite phallode qui sont des peptides.
Dans ce cas il sagit dun heptapeptide cyclique trs toxique (la Dose Minima Mortelle est de 50g
pour la souris).
Enfin signalons les peptides inhibiteurs : le trypsinogne pancratique est activ en trypsine par une
entrokinase ou par la trypsine aprs libration dun hexapeptide. Il en est de mme pour le
pepsinogne activ en pepsine et le chymotrypsinogne activ en chymotrypsine. Dans le lait la
plasmine issue du plasminogne joue un rle trs important .
page 56
IV. PRODUCTION ET UTILISATIONS DACIDES AMINES ET DE PEPTIDES
Il sagit l dun vaste march o saffrontent chimie industrielle et biotechnologie. Ainsi les acides
amins sont gnralement obtenus soit par voie chimique (mthionine) soit par voie microbiologique
(lysine) tandis que les petits peptides sont plus souvent fabriqus par synthse chimique et les peptides
de taille importante par biotechnologie.
Les acides amins et les peptides jouent un rle important dans les proprits fonctionnelles de nos
aliments et plus particulirement au niveau des proprits organoleptiques (saveur, got). Ces
composs apparaissent naturellement dans certains de nos aliments au cours de lhydrolyse des
protines lie des phnomnes de maturation ou daffinage. La dcouverte dacides amins, de
peptides et de drivs aux gots marqus (sucr, sal, etc.) permet actuellement le dveloppement dun
nouveau secteur dactivit de lindustrie alimentaire.
Si lintrt industriel de ces drivs sapides est trs important, leur rle nutritionnel ne lest pas
moins. En effet, ces composs sont utilisables par des consommateurs au mtabolisme dfaillant
(diabte, hypertension, problmes digestifs, etc.). De tels drivs contribuent par exemple assurer par
alimentation parentrale les besoins en protides de personnes malades.
Il faut signaler enfin que certains peptides produits au cours de la digestion possdent des activits
biologiques (activit opiace, immuno-stimulation, hypotenseur, etc.).
Nos connaissances et nos capacits de synthse stant considrablement accrues ces dernires annes,
il est donc trs vraisemblable que les acides amins et les peptides seront amens jouer, dans les
annes qui viennent, un rle de plus en plus important en sciences des aliments.
1. Les acides amins.
1.1. Production.
Actuellement la prparation dun acide amin est ralise partir dune protine naturelle lorsquil est
abondant dans cette protine et par ailleurs facile isoler. Il peut tre par ailleurs obtenu par synthse
chimique ou microbiologique. Le plus souvent, la synthse chimique conduit des racmiques
(mlange 50% de D et 50% de L), tandis que la synthse biologique permet lobtention disomres L
(ou D). Signalons encore quil est possible de marquer la molcule au cours de sa synthse en
incorporant un isotope radioactif (3H, 14C, 18O) ou lourd (13C, 15N) ce qui prsente un grand intrt
analytique en biochimie ou en nutrition.
Certains tissus animaux ou vgtaux contiennent un acide amin libre donn des teneurs leves,
acide amin qui peut alors tre facilement purifi. Par exemple il est possible dextraire 20 mg de LDOPA (3,4-dihydroxyphnylalanine) partir de 1 g de fve.
Jusqu ce jour, les acides amins synthtiss par voie chimique sont MET , PHE , SER , THR , TRP ,
ASN , CYS et GLY. Les mthodes de synthse chimique classique conduisent des racmiques, mais
des mthodes strospcifiques existent dj et devraient tre applicables industriellement dans les
prochaines annes.
Certains acides amins comme la L-cystine et la L-tyrosine sont purifis partir dhydrolysats de
protines. Ces acides amins peu hydrosolubles sont facilement spars dun hydrolysat acide de
page 57
protine (kratine des cheveux, des poils et phanres, plumes doiseaux ou volailles). La Lhydroxyproline est prpare partir dun hydrolysat de glatine. Ces mthodes sont de moins en
moins performantes par rapport aux mthodes de production microbiologique.
La production dacides amins par voie fermentaire est essentiellement lie la slection et la
disponibilit de souches performantes. La connaissance des voies mtaboliques est ncessaire pour
matriser cette production. Lacide glutamique est ainsi produit par Corynebacterium glutamicum ou
Brevibacterium flavum partir de mlasses de betterave ou de canne sucre additionnes de vitamines
et dammoniaque. Dans ces conditions, 500 g dacide L-glutamique sont obtenus partir de 1 kg de
saccharose. Des acides amins comme la L-lysine, la L-isoleucine, la L-thronine, la L-phnylalanine
et la L-tyrosine sont actuellement produits par biotechnologie.
Il existe des mthodes de production des acides amins par voie enzymatique. Ainsi lacide Laspartique peut tre obtenu par transformation du fumarate dammonium (matire premire dorigine
chimique) en prsence dammoniac et daspartase. Le rendement est voisin de 95%. La L-alanine est
obtenue par action de laspartate -dcarboxylase sur lacide L-aspartique ; le tryptophane est
synthtis partir dindole, de pyruvate et de tryptophanase. Ces mthodes prsentent lavantage de se
prter une production continue et linconvnient de voir lactivit enzymatique dcrotre souvent trs
rapidement dans le milieu.
1.2. Utilisations.
Les acides amins ont un got qui dpend essentiellement de leur configuration et de lhydrophobicit
de leur chane latrale (cf chapitre II.5.7.4). Gnralement seuls les acides amins chane latrale
carboxylique (ASP et GLU) sont acides sous forme dissocie, aucun acide amin libre nest sal (sauf
peut tre GLU). Certains acides amins ont un got sucr ( GLY , SER , THR ) et dautres un got
amer ( PHE , TYR , LEU , VAL , ILE ).
Les acides amins umamis sont sucrs avec un got de viande ou de bouillon de poule ( sels de
sodium de GLU et ASP).
Lacide glutamique et ses sels de sodium, de calcium, de potassium etc., sont dsigns sous le
vocable de glutamate. Il sagit dun compos naturellement prsent dans bon nombre daliments
comme le lait, les poissons, les viandes, certains lgumes. Sous forme libre il joue un rle dterminant
dans la sapidit et donc lacceptabilit de trs nombreux aliments. La tomate, la plupart des
champignons et le fromage, dont la teneur est importante, sont utiliss pour leur saveur dans de trs
nombreuses prparations culinaires.
Le monoglutamate de sodium, par ailleurs un excellent exhausteur ou releveur de got, contribue
lharmonisation de la flaveur de laliment. Il est utilis dans de trs nombreux aliments (soupes,
sauces, plats cuisins, charcuteries, salaisons, etc.) des teneurs comprises entre 0,1 1 % (P/P).
La glycine est utilise en industrie alimentaire mais aussi pour ses proprits tampons (comprims
dacide actyl salicylique). Possdant des proprits exhaustrices darmes, elle possde un got sucr
caractristique. Elle possde des activits antimicrobiennes qui la font utiliser en industrie fromagre
ou charcutire.
La L-lysine est produite par fermentation, sa production franaise annuelle pour 1994 tant denviron
40 000 T. Acide amin essentiel en nutrition, elle est utilise trs grande chelle en alimentation
animale avec des taux dincorporation voisins de 0,5 5 % (P/P).
Pratiquement tous les secteurs de production animale lutilisent (productions porcine, de volailles, de
lapins, de veau). Par ailleurs son utilisation dans le secteur alimentation danimaux domestiques
connat un grand dveloppement. Souvent limitante, son incorporation (supplmentation) permet
page 58
dquilibrer la composition en acides amins mais aussi de diminuer le taux protique de laliment ou
de substituer des protines de soja par des protines de crales (diminution des cots).
La supplmentation en lysine permet daugmenter la masse de viandes maigres (satisfaction du
consommateur par des viandes moins grasses) et dobtenir des rendements de croissance levs. Une
telle opration a des consquences conomiques videntes (excdents craliers mieux valoriss) et
cologiques (une diminution de 2% de la teneur en protines du rgime de porcins rduit de 25% leurs
rejets azots polluants).
2. Peptides.
Leurs utilisations en alimentation sont trs rcentes. Il faut signaler ici quil existe de nombreux
peptides biologiquement actifs qui sont directement issus de protines alimentaires. De nombreux
dipeptides ont des gots sucrs avec souvent un arrire got amer gnralement masqu dans les
produits mis disposition des consommateurs par laddition de glycine. Dautres ont des got sals,
acides, umami, ou amers.
2.1. Peptides sucrs.
Les cinq drivs de dipeptides dont la structure est indique ci-dessous ont des pouvoirs sucrants
respectivement gaux 200, 2000, 125, 100 et 170 fois celui du saccharose (de 1 5 ).
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NH
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NH
NH2
CH3
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CO
CO
CO
NH
CH3
(CH2)2
(CH2)2
CH
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
C
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L-Asp-L-Phe-O-mthyl
CH3
C
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L-Asp-D-Ala-O-npropyl
CH3
NH2
CO
NH
CH3
CH
CO
CH3
CH
CH3
CH3
L-Asp-D-Val-O-isopropyl
L-Asp-D-Val-O-npropyl
Laspartame nest pas stable en milieu aqueux quand la temprature dpasse 60C en particulier en
milieu acide. La stabilit est maximale pH 4 et en dessous dune teneur en eau de 10%. A des pH
acides ou de lordre de 7 8, laspartame nest pas stable (hydrolyse de la liaison ester, cyclisation) et
les drivs forms nont plus de pouvoir sucrant.
currentp
page 59
Il est souvent conseill den surdoser laddition dans certaines prparations culinaires pour tenir
compte de sa destruction partielle. Il faut par ailleurs veiller aux effets de sa consommation chez
certaines catgories de consommateurs car il peut engendrer une phnylctonurie ou encore un
urticaire par sa forme cyclise.
Utilis dans des prparations allges ou hypocaloriques en substitut du saccharose, il apporte 17 k.J
par g. La dose journalire admissible est de 50 mg/kg.
Il semble que sa prsence entrane chez certains sujets, une prise alimentaire plus importante par
action indirecte de la phnylalanine sur la scrtion de cholcystokinine.
**********************************************************************************
Quelques infos dactualit concernant lusage de laspartame

Cest au cours de la synthse dun produit pour la thrapie des ulcres que laspartame a t dcouvert
fortuitement en 1965 par le chimiste J.M. Schlatter. La synthse industrielle a fait lobjet du brevet US
n 3 492 131.
Il sagit de ldulcorant intense le plus employ. La Food and Drug Administration a autoris son
emploi dans les aliments en 1983 (48 FR 31376). Il est codifi E 951 en Europe. Il a ensuite t
commercialis sous le nom de Nutrasweet , puis Candrel, Pouss-suc, etc.
1 - Structure
Il sagit dun dipeptide : L-aspartyl-L-phnylalanine mthyl ester.
CH3
acide aspartique
HO
C
CH2
ester mthylique
O
NH2
C
CH
CH
NH
O
CH2
phnylalanine
La L-phnylalanine (acide amin essentiel est estrifie par du mthanol).

Il existe dans laspartame moins de 2 % de dictopiprazine.
2 - Pouvoir sucrant
Le pouvoir sucrant est denviron 180 200 fois suprieur celui du saccharose.
3 - Proprits physiques et solubilit

Il sagit dune poudre blanche, cristallise, sans odeur. Le poids molculaire est gal 294,3.
Le pouvoir rotatoire [a]D22 = 2,3 dans HCl N.
page 60
La solubilit dans leau est pH et temprature dpendante. Le maximum de solubilit est atteint pH
2,2 (20 mg/ml 25C) ; la solubilit minimale est atteinte au pHi soit pH 5,2 (13,5 mg/ml 25C).
4 - Valeur calorique et exemples dutilisations

Dans le tableau ci-aprs sont indiqus comme exemple les kcalories apportes par le saccharose et
laspartame dans un certain nombre de produits alimentaires.
aliment
kcal
saccharose
limonade
dessert glatine
gteau chocolat
boisson au lait
boisson non alcoolise
86
81
150
14
144
aspartame
4
10
75
7
1
Utilis pour les diabtiques, pour diminuer les caries, pour perdre du poids ou viter den gagner.
Dans quelques produits alimentaires, les doses de cet additif E 951 autorises sont par exemple les
suivantes (cf arrt du 2/10/97, annexe 2 pour plus de dtails) :
Produits
Boisson sans alcool base dextraits vgtaux,
darmes, de jus de fruits ( 50 kcal/l max) sans autres
sucres
Laits ferments, fromages frais
Laits aromatiss
Crmes desserts, desserts lacts, desserts glifis, flans,
entremets
Glaces, crmes glaces, sorbets
Produits de confiserie et de chocolaterie
Gommes mcher et chewing gums
Produits destins aux rgimes hypocaloriques ( 1000
kcal max)
Dose autorise
600 mg / l
600 mg / kg
600 mg / L
1000 mg / kg
1000 mg / L
3000 mg / kg
6000 mg / kg
100 mg / 100 kcal
5 - Stabilit
Elle est fonction du temps, de la temprature, du pH et de lactivit de leau (Dziezak, 1986 ; Bell et
Labuza, 1991 ; Tsoubeli et Labuza, 1991 ; Homler, 1984 ; Graves et Luo, 1987 ; Graves et Luo, 1987 ;
Huang et al., 1987 ; Neiderauer, 1998).
La stabilit de laspartame ltat sec est excellente ; 105C une perte denviron 5 % traduite par la
formation de dictopiprazine est observe aprs 100 heures de traitement. A 120C, une perte de 50%
est obtenue au bout de 80 heures de traitement.
En milieu hydrat, les tempratures leves induisent des hydrolyses, ce qui rend le produit
inutilisable dans les aliments chauffs (cuisson, strilisation, etc).
La stabilit est bonne entre pH 3 et 5 ; elle est maximale pH 4,3.
En-dessous de pH 3,4 cest lhydrolyse du dipeptide qui est observe.
Au-dessus de pH 5,0 cest la cyclisation en dictopiprazine qui intervient.
Dans les deux cas cette transformation se traduit par la perte du pouvoir sucrant.

NH2
page 61
CH2
CH
CH
C
CH3
HO
C
CH2
+ CH3OH
NH
aspartame
NH2
CH2
CH
CH
C
CH2
NH
H2O
HO
C
L-aspartyl-L-phnylalanine
O
NH
HO
C
CH2
C
CH
CH
C
O
H2O
CH2
NH
driv dictopiprazine
O
O
NH2
HO
C
acide aspartique
CH2
CH
C
CH
CH2
NH2
phnylalanine
C OH
O
O
Dans les aliments teneur en eau faible ou intermdiaire (activits de leau comprises entre 0,34 et
0,66), la stabilit maximale est observ pH 5,0. Lnergie dactivation de la raction de dgradation
est voisine de 30 kcal.mole-1.
Dans les produits pH compris entre 6 et 7 et pour des temprature comprises entre 70 et 100C, la
destruction suit une cintique dordre apparent gal 1 avec une nergie dactivation denviron 17
kcal.mole-1. Les augmentations de pH et force ionique se traduisant par une augmentation de la vitesse
de dgradation. A ces pH, des pertes significatives sont observes au cours de lentreposage 4 et
30C (Tsoubeli et Labuza, 1991).
Au cours du chauffage en prsence de glucose, laspartame donne la raction de Maillard et 4 bases de
Schiff sont formes (Huang et al., 1987).
Dans les boissons non alcoolises carbonates, la stabilit de laspartame est excellente (> 6 mois
temprature ambiante).
Dans les produits congels la stabilit est bonne mme dans les zones de pH sensibles entre 6 et 7.
6 - Stabilit microbiologique
Laspartame peut tre considr comme stable au plan microbien alimentaire .
Il nest pas caryogne (American Dental Association).
Dans les yaourts (cultures mixtes de Lactobacillus bulgaricus et de Streptococcus thermophilus), il
apparat que la vitesse de dgradation de laspartame est lie la croissance. Il napparat pas de
diffrence entre les deux souches. Globalement, moins de 10 % de perte sont observs aprs 6
semaines dentreposage des yaourts ltat rfrigr. On considre que laspartame est stable dans le
yaourt sil est ajout aprs fermentation (Keller et al., 1991).
7 - Pouvoir exhausteur darme

Laspartame est un exhausteur darmes dans produits fabriqus base de citrons et oranges. Cette
interaction est pH dpendante.
page 62
8 - Mtabolisme
Le mtabolisme de laspartame est celui des protines et peptides : il conduit la libration de
phnylalanine, dacide aspartique et de mthanol. La phnylalanine tant intolrable par certaines
catgories de consommateurs (phnylctonurie), un tiquetage adapt est ncessaire.
Laspartame est mtabolis comme un nutriment mais sa quantit utiliser est faible et il peut tre
considr comme virtuellement non calorique. Considr comme un protide, il apporte 4 kcal.g-1.
9 - Evaluation toxicologique de laspartame

De trs nombreux travaux ont t raliss pour valuer les effets biologiques et lventuelle toxicit de
laspartame (Potts et al, 1980 ; Bianchi et al, 1980 ; Saunfers et al., 1980 ; Lennon et al, 1980 ;
Aspinal et al., 1980 ; Stegink , 1987 ; Renwick, 1985).
En introduction il faut savoir que la consommation de 19 mg daspartame (quantit sucrante dune
tasse de caf ou de th) produit environ 7,6 mg daspartate, 9,5 mg de phnylalanine et 1,9 mg de
mthanol. En comparaison, un bol de lait (250 ml) produit 528 mg dacide aspartique, 542 mg de
phnylalanine, tandis quun verre de jus de tomate gnre 47 mg de mthanol soit lquivalent de 25
boissons sucres laspartame (Vetsch, 1985).
A ce jour, les travaux scientifiques et mdicaux raliss nont jamais permis de suspecter directement
de risques toxicologiques.
A la dose de 5 000 mg / kg.jour aucune toxicit na t mise en vidence. En administration chronique,
il na jamais t dcrit de pathologie tumorale, de lsion organique et de variation des constantes
biologiques.
Aucune action nfaste na t mise en vidence chez les rats nouveaux-ns traits ni chez des rats ns
de mre traits et traits eux-mmes jusqu 2 ans aux doses de 2 4 g / kg.jour. De mme les tudes
des pouvoirs mutagne, carcinogne, tratogne ainsi que ltude de la fertilit se sont rvles
ngatives tant pour laspartame que pour le driv dictopiprazine.
La dose de 5 000 mg / kg.jour stant rvle dnue de toute toxicit, la DJA a t fixe 40 mg /
kg.jour ou encore de 2800 mg daspartame par jour pour un adulte de 70 kg (et de 600 mg pour un
enfant de trois ans). A pouvoir sucrant quivalent, cette DJA correspond la consommation de 560 g
de saccharose par jour, soit environ 11 fois plus que la consommation moyenne de sucre en France.
Rappelons quaujourdhui les ingrs daspartame sont considrablement infrieurs la dose
maximale recommande.
On est donc trs en-dessous dun risque quelconque de toxicit.
Brunner et al. (1979) ont montr quune consommation daspartame (2 6 % du rgime) pendant 90
jours na pas deffet sur la gestation. Les effets dfavorables observs correspondent ceux dune
ingestion quivalente de phnylalanine.
La recherche des ventuels effets cancrignes de laspartame a fait lobjet de nombreuses recherches ;
trs rapidement mtabolis in vivo en mtabolites naturels non cancrignes, laspartame nest pas
considr comme carcinogne.
Shephard et al (1994) ont mis en vidence un effet mutagne de laspartame aprs nitrosation, effet
par ailleurs trs infrieur celui rsultant de la nitrosation dun ttrapeptide stomacal (CCK ou
cholcystokynine).
Les plaintes des consommateurs

Elles rsultent souvent dinformations mdiatiques mal matrises. Les nombreux et varis effets
secondaires ainsi dcrits sont apparus au fur et mesure de son utilisation : troubles gastro-intestinaux
(nauses) et surtout neuro-psychiques (troubles de lhumeur : anxit, irritabilit, dpression ; vertiges,
insomnies et cphales), troubles qui pourraient ventuellement tre attribus ses mtabolites : acide
aspartique, phnylalanine, mthanol et driv dictopiprazine.
Ces plaintes rvlent aussi que laspartame serait impliqu dans des pathologies graves comme la
sclrose multiple, le lupus erythmateux, le syndrome de la guerre du golfe, le syndrome de fatigue
page 63
chronique, et certaines formes de diabte. Dans toutes ces implications, lanecdotique est dominant
et il nexiste pas de preuves scientifiques mettant en cause laspartame.
Il faut nanmoins ragir ces tats de fait. Aux USA, la Food and Drug Administration a examin les
plaintes impliquant laspartame depuis 1985 et son analyse montre que laspartame na jamais pu tre
mis directement en cause.
Dautres articles mettent en cause le mthanol, cet alcool tant toxique aprs ingestion de relativement
grandes quantits. Il en sera question dans lanalyse des effets des mtabolites dcrite plus loin.
En 1984, le Center for Disease Control a analys les plaintes des consommateurs. Aprs plusieurs
mois dtudes, il a conclu que la majorit des symptmes avancs sont communs la population
gnrale. Ainsi les tudes de plus de 500 plaintes par le Centre of Disease Control dAtlanta na pas
permis de corrler lusage de laspartame avec les symptmes dcrits (Anonymous, 1986).
En Grande Bretagne, le Committe on Toxicity (COT) a expertis laspartame en 1982 puis en 1992. Il
en a conclu la non toxicit de cet dulcorant peptidique. Le World Health Organisation et la
Commission Europenne ont abouti la mme conclusion.
Nanmoins un article de 1996 laisse supposer que la consommation daspartame est corrle avec
lapparition de cancers crbraux. Cet article, soumis des experts comptents qui lont analys,
mettent de grandes rserves sur la qualit et la rigueur des rsultats prsents. Ainsi pour Bradley et
al. (1997), il apparat vident, aprs lecture et analyse de larticle concern, que laspartame nest pas
cancrigne.
Nanmoins, il continue toujours d apparatre des articles qui sment le doute sur la scurit de cet
dulcorant.
La Food Standard Agency (FSA) prend en considration tous les articles ddis cet additif. Par
exemple il sagit dexpertiser les travaux raliss au Kings College London qui montreraient que
laspartame et dautres composs alimentaires auraient un rle putatif dans les cancers crbraux. En
ralit, les recherches sur ce thme nen sont qu leur dbut et ce nest que bien plus tard que leurs
rsultats plus tays devraient tre prsents et analyss.
10- Evaluation de lventuelle toxicit des mtabolites.

Except le driv dictopiprazie, les autres composs sont naturellement prsents dans les aliments
ou forms au cours de la cuisson ou de lentreposage.
Laspartate est interconverti in vivo en glutamate. Les tudes ralises ce jour nont pas montr
deffets toxiques de ces deux drivs.
La phnylalanine
Dans le cas de malades prsentant une phnylctonurie (maladie gntique qui affecte 1 personne sur
10 000), la phnylalanine acide amin essentiel, nest pas normalement mtabolis . Elle
saccumule alors dans le sang et le cerveau en y provoquant des dommages. Pour les personnes saines,
cet effet nexiste pas mme aprs ingestion dune dose trs importante daspartame. Prsent au niveau
crbral haute concentration, la phnylalanine peut perturber le mtabolisme des autres acides
amins impliqus dans la biosynthse de neurotransmetteurs. La phnylalanine inhibe ainsi la
biosynthse de monoamines.
Des essais cliniques raliss sur des adultes et des enfants (doses de 34 1800 mg / kg) pendant 21
semaines nont pas mis en vidence de diffrence de comportement.
Les cphales reprsentent 20% des plaintes spontanes dutilisateurs daspartame aux USA (sur 30
000 plaintes en 10 ans). Cest la phnylalanine rsultant de lhydrolyse in vivo qui, ingre seule,
pourrait atteindre plus facilement le cerveau et perturber les transmissions nerveuses voire les
rgulations hormonales. Le rle de la phnylalanine dans la phnylctonuries est par contre bien
tabli ; cette maladie hrditaire entrane une dficience intellectuelle svre : la mention contient de
la phnylalanine est obligatoire sur ltiquetage.
Le mthanol
Il est libr par hydrolyse de la liaison ester (dans les boissons gazeuses ou dans le tractus digestif)
reprsente environ 10 % en poids de laspartame. Le mthanol est naturellement prsent dans les
aliments dans les jus de fruits, les pommes de terre cuites, et les boissons alcoolises ; il sagit dun
mtabolite normal de la digestion de lhomme. Il est mtabolis en formaldhyde qui est rapidement
dgrad en formate.
page 64
La consommation daspartame raison de 34 mg / kg.jour ne se traduit pas par une augmentation du

formate sanguin ; le formate est limin par voie urinaire. Dans ces conditions la concentration
enmthanol sanguin est infrieure 0,4 mg/ 100 ml, limite de dtection. Une ingestion de 200 mgt / kg
se traduit par une mthanolmie de 2,1 mg / 100 ml 8 heures aprs consommation ; aprs 24 heures la
mthanolmie est nulle.
Le driv de la dictopiprazine.
Produit par chauffage, ce driv nest pas naturellement prsent dans nos aliments. Ce compos na
pas deffets carcinognes ou mutagnes. Le dernier risque connue : les allergies imputables la
dictopiprazine qui apparat au cours de la dcomposition de laspartame en milieu acide (jus de
fruits, colas)
Les tudes toxicologiques (aspartame et dictopiprazine) montrent que ces produits sont dpourvus
de toute toxicit, et ce, des doses de 5 g /kg.jour.
10- Son statut
Ltiquetage des produits qui contiennent de laspartame doit clairement indiquer sa prsence (avec
dulcorant ).Les produits qui contiennent la fois des sucres et des dulcorants doivent porter la
mention avec sucre et dulcorant . Par ailleurs, les produits qui contiennent de laspartame doivent
porter lindication contient une source de phnylalanine .
Lalitame, plus stable que laspartame, connat un grand succs. Sa solubilit dans leau est trs bonne
et sa stabilit thermique et aux pH acides est plus grande que celle de laspartame.
Le notame est en phase finale dautorisation.
2.2. Peptides sals.
Il existe des peptides

sals
dont
le
dfaut
majeur
est
dtre
amers.
Parmi
ceux-ci
lornithyl-taurine,
qui
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L/gr/grestore
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gr
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as
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D
4
l0
donne un got sal en absence dions sodium, permettrait de par son utilisation de saler les aliments
dans les rgimes sans currentpoint
sel.
O
CH2
NH3+
CH2
CH2
NH
CH
CH2
NH3+
CH2
SO3-
currentpoint
192837465
2.3. Peptides umamis.

Ce sont des peptides dans lesquels le rsidu L-GLU est en position N-terminale et est associ un
acide amin acide. Il existe cependant des peptides umamis qui ne rpondent pas cette caractristique
(par exemple SER-PHE). Lhydrolyse des protines de soja gnre un tripeptide GLU-GLU-SER au
got umami marqu.
2.4. Peptides acides.
Ils contiennent un ou plusieurs rsidus ASP et/ou GLU dans leur squence.
2.5. Peptides amers.
page 65
Ces peptides contiennent dans la plupart des cas des acides amins hydrophobes, lamertume tant
plus intense quand le rsidu hydrophobe est en position C-terminale et quun acide amin basique est
en position N-terminale. Le peptides ARG-PRO est amer et loctapeptide ARG-ARG-PRO-PROPRO-PHE-PHE-PHE trs amer.
Les dictopiprazines (cyclo LEU,TRP ; cyclo GLY,PHE ; cyclo PRO,LEU ; cf chapitre II.6.6)
formes au cours de certains traitements technologiques sont respectivement lorigine de lamertume
dhydrolysat de casine, du chocolat ou du sak.
2.6. Peptidesalimentaires activit biologique.
Les protines alimentaires peuvent, en cours de digestion, conduire la libration de peptides actifs.
Cest par la corrlation tablie entre le rgime alimentaire et certaines maladies psychiques comme la
psychose schizophrnique, que cette recherche de peptides actifs a t initie. De trs nombreuses
relations structure-fonction ont t tablies ; on nen indiquera que quelques unes (tableau 8).
tableau 8. Origine et relations structure-fonction de peptides alimentaires
protine
hydrolyse
casine
bovine
multiple
peptide
casomorphine-5
60TYR-PRO-PHE-PRO-GLY 64
casomorphine-7
60TYR-PRO-PHE-PRO-GLY-PRO-ILE66
trypsine
177 ALA-VAL-PRO-TYR-PRO-GLN-ARG183
trypsine et
chymotrypsine
casine ! s1
bovine
63PRO-GLY-PRO-ILE-PRO-ASN68
pepsine
exorphines
90ARG-TYR-LEU-GLY-TYR-LEU-GLU96
90ARG-TYR-LEU-GLY-TYR-LEU 95
91TYR-LEU-GLY-TYR-LEU-GLU96
hmoglobine trypsine et
chymotrypsine
hmorphine 4
34TYR-PRO-TRP-THR37
activit
analgsie
fixation sur le rcepteur
des opiaces
inhibition des
contractions utrines
augmentation de la
rsistance l'infection
inhibition de l'adnylate
cyclase
inhibition de
contractions musculaires
fixation sur rcepteur
opiac
Il existe une corrlation entre la consommation de crales et de lait et des dsordres mentaux , la
polyarthrite rhumatode et la maladie cliaque. Aprs limination de la gliadine du rgime les
symptmes disparaissent en absence de lait.
2.7. Peptides activits diverses.
Des peptides riches en P-SER issus des casines sont dexcellents transporteurs de cations, dautres
sont de puissants anti-thrombiques ou anti-hypertenseurs.
page 66
V. DETERMINATION DES POIDS MOLCULAIRES

Lvaluation du poids molculaire dune protine inconnue est une des premires tapes de son
identification. Ainsi, en biochimie des protines, en enzymologie ou encore en technologie des
protines, lanalyste se trouve frquemment en prsence de mlanges protiques, et la dtermination
de la masse molaire de chacun des composants du mlange permet un suivi des oprations analytiques
ou technologiques, la caractrisation de ces molcules et contribue par ailleurs la dtermination de la
qualit ou de la puret des divers produits obtenus.
Le poids molculaire depetitscomposs est dterminable par des mesures de proprits physicochimiques de leur solution comme llvation de la temprature dbullition, la diminution du point
de conglation, la pression osmotique. Les protines de poids molculaire trs lev ne peuvent tre
mises en solution qu des niveaux trs dilus. Or il faudrait prparer une solution irraliste contenant
plus de 5 kg/l de protine de masse molculaire 100 000 D pour mesurer une diminution de 0,1C du
point de conglation.
Ce sont donc des mthodes mieux adaptes aux macromolcules qui doivent tre utilises. Elles
peuvent tre classes en deux groupes:
les mthodes chimiques reposant soit sur lanalyse de certains lments ou acides amins soit
sur la combinaison avec un ractif appropri.
les mthodes physicochimiques qui peuvent tre elles-mmes classes en trois catgories:
- celles bases sur les proprits colligatives des solutions qui dpendent surtout du nombre
de molcules prsentes dans un volume donn (mesure de la pression osmotique, proprits de films
monomolculaires),
- celles bases sur le poids rel des molcules prsentes (sdimentation lquilibre, mesure
de la viscosit et de la diffraction de la lumire),
- celles bases sur le volume hydrodynamique de la molcule protique (chromatographie et
lectrophorse).
La plupart de ces mthodes ne sont applicables qu des prparations protiques pures, seules certaines
dentre elles sont applicables des mlanges protiques (sdimentation lquilibre, chromatographie
et lectrophorse).
1. Dfinitions.
La masse molculaire est exprime en Dalton ( pour une molcule vraie).
John DALTON proposa en 1807 un systme de masse atomique dont lunit est la masse de latome
dhydrogne soit 1,663.10-24 g. Aujourdhui le Dalton comme unit de masse est dfini par rapport
latome 12C qui est attribu une masse de 12 Daltons. Le Dalton a donc une masse de 1 g / N, soit de
1 g / 6,02.1023 soit de 1,663.10-24 g.
Le poids molculaire est dfini comme le rapport masse de la molcule
dun atome de carbone. Il sagit dun nombre sans dimension.
douzime de la masse
La masse molaire M est la masse de substance contenant autant dunits lmentaires quil y a
datome dans 12 g de 12C. Elle est exprime en g.mole-1 et est numriquement identique une masse
molculaire exprime en Dalton (pour 6,02.1023 molcules vraies).
page 67
Lintrt de lusage du Dalton est quil peut tre utilis pour dfinir la masse de structures pour
lesquelles le terme molculaire est impropre ( par exemple ribosomes, virions).
2. Mthodes chimiques.
2.1. Dosage dun ou plusieurs composants de la molcule.
Il est possible de dterminer la masse molaire minimale dune protine pure cest dire la masse
quaurait la molcule si elle ne contenait quun atome dun lment analys (P, Cu, Fe etc.) ou encore
si elle ne contenait quun rsidu dun acide amin considr, acide amin gnralement choisi en
raison de sa trs faible contribution ldifice protique .
Mmin = Mconstituant x 100
% du constituant
quation 23
Exemple : Lhmoglobine contenant 0,335 g de fer (Fe masse atomique 56 ), sa masse molaire
minimale est gale : ( 56 / 0,335 ) . 100 = 16 700. En ralit sa masse molaire est de 16700 . 4
= 66800 car la molcule contient 4 atomes de fer.
Exercice : Lanalyse des acides amins du gluten donne les rsultats suivants :
TRP
1,68 g/100 g
TYR
4,50 g/100 g
acide hydroxy glutamique 1,80 g/100 g
Quelle est la masse molaire du gluten ?
La mthode de DELAAGE (B.B.A., 1968, 168, 573-575) permet le calcul de la masse molaire partir
de la composition en acides amins . La fonction
Y = !i ( ni - 1 )2
Ni
quation 24
Poids molculaire
minimum le plus probable
dans laquelle ni est le nombre de rsidus analyss pour une masse molaire arbitraire choisie et Ni le
nombre entier de rsidus le plus proche de ni. Le trac de Y en fonction des diverses masses molaires
choisies passe par des mimina dont le plus bas correspond la masse molaire de la protine (figure
19).
Poids molculaire choisi

figure 19. Dtermination graphique du poids moculaire par la mthode de Delaage.
Si lanalyse est exacte, la fonction Y passera par des minima gaux 0 (masse molaire vraie et ses
multiples entiers).
2.2. Combinaison avec un ractif.
Le poids molculaire minimum est le poids de protine ragissant avec une molcule-gramme dun
ractif chimique appropri (un acide, une base, un ractif spcifique). Par exemple 1 g dovalbumine
se combine avec 0,9 mEq dacide. Le poids molculaire minimum est de 1 / 0,87.10-4 soit de 1150.
page 68
3. Mthodes physico-chimiques ou physiques .

Si le systme est polydisperse (plusieurs protines de masses molaires diffrentes) le poids
molculaire dtermin sera un nombre moyen. Par dtermination base sur les proprits colligatives
des solutions qui dpendent surtout du nombre de molcules on obtient:
Mn=!niMi avec
ni= Ni soit Mn=! NiMi
quation 25
!Ni
i ! Ni
i
Ni est le nombre de molcules prsentes de la protine i.
Mi est le poids molculaire de la protine i.
Pi est le poids de cette protine i.
ni est la proportion de molcules de i
Par ailleurs on a : Ni= Pi

Mi
Par les mthodes bases sur le poids rel des molcules prsentes on obtient :
2
Mp = ! "i.Mi avec "i = Pi soit Mp = ! PiMi soit Mp = ! NiMi
quation 26
!Pi
i
i !Pi
i ! NiMi
Il est possible de calculer en % et dans ces conditions on a :
! x (%).Mi
quation 27
Mn = i
100
Si on considre un mlange de deux protines (systme polydispers) constitu de 25 % de protine de
poids molculaire 25000 et de 75 % de protine de poids molculaire 20000 le calcul donne:
Mn = 25.25000 + 75.20000 = 21250

100
et
Mp =
25.(25000)2 + 75.(20000)2
= 21470
25.25000 + 75.20000
On a Mp > Mn mais par viscosimtrie on obtient souvent Mp > Mv >Mn.

En gnral les protines en solution constituent un systme monodispers, mais des associations
peuvent se produire et la comparaison des masses obtenues par les deux types de mthodes permet de
dtecter les phnomnes dassociation / dissociation.
Parmi les nombreuses mthodes existantes on peut signaler :
3.1. Mesure de la pression osmotique.
Un systme compos dune solution aqueuse de protine spare dun compartiment deau par une
membrane semi-permable (permable leau, impermable aux protines) nest pas en quilibre.
Lactivit de leau dans la solution protique est infrieure celle du compartiment eau, et leau a
donc tendance traverser la membrane vers la solution de protine. Il en rsulte une diffrence de
pression qui est la pression osmotique (figure 20).
po
! = p - po
eau
eau +
protine
figure 20. Schma de mesure de la pression osmotique.
Vant Hoff a montr que pour des solutions trs dilues on a : = C.R.T
quation 28
tant la pression osmotique, R la constante des gaz parfaits, T la temprature absolue, C la
concentration molaire de la solution. Dans le cas dune solution idale infiniment dilue on peut crire:
quation 29
(c est la concentration en g.l-1)
! = c R T soit M = c R T
M
!
page 69
Il est donc possible de calculer le poids molculaire dun solut (ou le poids molculaire moyen
dun mlange) en mesurant .
Souvent les valeurs dtermines exprimentalement sont suprieures celles issues de lquation 29.
En fait /c normalement constant et appel pression osmotique rduite varie en fonction de la
concentration. Sa mesure diffrentes concentrations permet de construire un graphe /c en fonction
de c dont lextrapolation la valeur de c = 0 permet daccder Mm .
Avec les solutions de protines, lquilibre de Donnan li des transferts de charges complique les
phnomnes en modifiant la diffusion des ions au travers de la membrane. Pour le minimiser il est
possible de se placer au pHi, mais alors la solubilit de la protine est minimale et des agrgats
peuvent se former. Par ailleurs lquilibre ntant pas instantan, il est frquent que des agrgats
apparaissent au cours de cette phase.
3.2. Sdimentation.
Les ultracentrifugeuses modernes permettent datteindre des acclrations suprieures 500 000 g (la
force centrifuge est gale F = m.2.r avec m masse de la substance, vitesse angulaire et r rayon de
rotation). Dans de tels champs de force les protines qui ont des densits gnralement suprieures
celle de leau (1,2 1,4) vont sdimenter contre les forces de diffusion qui les maintiennent
normalement en solution, forces dpendant entre autre de lagitation thermique. Les molcules
protiques tant volumineuses, les frottements sont importants et leur diffusion sopre lentement, les
constantes de diffusion des protines tant une centaine de fois plus faible que celle des ions et des
petites molcules organiques. Places dans un champ gravitationnel intense les protines se dplacent
alors, la vitesse de sdimentation tant fonction de nombreux paramtres parmi lesquels on peut citer
: la force applique, la taille - forme - densit des molcules protiques, la densit - temprature viscosit du solvant (figure 21).
Axe de rotation
Solution
protique
homogne
dC
dr
0
dC
dr
r
Solution
protique
polydispers
e
dC
dr
dC
dr
0
r1
dC
dr
dC
dr
r1
r2
r2
figure 21. Ultracentrifugation dune solution protique pure ou dun mlange.
page 70
Svedberg a soumis des molcules protiques en solution une ultracentrifugation. Les molcules
mises en mouvement sdimentent, le phnomne pouvant tre suivi par la mesure des variations
dindice de rfraction de la solution en fonction de la distance r laxe de rotation. Dans le cas dune
solution monodisperse les molcules sdimentent sensiblement avec la mme vitesse et il y a
formation dune seule zone dans laquelle la concentration en protine varie entre 0 et c. Le systme
optique de mesure permet de suivre le dplacement du pic correspondant aux variations de la drive
dc / dr. La vitesse de sdimentation correspondant la vitesse de dplacement du pic est gale :
r2 -r1 ou dr
t2 -t1
dt
quation30
La constante de sdimentation ou coefficient de sdimentation s qui reprsente la vitesse de

sdimentation dans un champ unit est gal :
s = dr . 1
dt !2 . r
quation 31
F = m2r
soit 1 / 2 r = m / F
avec : vitesse angulaire en radians par seconde, r distance laxe de rotation en cm, t le temps en
seconde.
Le coefficient de sdimentation s exprim en unit Svedberg (= 10-13 sec) pour un solvant donn dans
des conditions de temprature donnes, est une caractristique dune protine. Ce coefficient augmente
avec le poids molculaire mais il ne lui est pas proportionnel car il est influenc par la forme de la
particule et les rsistances par friction du solvant.
Le calcul du poids molculaire M requiert la dtermination pralable de la constante de diffusion D, de
et de s. La dmonstration sera donne en V.3.4 . On peut crire:
M = R.T.s
D (1 - ! ")
quation 32
avec R constante des gaz parfaits, T temprature absolu, s vitesse de sdimentation en unit Svedberg,
volume spcifique partiel de la protine et masse volumique du solvant.
Une mthode de dtermination des poids molculaires plus laborieuse seffectuant vitesse moins
leve et ne ncessitant pas la mesure de la constante de diffusion D consiste trouver les conditions
dans lesquelles il y a quilibre de sdimentation, la sdimentation compensant la diffusion. Cette
mthode nest applicable qu une protine pure et on peut crire:
2 R.T.ln C2
C1
M=
2
! (1 - ".#) (r22 - r21 )
quation 33
dans laquelle C1 et C2 sont les concentrations aux distances r1 et r2 et la vitesse de rotation en

radian par seconde. Dans ces conditions le transport du solut d la sdimentation par centrifugation
est quilibr par la force de diffusion en retour. La dure de cette mthode longue, lquilibre tant
difficile atteindre, est amliorable si on effectue des calculs pendant la priode o lquilibre
commence se faire. Lutilisation largement rpandue de solutions de densits leves et proches de
celles des protines (chlorure de csium, saccharose) distribues en gradient de concentration dans les
tubes centrifuger permet des dterminations relativement rapides des masses molaires. Cette
centrifugation en gradient de densit est qualifie de zonale quand elle est ralise dans des tubes
prpars au pralable (figure 22).
page 71
mlanges de
protines dans
l'eau
20 %
20 %
60 %
60 %
avant centrifugation
aprs centrifugation
gradient de saccharose
prform
figure 22. Ultracentrifugation en gradient de densit
La centrifugation est arrte quand lquilibre est atteint. La position des bandes protiques est
localise par des moyens optiques ou par recueil minutieux de fractions du contenu du tube aprs
perage par sa partie infrieure. Le gradient de densit peut tre ralis en cours de centrifugation : la
technique est alors qualifie disopycnique.
3.3. Diffusion et coefficient de diffusion.
La diffusion est une consquence du second principe de la thermodynamique pour lequel tous les
processus tendent vers une augmentation dentropie, cest dire de distribution au hasard. La vitesse
de diffusion est donne par la premire loi de Fick :
ds = - D.A. dc
dt
dx
quation 34
la quantit de solut ds diffusant travers la surface A pendant dt est proportionnelle au gradient de
concentration dc/dx en ce point. La diffusion seffectuant vers la zone la moins concentre, le signe de
cette expression est ngatif. D, constante de diffusion, sexprime en cm2.sec-1 . D est fonction de la
taille, de la forme (il est inversement proportionnel au rayon de la protine et donc inversement
proportionnel la racine cubique de son poids molculaire), des rsistances de friction dues la
viscosit du solvant.
Le coefficient de diffusion des protines est dtermin par leur vitesse de migration dans une cellule
adapte (figure 23).
solution
protique
distance
solvant pur
temps 0
aprs x heures
temps infini
1
0,5
concentration relative des protines
figure 23. Mesure de la diffusion dune protine en solution
EINSTEIN a tudi en thorie la diffusion de particules de taille importante et parfaitement sphriques

animes de mouvements browniens et a montr que:
page 72
D = RT . 1 = RT
N f
F
quation 35
Pour une vitesse de dplacement dune sphre gale 1 cm.sec-1 produite par le liquide, f, rsistance
au dplacement est la force de friction exerce sur une molcule. F est le coefficient de friction
molaire et N le nombre dAvogadro. Par ailleurs la loi de STOCKES donne la rsistance au
dplacement :
f=6! ! r
quation 36
avec viscosit du liquide et r rayon de la particule sphrique.

Le volume dune particule sphrique est gal 4/3 r3 et celui dune protine sphrique :
1
4 ! r3 . N
volume d'une protine sphrique : M.! d'o ! =
et r = 3 M ! 3
N
3M
4!.N
quation 37.
En combinant les quations 35, 36, 37 on peut crire :
1
D = RT . 1
= RT .
N 6! !r
N 6 ! ! 3 3 M."
4 !.N
quation 38
Les valeurs de D et s pour quelques protines sont indiques dans le tableau 9.

Tableau 9. Valeurs de D et S pour quelques protines.
protine
cytochrome C
myoglobine
chymotrysinogne
-lactoglobuline de chvre
ovalbumine
srum albumine bovine
hmoglobine humaine
catalase de foie de cheval
urase de fve
fibrinogne humain
collagne
myosine de morue
virus de la mosaque tabac
Poids
molculaire
13370
16900
23240
37100
45000
68500
64500
247500
482700
339700
480000
524800
40590000
coefficient de
diffusion D
coefficient
de
sdimentation
D2 0 . 107 cm2 s -1
S2 0.101 3
11,4
11,3
9,5
7,48
7,76
6,1
6,9
4,1
3,46
1,98
0,69
1,10
0,46
1,17
2,04
2,54
2,85
3,32
4,60
4,46
11,3
18,6
7,63
6,43
198
3.4. Calcul du poids molculaire par sdimentation.

Lquation 37 montre que la seule mesure du coefficient D ne permet pas daccder M, et il faut
associer D et s (constante de sdimentation) pour y parvenir.
Une particule de masse M et de volume partiel spcifique (volume de lunit de masse) soumise
une force centrifuge dans un milieu de masse volumique a une masse apparente gale M diminu
de la masse de volume de liquide dplac, soit de M - M.. = (1 . ). Cette particule centrifuge
est est en fait soumise une force nette correspondante :
F = (1 . ) . 2 r
quation 39
La sdimentation de cette particule est freine par les frottements avec les molcules de liquide
solvant, ces forces tant proportionnelles la force de friction f et la vitesse de la particule dr / dt .
Dans ces conditions chaque instant on peut crire :
page 73
M (1 - !." ) . #2 r = f . dr
dt
quation 40
Apartir de lquation 35 et pour une mole (N = 1) on a:
2
RT
RT dr
RT
dr
f=
ce qui donne M (1 - !." ) . # r =
.
soit M =
. .
D
D dt
M (1 - !." ) dt
1
2
# r
quation 41
Si on pose
M = R.T.s
s = dr . 1
D (1 - ! ")
dt !2 r (quation 31) on retrouve bien lquation 32 :
s a la dimension dun temps (vitesse / acclration) ( F = m = m 2r).
Le volume spcifique partiel est mesur par picnomtrie ou par calcul approximatif partir de la
composition en acides amins. Sa valeur pour la plupart des protines est comprise entre 0,7 et 0,75
cm3.g-1 (tableau 10).
tableau 10. Volume spcifique partiel de quelques protines.
protine
! (ml/g)
protine
! (ml/g)
hmoglobine
ovalbumine
srum albumine
catalase
0,750
0,748
0,734
0,730
myosine
ribonuclase
collagne
lysozyme
0,728
0,728
0,695
0,688
Si on connat M et s par diffrentes mthodes, on peut calculer Do. La comparaison avec la valeur
exprimentale de D permet destimer la sphricit de la molcule, donc daccder sa forme ou son
hydratation . Ainsi le rapport Do / D = f / fo est pour quelques protines donn dans le tableau 11.
tableau 11. Rapport de friction pour quelques protines.
protine!
hmoglobine! !
ovalbumine! !
srum albumine!
-lactoglobuline!
f / fo!
protine!
f / fo
1,14!
1,17!
1,35!
1,25!
!
!
!
!
myosine!
ribonuclase!
collagne!
fibrinognee!
!
!
!
!
3,53!
1,14!
6,8
2,34
3.5. La chromatographie dexclusion.

La chromatographie d'exclusion, ou gel filtration ou gel permation est fonde sur la rtention
des molcules de solut en fonction de leur taille en raison de leur pntration dans les pores, remplis
de solvant, d'une phase stationnaire approprie. Si on suppose que les molcules de solut ne
prsentent aucune affinit pour les parois de la phase stationnaire particulaire, les grosses molcules ne
pourront pas pntrer dans les pores ; elles migreront plus rapidement que les petites molcules qui
peuvent, quant elles, pntrer dans un plus grand nombre de pores (figure 24).
page 74
molcules de solut
Figure 24. Chromatographie d'exclusion. Schma de "trajet " d'un solut de masse molaire leve ( S ) et d'un solut de
masse molaire faible ( s ).
Les grosses molcules sont lus par un volume Vo de solvant qui correspond au volume entre les
"grains" de la phases stationnaire. Les petites molcules pntrent dans le rseau du gel et sont lues
par un volume Vt gal au volume total de solvant contenu dans la colonne. La sparation est donc
fonde sur la dimension des molcules en solution. Le volume de rtention VR des molcules X est
donn par :
VR = Vo + K . F. Vi
quation 42
Vo = volume total de la phase mobile ou volume mort, Vi = Vt - Vo - Vmatrice du gel

Vi = volume total de la phase stationnaire.
F est la fraction du volume poreux de la phase stationnaire accessible aux molcules X .
F est compris entre 0 et 1. K coefficient de distribution des molcules X
K = Cs / C M , Cs et CM tant les concentrations respectives de X dans la phase stationnaire et
dans la phase mobile.
Les reprsentations de Vo, Vt et Vt - Vo sont schmatises sur la figure 25.
Vo
Vt-Vo
Vt
Figure 25. Diagramme reprsentatif de Vt et Vo
En chromatographie d'exclusion pure K est gal 1 et on a : VR = Vo + F. Vi

Il y a 2 cas limites importants :
quation 43
1) F = O Les molcules sont totalement exclues de la phase stationnaire et on a VR = Vo. Toutes ces
molcules mergent ensemble de la colonne aprs le passage d'un volume de phase mobile gal au
volume interstitiel de la colonne.
2) F = 1 Tous les pores de la phases stationnaire sont accessibles aux molcules considres et on a
VR = Vo + Vi.
page 75
Entre les deux limites, VR varie linairement en fonction de la fraction du volume poreux accessible.
Ainsi, chaque valeur de VR correspond thoriquement une taille de molcule elle-mme
proportionnelle la masse molaire (figure 26).
log (masse
molaire)
F = 0 (exclusion totale)
permation slective
F = 1 (permeation totale)
Vo+Vi
Vo
VR
Figure 26 : Relation entre la taille ou la masse molaire et le volume de rtention
Si VR > Vt cela implique K > 1 : il se superpose alors un autre mcanisme de rtention (adsorption change d'ions). Quand K = 1, les isothermes sont des droites et les pics sont des courbes de Gauss
parfaites. Tous les constituants du mlange chromatographi sont lus dans un volume infrieur Vt.
VR = Vo + F Vi donc
F = VR - V0
Vi
avec Vi = Vt - Vo - Vmatrice du gel
En pratique on remplace Vi par Vt - Vo ; on obtient alors:
Kav = VR - V0
Vt - V0
quation 44
Kav est la fraction du volume du gel stationnaire accessible (available) o diffuse une molcule
donne.
Pour des composs de densit et de forme molculaire identiques, il existe une relation sigmodale
entre les valeurs de leur Kav et le logarithme de leur masse molaire. Ces courbes prsentent dans une
partie importante, une relation linaire entre Kav et log MM (figure 27) ; cette relation est du type :
Kav = A log (.M) + B
avec A et B sont des constantes
Kav
quation 45
viscosit intrinsque (ml.g-1).
0,5
log (masse molaire)
Figure 27. Variation du Kav en fonction du logarithme de la masse molaire

A gel "grande" taille" de pores, faible rticulation
B gel "moyenne" taille de pores, rticulation plus leve.
Cette mthode est rapide et ne ncessite pas une purification pousse. Il faut nanmoins viter les
oxydations des rsidus de cystine en se plaant en milieu rducteur ou en protgeantles fonctions
page 76
thiol. Certaines protines donnant des interactions avec la matrice ou des protines complexes
complexes
Diffrents types de gel existent actuellement :
on distingue les gels mous, semi-rigides et rigides. Seul ce dernier peut tre utilis avec des vitesses
de phase mobile leves (FPLC par ex.).
a) Gels mous : ce sont des polymres faible taux de pontage pour lesquels le gonflement est
important. Il s'agit le plus souvent de dextrane rendu insoluble dans l'eau par raction
l'pichlorhydrine. La rsistance mcanique augmente avec le taux de rticulation tandis que le
diamtre des pores diminue. Il existe des gels dont le polymre est du polyacrylamide et des gels
mixtes composs d'acrylamide et de dextranes. L'agent de pontage est le N-N'-mthylne
bisacrylamide. L'alcoylation des polymres de dextrane conduit des gels stables en prsence de
solvants organiques ce qui permet le fractionnement des substances insolubles dans l'eau (LH). Ces
gels sont vendus sous forme de grains secs et doivent tre mis gonfler avant utilisation dans une
colonne.
b) Gels semi-rigides
- polystyrne . Ce type de gel possde des proprits remarquables et ne gonfle pratiquement pas. Il
peut tre utilis dans la plupart des solvants sauf : l'eau, les alcools, l'actone, l'acide formique. Il est
utilisable en haute pression.
- gel d'actate de polyvinyle.
- gels mixtes (dextrane-acrylamide) taux de rticulation lev.
c) Gels rigides : ils sont constitus par des silices poreuses ou des verres poreux. Les colonnes HPLC
du type TSK (FPLC : fast protein liquid chromatography) correspondent des phases stationnaires de
ce type poreuses, mais rsistantes aux dformations mcaniques et donc utilisables sous des dbits et
pression levs. Les analyses demandent alors une dizaine de minutes.
3.6. Llectrophorse.
Cest TISELIUS qui le premier, en 1937, ralisa la premire lectrophorse en veine libre. Il est ainsi
possible de raliser la sparation de protines globulaires en fonction de leurs vitesses de migration
dans un champ lectrique (figure 28).
dc
dx
dx
x
figure 28. Chromatographie en veine liquide
La cellule ralise en tube de quartz contient la solution de protine en milieu tamponn dans lequel
plongent les lectrodes. Les protines charges ngativement par exemple migrent vers la cathode et le
front de migration est dtect par mesure des variations de lindice de rfraction. La mobilit
lectrique U de la protine est gale au rapport de sa vitesse de migration sur lintensit du champ
lectrique appliqu.
U en cm2/volt.s
quation 46
U= V
E
page 77
Pour les protines U est compris entre 10-1 et 10-4 cm2 / volt.s et pour la plupart des ions entre 5 et
10.Un mlange de protines de mobilits lectrophortiques diffrentes engendrera plusieurs fronts.
Cette mthode difficile utiliser est largement supplante par les mthodes sur support (papier, actate
de cellulose, gels damidon ou de polyacrylamide) dans lesquelles le dplacement de la molcule est
frein par les forces de friction proportionnellement sa vitesse, son rayon et la viscosit du milieu.
Il est possible de contrler ce coefficient en matrisant sa porosit.
Dans le cas des gels de polyacrylamide forms par copolymrisation dacrylamide (monomre) et de
N,N-mthylne bisacrylamide (agent de pontage ou de rticulation) on dfinit deux indices T (%) et
(C%) qui caractrisent la densit ou la rticulation du gel.
T (%) =
g acrylamide + g bisacrylamide
g bisacrylamide
. 100 et C (%)=
. 100
volume (ml)
g acrylamide + g bisacrylamide
quations 47
Les facteurs gouvernant la porosit sont complexes, laugmentation du pourcentage de bisacrylamide

(ou agent de rticulation) contribuant sa diminution jusqu 5% puis cette porosit augmente avec le
pourcentage de bisacrylamide (figure 29).
diamtre
des
pores
5 % [ bis acrylamide]
figure 29. Variation de la porosit dun gel de plyacrylamide en fonction de [bisacrylamide]
La structure
chimique
dun
gel
de
polyacrylamide
est
schmatise
sur
la
figure
%w
userdict/chemdict
L/gr/grestore
L/tr/transform
xl
lpp
SA
RA}{6
-1
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CH 2
CH2
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CH2
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CH2
CH
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C
NH2
O
C
CH
CH
C
NH2
figure 30. Structure chimique dun gel dacrylamide.
NH2
currentpoint
1928374
page 78
La loi empirique de FERGUSON relie U T :
ln U = - KR . T + ln U0
quation 48
Uo correspond la mobilit pout T = 0 soit pour une lectrophorse en veine liquide. KR est un
coefficient de retard proportionnel au rayon de Stokes. La mobilit est souvent exprime par le Rf qui
est dfini par :
distance de migration de la protine longueur du gel aprs coloration
Rf =
x
longueur du gel avant coloration
distance de migration du colorant quation 49
La loi de FERGUSON devient alors :
ln Rf = - KR . T + ln Rf 0
quation 50
Il est possible de sparer des protines de mmes masses molculaires et de charges diffrentes
comme les iso-enzymes (figure 31,a) ou des protines de masses molculaires diffrentes mais de
charge identique pour lesquelles Rfo est le mme (figure 31b).
ln R f
ln Rf
Rfo
0
T (%)
T (%)
figure 31. Variations de la mobilit lectrophortique en fonction des protines
Llectrophorse en milieu dnaturant.

Pour dterminer les poids molculaires par lectrophorse cest la mthode SDS-PAGE (Sodium
Dodcyl Sulfate - Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) qui est la plus largement utilise. Cette
mthode saffranchit des variations de mobilit lies la charge et passe dabord par un traitement de
lchantillon chaud en prsence de -mercaptothanol et de SDS. Au cours de ce traitement, les
ponts disulfure sont rduits et les protines dnatures charges ngativement par le SDS. Le SDS
(dtergent de structure CH3 - (CH2)11 - O-SO3-) donne des interactions hydrophobes avec les protines
qui en fixent en moyenne 1,4 g / g (cette valeur est fonction de la temprature, de ltat rduit ou non,
de la force ionique). La protine devient alors un polyanion tir dont la longueur est proportionnelle
sa masse molculaire. Par dichrosme circulaire il a t montr que des zones en hlice existent
encore dans la protine traite.
Dans ces conditions la mobilit lectrophortique est alors proportionnelle la masse molculaire de
la protine quand le rapport charge / masse est le mme et que leur forme sont identiques.
Deux principales approches sont ainsi utilisables pour dterminer la masse molculaire:
- gel dacrylamide simple: reporter le Rf en fonction du log M (figure 33a).
- gel en gradient de polyacrylamide: reporter le log(%T) en fonction du log M.
Leur sparation sous leffet dun champ lectrique (tube ou plaque) est suivie dune fixationcoloration (au noir amide ou au bleu de Coomassie par exemple en milieu mthanol/acide
page 79
actique/eau) puis dune dcoloration. La mesure densitomtrique des bandes colores permet de
dterminer leur Rf.
Dans llectrophorse simple un marqueur de mobilit leve (colorant comme le bleu de
bromophnol) est utilis pour matriser la migration qui est stoppe quand ce colorant atteint la limite
du gel (figure 33a).
Dans llectrophorse en gradient de densit, la migration sarrte quand la protine charge atteint
une valeur de T pour laquelle la vitesse de migration est gale 0 (figure 33b). Il nest alors pas utile
de contrler le temps de migration et les bandes ont tendance se re-concentrer la valeur de T
correspondante U = 0 ce qui rend plus facile et plus prcise la mesure de Rf (figure 32).
5%
25%
5%
25%
figure 32. Schma de prparation de gel en gradient de densit en plaque .
Pour tenir compte des nombreux paramtres mal contrls de la migration, une comparaison avec une
courbe dtalonnage obtenue avec des protines de masses molculaires connues est toujours ralise.
Il est alors possible de dterminer la masse molculaire des protines analyses (figure 33).
log M
log M
a
5
4
0
0,5
Rf
10
15
25
T (%)
figure 33. Dtermination de la masse molculaire en lectrophorse en gel de polyacrylamide

a : pour deux valeurs de T
3.7. Autres mthodes de dtermination des masses molculaires.

3.7.1.Diffraction de la lumire.
Quand la lumire traverse une solution protique, elle est diffracte dans toutes les directions et
lintensit de la lumire transmise I est infrieure lintensit de la lumire incidente Io. Si la lumire
incidente est monochromatique, la presque totalit de lumire diffracte a la mme longueur donde
(diffraction Rayleigh). Seule une petite partie a des longueurs donde diffrentes par suite de lnergie
communique aux molcules (vibration et rotation surtout), on parle alors deffet Raman.
page 80
Quand la lumire passe dans la solution protique, son trajet est bien visible cause de la diffraction
(effet Tyndall).
La fraction de lumire diffracte augmente avec la taille et le nombre des molcules protiques. On
peut dfinir la diffraction par ou turbidit :
I = I0 . e- ! l
quation 51
I et Io sont les intensits des lumires incidentes et transmises, l la longueur du trajet optique.
Il a t dmontr que est relie au poids molculaire par la relation :
2
32 ! 3 . n20 n -c n0
!=
.cM
4
3" .N
quation 52
soit
= K.c.M
quation 53
avec M poids molculaire, la longueur donde, n et no les indices de rfraction de la solution et du

solvant, c la concentration de la protine et N nombre dAvogadro. Cette quation est applicable
quand la protine a des dimensions infrieures denviron 20 fois ou plus de la longueur donde
incidente. Il est possible par un choix judicieux de la longueur donde et de langle de mesure davoir
des informations sur les dimensions de la protine (ellipsode, sphre, etc.).
3.7.2. Viscosit.
Il sagit dun mthode de dtermination du poids molculaire surtout empirique. La valeur trouve est
note M qui se rapproche beaucoup plus de Mp que de Mn (quations 26 et 27). La mesure est
ralisable soit par la mthode du flux capillaire qui est base sur la loi de Poiseuille (mesure de la
vitesse dcoulement dans un tube capillaire sous une pression donne : viscosimtre dOstwald) soit
par la mthode du flux concentrique (viscosimtre deux cylindres coaxiaux).
La viscosit spcifique sp est dfinie par :
!s p =
! " !0
!
=
- 1 = !r - 1
!
!0
quation 54
avec viscosit de la solution protique et et 0 viscosit de leau.

Pour des particules sphriques et des solutions trs dilues, EINSTEIN donne lquation :
r = 1 + 2,5
quation 55
dans laquelle est la fraction volumique de la protine, cest dire le rapport du volume occup par
les molcules protiques et du volume total. Avec n molcules de volume v dans un volume total V,
sera gal n.v / V. Si n est connu on peut calculer le volume occup par chaque molcule, donc son
degr dhydratation.
STANDINGER propose une loi permettant dvaluer M partir de sp :
!
M = sp
c . Km
quation 56
dans laquelle Km est une constante caractristique de la protine et c la concentration.
page 81
VI - CONFORMATION DES PROTEINES

La structure primaire dune protine correspondant la squence denchanement de ses acides
amins, qualifis alors de rsidus dacides amins, est dtermine par des mthodes classiques de
biochimie. Ces mthodes, dcrites pour les peptides, ne seront pas reprises ici (cf chapitre III). La
structure primaire ne permet pas (ou peu) daccder la forme de la molcule dans lespace, forme
souvent ncessaire lactivit de la molcule. La chane polypeptidique adopte une structure spatiale
ou conformation qui est unique et constante pour une protine donne. Les structures secondaires,
tertiaires et quaternaires permettent de dfinir la conformation.
Les structures secondaires sont les formes que prennent des parties de la chane polypeptidique dans
lespace selon un axe principal la suite dinteractions entre rsidus dacides amins proches dans la
squence.
La structure tertiaire, caractristique unique chaque protine, correspond lorganisation spatiale
de lensemble de la molcule et rsulte dinteractions entre rsidus dacides amins loigns ou entre
des zones dj organises en structures secondaires.
La structure quaternaire rsulte dassociations de molcules protiques identiques ou diffrentes
(monomres) par des liaisons hydrogne, hydrophobes, ioniques ou par pont disulfure conduisant un
difice oligomrique complexe (submicelles de casine par exemple).
De par la structure et les proprits de la liaison peptidique dcrites dans le chapitre III, un nombre
infini de conformations, en particulier sous leffet de lagitation thermique, pourrait tre attendu par
suite de la rotation autour des angles et . En ralit les protines adoptent, dans des conditions
environnantes bien dfinies et souvent troites (pH, force ionique, temprature), une seule et unique
conformation. Cette conformation gnralement obtenue dans les conditions de la biosynthse est
qualifie de conformation native. La chane en se repliant (repliement) adopte une structure unique.
Du fait de sa structure, la liaison peptique est mme de donner des liaisons hydrogne avec d'autres
liaisons peptidiques (figure 34). La structure secondaire qui en rsulte na dexistence que si les plans
ne scartent pas de plus de 30, la distance entre loxygne du carbonyle et lhydrogne dun groupe
amide interdisant alors ltablissement dune liaison hydrogne.
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C
O
currentpoint
figure 34. Structure secondaire des protines.
La seule variable dans cette structure est apporte par la chane latrale des rsidus dacides amins.
Le volume, ou encombrement strique, de cette chane latrale associ ses proprits chimiques
(prsence de groupements polaires ionisables ou non, de groupements apolaires etc) conditionne les
angles et , ce qui conduit des structures secondaires puis tertiaires bien dfinies.
Sil nexiste quune forme gnrale bien dfinie au niveau dune protine donne, cela rsulte des
conditions de sa synthse squentielle. Il ne faut pas cependant perdre de vue que ce sont des
modifications lgres de conformation qui sont lorigine de la plupart des proprits des protines
(contractiles, enzymatiques, etc.) et que ce sont des modifications plus ou moins importantes de cette
structure (dynamique des protines) qui conditionnent beaucoup des proprits de nos protines
alimentaires (texturation, tendret, mulsification, formation de mousse etc.).
In vivo, cette synthse commence par lacide amin N-terminal, le sens de biosynthse de ces
polypeptides tant donc
>- CO -> NH - au niveau des ribosomes. Sur un plan conceptuel cette
biosynthse peut se schmatiser de la faon suivante (figure 35).
B
A
NH 2 1
NH 2 1
NH2 1
C
NH 2 1
D
2
3
4
NH 2 1
5
3
4
figure 35 . Schma de la synthse squentielle structure dune protine
page 83
Dans ce schma le premier acide amin impliqu dans la synthse (N terminal) sassocie lacide
amin n 2 et la conformation du dipeptide dpend des proprits des chanes latrales de 1 et 2.
Quand le troisime acide amin sassocie au dipeptide, la position de sa chane latrale dpendra
beaucoup du n2 mais aussi du dipeptide 1-2 dans son ensemble et ainsi de suite.
Quand le nombre dacides amins engags est lev (polypeptide), la rotation permise au niveau des
C peut alors laisser des interactions se produire entre chanes latrales loignes. Sur un plan
thermodynamique, cest le systme le plus stable en milieu aqueux aux temprature, pH et force
ionique du milieu de la synthse qui correspondra alors la forme native.
Le repliement des protines est un phnomne trs complexe qui fait aujourdhui lobjet de trs
nombreux travaux de recherche.
page 84
Pendant longtemps on a pens que les protines accdaient une structure spatiale prcise du seul fait
de lenvironnement et de leur structure propre. Or, toutes conditions tant gales par ailleurs, il savre
parfois que plusieurs structures tridimensionnelles sont thermodynamiquement et striquement
possibles. Cest la dcouverte de protines chaperons qui permet de comprendre alors lunicit de la
structure tridimensionnelle dune protine donne.
La dcouverte des protines chaperons est lie celle des protines de choc thermique (heat shock
protein, HSP) et plus gnralement celle des protines de stress (modification de la force ionique, du
pH, addition de solvants etc). Ainsi les HSP 60 et 70 dEscherichia coli ou lHSC de stress (heat shock
cognate) sont capables de se fixer de faon rversible aux protines en empchant leur dpliement
sous leffet de modifications du milieu ou encore en empchant que les protines stresses
ninterragissent entre elles avec formation dagrgats souvent irrversibles.
Une protine chaperon en se fixant rversiblement sur une protine donne nautorise pas cette
dernire adopter une conformation inactive ou interagir avec dautres protines. Dautres
protines chaperons ne permettent, par leur fixation, quune conformation sur toutes celles qui sont
thermodynamiquement et striquement permises. Les protines chaperons de classe I (comme lHSP
70, lHSC 70) reconnaissent de courtes zones hydrophobes constitues denviron 7 10 rsidus
dacides amins.
Ces protines rendent possible le passage au travers des membranes cellulaires (mitochondriales,
rticulum endoplasmique) sous une forme qui est obligatoirement dplie. Aprs franchissement de la
membrane, la suppression de leurs interactions avec la protines chaperonne permet alors cette
dernire dadopter sa conformation (figure 36).
ARNm
ribosomes
chane
polypeptidique
protine chaperon
de classe I
chaperon
de classe II
membrane
parfois
protine native
compartiment
interne
protine native
page 85
figure 36. Conformation des protines et protines chaperons.
HSP 70 et prfoldines
HSP 60
Les protines chaperons de classe II qui assurent le repliement des protines (chaperonines comme
Gro E2 , Gro ES chez Escherichia coli , TCP1 chez les mammifres). Ce sont surtout par des
contraintes striques que ces protines assistent le repliement. Lhydrolyse dATP apporte lnergie
ncessaire la protine chaperon.
La Proteinaceous infectious particles (PRION) isole en 1982 par PRUSINER rsulte dune transition
intervenant au niveau de la protine intraneuronale crbrale PrPc (253 rsidus dacides

amins). La protine 4 devient 2 - 2 . Elle saccumule dans le cytoplasme neuronal en un gel
spongieux : encphalite spongiforme bovine (ESB) et maladie de Creutzfeld Jacob chez lhumain.
page 86
1. Principales structures spatiales des protines.

Cest par la connaissance de la structure de la liaison peptidique et par diffraction aux rayons X de
quelques protines cristallises, que PAULING et COREY ont conclu, en 1951, lexistence dans la
structure spatiale de deux principaux types dorganisation au niveau des structures secondaires :
lhlice et le feuillet .
1.1. Structures secondaires.
Il sagit de structures rencontres avec des frquences trs variables dans la plupart des protines.
Schmatiquement il sagit de structures organises selon un axe principal.
1.1.1. Lhlice .
L'hlice est une structure stable qui possde 3,6 rsidus dacide amins L par tour, les chanes
latrales se plaant l'extrieur de l'hlice dont le pas est de 54 nm (figure 37). Deux liaisons
hydrogne successives entre les H de la fonction NH et l'O de la fonction C = O de la liaison
peptidique dans la structure dlimitent 13 atomes : lhlice est donc une hlice 3,613. Tous les
carbonyles sont orients presque paralllement laxe vers laval de la squence, les H-N sont orients
vers lamont ; il en rsulte la formation de liaisons hydrogne pratiquement dans laxe, ce qui gnre
une structure compacte etsolide. Les diples de la liaison peptidiques sont orients dans le mme
page 87
sens ce qui contribue galement la stabilisation de cette structure. Cette structure implique
gnralement de 10 14 rsidus et est souvent schmatise par un cylindre. De par sa "densit",
l'hlice n'engendre pas de liaisons avec d'autres molcules (eau par exemple) et donc sa solubilit ou
sa dissociation dans l'eau est faible. Cest cette structure qui est dominante dans de nombreuses
protines de structure plus ou moins fibreuse.
Par contre, sa dstabilisation par chauffage en milieu aqueux, induisant le "dbobinage" ou
dpliement, conduit des polypeptides gnralement solubles.
La proline, en raison de sa structure pyrrolinique, ne s'intgre pas dans cette hlice ce qui rend sa
formation impossible.
Il en est de mme avec des acides amins dont les chanes latrales possdent une charge ou un
volume incompatible avec cette structure secondaire.
* Ainsi la polylysine et le polyacide glutamique ne donnent une hlice que pour des pH o le
groupement ionisable de la chane latrale n'est pas charg (pH > 11 pour la lysine et pH < 4 pour
l'acide glutamique). Dans ces cas c'est la rpulsion lectrostatique des chanes latrales qui rend
impossible la formation de l'hlice , la chane polypeptidique prenant une structure en pelote
statistique pour laquelle les groupes chargs sont loigns au maximum et l'nergie libre
lectrostatique rpulsive minimale.
* Avec la polyisoleucine, c'est l'encombrement strique de la chane latrale qui inhibe la
formation de l'hlice.
A ct de ces principales conformations, il existe d'autres structures secondaires telles que les hlices
310, M, , polyproline I ou II. Dans le collagne c'est la structure polyproline II qui est dominante.
Cette protine du tissu conjonctif (peau, tendon, os) est la plus abondante chez les animaux. En milieu
aqueux, sous l'action de la chaleur elle se transforme en glatine.
Les acides amins sont classables en fonction de leur aptitude former ou rompre l'hlice (chapitre
II, tableau 2).
C
O
H
H
N
H
R
N
R C
C
H
26
O
H
N
N
C
CH
0,54 nm
C
R
C
C
O
O C
R
H
N
C O
vue suprieure
0,6 nm
figure 37. Schma dune hlice avec pas droite
page 88
1.1.2. Les feuillets .

Les feuillets (feuillets plisss) correspondent une structure en zig zag tire. Souvent la
destruction de liaisons hydrogne d'une hlice par la chaleur en milieu aqueux conduit la formation
de feuillets. Les chanes parallles ou antiparallles (2, 3 ou quelquefois 4) sont lies par des liaisons
hydrogne (figure 38) qui peuvent tre dtruites par chauffage en milieu aqueux.
H
N
O
N
CH
CH
H
N
H R
O
R
H
CH
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CH
H R
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H R
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N
CH N C
CH
CH
H R
CH
CH
H R
O
CH
R
figure 38 . Structure en feuillets plisss parallles (1 et 2) et antiparallles (2 et 3)
Cette structure se retrouve par exemple avec des protines fibreuses (fibrone de la soie). Les feuillets
prdits galement par Pauling ne sont pas plats mais vrills (figure 39).
R
H
N
CH
H R
O
H
N
C
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CH
CH
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C
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H R
H R
H
N
CH
N
CH
N
O
CH
C
O
figure 39. Schma et reprsentation des structures twistes (vrille) des feuillets
CH
H R
page 89
1.1.3.Courbure .
Il existe une conformation qui permet aux chanes de se replier sur elles-mmes, une liaison
hydrogne assurant la stabilisation (figure 40).
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4700
e
1
bL
s
p
ro
gi
gr}b/O
neg
or{4
dup
1.6
0
4920
fill}b/
sm
w
st}{px
m
py
st
p
sm
0
2
SA
lCt
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L/m
SA
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0
sm
bd
al
cp
p
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AA
p
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gr
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g/
rO
st
cp
py
27
D
e
3
1
w
s
2
lp
g
1
lm
O
1
4
f
currentpoint
N
C
H
H
C
O
H
C
R
H
H
C
currentpoint
192837465
Figure 40. Courbure ou conformation
Il existe enfin dans la plupart des protines des zones structure non dfinie et sans axe de symtrie :
pelote statistique.
Ces structures secondaires sont souvent schmatises par des cylindres pour les hlices et par des
plans flchs pour les feuillets (figure 41).
pont
pelote statistique
feuillets
antiparallles
hlices !
figure 41. Schma reprsentatif des structures secondaires
1.2. Structures tertiaires

La structure tertiaire est la structure spatiale qu'adopte une protine prsentant des zones structures
secondaires bien dfinies (hlice , feuille , courbures ) est fonction de son environnement
(temprature, , solvant, pH). En milieu aqueux les rsidus d'acides amins hydrophobes sont pour la
plupart dentre eux localiss vers l'intrieur de la molcule tandis que les acides amins polaires sont
plus reprsents en surface. Des distributions anisotropiques de charges ou de groupements polaires ou
hydrophobes peuvent contribuer confrer la protine une fonction donne. Dans tous les cas, la
conformation que prend la protine est obtenue pour un niveau nergtique minimum.
Actuellement il est possible de dcrire des classes ou des types de structures tertiaires en fonction de
la prdominance et de la distribution dans la molcule (ou mme une zone structure dune partie de la
molcule) de structures secondaires en hlice ou en feuillets (figure 42). Les protines dans de trs
nombreux cas prsentent une structure tertiaire sphrique ou ovode.
page 90
Structures de type
sous-unit de lhmoglobine
cytochrome b 562
myomrythrine
Structure de type
Retinol binding protein
Chymotrypsine ( anti parallles)

Structure /
triose-phosphate isomrase
flavodoxine
Figure 42. Schma de quelques classes de structures tertiaires
adnylate kynase
page 91
figure 43. Images stroscopiquesde protines et topologies
Les progrs raliss en informatique au niveau de limagerie molculaire permettent de visualiser dans
lespace de nombreuses molcules protiques.
1.3. Structures quaternaires ou supramolculaires.
Il sagit dune organisation spatiale dassemblages de molcules protiques dans une structure tertiaire
donne par des liaisons ionique, hydrogne, hydrophobe ou par pont disulfure. Cet assemblage
symtrique ou non est en gnral constitu par un nombre limit de sous-units (monomres)
identiques ou non. Lentit molculaire, dont la masse molaire peut dpasser plusieurs millions,
possde des proprits souvent remarquables; chaque association a une structure souvent unique et
contribue la fonction biologique:
-protines fibreuses en super hlice constitues de monomres en structure hlicodale (tropocollagne
de 300 nm de long et 1,5 nm de diamtre form de 3 monomres en hlice avec pas droite )
-protines fibreuse et globulaires (myosine constitue de deux monomres avec zones continues en
hlice et zone terminale en pelote statistique )
page 92
-protines fibreuses en double hlice constitues de monomres globulaires ( monomres de G actine

associs en F actine dont deux chanes en hlice forment un filament )
-protines globulaires constitues par lassemblage de sous-units de structures non fibreuses
(glycinine du soja - micelle de casine - etc).
Quand la zone de fixation est la mme pour tous les protomres, lassociation est qualifie disologue
et quand le domaine de fixation est diffrent lassociation est qualifie dhtrologue (figure 44).
association isologue
association htrologue
figure 44. Associations entre sous-units protiques
Ces arrangements impliquent des systmes symtriques autour dun axe ou plus complexes avec
plusieurs axes de symtrie (figure 45).
!2
!1
hmoglobine
glycinine du soja
figure 45. Structures quaternaires types et exemples
page 93
2. Moyens dtudes de ces structures .

Rappelons que la dtermination de la structure primaire requiert des hydrolyses enzymatiques
mnages ou des hydrolyses chimiques spcifiques (BrCN et met par exemple) suivies du dosage des
acides amins totaux et des parties N terminales (mthodes de Sanger ou dEdman) ou C terminale (cf
chapitre III).
Il existe de nombreux moyens dtude des structures protiques classs en mthodes physiques,
chimiques ou biologiques .
2.1. Mthodes physiques.
Ces mthodes sont applicables soit des protines cristallises soit des protines en solution soit
des protines pralablement traites et dshydrates.
2.1.1. Microscopie.
La microscopie lectronique permet dobtenir des images des structures quaternaires ou de rseaux
protiques (gels , ptes etc). Les observations par transmission sont ralises sur des chantillons
fixs au glutaraldhyde (3% , 3 h), rincs, fixs au ttraoxyde dosmium (2% , 2 h), rincs puis
dshydrats dans des solutions thanol / eau (50/50, 80/20 puis 90/10, thanol pur). Les chantillons
sont inclus dans des milieux (70C, 2 jours). Des coupes ralises lultra-microtome sont colores
lactate duranyle et au citrate de plomb avant observation microscopique.
Pour les observations par balayage, les chantillons dshydrats au point critique sont pralablement
couverts de platine et dor. Les observations effectues aprs ces traitements peuvent ne pas
correspondre la conformation native. Il existe des microscopes lectroniques quips de platines
conglation qui permettent des observations sans fixation pralable. Lobservation aprs cryofracture
de lchantillon congel dans lazote liquide permet lobservation de zones de moindre rsistance.
Il existe des techniques de microscopie lectronique qui permettent lobservation sans dshydratation
pralable. Il sagit essentiellement de la microscopie platine froide rfrigre par de lazote liquide
et la microscopie environnementale.
La microscopie effet tunnel permet dobtenir des images de macromolcules protiques comme les
immunoglobulines.
2.1.2. Les mthodes spectrales.
Les protines absorbent et mettent des radiations dans la zone UV. Labsorbance rsulte des
proprits des liaisons peptidiques, des acides amins aromatiques et des ponts disulfure. Dans ce cas
lnergie lumineuse induit un passage des lectrons dun tat stable un tat excit. Les phnomnes
de fluorescence sont lis la prsence des acides amins aromatiques. Quelques protines possdent
des co-facteurs absorbant dans le visible. Enfin si une structure dissymtrique est prsente, la lumire
polarise droite ou gauche nest pas absorbe avec la mme intensit (dichrosme circulaire).
Les proprits spectrales des protines dpendent donc de leur composition en acides amins mais
aussi de lenvironnement de ces acides amins ; des informations sur les structures secondaire et
tertiaire et leurs modifications peuvent tre obtenues partir de ces proprits spectrales. Le
dichrosme circulaire dans la rgion des amides permet danalyser les structures secondaires, tandis
que labsorbance et la fluorescence des rsidus dacides amins aromatiques est directement lie leur
environnement.
La mesure de labsorbance dune protine native en utilisant comme rfrence la mme protine mais
ltat dnatur conduit des spectres diffrentiels (figure 46,a) avec :
page 94
!" = !A
c.l
A tant la diffrence dabsorbance entre les formes natives et dnatures, c la concentration et l la
longueur du trajet optique
absorbance
! " (M -1cm-1 )
2000
a
b
"
N
!"
1000
"D
0
250
275
300
longueur d'onde (nm)
-500
concentration en dnaturant
figure 46. Spectre diffrentiel et variation dabsorbance dune protine native et dnature
Par ailleurs, labsorbance de la forme native et celle de la forme dnature augmentent avec la
concentration en dnaturant (figure 46 b).
La fluorimtrie permet dvaluer lenvironnement et la mobilit de chanes latrales trs fluorescentes
comme celle du tryptophane.
Le dichrosme circulaire (figure 47) mesure labsorption ingale de la lumire polarise
circulairement droite et gauche; la diffrence dabsorption (A = AL - AR) trs faible exige un
appareillage trs sensible (dans lUV aux environs de 200 nm cette diffrence est de lordre de 0,0001
quand labsorbance de la molcule en solution est gale 1).
! (degr . cm 2 . dmole-1)
! (degr . cm 2 . dmole-1)
0
-200
ponts disulfure
-100
acides amins
aromatiques
-5000
-10000
liaison peptidique
250
275
300
325
200
longueur d'onde " (nm)

RNAse 80 M (d=1cm)
210
220
230
240
longueur d'onde " (nm)

protine native
RNAse 30 M (d=0,1cm)
protine dnature
figure 47. Spectres CD dune protine native et dnature.
page 95
Une protine donne gnralement 3 bandes en dichrosme circulaire. La premire entre 170 et 250 nm
est lie aux liaisons peptidiques et permet lvaluation de l-hlicit, la seconde voisine de 250 est
caractristique des ponts disulfure et la troisime voisine de 270-285 nm est lie aux rsidus dacides
amins aromatiques. Ces bandes sont influences par lenvironnement et permettent une estimation de
la structure native globale de la protine .
Les rsultats des mesures sont aussi exprims en ellipticit obs (m.degr). Le coefficient dextinction
molaire dichroque est gal :
!" = "L - "R
quation 56
Lellipticit molaire M est relie au coefficient dextinction molaire dichroque par :
M = . 3000
quation 57
Les units sont diffrentes ; est labsorbance diffrentielle dune solution 1 mole.L-1 dans une cuve
de 1 cm de trajet et M est la rotation en degrs dune solution 1 d mole / cm3 dans une cuve de 1 cm
de trajet .
On dmontre que :
!" = "L - "R = AL - AR et #M = # . 100 . M
c.d
c.d
quation 58
c est la concentration en mole.L-1, d la longueur du trajet optique en cm, M le poids molculaire de la
protine.
Quand les chanes polypeptidiques ont plus de 10 rsidus, leur rotation optique nest pas une simple
fonction additive des rotations de chaque rsidu. Dans les protines cette rotation est plus dextrogyre
que la somme des rotations individuelles. Ce pouvoir de dextrorotation est maximal avec des hlices .
La capacit de dvier le plan de lumire polarise rsulte de lasymtrie molculaire (C avec 4
substituants diffrents). Cependant, dans les protines cette proprit rsulte de la prsence de
carbones mais aussi de lasymtrie apporte par lenroulement en hlice (pas gauche ou droite).
Le pouvoir rotatoire avant et aprs dnaturation (forme native et forme droule) permet destimer le
degr approximatif denroulement en hlice .
Pour dterminer les diffrentes contributions des structures secondaires dans une protine donne, on
suppose que le spectre CD dans la zone des liaisons peptidiques peut tre reprsent par une
combinaison linaire des contributions des diffrents lments impliqus dans les structures
secondaires:
!M(") = f# . !M#(") + f$ . !M$(") + ft . !Mt(") + fn . !Mn(")
quation 59
fi sont les fractions respectives des lments structuraux de type hlice (), feuillet (), pont (t) et
non rgulire (n).
La spectroscopie aux rayons X, applicable aux protines cristallisables (pures ou avec des soluts) est
la technique qui donne le plus de renseignements sur la structure spatiale. La diffusion et la diffraction
des rayons X sont dautant plus grandes que la densit lectronique des atomes est leve. Le trs
grand nombre datomes dans la molcule donne des spectres trs complexes. Le diagramme de
diffraction des rayons X de la myoglobine cristallise (qui contient environ 2500 atomes, MM de
16700) prsente 25000 rflexions dont lanalyse a conduit la dtermination de la premire structure
tertiaire.
La cristallisation des protines est obtenue par la mthode de la goutte pendante :
page 96
cristal
10 l de protine
10 mg / ml de sulfate
d'ammonium
non satur
rayons X
solution sursature
en sulfate d'ammonium
dtecteur
Lorsquun faisceau de rayons X est focalis sur un cristal protique, il est rflchi par les noyaux de
masse suffisante (C, O, N, P, S) et subit une srie de diffractions dpendant de la position de ces
atomes. Ltude des intensits de diffraction permet de dterminer la structure. Avec les protines il
est souvent ncessaire dintroduire des atomes ou groupements datomes qui diffractent beaucoup
(mtaux lourds comme Pt Cl4 sur les rsidus de mthionine) sans pour autant modifier la
conformation. Selon la rsolution obtenue, exprime en on obtient :
- 5 la silhouette de la molcule
- entre 2 et 4 la disposition spatiale de la chane polypeptidique
- entre 1,5 et 2 la position individuelle des atomes constitutifs.
Les amliorations et progrs raliss aux sources de rayons X, aux quipements de collecte des
donnes, aux traitements informatiques des donnes en particulier au niveau du graphisme, ont permis
damliorer la rsolution et la rapidit des analyses.
Le synchrotron SOLEIL Saclay qui va tre mis en service permettra de dterminer les structures
tridimensionnelles des protines avec une trs grande rsolution.
La diffusion de neutrons permet de donner une image du volume de la molcule.

La spectroscopie Raman renseigne sur les modes de vibration et de rotation des molcules protiques.
Applicable des tudes de structure elle permet galement ltude de la fixation dions ces
macromolcules.
page 97
2.1.3. Les mthodes nuclaires et lectroniques.

La rsonance magntique nuclaire RMN
Les noyaux de certains atomes comme 1H, 13C, 15N, 31P, ont un moment magntique ou spin.
Lenvironnement chimique de ces noyaux peut tre examin par RMN et les distances inter-atomiques
values. Il est alors possible den dduire un modle tridimensionnel. La RMN permet la localisation
des protons dans les protines, den dterminer le nombre et la disposition. Cette technique permet de
dterminer des couplages par liaison covalente et des couplages dipolaires si d < 0,5 nm. (effets
COSY et NOESY ) et donc de situer des repliements.
Leffet NOESY (spectroscopie deffet Overhauser nuclaire) se manifeste entre 0,2 et 0,5 nm et rvle
des interactions entre deux atomes dhydrogne proches dans lespace mme sils appartiennent des
rsidus diffrents.
Leffet COSY (spectroscopie de corrlation) rvle les interactions entre deux atomes dhydrogne
relis de faon covalente par lintermdiaire dun ou deux atomes diffrents. Les spectres
bidimensionnels sont interprts par la mthode de lattribution squentielle. Chaque acide amin
possde un spectre COSY caractristique (couplage scalaire). Les contraintes de distances sont
utilises pour dduire la structure possible de la protine.
La RMN transforme de Fourrier (2D, 3D, et 4D) permet daccder la structure des protines en
solution et de comparer ainsi les rsultats obtenus avec ceux issus des cristaux (RX). Initialement,
seules la structure des petites protines (poids molculaire infrieur 12000) tait tudiable par cette
mthode. Pour les protines de poids molculaire plus important il tait ncessaire de fabriquer des
protines uniformment enrichies en 13C ou 15N par recombinaison. Lutilisation des mthodes 3D et
4D permettent de travailler avec des protines de poids molculaire suprieur 30000. Cette approche
danalyse structurale prsente lavantage de pouvoir tudier des phnomnes dynamiques de
modifications structurales (fixation dun ligand, dnaturation thermique etc.).
La ESR (electron spin resonance) ou RPE (rsonance paramagntique lectronique) permet
dvaluer la diffusivit rotationnelle (ou frquence de r-orientation-Drot) qui est un paramtre
troitement reli la diffusion translationnelle (Dtrans - sous linfluence dun gradient de
concentration) et permet destimer la mobilit de traceurs et de soluts au sein de molcules
protiques. La mthode par sondage de spin utilise des sondes paramagntiques appeles marqueurs de
spin telles que le 4-hydroxy,2-2-6-6-ttramthylpipridinooxyl qualifi de tempol.
2.1.4. Les mthodes thermodynamiques.
La calorimtrie diffrentielle balayage (ATD : analyse thermique diffrentielle) permet dvaluer la
temprature de dnaturation des protines (pic endothermique) mais aussi la quantit dnergie quil
faut amener la protine pour la dnaturer. En effet les modifications de conformation des protines
saccompagnent dune variation de son niveau dnergie. Ces changements se manifestent soit par une
absorption de chaleur (raction endothermique) soit par une libration de chaleur (raction
exothermique) et saccompagnent par une variation denthalpie.
Pour la mesure, la protine en solution est chauffe graduellement (c / temps) et la temprature est
contrle. Le flux de chaleur diffrentiel entre lchantillon et une rfrence est enregistr. La surface
des thermogrammes permet dvaluer la variation denthalpie associe aux transitions dtat induites
par la temprature. La drive de la ligne de base correspond aux capacits calorifiques diffrentes des
page 98
formes natives et dnatures. Lenthalpie de dnaturation est fonction de la vitesse de chauffage

impose. Le pic endothermique proportionnel lenthalpie est gal :
H = k . A/M
avec H variation denthalpie , k coefficient de calibration (J.m-2) et M
molarit de la solution protique.
Les variations de H/t en fonction de la temprature sont schmatises sur la figure 48.
dH
dt
(J.sec -1)
pHi
30
50
80
Temprature (C)
figure 48 . Thermogramme dune protine diffrents pH
Dans lexemple donn il apparat que lnergie amener la protine pour la dnaturer (dplissement
maximum, raction endothermique) est plus faible quand la molcule est partiellement dbobine
sous leffet du pH (surface sous la courbe); la temprature de transition est abaisse de la mme
faon.
2.1.5. Les mthodes bases sur la charge et le volume et /ou la forme.
Llectrophorse en milieu dnaturant ( SDS-PAGE) est une technique analytique permettant de
dterminer le poids molculaire ainsi que le nombre de sous-units dans une structure quaternaire.
Associe un blocage spcifique et modul des fonctions thiols ou amines elle permet de compter
ces groupements. Ainsi si on fait ragir la protine avec des quantits croissantes dun agent
bloquant des fonctions amines comme lanhydride succinique (figure 49) et si llectrophorse est
ralise un pH pour lequel seules ces fonctions amines sont protones, la migration lectrophortique
(Re) vers lanode sera dautant plus leve que la charge nette positive de la protine sera grande
(figure 50).
Le nombre de bandes comptes correspond alors au nombre de fonctions amines ( et ). La
dtermination du nombre de fonctions thiol se fait aprs rduction et S-carboxy-mthylation ( SH
devient S-CH2-COO-) ; dans ces conditions la charge nette ngative de la protine augmente en
fonction du nombre de sites ractifs pH > pKa de lacide greff .
page 99
currentpoint
+
NH3
Charge nette +4 pH 3
NH3
NH3 +
NH3 +
anhydride succinique
prot / anhydride = 1
NH3 +
NH3 +
NH3 +
+
O
NH
COOH
prot / anhydride = 2
NH3 +
NH3 +
NH2
COOH
NH
COOH
etc....
figure 49. Masquage squentiel des groupes NH2 dune protine
currentpoint 192
0
3
5
7
10
protine
native
protine avec des concentrations croissantes

en anhydride succinique
mlange
figure 50. Electrophorse dune protine en fonction du masquage de ses groupes NH2
La conformation des protines peut tre analyse par lectrophorse en gel non dnaturant ou en gels
contenant des gradients transverses de dnaturants. Ces mthodes sont relativement simples et ne
ncessitent que de faibles quantits de protines (1 g). Selon le type de dtection utilis (bleu de
Coomassie, sels dor, marquage radioactif, dtection immuno-chimique ou immuno-enzymatique).
Comme cela a dj t signal, la mobilit dune protine dpend dun certain nombre de facteurs
parmi lesquels la charge et la taille/forme jouent un rle dterminant.
Ainsi llectrophorse en gel non dnaturant dune protine native et de la mme protine dans
laquelle les ponts disulfure sont rduits par le -mercaptothanol montre que la forme rduite dplie a
un volume hydrodynamique plus grand et donc une mobilit rduite (figure 51).
Avec les gels de polyacrylamide, le pH est rgul par des systmes tampons non dnaturants comme :
- alanine - acide lactique (pH 3,8)
- histidine - acide 3-(N-morpholino)-propane sulfonique (pH 6,1)
page 100
- Tris (hydroxymthyl)aminomthane - acide borique (pH 8,7).
protine
native
protine
rduite
figure 51. Electrophorse non dnaturante dune protine native et rduite
Llectrophorse gradient transverse permet une interprtation simple des variations de mobilit
dune protine (figure 52).
2RT
0,5 Fu
!Gf
forme native
forme dnature dplie
-2RT
pH = 4 , 15C
concentration en ure (M)

figure 52 . Electrophorse en gradient transverse dure.
La protine est dpose au sommet du gel gradient transverse puis soumise une lectrophorse vers
la cathode pH 4 et 15C. La mobilit de la protine (M) chaque concentration en ure indique la
fraction de protine dplie (Fu) comme schmatis droite de la figure. Au voisinage du point de
transition pour lequel Fu = 0,5 la stabilit nette de ltat repli (ou natif) Gf est gale 0. On a :
D
M - MN
Fu =
soit Fu =
et !Gf = - RT ln N
D + N
MD- MN
D
quation 60
Fu est approximativement une fonction linaire de la concentration en ure. La stabilit nette en
absence de dnaturant est ainsi estime par extrapolation de Gf partir de la tangente au point
dinflexion de la rgion de transition vers la concentration 0 en ure. Les zones en plateau des tats
natifs et dnaturs correspondent des valeurs de Gf respectivement gales 2RT et -2RT.
Lisotachophorse permet, quant elle de mesurer le pHi de la protine.
page 101
Certaines mthodes chromatographiques utilisant des phases stationnaires polaires, apolaires ou

spcifiques (Chromatographie daffinit) contribuent ltude des structures protiques et de leurs
volutions.
2 .2. Mthodes chimiques.
Certaines de ces mthodes reposent sur la dtermination de proprits hydrophiles ou hydrophobes de
surface des molcules protiques en utilisant respectivement des sondes ou des phases stationnaires en
chromatographie qui sont respectivement hydrophiles ou hydrophobes.
Lvaluation du nombre de sites hydrophobes peut tre corrle avec certaines des proprits
fonctionnelles et en particulier avec le comportement des protines aux interfaces (mousses,
mulsions).
Le principe de ces mthodes est le suivant : lorsqu'une protine en solution est mise au contact d'un
compos hydrophobe, celui-ci va se fixer sur les sites, la constante d'association tant d'autant plus
leve que le site est hydrophobe. Ltude classique de cette interaction protine-ligand qui ncessite
lvaluation du ligand libre et du ligand li peut se faire par dialyse lquilibre, par partage liquideliquide, par chromatographie dexclusion.
Parmi les sondes (ligands) les plus utilises on peut signaler l'acide cis-parinarique, l'acide 8-anilino1-naphtalne sulfonique (ANS) ou le rtinol.
Ces composs deviennent fluorescents lorsqu'ils se fixent sur les sites hydrophobes des protines. La
mesure de fluorescence, proportionnelle au nombre de molcules de ligand fix, permet, par la
mthode de Scatchard ou de Klotz, d'estimer le nombre de sites.
On peut aussi estimer l'hydrophobicit de surface d'une protine par chromatographie avec des
phases stationnaires apolaires (RPC : reversed phase chromatography). Le facteur de capacit sera
d'autant plus lev que la molcule possdera des zones hydrophobes importantes et de forte nergie.
Il est possible de dterminer le nombre de sites hydrophiles "ionisables" en surface en utilisant des
composants qui sont capables de donner des liaisons ioniques avec les groupements chargs des
chanes latrales. Le plus souvent il s'agit de composs colors porteurs soit de groupements sulfons
(SO3-) soit des groupements amins (R-NH3+). Le traitement des donnes se fait par la mthode de
Scatchard ou de Klotz. Il faut remarquer ici que la formation d'un COOH partir d'un COO- (par
diminution du pH en dessous du pKa) se traduira par une diminution de l'hydrophilicit ou
inversement par une augmentation de l'hydrophobicit.
page 102
2.3. Mthodes biologiques.

Ces mthodes sont bases sur la raction antigne anticorps
Rappelons quun anticorps est une immunoglobuline (glycoprotine) produite par des une raction
complexe schmatise sur la figure 53. Il existe de nombreux clones de lymphocytes B activs par le
mme antigne initial (et donc de plasmocytes producteurs danticorps) car les fragments de cet
antigne hydrolys par les macrophages et prsents ces lymphocytes B peuvent tre diffrents. Un
lymphocyte donn reconnat un seul antigne et le plasmocyte rsultant de sa transformation produit
un seul type danticorps. Cest le mlange de clones de lymphocytes B qui conduit in vivo la
production dun mlange danticorps (anticorps polyclonaux ) .
lymphocyte T
lymphocyte B
antigne
transformation
blastique
macrophage
plasmocyte
anticorps
figure 53 . Schma de la biosynthse danticorps
La fusion dun lymphocyte producteur danticorps et dune cellule mylomateuse engendre un

hybridome qui se multiplie indfiniment et fournit un seul type danticorps : anticorps monoclonal
qui est trs spcifique et possde une constante dassociation leve.
Connatre la structure antignique dune protine permet dvaluer sa conformation. Une molcule
protique possde deux types dterminants antigniques (pitopes) :
des sites continus ou squentiels attribus une succession dacides amins dans la chane
polypeptidique
des sites discontinus ou conformationnels attribus la proximit dans lespace de rsidus non
voisins sur la squence.
Le plus souvent les anticorps obtenus (injections rptes lanimal en association avec ladjuvent de
Freund et rcupration des srums stabiliss contre la protolyse par le PMSF ou fluorure de
phnylmthylsulfonyle) contre les protines natives sont spcifiques de sites conformationnels. On sait
que lpitope doit contenir au moins 6 7 rsidus dacides amins dont certains doivent tre basiques.
Ltude de la raction antigne anticorps seffectue :
par diffusion simple
en milieu liquide pour la dtermination du titre (lantigne marqu liode radioactif est incub avec
le srum et ses dilutions ; aprs prcipitation du complexe Ag-Ac au sulfate dammonium 1,3 M , on
mesure la radioactivit du culot ; le rapport de la radioactivit du culot la radioactivit totale B/T est
report en fonction du logarithme de la dilution de limmunsrum. La courbe obtenue a la forme dune
sigmode. La concentration en immunsrum pour laquelle on a B/T = 0,5, cest dire pour laquelle
limmunsrum fixe 50 % de la protine, correspond au titre de cet immunsrum).
par radioimmunologie dont le principe est le suivant :
Une quantit fixe dantigne marqu (Ag*) lie une quantit fixe danticorps (Ac) est dplace par
une quantit variable dun antigne froid (Ag). Lors de laddition de quantits croissantes de
page 103
protine (Ag) une quantit fixe du complexe protine* - Ac, la protine (Ag) dplace une quantit
croissante de protine*. On peut crire :
Ago* + Ago + Aco ------> (Ag*-Ac)1 + (Ag-Ac)1 + Ag1* + Ag1
En nombre de moles on a :
Ago* = ( Ag*-Ac )1 + Ag1* et Ago = ( Ag - Ac )1 + Ag1
Pour Ago = 0 on a (Ag*-Ac)1 = Bo
et (Ag-Ac)1 = 0 et Ag1= 0
Pour Ago > 0 on a (Ag*-Ac)1 = B
Une courbe dtalonnage donnant la valeur de B/Bo en fonction des quantits connues de protine
ajoute permet le dosage de quantits inconnues de protine. Par ailleurs, il est possible de substituer
la protine native par une forme dnature. Si la protine a subi des modifications de conformation
affectant un ou plusieurs de ses pitopes, son affinit pour les anticorps sera modifie et la courbe
B/Bo ne sera plus superposable la courbe de rfrence.
2.4. Mthodes prdictives.
Ces mthodes se dveloppent trs rapidement du fait des progrs de linformatique et des mthodes
modernes de la biochimie et de la biologie molculaire. Ces mthodes thoriques reposent sur la
connaissance des squences nuclotidiques, permettent dune part la construction de squences
dacides amins et dautre part de discerner leur signification, prdisent les structures secondaires et
certaines proprits comme les zones rponse antignique, et enfin corrlent structure et fonction.
Ces mthodes sont de plus en plus mathmatises.
Le problme du repliement : le paradoxe de Levinthal..Pour un peptide dune trentaine dacides
amins le nombre de conformations possibles le repliement- est gal ou suprieur de N = 10100 . Le
force motrice du repliement est leffet hydrophobe tandis que les interactions lectrostatiques
gouvernent la reconnaissance molculaire.
Les protines ont tendance enfouir les chanes latrales hydrophobes en leur cur.
Les 20 acides amins possdent des caractristiques physico-chimiques et structurales bien connues.
taille
TRP
ILE
TYR
LEU
VAL
MET
CYS
HIS
ASP-
THR
SER
PRO
ARG+
GLU-
GLN
PHE
ALA
GLY
LYS+
ASN
polarit
page 104
Les chanes latrales sont flexibles et ont des angles de torsion multiples (orientation prfrentielle de
la chane latrale conduit une structure spatiale bien dfinie appele rotamre).
On peut calculer une fonction dnergie empirique pour modliser :
U=
" k (b # b ) + " k (a # b )
b
liaisons
angles
%
+ " '1+cos
&
torsions
(nt#$)
%
qi q j (*
(
A
B
ij
ij
'
12 #
6 +
*) + "'
r ij *)
ij &
r ij
r ij
Van der Waals
Coulomb
On peut caractriser
une surface dnergie
comme ci-contre, en
fonction de nombreux
paramtres comme les
valeurs de et de
2.4.1. Recherche des rgions codantes pour une protine donne dans le gnme.
Il existe pour cela des mthodes informatises (STADEN R., 1985, Genetic Engineering, Setlow and
Hollaender Edrs, Plenum Press, Vol 7 , p.67, London ; STORMO G.D.,1987, Nucleic acid and protein
sequence analysis- A practical approach, Bishop and Rawlings Edrs, IRL Press, Oxford. Logiciel
RASMOL, bases de donnes comme http://www.swissprot).
Pour un acide amin donn, les codons varient avec lespce mais aussi avec la protine.
2.4.2. Alignement des squences dacides amins.
Quand une squence est dtermine, il faut rechercher si elle na pas dj t dcrite dans une protine
connue. En cas dhomologie, il est probable que la conformation soit la mme ou trs voisine. On
procde par alignement der squences. La conservation de la squence se traduit par une conservation
de la structure 3D.
2.4.3. Prdiction des structures secondaires.
page 105
Trois principaux types de rponses sont attendues de ces mthodes :

- description des structures secondaires typiques (hlice , feuillet , ponts et pelote). La mthode
rseau de neurones permet cette prdiction
- description des hlices trans-membranaires
- position des sites antigniques.
Depuis 1984, les mthodes utilises sont classes en mthodes probabilistiques ou probabilistes,
mthodes physico-chimiques et mthodes bases sur des informations thoriques.
La mthode des pionniers CHOU et FASMAN (1978) est essentiellement probabiliste ou statistique.
Ainsi la frquence de participation dun rsidu dacide amin donn une structure secondaire type est
estime partir de banques de donnes. Par exemple si avec 10 protines contenant 4000 rsidus
dacides amins, 1500 sont impliqus dans les hlices , et si ces 10 protines contiennent 400 rsidus
dalanine dont 220 sont impliqus dans les structures hlices , la probabilit qua lalanine de
participer lhlices est gale :
P! (ALA) =
220
400
1500
4000
= 1,46
et comme P est suprieur 1, le rsidu est qualifi de formateur ou stabilisant de la structure

secondaire (ici lhlice ). Il est qualifi de destructeur si P est infrieur 1 (cf tableau 2, p.8).
La mthode de LIM (1974) est un exemple dapproche physico-chimique. Elle est base sur les
proprits polaires et apolaires des rsidus le long de la squence. Dans une hlice la rotation est
denviron 100 entre rsidus ; la position spatiale des chanes latrales de ces rsidus quand la protine
est en milieu aqueux varie en fonction de leur polarit. Il en est de mme pour les structures tertiaires
dans lesquelles les zones hydrophobes seront localises prfrentiellement vers le cur de la molcule
(figure 54).
Les dveloppements les plus rcents sont lis lamlioration des techniques premires, les structures
tertiaires tant ainsi obtenues par des rptitions de motifs de base (structure / par exemple). Les
banques de donnes deviennent de plus en plus fournies et performantes :
Google propose des accs nombreux
BISANCE : Base Informatique pour la Squence des Acides Nucliques des Chercheurs Europens ,
CITI 2, 45 rue des Saint Pres , 75270 Paris
PIR : Protein Identification Resource, National Biomedical Reseach Foundation, Georgetown
University, 3900 Reservoir Road NW, Washington DC 20007, USA
Protein Data Bank : Chemistry Department, Brookhaven National Laboratory, Upton NY 11973 USA.
Les derniers progrs dans la prdiction des structures secondaires et tertiaires reposent sur lutilisation
des techniques dintelligence artificielle. Ecrits en langage LISP, ces techniques hirarchisent les
structures les plus probables.
page 106
"coupe d'une structure

tertiaire" en milieu aqueux
hlice !
rsidu polaire
rsidu apolaire
vue de dessus
zone apolaire
hydrophobe
zone polaire
hydrophile
figure 54. Disposition probable des chanes latrales dans une hlice a et dans une structure tertiaire.
Les prdiction de sites antigniques reposent sur lhydrophilicit de la squence et la probabilit de

retrouver ces zones lextrieur de la molcule, ces zones tant donc accessibles aux anticorps
3. Interactions impliques dans la conformation des protines.
La connaissance de ces interactions permet de matriser la conformation et ses volutions. Ceci est
particulirement important en technologie enzymatique , en technologie des viandes, en technologie
laitire ou encore en technologie des protines dorigine vgtale. De par leur structure, ce sont les
chanes latrales qui sont lorigine de ltablissement dinteractions contribuant la structure
spatiale et donc aux proprits de la protine.
3.1. Prise en compte des contraintes striques.
Les contraintes striques sont lies aux degrs de libert de rotation et des liaisons peptidiques
qui peuvent prendre toutes les valeurs comprises entre 180 et -180 (figure 55). Cependant la nature
de R (ionisation, volume, hydrophobicit, hydrophilicit) va impliquer des rpulsions des R ou des
attractions se traduisant par un rapprochement ou un loignement maximum et donc par des angles
et bien dfinis pour deux rsidus donns.
Pour les rsidus de glycine les zones de conformations permises sont importantes et symtriques tandis
que pour les rsidus d'alanine les degrs de liberts de et sont plus faibles (figure 55).
+180
+180
#
$
0
degr
-180
-180
0
"
L-alanine
+180
degr
-180
"
Glycine
Figure 55. Diagramme de Ramachandran. Conformations stables (= ) ou limites (III) des conformations permises.
p et a : feuillets plisss parallles et antiparallles ; R et L : hlices pas droite et gauche ; C : structure type
collagne.
page 107
Cependant le diagramme de Ramachandran ne donne que les conformations possibles sans dterminer
celle qui sera adopte en raison de sa plus grande stabilit. Pour obtenir cette structure il est ncessaire
de prendre en compte les divers potentiels nergtiques mis en jeu en fonction de et . Les mthodes
d'valuation existantes actuellement sont encore empiriques et utilisent des mthodes statistiques et
analytiques souvent trs sophistiques.
Dans cette approche il est tenu compte des rayons de Van der Waals qui sont respectivement gaux :
-C : 1,87 , H : 1 , =C : 1,76 , N : 1,65 , O : 1,4 , S : 1,85 , P : 1,7 .
Pour estimer la structure, la prise en compte des contraintes striques doit tre associe des
contraintes de polarit qui rendent possibles ou non certaines conformations mais aussi de
nombreuses autres considrations.
Les liaisons intramolculaires susceptibles de stablir et de contribuer la structure tertiaire sont
nombreuses : il sagit de liaisons covalentes dnergie leve (ponts disulfure) ou de liaisons de plus
faible nergie mais en nombre beaucoup plus lev (liaisons ioniques, liaisons dipolaires,
interactions de Van der Waals, liaisons hydrogne, interactions hydrophobes). Dans ce dernier
cas les phnomnes de cooprativit conduisent des zones stabilises par des nergies leves. Ces
interactions sont schmatises dans le tableau 12.
Les interactions avec le solvant, le plusz souvent leau, sont prendre en considration.
3.2. Les interactions de Van der Waals.
Il sagit dinteractions attractives et rpulsives entre groupes d'atomes quels qu'ils soient dont la
distance r est fonction de et et drivent du potentiel :
Uk,l ( i,i) = ak,l / rmk,l - Ck,l / r6k,l
m compris entre 9 et 12
ak,l et ck,l sont des constantes caractristiques des groupes d'atomes k et l. La reprsentation uk,l = f
(rk,l) montre qu'il n'y a pas d'interaction quand k et l sont loigns. Les forces qui drivent de ce
potentiel deviennent attractives puis trs fortement rpulsives quand r diminue. La distance moyenne
pour laquelle ces forces sont attractives est comprise entre 0,2 et 0,5 nm.
Ces interactions de Van der Waals contribuent surtout la stabilisation des structures internes des
protines et peut-tre leur prcipitation quand la sphre de solvatation diminue par augmentation de
la force ionique ou encore quand les effets rpulsifs de type lectrostatique sont minimiss (par
exemple au pHi).
Ces interactions attractives diminuent quand la temprature augmente ; le relargage des protines sera
donc favoris par abaissement de la temprature. L'nergie mise en jeu est de l'ordre de 1 10
kJ.mole1.
3.3. Les interactions dipolaires.
Les diples permanents que constituent certains rsidus d'acides amins ( SER, THR, TYR, CYS,
MET) et les liaisons peptidiques qui ont une valeur de 3,7 debyes contribuent l'orientation de la
chane polypeptidique, les degrs de libert tant conditionns par et . L'nergie d'interaction entre
deux diples spars de d est donne par :
k . l
3 ( k . x ) l . d
Udip = ______ .
___________
3
.x
. x5
o x est la magnitude scalaire de d et la constante dilectrique.
Udip peut tre valu en attribuant une charge partielle aux atomes des diples et en calculant
l'nergie lectrostatique par la somme des interactions du type Coulomb :
Udip =
page 108
Sq,l qk.ql
________
. dk,l
dans laquelle qk et ql sont les charges partielles de k et l et dk,l leur distance. qk et ql prennent les valeurs
de - 0,28,+ 0,28, - 0,39 et + 0,39 e pour N, H, O et C respectivement, a une valeur comprise entre 2
et 5.
Les nergies de ces interactions sont comprises entre 1 et 10 kJ.mole-1.
Liaison ou nergie distance

interaction (kJ.mole-1 ) (nm)
reprsentation
chimique
diminue
par
SH
S
rducteurs
sulfites
covalente
0,1
pont disulfure 320 - 380 0,2
pont
hydrogne
8 - 40
0,2
0,3
HS
S
N H
O C
TYR O H
SER
attractives ou
rpulsives
dipolaires
apolaire
(Van der
Waals)
hydrophobe
35 - 90
0,2
0,4
1 10
0,2
0,5
4 12
0,3
0,5
H
H
chaleur
NH 3 +
O-
O
H
H
O
froid
N GLN
H
C
O ASN
0,2
0,3
1 10
O C
H
GLN O
C
H
ASN N
H
ioniques
eau
ure
guanidine
dtergents
renforce
par
O
H
tableau 12 . Liaisons impliques dans la structure spatiale des protines.
eau ,sels
pH ,
chaleur
froid
ions
divalents
chaleur
froid
chaleur,
dtergents
solvants
froid
froid
dtergents
solvants
chaleur
page 109
3.4. Les interactions ioniques (lectrostatiques).

Elles sont essentiellement dues aux groupements ionisables des chanes latrales et se traduisent par
des rpulsions ou des attractions selon le signe. Dpendantes du pH elles contribuent la stabilisation
des structures spatiales (2 aire ou 3 aire) et aux changes avec l'environnement .
Les groupements et carboxyliques des acides aspartique et glutamique et le COOH de l'acide
amin C terminal sont susceptibles d'tre porteurs de charges ngatives; les groupements NH2 de la
lysine, NH2 de l'acide amin N-terminal, guadinine de l'arginine ou imidazole de l'histidine peuvent
tre porteurs de charges positives. L'nergie de la liaison ionique mise en jeu est de la forme:
a
Ui = - Zk . eek .. rZl . el . . k,l
k,l
rm
k,l
rkl est la distance entre k et l. La force qui drive du potentiel ak,l / rmk,l est rpulsive (m compris entre
9 et 12) ; cette force rsulte de l'impossibilit de pntration de deux atomes ou ions en-dessous de leur
rayon atomique (rayon de Van der Waals). La force attractive ou rpulsive ionique a une nergie de
liaison comprise entre 40 et 85 KJ.mole-1. Ces interactions affectent entre autre la solubilit, et les
proprits mulsifiantes et moussantes des protines .
Cest le pH du milieu et la prsence de sels qui sont le facteur de contrle le plus important de ces
liaisons. En raison des interactions qu'ils donnent avec l'eau, les groupes ioniques sont souvent situs
en milieu aqueux l'extrieur des protines et ces groupes sont impliqus dans l'quilibre acidobasique. Les courbes de titrage des protines sont trs complexes car les groupements ionisables sont
nombreux et peuvent reprsenter jusqu 30 50 % du nombre total de rsidus ; de plus l'ionisation
d'un groupement donn dpend de son environnement, le pKa pouvant alors varier de plus ou moins 1.
Au cours du titrage d'une protine de sa forme - vers la forme +, il existe un pH pour lequel le nombre
total de + est gal au nombre total de -, c'est le pHi (point isolectrique ), pH pour lequel la charge
globale est gale 0.
La prsence d'ions peut entraner des modifications importantes de ces interactions de mme que la
proximit dautres groupements ioniss ou non . Laugmentation de la force ionique au pHi amliore
la solubilit en rduisant les attractions lectrostatiques intermolculaires .
3.5. Liaisons par pont hydrogne.
Ces liaisons sont mises en vidence par spectroscopie IR, Raman ou par RMN. Ce type de liaison
s'tablit entre un atome lectrongatif possdant au moins un doublet lectronique (O, N, S) et un
atome d'hydrogne lui-mme li un atome lectrongatif. Dans les protines ces ponts se forment par
exemple entre l'O du C = O d'une liaison peptidique et l'hydrogne du NH d'une autre liaison
peptidique. La distance - O .... H - est d'environ 0,2 nm. Dans les protines ces liaisons se forment
entre amide et carbonyl (ASN-GLN), phnol et carbonyl (TYR - ASN ou GLN), carbonyl et hydroxyl
(ASP-GLU-SER). L'nergie de ces liaisons est de l'ordre de 10 40 kJ.mole-1 et varie en fonction de
l'lectrongativit et de l'environnement.
Ces liaisons jouent un rle dterminant dans la stabilisation de structures secondaires (hlice ,
feuillets ) et tertiaires.
Les protines, par les groupements polaires non ioniss des chanes latrales des rsidus d'acides
amins situs en surface, peuvent former avec les molcules d'eau de nombreux ponts hydrogne, ce
qui contribue la structure et la solubilit. L'eau peut entrer en comptition avec des liaisons H
"peptidiques", ce qui peut dstabiliser la molcule. Il faut nanmoins retenir que la biosynthse de la
macromolcules protique a lieu en milieu aqueux : il stablit alors un quilibre entre leau et la
protine et cest sous sa forme hydrate quil faut envisager sa fonctionnalit in vivo .
Ces liaisons sont dtruites par la chaleur, l'ure, le chlorure de guanidine.
page 110
3.6. Interactions hydrophobes.

La structure native d'une protine est fonction du solvant dans lequel elle se trouve. Ainsi l'addition d'1
mole d'ure 10 moles d'eau permet de modifier compltement la conformation d'une protine native
avec adoption de structures dsorganises. Par ailleurs, il est possible d'induire la formation de
structures plus ordonnes dans des solvants dont la capacit former des liaisons hydrogne est
infrieure leau (par ex. le 2-chlorothanol).
L'hydrophobicit des chanes latrales des rsidus d'acides amins est lie une structure chimique
apolaire telle qu'aucune interaction (sauf les interactions de Van der Waals) ne peut se produire avec
des molcules polaires comme l'eau. Ces chanes latrales qui "fuient" l'eau se trouvent donc souvent
regroupes dans des zones hydrophobes internes. En prsence d'ure, l'affinit des chanes latrales
apolaires pour l'intrieur de la molcule diminue de quelques centaines de joule. L'nergie libre de
transfert d'une mole de chane latrale de l'eau vers une solution d'ure 8 M est ngative et gale 0,3, - 1,59, - 2,93 et - 3,05 kJ.mole-1 respectivement pour l'alanine, la leucine, la phnylalanine et le
tryptophane. Comme les rsidus apolaires reprsentent environ 50 % de l'ensemble des rsidus d'une
protine, l'ure induit donc des modifications importantes de la conformation.
L'nergie de ces interactions, voisine de 3 13 kJ.mole-1 augmente avec la temprature en milieu
aqueux .
3.7. Ponts disulfure.
Ces ponts forms par oxydation de deux rsidus de cystine permettent la stabilisation des
conformations protiques et limitent leur nombre.
Dans une protine possdant n rsidus de cystine, le nombre de combinaisons aptes former des
points est C2n. Si n est pair le premier pont disulfure a n - 1 possibilits de se former, le second n - 3,
etc... et le nombre de ponts possibles est N = (n - 1) (n -3) (n - 5) ... (1). Bien qu'il existe de
nombreuses possibilits, un seul arrangement est souvent possible.
Ainsi quand la ribonuclase est dnature par le -mercaptothanol, les 4 ponts disulfure initiaux se
reforment ( pH 8 et l'air) alors qu'il existe 105 possibilits de formation de ponts S-S (N = 7.5.3.1);
l'activit biologique de la molcule rapparat. Cependant si la roxydation (limination du mercaptothanol) est ralise en milieu ure 8 M, l'limination ultrieure de l'ure conduit l'obtention
d'un ensemble de structures dont l'activit n'est gale qu' 1 % de l'activit initiale.
Ceci est en bon accord avec la prdiction des possibilits de formation des ponts car 1 seule structure
sur les 105 possibles correspond la protine native active.
Dans d'autres systmes protiques, des ractions d'change peuvent se produire. Ces ractions
affectent les proprits des molcules. Si elles se produisent entre molcules diffrentes, des
modifications des proprits rhologiques importantes apparaissent alors. Ainsi la viscosit et
l'aptitude glifier de solutions protiques sont troitement lies ces changes de ponts disulfure.
Ces liaisons covalentes, dont l'nergie est leve (320 - 385 kJ.mole-1) ne sont ni linaires ni dans un
mme plan (figure 4, chapitre II) et sont l'origine d'isomres optiques. Leur prsence impose des
contraintes importantes la structure protique et il est difficile de modifier la conformation de
protines contenant de nombreux ponts disulfure en particulier par chauffage.
Aprs rduction de ces ponts, certains sites hydrophiles (et hydrophobes) peuvent devenir accessibles
l'environnement solvant, ce qui se traduira par une augmentation de la solubilit.
Les rducteurs puissants, comme le dithiothritol ou le -mercaptothanol, ne sont pas utilisables dans
la prparation de protines alimentaires en raison de leur toxicit. Pour rompre des ponts disulfure
dans le but d'augmenter la solubilit d'une protine alimentaire, il est possible d'utiliser les sulfites qui
donnent des S-sulfonates (-S-SO3-), ou encore de rajouter des rducteurs comme la cystine .
page 111
VII - EXTRACTION & PURIFICATION DES PROTEINES

1 . Objectifs de lextraction & purification.
Jusquaux environs des annes 1980 il tait exceptionnel dextraire et purifier des protines usage
alimentaire exception faite des molcules possdant des activits enzymatiques, hormonales ou encore
pharmacologiques.
Si quelques produits dusage courant sont disponibles ltat quasiment pur (saccharose, chlorure de
sodium) ou dans un tat correspondant un mlange de composs aux proprits communes (huiles,
margarines, etc), il existe encore de nos jours certaines rticences consommer des prparations
protiques purifies.
La purification des protines est ralise:
- pour tudier les structures, la ou les fonctions et leurs interrelations. Dans ce cas, une petite quantit
de protine est suffisante mais sa puret doit tre la meilleure possible
- pour des utilisations industrielles et en particulier en technologie alimentaire. Dans ce cas la puret
ne joue quun rle secondaire par rapport aux cots de production et aux besoins. Les objectifs de
lextraction sont alors dordre fonctionnel, organoleptique, nutritionnel ou encore conomique.
Le choix des sources de protines extraire & purifier dpend du but atteindre.
Lextraction des protines de sous-produits dindustries agroalimentaires comme les laiteries, les
abattoirs, les amidonneries, les fculeries, les brasseries, les huileries, les distilleries, les sucreries etc
rpond la fois un souci de protection de lenvironnement par matrise des rejets et un souci de
rcupration de protines nobles potentiellement intressantes aux plans de leurs proprits
nutritionnelles ou fonctionnelles par exemple.
Pour amliorer la valeur nutritionnelle de sources de protines vgtales il faut souvent les sparer de
facteurs toxiques ou antinutritionnels (lectines, fibres, polyphnols, etc).
Lamlioration des qualits organoleptiques requiert par exemple, pour lacceptabilit, la matrise de la
couleur ( vert et chlorophylles, rouge et hmoglobine etc) ou du got et des armes (amertume, odeur
dherbe etc).
La meilleure utilisation de productions alimentaires en court-circuitant certaines transformations
protines-protines inutiles et de trs mauvais rendement, ce qui assurerait une meilleure disponibilit
au niveau mondial en particulier.
Pour les protines activit enzymatique, la source choisie sera celle dans laquelle la protine est la
plus abondante et la plus stable. Cette source sera, si possible, dune grande disponibilit et dun cot
le plus bas possible. Quand cela est possible on utilise des cellules pro ou eucaryotes susceptibles
dtre cultives (bactries, levures, moisissures, cellules vgtales ou animales). Dorganes animaux
sont extraites trypsine, rnine (prsure), pepsine et dorganes vgtaux papane, bromline, ficine,
actinidine. Le gnie gntique permet dobtenir des protines recombinantes qui sont souvent
exprimes en grandes quantits dans des cellules microbiennes faciles cultiver. Il arrive parfois que
ces protines ne soient pas excrtes ou se retrouvent sous une forme insoluble en milieu aqueux
(Escherichia coli). Quand elles sont excrtes (Bacillus subtilis) la physiologie de la bactrie est moins
connue et la bactrie plus difficile contrler. Saccharomyces cerevisi nexcrte que de petits
peptides. Les modifications post-transcriptionnelles comme la glycosylation ne sont pas effectues par
les microorganismes. Les cultures de cellules animales (cellules dinsectes et de baculovirus)
permettent dexprimer bon nombre de gnes avec modifications post-transcriptionnelles.
page 112
Les enzymes purifier sont par exemple des protases utilises dans lindustrie des dtergents, des
amylases hydrolysant lamidon ou des pectinases hydrolysant les composs pectiques. Dans le cas de
protines activit enzymatique ou aux proprits fonctionnelles recherches, il est fondamental de les
produire ltat natif pour que la prparation prsente une activit technologique ou pour les
enzymes une activit spcifique aussi leve que possible.
Souvent, la structure native des protines dun produit vgtal ou animal est altre au cours de l
extraction par les conditions adoptes (temprature, traitements mcaniques et/ ou chimiques, etc.)
mais aussi par le contact avec des protases soit naturellement prsentes (trypsine, actinidine du kiwi,
papane de la papaye, bromline de lananas) soit libres et mises en contact des protines extraire
par le traitement (cathepsines, etc). Pour minimiser ces modifications dfavorables il est possible de
matriser la concentration locale excessive en composs dnaturants divers au cours de leur addition,
de contrler la temprature (aux temprature infrieures 10C lactivit des protases est rduite) et
le pH (les pH extrmes sont des facteurs de dnaturation), dutiliser des inhibiteurs de protases
comme leupeptine : N actyl-LEU-LEU-ARG-al, antipaine : (S)-1-carboxy-2phnylthyl carbanoylARG-VAL-ARG-al, chymostatine : PHE-(Cap)-LEU-PHE-al, ces inhibiteurs tant ensuite limins
par les proprits de leur fonction aldhydique).
Pour extraire les protines intracellulaires il faut souvent dtruire par des moyens physiques ou
chimiques les membranes et parois cellulaires impermables aux macromolcules. Les protines
membranaires ne seront extractibles quen prsence de dtergents ou de solvants organiques. La paroi
pecto-cellulosique des cellules vgtales les rend plus proche dans leur comportement des cellules
microbiennes que des cellules animales. Par ailleurs les cellules vgtales contiennent des acides
organiques et des polyphnols oxydables par des polyphnol-oxydases en quinones susceptibles de
ragir avec les protines (tannage du cuir) et de se polymriser en tanins (tanins condenss trs ractifs
avec les protines).
La
perte
dactivit
ou
de
valeur
nutritionnelle,
la
du
rendement
%w
userdict/chemdict
L/gr/grestore
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a
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S
1
p
B
g
p
sdextraction requirent soit une limination des phnols par adsorption sur des rsines soit une
inhibition des activits polyphnol-oxydasiques ou une limination des quinones par des rducteurs ou
par condensation (polyamide, poly-caprolactone, polythylne, polyvinyl-pyrrolidone; cette dernire
est la plus utilise sous forme insoluble sous la dnomination de Polyclar AT).
currentpoint
N
CH2
CH
O
CH2
n
currentpoint
192837465
Les effets inhibiteurs des acides peuvent tre minimiss par le solvant qui doit imposer un pH par son
pouvoir tampon.
2. Mthodes dextraction des protines.
De par leur structure native complexe, leur htrognit, leurs associations avec dautres composants
cellulaires, les protines sont les bio-polymres les plus difficiles extraire.
Lextractibilit de protines dans un environnement donn dpend dabord de leur localisation et de
leur solubilit en milieu aqueux, de leur dnaturabilit qui correspond des modifications de leur
conformation avec comme consquence frquente une diminution de solubilit et une perte dactivit.
Elle est galement fonction de la taille et de la forme de la molcule, de sa polarit etc.
Le schma gnral de lextraction purification des protines (figure 56) est fonction de la matire
premire et plus particulirement de sa teneur en eau.
page 113
Dans les mthodes dextraction ngatives, la (ou les) protine est maintenue dans la matire
premire de laquelle on extrait divers composs, le rsidu senrichissant alors relativement en
protines. Cette mthode ne permet pas datteindre des taux de purification levs car la protine reste
associe de nombreuses substances; le produit obtenu est un concentr ou concentrat.
Dans les mthodes dextraction positives, la (ou les) protine est extraite, par mise en solution le plus
souvent, de la matire premire puis spare des composants qui lont accompagne. Ces mthodes
permettent datteindre des taux de puret trs grands, le produit obtenu tant un isolat.
Matire premire solide

Teneur en eau infrieure 10%
Matire premire solide
Matire premire liquide
Teneur en eau suprieure 50%
destructuration
Moyens chimiques
Moyens physiques
Solubilisation des protines
Dtergents, acides, bases,

solvants
Broyeurs, ultrasons, hautes

pressions, chaleur
Phase
insoluble
rsiduelle
Addition deau, ou dthanol

Extraction des substances solubles
Sparation des particules

(en fonction de leur masse
volumique : turbosparation)
Phase liquide
rsiduelle
Phase solide
rsiduelle
Rsidu
insoluble et
protines
Prcipitation ou
rcupration slective des
protines
schage
concentrat
schage
isolat
Phase
soluble
rsiduelle
figure 56. Schma des grandes voies dextraction des protines
Le rendement dextraction R (R = masse de protine extraites / masse de protines totales) est souvent
plus faible pour les produits dorigine vgtale que pour les produits dorigine animale.
La slectivit caractrise le degr de puret et dhomognit.
Le cot dextraction dpend entre autre du rendement ( pondrer du temps dextraction : masse
extraite par unit de temps) et de la concentration de lextrait.
page 114
3. Les procds de dstructuration.

Ils permettent la dlocalisation des protines extraire. Appliqus des produits faible teneur en eau
ils augmentent le rapport surface / volume ce qui permet de meilleurs rendements dextraction solide /
liquide par la suite.
3.1. Traitements de dstructuration physique.

Les traitements de dstructuration physique sont nombreux : concassage, agitation, broyage, hachage,
pressage, mouture, pulvrisation. Les technologies sont toujours adaptes aux proprits de la matire
premire traiter.
Au laboratoire cette opration est gnralement ralise en phase liquide.
Les broyeurs utiliss (Ultraturrax, Waring blendor) sont des systmes mcaniques plus ou moins
sophistiqus, souvent couteaux, qui peuvent tre facilement rfrigrs.
Le passage par une poudre actonique (rsidu dshydrat rsultant du broyage du tissu basse
temprature et de son traitement -15C par de lactone anhydre) donne des rsidus dlipids
enrichis en protines et peptides avec parfois une dnaturation et une perte dactivit.
Les cellules bactriennes et levuriennes sont rsistantes au broyage et il faut les dstructurer en
prsence de billes de verre ou de sable avec risques de pertes par adsorption.
Lagitation de la matire premire additionne dun abrasif avec une frquence leve donne de bons
rsultats, la chaleur dgage au cours de lopration tant limine par refroidissement dans du CO2
solide (neige carbonique).
Les parois cellulaires peuvent tre fragilises par des cycles conglation / dconglation.
Les pertes de charges subies par un liquide soumis une pression leve (500 bars et plus) puis
brutalement ramen pression atmosphrique permettent de rompre des cellules. Il en est de mme
avec certains procds pour lesquels le liquide est projet sur une paroi mtallique avec une vitesse
leve (homognisateur).
Lextrusion de la matire premire sous forme de pte congele produit, du fait des cisaillements, les
rupture des parois cellulaires.
Les ultra-sons (20 kHz et plus) appliqus aux solutions produisent un phnomne de cavitation
gazeuse, cest dire des zones de rarfaction gazeuse et de compression qui se dplacent rapidement.
Les bulles gazeuses peuvent mme coalescer et gnrer une onde de choc. La production de chaleur,
de radicaux libres et dions peut conduire une dnaturation des protines, do la ncessit de
refroidissement et doprer par des squence de traitement de courte dure suivies dune priode de
repos de quelques minutes.
Les traitements thermiques (50 140C pendant des dures variables) permettent de fragiliser
certaines structures, de fluidiser une phase (fonte des graisses), de solidifier une phase (coagulation
presque toujours dnaturante et irrversible des protines), de dshydrater dans certaines conditions
(schage, concentration) et enfin de pasteuriser, blanchir ou striliser la matire traite.
3.2. Traitements de dstructuration chimique.
Ces traitements sont nombreux et gnrent souvent des modifications de conformation.
Les traitements en milieu alcalin ou acide, pH loigns du pHi, chargent

positivement les protines, augmentant ainsi leur solubilit dans la phase aqueuse.
page 115
ngativement ou
La force ionique modifie aussi la solubilit des protines (effets de salting in ou de salting out).
Les dtergents dissociant protines et lipides provoquent souvent une dnaturation.
Certains solvants (actone, tolune) favorisent lautolyse cellulaire.
3.2. Traitements enzymatiques.
Il sagit dune mthode douce et slective de dstructuration des parois cellulaires. Lactivation des
enzymes hydrolytiques endognes est utilisable (autolyse), mais il y a risque de protolyse.
Pour les bactries Gram + , on peut utiliser le lysozyme du blanc duf qui catalyse lhydrolyse des
liaisons 1-4 glycosidiques des peptidoglycanes de la paroi. Dans le cas des levures on utilise des
polysaccharidases dorigine fongique ou descargot (Helix pomatia).
4. Optimisation de la solubilisation.
De nombreux facteurs principaux souvent non indpendants sont prendre considration. Dans le
cas de solubilisation de protines destines tre consommes dans notre alimentation, ils font lobjet
dune approche exprimentale base sur la mise en place de plans dexprience.
Parmi les plus importants on peut signaler le rapport solide/solvant, la granulomtrie, le mode
dagitation, la temprature, le temps, le pH, la force ionique, la temprature, la constante dilectrique,
la prsence de cations bivalents, etc.
5. Purification & concentration & rcupration des protines solubilises.
La prcipitation des protines est un bon moyen de concentration qui engendre, selon les mthodes
utilises, des dnaturations rversibles ou non. Elle dpend essentiellement de facteurs qui sont :
- la nature, la polarit et la temprature du solvant
- la charge de la protine directement lie au pH
- la conformation et le degr dhydratation
- la prsence de composs non protiques (sels, oses, lipides).
5.1. Prcipitation enzymatique.
La coagulation des casines du lait par la prsure est une des tapes de purification de casinates, la
phase liquide exsudant spontanment aprs tranchage et gouttage.
La coagulation du fibrinogne du sang par la thrombine est une sparation des hmaties du srum
liquide.
5.2. Prcipitation isolectrique.
La solubilit dune protine est minimale son pHi ce qui ne prjuge pas de sa prcipitation. Les
courbes de la solubilit en fonction du pH sont en forme de U et dpendent entre autre de la force
ionique (figure 57).
page 116
solubilit
solubilit
protine+
-lactoglobuline
protine
NaCl 20 mM
NaCl 5 mM
NaCl 1 mM
protine +
pHi
pH
5,4
5,8
pH
figure 57. Courbes de solubilit des protines en fonction du pH.
Nanmoins, une protine pralablement dnature par la chaleur ou un traitement en milieu trs acide
prcipite avec un rendement trs lev son pHi. Ce procd est utilis en laiterie pour rcuprer les
protines sriques dans le caill (procd Centriwhey). La dnaturation thermique souvent irrversible
gnre des protines aux proprits fonctionnelles limites.
5.3. Prcipitation par augmentation de la force ionique.
Rappelons que les albumines sont solubles en phase aqueuse et que les globulines ne sont solubles
quen prsence de sels. La force ionique est dfinie par :
=1
2
! ci.z2i
avec c concentration molaire en ion i et z valence de lion i.

(exemple : une solution molaire de Na Cl a une force ionique de 1 , de K2SO4 de 3 )
La solubilit des protines suit la loi de KIRKWOOD :
log S = log So + B - A.
dans laquelle S est la solubilit,
So la solubilit force ionique nulle (dans leau),
A une constante indpendante de la temprature qui dpend du rayon de la molcule, de la nature du sel, de la constante
dilectrique et de la temprature et
B une constante fonction de la temprature, de la nature du sel et de la constante dilectrique.
Souvent B>A ce qui conduit une augmentation de log S en fonction de aux faibles forces ioniques
(effet de salting in) et une diminution de log S aux fortes forces ioniques (effet de salting out)
comme schmatis sur la figure 58.
Ces effets, qualifis de rciproques, varient avec les ions ; plus un ion aura une charge et un volume
importants et plus il fixera de molcules deau qui ne seront plus solvantes, leffet de salting out tant
alors lev. Cette srie est qualifie de srie dHOFMEISTER ou de srie lyotropique ou
chaotropique. Classs en fonction de leurs effets croissants en salting out elle est la suivante :
trichloractate > citrate > HPO42- > SO42- > tartrate > SCN- > ClO4- > NO3- > actate > I- > Br- > Cl> OH- > FAl+++ > OH3+ > Ba++ > Sr++ > Ca++ > Mg++ > NH4+ > K+ > Na+ > H+ > Li+
page 117
log (S/ So) srum albumine

(20C)
log S 10C
1
fib
NaCl
b
00
0
68
50
e1
67
in
ne
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mi
gl
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0
m
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ru
S
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lin
bu
glo
000
450
ne
og
rin
-1
KCl
-2
Na2 SO4
0
-1
-2
0
force ionique
3
4
force ionique
figure 58. a-Variations de la solubilit de la srum albumine en fonction de la force ionique et de la nature du sel
b- Variations de la solubilit en fonction de la force ionique [(NH4)2 SO4 ] pH 6,9 .
Par ailleurs, plus le poids molculaire de la protine est lev et plus sa prcipitabilit pour une mme
force ionique est leve (prcipitation fractionne). Dans la pratique cest le sulfate dammonium qui
est utilis (solution sature 4 M de densit 1,235) en milieu lgrement tamponn (50 mM).
5.4. Prcipitation par diminition de la constante dilectrique.
Lure ou le chlorure de guanidine augmentent D ( D = 80 avec leau et 130 avec une solution 6M
dure) diminuent lintensit des liaisons hydrogne intra et intermolculaires et donc favorisent la
solubilit des protines charges par augmentation des forces rpulsives des molcules rgies par la loi
de COULOMB :
q . q'
f= 1 .
D d2
Les solvants qui diminuent D diminuent la solubilit (dimthylsulfoxyde D = 49, dimthylformamide
D = 37, mthanol D = 33, thanol D = 24, actone D = 21, benzne D = 2,3 et hexane D = 2).
5.5. Coprcipitation par adsorbtion.
Les polythylne glycols (PEG) de poids molculaire compris entre 6000 et 20000 permettent de
fractionner les protines du sang diffrents pH (4,6 6 et 7). Ils donnent de trs nombreuses liaisons
hydrogne avec les protines.
Lacide polyacrylique permet dobtenir partir du lactosrum des protines aux proprits
fonctionnelles comparables celles du blanc duf.
La poly-vinylpyrrolidone, les tanins, le poly-uronate, la carboxy-mthyl-cellulose, les alginates sont
des polymres qui forment des complexes avec les protines permettant leur rcupration.
Les poly-phosphates (hexamtaphosphate) et le chlorure ferrique (et la plupart des sels de mtaux
lourds malheureusement non utilisables en technologie alimentaire en raison de leur toxicit) sont
dexcellents agents de prcipitation des protines.
5.6. Lultrafiltration.
Il sagit dune mthode de concentration / sparation des macromolcules biologiques base sur leurs
diffrences de taille et de forme qui utilise des membranes semi-permables (tamisage molculaire).
En fonction des dimensions des particules sparer et donc de leur diamtre on peut dcrire :
- la filtration jusqu 1000 nm (mulsion de globules gras, bactries)
- la micro-filtration entre 1000 et 100 nm (virus, micelles de casine)
- la nano-filtration entre 100 et 10 nm (virus, micelles)
page 118
- lultra-filtration entre 10 et 1 nm (protines, hormones, vitamines)

- losmose inverse jusqu 0,1 nm (molcules organiques simples et ions).
Deux phases sont obtenues : un rtentat compos dun concentr de molcules les plus volumineuses
et un filtrat ou permat contenant les molcules les plus petites qui sont la mme concentration que
dans le rtentat (figure 59).
liquide initial
macromolcule
molcule
ultrafiltrable
rtentat
pompe
rtentat
membrane
permat
permat
figure 59. Schma de principe dune ultrafiltration
Les membranes sont soit planes et le flux de filtration leur est perpendiculaire soit tubulaires et le flux
est tangentiel. Les supports sont soit organiques (cellulose, actate de cellulose, poly-carbonates et
autres polymres dont les protines) soit minraux (alumine, cramique, oxyde de zirconium etc). Ces
derniers sont plus rsistants aux pertes de charge et aux agents chimiques de nettoyage.
La rtention dpend du diamtre moyen des pores mais aussi des dimensions et de la conformation des
molcules. Le dbit de filtration dpend de nombreux facteurs et les interactions entre protines
concentres la surface de la membrane et avec la membrane gnre la formation dune couche de
polarisation qui modifie les proprits et les performances du systme. Cet effet de polarisation limite
250 - 350 g / l la limite de concentration du rtentat. Llimination de soluts dans le permat
requiert alors laddition deau (diafiltration : dbit deau = dbit de permat) pour rester en-dessous
des concentrations limites.
Lultrafiltration destine la purification des protines nest utilise lchelle industrielle que pour le
lactosrum, les extraits vgtaux sans autres polymres, le sang. Llimination de leau est possible
grce lemploi de membranes porosit trs faible : osmose inverse.
Au laboratoire de nombreuses membranes (planes ou fibres creuses) en polymres organiques sont
disponibles et proposes avec des seuils de coupure prcis.
XM 300
XM 100
XM 50
PM 30
PM 10
fibrinogne
hmoglobine
ovalbumine pepsine
insuline
globuline 7S
300 000
64 000
35 000
45
000
6000
160 000
apoferritine
Srum albumine
mypglobine
peptides
480 000
67 000
17 800
5.7. Mthodes bases sur la structure et les proprits des protines.

Ces mthodes sont essentiellement bases sur les proprits de surface des molcules protiques et
concernent leur charge, leur polarit, leur apolarit, la prsence de groupements particuliers. En effet,
page 119
seule la surface des protines permet des changes facilement rversibles avec le milieu environnant
sans modification par trop dfavorable de conformation, ce qui permet leur purification.
5.7.1. Mthodes bases sur la taille et la forme : chromatographie dexclusion.
Le principe de cette mthode est indique dans le chapitre V.3.5. Pour les lments de thorie plus
gnraux voir le chapitre II.7.1.
Il sagit dune mthode intressante pour purifier des protines car :
- elle est peu dnaturante.
- elle ninduit pas de modification de milieu en cours dopration ; leau, facilement liminable
par schage ou lyophilisation par exemple, peut tre utilise comme phase luante.
- la rcupration des activits enzymatiques est excellente.
A lchelle industrielle les colonnes utilises en srie ou en parallle ont 15 cm de haut, 37 cm de
diamtre et leur volume total est de 16 l. Cinq units de ce type en srie donnent la mme rsolution
quune colonne de 75 cm de longueur.
Les polymres les plus utiliss dans ce type de sparation sont indiqus dans la tableau 13.
nom
commercial
Sphadex
Sphacryl
Spharose
Spharose CL
pH :domaine stabilit
polymre
dextrane
dextrane/acrylamide
agarose
agarose rticul
d'emploi
(temp.C)
stabilit
solvants sels chaotropiques
I = instable
biodgradable
stable
instable , ure I
stable
2
2 - 11
4-9
3 - 14
120
120
40
120
Ultrogel A
agarose
Ultrogel ACA agarose/polyacrylamide
4-9
3 - 10
40
40
sels I, ure I, solvants I

biodgradable
Biogel A
Biogel P
4-9
2 - 10
40
120
sels I, ure I, solvants I

solvants I, oxydants I
1 - 14
120
stable
agarose
polyacrylamide
Fractogel TSK polyther rticul
tableau 13. Matrices utilisables en gel filtration.
Les gels les plus utiliss sont des agaroses, des polyacrylamides ou des gels mixtes.
Le choix de la matrice pour purifier une protine repose sur plusieurs facteurs :
- la gamme de poids molculaires sparer. Si les protines sont exclues totalement, la
mthode permet leur dessalage.
- la rsolution. Toutes conditions tant gales par ailleurs les granulomtries les plus fines
donneront une meilleure rsolution mais avec un dbit plus faible (granulomtrie souvent exprime en
mesh avec 400 mesh = 37 m, 100 mesh = 149 m et 10 mesh = 2 mm). Les gels rigides peu
dformables sont utilisables en HPLC et FPLC (fast protein liquid chromatography).
- stabilit aux hydrolyses dorigine microbienne, aux solvants, lure et certains sels.
5.7.2. Mthodes bases sur la charge. Echange dions.
Ces mthodes sont surtout reprsentes par les changes dions en batch ou en colonne. Autour de leur
pHi les protines sont charges soit positivement soit ngativement et sont donc changeables au
niveau dune phase stationnaire le plus souvent solide et porteuse de charges de signe oppos (figure
60).
page 120
- Si elles sont charges positivement (pH < pHi), elles seront changeables avec un support charg
ngativement et la chromatographie est qualifie de chromatographie dchange de cations.
- Si elles sont charges ngativement (pH > pHi), elles seront changeables avec un support charg
positivement et la chromatographie est qualifie de chromatographie dchange danions.
chromatographie d'change de cations

X - Na+
+ Protine +
X - Protine +
Na+
chromatographie d'change d'anions

Y+ Cl+ Protine -
Y+ Protine -
Cl-
figure 60. Schma des changes dions dans la purification dune protine
Les protines fixes par liaison ionique la phase stationnaire seront lues slectivement soit par
variation de pH soit surtout par variation de la concentration en contre-ion (ion de mme charge que la
protine). Par exemple une protine de charge nette +4 sera lue avec une concentration en ion
sodium plus faible que celle requise pour luer une protine de charge nette de +10. Toutes conditions
tant gales par ailleurs, laffinit des contre-ions varie avec leur charge et leur taille et suit
sensiblement la srie dHofmeister (cf chapitre VII.5.3).
a) Choix de la matrice.
Ce choix porte dabord sur la nature de la matrice de la phase stationnaire souvent constitue par un
polymre organique (cellulose, agarose, dextrane, polyacrylate, polystyrne, poly-ther etc) ou minral
portant sur un bras organique une fonction ionisable. Polystyrnes hautement rticuls et surtout
silices greffes (TSK) peu dformables sont utilisables en chromatographie liquide haute performance.
b) Choix du groupement fonctionnel.
Le choix porte ensuite sur la nature du groupement fonctionnel (ionogne) impliqu dans lchange
dion et selon la valeur de son pKa on dfinit les changeurs forts ou faibles.
Les changeurs forts (de cations ou danions) restent ionises dans une trs large gamme de pH, donc
en gnral dans lintervalle de pH utilis pour purifier la protine.
Les changeurs faibles ne restent par contre ioniss que dans une gamme restreinte de pH (figure 61).
fraction molaire charge

1
1
changeur de cations
fort
faible
0,5
0 0
14
pH
fraction molaire charge

changeur d'anions
fort
faible
0,5
0 0
14
pH
figure 61. Variation de la charge des changeurs dions forts et faibles en fonction du pH
page 121
Les principaux groupes fonctionnels changeurs dions utiliss pour purifier les protines sont
indiqus dans le tableau 14.
nom
changeur d'anions
abrviation
forts
trimthylaminomthyl
-CH2 -N+ (CH3)3
trithylaminothyl
-CH2 -CH2-N+ (C2 H5)3
-CH2 -CH2-N+ (C2 H5)2 - CH2-CH(OH)CH3 dithyl-2-hydoxypropylaminothyl
faibles
-C2H4N+H3
aminothyl
-C H N+H(C H )
dithylaminothyl
2 4
TAM
TEAE
QAE
AE
DEAE
52
changeur de cations
nom
abrviation
forts
-SO3-
sulfo
-CH2 -SO3 -
sulfomthyl
SM
sulfopropyl
SP
carboxy
carboxymthyl
CM
-C3H6 -SO 3faibles

-COO-CH2 COO-
tableau 14. Groupements changeurs dions utiliss pour la purification des protines.
Pour caractriser au mieux le systme on donne le nom du groupement impliqu associ au nom de la
matrice par exemple DEAE-cellulose, CM-cellulose, polystyrne sulfon etc.
Le choix du groupement fonctionnel utiliser dpend entre autre de la stabilit de la protine en
fonction de la force ionique et du pH. Si la protine est plus stable sous forme cationique on utilisera
un changeur de cations et inversement. Par exemple l-amylase est stable au-dessus de pH 6 ce qui
conduit utiliser un changeur danions pour la purifier (figure 62).
!-amylase
stabilit
fixe sur changeur
(% de l'initial)
de cations
100
50
pHi = 5,2
pH
fixe sur changeur

d'anions
figure 62. Charge et stabilit de l-amylase en fonction du pH.
page 122
c) Modalits de la sparation.
Il est frquent de purifier une protine donne par une squence chromatographie dchange danions
/ chromatographie dchange de cations.
Le point isolectrique peut tre dtermin par focalisation isolectrique. Les protines migrent sous
leffet dun champ lectrique dans un milieu tamponn en gradient par des ampholines; quand elles
atteignent la zone correspondante leurs pHi respectifs leurs vitesses de migration sannulent et leurs
localisations dans les ampholines correspondent leurs pHi.
La sparation par change dions peut tre ralise en batch ou sur colonne, llution tant ralise soit
de faon statique discontinue avec un petit volume dluant de forte force ionique, soit de faon
dynamique par un flux constant dluant.
Dans un systme donn il existe trois possibilits dlution :
- isocratique (la composition de la phase luante est constante)
- par paliers (la composition de la phase luante est discontinue et croissante (par ex en force
ionique)
- en gradient . Dans ce cas gnralement contrl par des systmes informatiss (couplage
pompes-micro-ordinateur), la composition de la phase mobile (pH et force ionique) varie dans le
temps linairement ou avec un autre mode (exponentiel, partiellement continue puis linaire etc).
d) Applications en sciences des aliments.
A lchelle industrielle deux procds sont actuellement utiliss:
- le procd Sphrosil ( Rhne Poulenc) dans lequel une silice est porteuse des groupements
fonctionnels changeurs dions. Il sagit dune technique rsolutive permettant datteindre de bons
niveaux de purification. Il est utilis pour la purification des protines du lactosrum, du soja et reste
potentiellement utilisable pour purifier les protines du colza, de luzerne, et de pommes de terre.
- le procd Vistec. Il utilise des celluloses changeuses danions faibles.
Linconvnient majeur de ces procds rside dans la prsence dans lluat dions participant
lchange et aussi de la ncessit dutiliser les deux types dchanges (anions et cations) pour les
chantillons de pH voisins de la neutralit.
5.7.3. Mthodes bases sur la charge. Chromato-focalisation.
Il sagit dune mthode hybride entre lchange dions et llectro-focalisation.
En lectro-focalisation les protines sont spares sous leffet dun champ lectrique dans une matrice
glifie prsentant un gradient de pH.
En change dions les protines sont un moment donn ( une force ionique et un pH dtermins)
lies un changeur insoluble puis lues grce un gradient de pH et/ou de force ionique.
En chromatofocalisation (figure 63) le gradient de pH est obtenu en introduisant dans une colonne
pralablement quilibre un pH donn (per exemple 9) un tampon de pH diffrent (par exemple 7).
pH 7
Protine dans
tampon pH 7
pH 8
Colonne
changeuse
danions quilibre
pH 9
pH 9
figure 63 . Schma du principe de la chromatofocalisation .
page 123
Si la protine en milieu tamponn de pH 7 et de pHi = 8 est introduite dans une colonne pralablement
quilibre pH 9, la protine migrera et son pH environnant augmentera sous leffet du pH colonne.
Quand elle atteindra un pH juste suprieur son pHi, sa charge ngative lui permettra de se lier la
matrice charge positivement. Quand le tampon pH 7 continuera de migrer dans la colonne une
diminution de pH interviendra et la protine charge positivement pH < son pHi migrera jusqu ce
quelle atteigne un pH suprieur son pHi et ainsi de suite. La protine est lue un pH trs proche
de son pHi.
Au cours de lopration il se produit une focalisation car les protines migrent dans la colonne avec
une vitesse infrieure celle de la phase mobile et les protines sont arrtes et concentres au pH gal
leur pHi.
On utilise en gnral des poly-tampons constitus par des mlanges dune grand nombre dacides
aliphatiques, des copolymres de glycine etc.
5.7.4. Mthodes bases sur lhydrophobicit de surface.
Il sagit de chromatographie en phase inverse (cf chapitre II.7.3.2). La protine donne des interactions
hydrophobes avec une phase stationnaire apolaire par les chanes latrales des rsidus dacides amins
apolaires positionnes en surface (figure 64).
silice
zones hydrophobes
protine
chane en C18
silice
figure 64. Chromatographie hydrophobe dune protine .
Les groupements utilisables sont des C18 (octadcyl), C8 (octyl), phnyl, etc. Llution est ralise par
addition dun tensioactif non ionique (Triton X100 par exemple), par addition dthylne glycol qui
diminue la polarit, par variation de pH. Ces mthodes sont surtout utilises lchelle du laboratoire.
5.7.5. Mthodes bases sur ltablissement de liaisons covalentes.
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L/gr/grestore
L/tr/transform
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8
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m1
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sp
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2
sm
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px
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gs
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dp
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ar
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0
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m
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p
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a
sd
sagit
surtout
dune
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dans
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des
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-1
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-8
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0
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419
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2
bW
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-2
cw
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py
1
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pcm
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1
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m
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gr
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mv
st
p
2.25
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m
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pp
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p
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n
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m
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protines
aptes
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de
tels
changes.
Llution
est
ralise
par
rduction
du
pont
disulfure au moyens de rducteurs comme le -mercapto-thanol ou le dithiothritol.
currentpoint
S S R + HS
S
CH2
CH2
+ R'
P
SH
CH2
S S R' + HS
CH2
SH
P
currentpoint
192837465
currentpoint
192837465
5.7.6. Chromatographie sur hydroxyapatite.

Lhydroxyapatite
currentpointest obtenue par les ractions suivantes :
Ca Cl2 , 2 H 2 O
+ Na2 H PO4 , 2 H 2 O
Ca H PO4 , 2 H2 O
Na OH
bullition
Ca H PO4 , 2 H2 O
brushite
Ca3 (PO4 )3 , Ca (OH) 2

hydroxyapatite
+ 2 Na Cl
page 124
Ladsorption des protines fait intervenir des ions Ca++ et PO43- prsents la surface des cristaux.
Ainsi les phosphoprotines ont une grande affinit pour lhydroxyapatite (phosphoprotine du jaune
duf, et lipovitellines, phosvitine).
5.7.7. Chromatographie par chlation.
Ladsorption entre la protine isoler et la matrice intervient par lintermdiaire de liaisons de
coordination entre des ions mtalliques retenus par des rsines. Avec les protines ce sont les rsidus
his, trp et cys de surface qui sont mme de donner ce type de liaison.
5.7.8. Chromatographie daffinit.
Dcouverte en 1910 lors de ladsorption slective damylase sur un amidon insoluble, elle est base
sur la reconnaissance spcifique de deux molcules :
- enzyme & substrat
- enzyme & inhibiteur comptitif
- antigne & anticorps
- hormone & rcepteur
- glycoprotine & lectine
Les liaisons impliques sont multiples en nombre et en nature (liaisons ioniques, liaisons hydrogne,
liaisons hydrophobes essentiellement) mais restent parfaitement localises dans lespace. Ainsi
lnergie change est leve ce qui conduit une constante dassociation leve (affinit leve).
Le ligand immobilis sur une phase stationnaire fixe est gnralement situ au sommet dun bras pour
faciliter le positionnement spatial et donc les interactions avec la molcule affine (figure 65).
protine
ligand
matrice
liaisons ioniques
zones hydrophobes
zones liaison H
protine
ligand
figure 65. Schma dune quilibre entre ligant et protine en chromatographie daffinit.
a) Le choix du ligand.
Spcificit
Idalement un ligand ne devrait reconnatre quune seule protine purifier. Souvent dautres
protines que celle vise donnent un certain nombre dinteractions avec le ligand mais avec une
nergie change plus faible.
page 125
Par exemple l-chymotrypsine se lie aux deux nantiomres de lester mthylique du tryptophane,
lester D non hydrolysable par lenzyme constituant donc un ligand potentiel pour la purification de
lenzyme.
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userdict/chemdict
L/gr/grestore
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SA
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-1
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D
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w
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2
lp
g
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O
1
4
f
La fixation du NAD+ sur une matrice insoluble permet la fixation des dshydrognases qui utilisent
lenzyme pour fonctionner. Ce ligand est qualifi de gnral.
currentpoint
O
C
NAD+
NH
currentpoint
192837465
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m
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16
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cm
sm
dp
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m
1
d
2
Ces enzymes ainsi que les kinases, qui ont lATP comme cofacteur, peuvent tre purifies en fixant de
lAMP 5 une matrice insoluble.
Il existe des pseudo-ligands qui sont des substances mimtiques. Ainsi les colorants drivs de
triazines polysulfons (bleu Cibacron 3GA ou HE3B spcifiques respectifs du NAD+ et de NADP+)
se lient spcifiquement aux enzymes NAD+ qui ont une conformation particulire qualifie de pli
dinuclotidique.
currentpoint
bleu Cibacron F3GA
O
NH2
R1
(spcifique du NAD+)
SO3Na
R2
NH
O
NH
N
R1 = H ou SO3 Na
R2 = SO3 Na ou H
NH
SO3Na
N
N
matrice
currentpoint
Les lectines sont des glycoprotines dorigine vgtale ou prsentes chez certains mollusques capables
dagglutiner spcifiquement les rythrocytes humains (agglutinines). Constitues gnralement de 4
protomres identiques reconnaissant le mme glucide soit de 4 protomres identiques 2 2
reconnaissant plusieurs glucides (tableau 15).
lectine
poids
molculaire
concanavaline A (conA)
nombre de
sous-units
lectine de lentille
55000 pH<5,6
110000 entre 5,7 et 7
49000
2
4
2
lectine de soja
120000
36000
79000
2
6
lectine de germe de bl
lectine d'escargot
tableau 15. Proprits de quelques lectines
spcificit
mannose et
glucose
mannose, glucose
N-actyl glucosamine
N-actyl glucosamine
galactose
N-actyl glucosamine
N-actyl glucosamine
N-actyl galactosamina
D-galactose
192
page 126
Rversibilit
Le ligand doit former avec la protine purifier un complexe rversible avec une constante
dassociation suffisamment leve pour viter leffet lavage de lluant.
KA =
Li-P
Li . P
La dissociation doit tre ralisable dans des conditions suffisamment douces pour ne pas induire de
dnaturation des protines. Llution peut tre slective avec un luant comptitif (NAD+ pour luer
les protines lies NAD, lATP ou au bleu Cibacron) ou tre obtenue par des variations de
conformation induites par le pH ou la force ionique (figure 66).
matrice ligand
+
protine
protine
,
de
ent n (pH
m
o
nge ati
cha nform
co
protine
dnature
rajustement
du pH et de
protine
dialyse
figure 66. Chromatographie daffinit des protines.
Stabilit
Le ligand doit tre stable dans les conditions adoptes.
Taille
Le ligand doit comporter des groupements susceptibles dinteragir de faon spcifique (localisation
dans lespace) avec les groupements correspondants de la protine purifier. Trop volumineux, ils
perdent rapidement leur spcificit.
b) Choix de la matrice.
Rigide, elle doit nanmoins tre de porosit leve pour permettre un accs satisfaisant aux
macromolcules protiques. Elle doit tre stable dans les conditions de couplage et de rgnration.
Lagarose rticul est une matrice rpondant ces exigences tout comme les gels TSK, les gels base
dacrylate, dacrylamide, dhydroxymthyl-mthyl-acrylate etc.
Il existe des gels mixtes composs de copolymres.
page 127
c) Choix du bras espaceur.

Le bras, gnralement compos dune chane aliphatique 6 ou 10 C, comporte un groupement
susceptible dtre activ pour accepter le ligand (NH2 , COOH).
d) Couplage.
Il existe de nombreuses mthodes de couplage, la plus ancienne tant celle au carbo-diimide.
currentpoint
COOH
R1
R2
carbodiimide
matrice et bras
NH R 2
C
NH2
ligand
R1
NH
currentpoint
192837465
6. Dtermination de la puret de la protine isole.

Il nexiste pas de moyens directs destimation de la puret. La cristallisation dune protine,
permettant son analyse aux rayons X par exemple et critre de puret, est parfois possible dans
certaines conditions de force ionique de pH et de temprature. En rgle gnrale les composs
susceptibles de contaminer la prparation protique sont facilement limins par les techniques de
purification utilises. Les mthodes dvaluation de la puret des protines les plus communes sont
indiques dans le tableau 16.
fractionn-
mthode
nante
Electrophorse
gel dnaturant
+
gel natif
+
lectrofocalisation
+
Chromatographie
gel permation
+
change d'ions
+
affinit
+
Sdimenation
vitesse
+
quilibre
Composition
Activit
-
rcupration quantit
facilit cot
proprit
value
+
+
ng - g
ng - g
ng - g
+
+
+
+
+
longueur chne
taille / charge
pHi
+
+
+
g
g
g
+
+
-
+
+
taille
charge nette
liens spcifiques
+
+
_
_
g
g
g - mg
g - mg
masse / taille
masse - association
composants
site actif
tableau 16. Mthodes dvaluation de la puret des prparations protiques.
page 128
VIII - DENATURATION
1. Dnaturation et changements de conformation
La conformation native de la plupart des protines est fragile et peut tre modifie par des traitements
mcaniques, physiques (irradiation, chaleur) ou chimiques (pH, sels, solvants, ractifs etc.). Ces
changements qui affectent les structures quaternaires, tertiaires et secondaires sont complexes, parfois
fugaces et dpendent dabord des quantits dnergie mises en jeu .
Ce sont en gnral les liaisons de plus faible nergie qui cassent les premires . Les ponts qui ne
sont stabiliss que par 2 liaisons hydrogne sont par exemple facilement ouverts et les zones en hlice
quils rapprochaient se retrouvent alors loignes sans que la structure secondaire bien stabilise par
de nombreuses liaisons hydrogne soit modifie. Le droulement qui se produit est ensuite suivi par
des dstructurations de zones en feuillets et en hlice , le stade ultime de la dnaturation
correspondant souvent une structure droule au sein de laquelle peuvent ou non subsister des
zones interactives niveau nergtique lev. Chaque protine prsentera une forme dnature donne
pour un agent dnaturant donn (par exemple en milieu aqueux la chaleur augmente les interactions
hydrophobes intra et inter-protiques, alors quen milieu thanolique elle les diminue).
Minimiser la dnaturation, et plus particulirement les phnomnes irrversibles, est un but recherch
en analyse au laboratoire mais aussi dans la production denzymes ou de protines actives en
bioracteurs ou encore dans la production de protines usage alimentaire.
2. Dnaturation rversible ou irrversible.
Les forces impliques dans la stabilisation de la conformation dune protine donne sont de faible
nergie (liaisons hydrogne, interactions hydrophobes, forces de Van der Waals, liaisons ioniques), les
ponts disulfure de forte nergie tant parfois impliqus par des ractions doxydo-rduction. Sous
laction dagents dnaturants, ces forces sont minimises puis rompues, ce qui induit un changement
de forme par dplissement. La raction implique une cooprativit de rupture, beaucoup dtats
conformationnels intermdiaires pouvant tre dcrits. La diffrence nette entre les nergies libres des
formes natives et dnatures voisine de 20 90 kJ.mole-1, ce qui ne reprsente que la rupture de
quelques liaisons hydrogne par exemple.
Ltat natif initial est caractrisable de mme que ltat (ou un tat donn avec un dnaturant donn)
dnatur 100%. Dans certaines circonstances la raction entre protine native et dnature
(dplisse) est rversible (figure 67).
protine
partiellement
dplisse 1
protine
native
protine
partiellement
dplisse 4
protine
partiellement
dplisse 2
protine
dplisse
protine
modifie par liens
covalents
protine
partiellement
dplisse 3
agrgation des
protine ou
modifications
replissement incorrect
non covalentes
figure 67. Les changements de conformation des protines (dplissement-dnaturation)
Il faut donc retenir que la structure modifie par un traitement qualifi de dnaturant variera avec la
protine mais surtout lagent dnaturant. Schmatiquement et en ne considrant que ltat initial et un
%w
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L/gr/grestore
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1
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rg
d
0
a
page 129
tat final dnatur

donn, on peut crire :
currentpoint
k1
protine native
protine dnature 1
k-1
k'1
protine native
protine dnature 2currentpoint
192837465
Lquation de vitesse est la suivante :

d PN
= k1 PN - k-1 PD
dt
et la constante dquilibre est :
P
K= N
PD
Les principaux paramtres thermodynamiques de la dnaturation sont complexes :
o
!G = - RT ln K
!H = - R
" (ln K)
"
o
!C p =
" !H
(" T) p
!H - !G
!S =
T
o
# p
avec T temprature absolue, R constante des gaz parfaits, Go variation dnergie libre standard
(diffrence entre lnergie libre du systme natif et lnergie libre du mme systme aprs
dnaturation), Ho la variation denthalpie pression constante, So la variation dentropie, Cpo la
variation de capacit calorifique pression constante. Laugmentation denthalpie Ho au cours du
dplissement peut indiquer que la forme native possde une nergie libre plus faible que la forme
dnature. Laugmentation dentropie So est lie au dsordre accompagnant le dplissement et
laugmentation de Cpo correspond au transfert des groupes apolaires des chanes latrales des acides
amins vers lenvironnement aqueux.
Lagrgation est un mcanisme impliqu dans nombre de dnaturations. Ce phnomne est souvent
utilis pour former des gels ou des prcipits (ovalbumine). Quand elle se produit chaud en milieux
aqueux elle rsulte des interactions qui stablissent entre les rsidus dacides amins dmasqus dans
une premire phase.
3. Facteurs lorigine de la dnaturation irrversible.
Parmi les nombreux agents de dnaturation physiques ou chimiques on peut signaler :
3.1. La chaleur.
Cest en technologie alimentaire le plus important facteur de dnaturation. Elle conduit par agitation
(et en milieu aqueux) dabord des ruptures de liaisons hydrogne, puis de liaisons ioniques puis plus
rarement de ponts disulfure. Jusquaux environs de 80-95C et en fonction du temps de traitement, les
liaisons hydrophobes sont renforces et ce dautant plus facilement que le dmasquage de rsidus
apolaires internes dans la structure native augmente leur potentialit dtablissements
intermolculaires.
Ces effets sont largement dpendants de la nature et la concentration de la protine, de la force ionique
et de la nature des sels et du pH.
A partir de 90 - 100C il se produit des ractions modifiant la structure primaire :
- dsamidation (GLN et ASN). Le temps pour dsamider 50% des ASN dans le peptide ASNGLY est de 34 h 37C et de 12 min 100C.
- hydrolyse des ponts peptidiques impliquant ASP. Le temps pour hydrolyser 50% de la
liaison ASP-PRO est de 10 min 100C en milieu HCl 0,015 M et de 24 h pour la
liaison 121APS-PRO pH 4 et 90C.
page 130
- oxydation des rsidus de cystine

- change de ponts disulfure
- raction de Maillard en prsence de glucides rducteurs, etc.
Il peut se produire des dsulfurations mais il arrive souvent que des ponts S-S inter ou
intramolculaires se forment au cours du chauffage par changes irrversibles et ce partir de 6070C. La polymrisation dsordonne qui en rsulte conduit une diminution de la solubilit (BSA, lactoglobuline). Une glification, prcde par une forte augmentation de la viscosit peut tre
observe dans certains cas.
La vitesse de dnaturation dpend de la temprature et avec les protines cette vitesse est multiplie
par environ 600 quand la temprature augmente de 10C au voisinage de la temprature pour laquelle
il se produit une dnaturation .
Leau favorise certaines dnaturations, en particulier celles mettant en jeu des liaisons hydrogne ; il
se produit une cassure intramolculaire et leau vient ragir avec les deux rsidus dacides amins
initialement impliqus dans la liaison, les empchant ainsi de la reformer.
En absence deau, les protines sont moins sensibles la dnaturation thermique car une liaison
coupe aura tendance se reformer spontanment.
Signalons enfin que sous leffet de la chaleur il peut se former des ponts covalents inter ou
intramolculaires (lysinoalanyl, -aspartyl-lysyl, -glutamyl-lysyl etc). Pour les protines globulaires,
la dnaturation se traduit gnralement par une augmentation de la surface interfaciale et une
augmentation des interactions protine-eau et donc de la capacit de rtention deau. Par exemple,
pour l'-chymotrypsine la surface passe de 10-16 m2 3,6.10-16 m2 aprs dnaturation tandis que la
quantit d'eau lie (eau de structure - eau interfaciale) passe de 0,37 0,42 g/g.
Lnergie dactivation peut tre calcule partir de la loi dArrhnius. Les nergies dactivation sont
gnralement leves (150 1000 KJ.mole-1) au cours de la dnaturation par la chaleur car le nombre
de liaisons rompre est trs lev bien quelles soient de faible nergie cause de leur cooprativit.
3.2.Le froid
Il peut provoquer des changements de conformation rversibles ou irrversibles par renforcement de
lnergie de stabilisation des liaisons hydrogne et cration de liaisons intermolculaires. Dans ce cas
il ny a pas droulement mais agrgation et prcipitation.
Ce sont les protines possdant un rapport acides amins apolaires / acides amins polaires lev qui
sont gnralement les plus sensibles au froid, les interactions hydrophobes diminuant avec la
temprature.
Les agents poly-hydroxyls (glycrol, thylne-glycol, oses et diholosides, polyols) sont de bons cryoprotecteurs.
Les phnomnes associs aux basses tempratures comme la formation de glace ou laugmentation de
concentration en soluts dans les phases liquides non congeles engendrent parfois une baisse de
solubilit ; cela revient augmenter fortement la force ionique. Dfavorable pour certaines protines
(oeuf), ce phnomne est mis profit pour texturer des protines : cryo-texturation (kori tofu ).
Le facteur pH est toujours associ aux diminutions de temprature dans les modifications de
conformation. Ainsi le pH dun tampon phosphate passe de 7 3,5 au cours de la conglation ce qui
induit une dnaturation acide.
page 131
Par ailleurs des ractions doxydation, surtout des thiols, peuvent intervenir du fait que la teneur en
oxygne dans un milieu congel sont plus de 1200 fois plus leves qu 0C.
3.3. Les traitements mcaniques .
En prsence deau, ces traitements peuvent casser hlices et feuillets et surtout les ponts .
Lagitation induit parfois des changements de conformation.
Les contraintes de cisaillement lies par exemple au passage forc au travers de filtres et membranes
induit des dmasquages de groupements hydrophobes.
Les hautes pressions (P> 2000 bars) sont suffisamment nergtiques pour rompre des liaisons de
faible nergie (hydrophobe, hydrogne, Van der Waals). Elles sont donc capables de rompre
simultanment par contrainte mcanique des liens sur lesquels les solvants ou la chaleur ont un effet
slectif. Des protines oligomriques sont dissocies en protomres dans ces conditions.
Les ultra-sons crent des micro-bulles par dgazage qui gonflent et fusionnent violemment
(cavitation). Il en rsulte des contraintes de cisaillement et la formation de radicaux libres dnaturants
sur les protines.
3.4. Le positionnement dune protine une interface.
Le positionnement dune protine une interface eau / fluide hydrophobe (huile, air etc. ) qui
permet par exemple de stabiliser des mulsions ou des mousses provoque une distribution anisotrope
des rsidus dacides amins dans les deux phases et donc une modification de conformation par
rapport la forme native. Cest la distribution des rsidus apolaires et polaires (regroups en zones
bien dfinies) qui assurera ou non ces pouvoirs la protine.
On qualifie de train les zones hydrophobes ou hydrophiles de la protine qui se positionnent
linterface.
3.5. Protolyse et autolyse.
Les ractions impliques modifient la structure primaire.
3.6. Agents chimiques.
De nombreux agents chimiques peuvent engendrer des dnaturations, certains agents tant mme
qualifis de dnaturants.
Les acides et les bases modifient lionisation de certaines chanes latrales et donc les interactions
ioniques stabilisant les structures. Il en rsulte, selon les protines et les conditions, des dnaturations
irrversibles ou non.
La plupart des mtaux divalents en se fixant sur les protines au niveau de deux groupements SH
intermolculaires entranent des modifications de conformations (il y a cration et non destruction de
liaisons). Hg2+, Cd2+, Pb2+ donnent des mercaptides avec les thiols.
Les sels diminuent lactivit de leau et possdent des effets chaotropiques qui dnaturent les protines
dans des conditions donnes de concentration, temprature, etc (cf chapitre VII.5.3).
Les agents chlatants comme lEDTA peuvent complexer des cations impliqus dans la structure
protique. Souvent cette dnaturation est rversible.
page 132
La plupart des solvants organiques donne des interactions avec les groupements hydrophobes qui sont
ainsidmasqus; une dnaturation sen suit alors. Certaines enzymes fonctionnent aussi bien dans
leau que dans certains solvants, la spcificit tant parfois profondment modifie dans ces
conditions.
Le dimthyl-sulfoxyde ou le dimthyl-formamide faibles concentrations protgent la conformation
de nombreuses protines.
Le chloro-2-thanol augmente lhlicit.
Des composs en solution comme lure (4 8 M), ou le dodcyl sulfate de sodium (1%) donnent avec
les protines des interactions respectivement avec les liaisons hydrogne et hydrophobe, ce qui
modifie profondment la structure spatiale des protines. Ces composs sont qualifis de dnaturants.
4. Contrle et minimisation de la dnaturation.
Il sagit de conserver, au cours doprations de purification ou autres, certaines des proprits
catalytiques ou fonctionnelles de la protine .
Ainsi laddition de composs poly-hydroxyls (polythylne glycol) ou de sels permet de stabiliser
dans des conditions bien dfinies la conformation dune protine donne.
Lactivit de leau joue un rle trs important dans la dnaturation : ainsi la gliadine est dnature en 1
heure 60C en milieu dactivit deau gale 0,24 tandis que dans les mmes conditions, elle ne sera
dnature qu 70C en milieu dactivit deau gale 0,18.
Limmobilisation denzymes sur des supports fixes contribue parfois leur assurer une grande stabilit
vis vis dagents ou de conditions dnaturants.
Enfin il existe toute une stratgie de stabilisation base sur des modifications chimiques impliques
dans la structure tridimensionnelle.
La maladie de la vache folle et la variante

de la maladie de Creutzfeldt-Jacob
page 133
Les Encphalopathies Spongiformes Transmissibles

Les encphalopathies spongiformes transmissibles (EST) affectent de trs nombreuses
espces de mammifres.
Il sagit daffections dgnratives irrversibles des neurones du systme nerveux
central.
La forme la plus anciennement connue de la maladie est la tremblante du mouton (scrapie
en anglais). Les premires descriptions remontent en 1730. Il a t montr en 1936 que cette
maladie tait transmissible dun animal lautre par injection. En 1950, par cette mme
dmarche, il a t montr quelle pouvait franchir la barrire despce : du mouton vers la
Cependant
passage
la forme ovine de la maladie vers lhomme na jamais t
chvre,
le rat, lelehamster
et de
la souris).
constat.
Lencphalite spongiforme bovine (E.S.B.) et la variante de la maladie de

Creutzfeldt-Jacob
La variante de la MJC (vMCJ) est issue de la maladie de la vache folle En fvrier 2001 : 100 cas en Europe, 3
en
France.
Evolution de la maladie de la vache folle

Avant 1985 la maladie nexistait pas. Les vaches laitires sont les plus
exposes (alimentation)
Nombre de cas 1986 : 60 vaches atteintes, 1987 : 600 , 1988 : 3 000, 1992 : 37 280 1993 : 37
500 1994 : 26 000
1995 : 20 000 1996 : 9 000 1999 : 2270
2000 : 1258
En 2001, le total des cas depuis son apparition est denviron

185 000
40 000
20 000
1986
88
90
92 11993
95
97
Juillet 88 : interdiction des farines animales pour les ruminants en GB

(contaminantes contenant des carcasses de mouton malades atteints de
tremblante)
Fvrier 1985 : premier cas dESB en

GB.
Fvrier 1985 : 1 er cas dESB

en GB
Juillet 1988 : interdiction des
farines
Dcembre 1990 :
interdiction dimportation des
farines de viandes bovines
pour les bovins en FR.
Juillet 1990 : interdiction des
farines animales pour les
bovins en FR.
Fvrier 1991 : premier cas
dESB en FR.
Mars 1991 : premier cas
NAIF (n aprs interdiction
des farines).
Mars 1996 : En GB 10
personnes font la vMCJ :
passage de lESB
lhomme ; embargo sur le
buf britannique dans le
reste de lEurope.
Juillet 2000 : 4 dcs dans
le village de Queniborough
en GB.
Aot 2000 : 79 cas (70 morts
du vMCJ en GB, 2 4
supposs en FR).
Pr Anderson de lUniversit
dOxford : estimation de 136
000 cas ( venir en GB).
Fin de lpidmie 2005 ?
page 134
183 000
500
6
14
164
452
360
2
Mouton
Chvre,
rongeurs
Prion de la tremblante
farine
s
Evnement
spontan :
Une vache fait la
maladie ESB
Vache
(Viande et autres)
Chat
Autres ruminants
Le systme immunitaire
est ncessaire la
transmission de la
maladie
Homme
?
Porc, poule
page 135
Il semble ny avoir aucun transmission horizontale directe

de vache vache ; de vache veau elle est peu probable.
Presque tous les animaux auxquels on a tent de transmettre la maladie par injection
intracrbrale lont faite. La souris fait sa maladie aprs injection de broyat de cervelles
infectes (1 an dincubation puis mort). Le lapin est insensible*, le porc et le
mouton peu sensibles.

(Si on traite au pralable les cervelles par des dnaturants, ou des protases comme la
protinase K, ou le SDS avant injection : on inactive).
Mise en vidence du pouvoir infectieux

Cervelle Animal
malade
Injection
intracrbral
e
Les organes infects sont le cerveau, la rate, lilon, la moelle pinire et les organes
lymphodes comme les ganglions msentriques.
Aucune transmission na t possible ce jour partir de tissu musculaire (viande).
(lincubation est suprieure la dure de vie de lanimal)
Mise en vidence du pouvoir hautement infectieux de PrPsc Exprience de
WEISSMANN.
Souris malade
Un fil dacier est plac quelques minutes au contact dun cerveau de souris
infect
Souris saine
30 min
Le fil dacier plac au contact dune culture de

neurones provoque la transformation de la PrPc
en PrPsc (ou PrPres : Prsistant aux protases).
La contamination stend ensuite toute la
culture mme si la fil a t retir.
Souris malade
fibril
les
tr
a
n
s
p
or
t
Lagent responsable : le PRION

(PRoteinaceous Infectiosity ONly)
Biochimie des protines Polytech

STIA 1
(Stanley
PRUSINER le dcouvre en 1982, Prix Nobel 1997)
page 136
Il existe naturellement dans les neurones une protine de 253 acides amins (PrPc ) dont
la structure, dtermine par Kurt Wthrich) est conserve dans lvolution, ce qui traduit son
importance. Elle est indispensable la vie fonctionnelle du neurone.
Cette protine intervient dans les rythmes circadiens, dans la transmission de linflux nerveux
(acide
amino butyrique). Haute affinit pour le cuivre et rle antioxydant.
20 acides amins (nature et squence uniques pour

une protine donne)
Une seule forme dans lespace :
conformation
fonction
Il sagit dune glycoprotine.
Le gne humain de la PrPc
est port par le
chromosome 20
Hlices
PRION Pr Pc
Indispensable au neurone
De la protine native la protine infectieuse

(Protine PrPsc scrapie)
Comment ?
Gntique ?
Spontan ?
Traitement ?
Cette conformation se traduit

par une rsistance la
digestion par des protases
endocellulaires, systme mis
en jeu dans le turnover
physiologique des protines
Les parties glycosyles
sont lorigine des
barrires despces et
des diverses formes de
PRIONS
Feuillets
infection
noya
Golgi u
Comment le prion est

synthtis ? Quand sa
teneur est insuffisante dans
le neurone :
Gne actif
ARNm
ribosome
Protine PRION Pr Pc
achemine vers la
membrane, elle rgule la
transmission de signaux
avant dtre dtruite
page 137
Que se passe-t-il si une molcule

Protine PrPsc (scrapie)
est
prsente au moment de cette synthse ?
Cette protine joue le rle dun chaperon (peut-tre existe-t-il
une protine chaperonne X ?) et impose la nouvelle protine
fabrique une conformation au lieu de la conformation
fonctionnelle.
La protine ntant pas fonctionnelle, le neurone ragit en
lanant une nouvelle synthse ; au contact des deux
chaperonnes prsentes la protine synthtise est du type
Le neurone lance une autre synthse .. raction en chane
qui se traduit par laccumulation dans le cytoplasme du neurone
de la protine non fonctionnelle, et ce dautant quelle nest
pas hydrolysable par les protases endocellulaires. Cette
protine adsorbe de leau (comme la plupart des protines) et
le neurone gonfle (aspect dponge). Les protines PrPcs
sassocient en pseudo-cristaux (plaques amylodes)
fibrilles
La cellule perd sa fonctionnalit, clate et

libre des PrPsc qui envahissent les
cellules voisines .. : troubles de
lquilibre, du comportement et mort : ESB
(vache) ou maladie de Creutzfeldt
Jacob chez lhomme.
transport
Cellule
Microgliale
MORT
Corps en toile
(plaque floride)
Quelques caractristiques de rsistance exceptionnelle de cette

protines
PATTISON et MILLSON, en 1961, ont mis en vidence lexistence de diffrentes souches
du scrapie. La rsistance exceptionnelle de lagent du scrapie est dcouverte en 1954. Les
prions rsistent toutes les mthodes conventionnelles dinactivation des virus :
- rsistance en temprature sche norme ( 160C 24 heures et mme 360C 1 heure).
- un traitement par le formaldhyde 10 % est inefficace
La dcontamination peut tre obtenue :
- par autoclavage 132 C pendant 1h30
- par traitement lhypochlorite de sodium pendant 1h30 20C
- par exposition brve dans l hydroxyde de sodium M 100C.
La maladie de Creutzfeldt Jacob et sa variante vMCJ

page 138
La tremblante du mouton est connue depuis 1730, lencphalopathie du cerf depuis 1967, la
maladie de Creutzfeldt- Jacob depuis 1920.
. La maladie de Creutzfeldt Jacob affecte les personnes ges (65 ans en moyenne)
La maladie de Creutzfeldt Jacob a une origine :
5 % gntique (elle est transmissible : mutation se traduisant par la substitution de
lacide glutamique 200 par une lysine et une transition
).
10 % infectieuse ou iatrogne (par lhormone de croissance, 11% de gnotype met/met
du codon 129)
85 % sporadique (68 % de porteurs du gnotype du codon 129 met/met)
La maladie se traduit par une dmence suivie dune perte de coordination ou linverse. Elle
entrane une mort irrvocable.
. La maladie existe dans les populations de papouasie (kuru) qui pratiquaient le cannibalisme.
Cest Carleton GAJDUSEK (prix Nobel en 1976) qui dans les annes 50-60 a montr que
lorigine infectieuse de la maladie tait lie au cannibalisme. Les pratiques funraires
impliquaient que le cerveau des morts soit mang. On situe le dbut de lpidmie de kuru vers
1900, peut-tre la suite de lingestion du cerveau dun malade atteint dune forme sporadique
de la maladie de Creutzfeldt Jacob (MCJ). Le cannibalisme a t interdit en 1957 et la
maladie a presque totalement disparu depuis.
. Il existe la maladie de Gertsmann-Strassler-Scheinker qui est lie une mutation du gne
PrP : les symptmes sont les mmes mais la maladie se dveloppe plus lentement.
. Linsomnie fatale familiale est aussi lie une mutation du gne PrP ; elle sachve dans la
dmence.
. La variante de la maladie de Creutzfeldt Jacob affecte des personnes plus jeunes (29 ans
en moyenne). Il sagit de la forme la plus courante des Encphalites Spongiformes
Transmission de
la variante
de la%MCJ
Transmissibles
(EST).
Dans 100
des cas le gnotype du codon 129 est met/met.
Le plus souvent par voie orale ; le temps dincubation stend sur plusieurs
annes au cours desquelles lagent infectieux passe de lintestin au cerveau.
Accumulation dans
la rate :
rle dterminant des
lymphocytes B
Traverse de
lpithlium intestinal et
accumulation dans les
foyers lymphodes : les
plaques de Peyer :
Multiplication du Prion
dans des cellules
stromales : les
cellules dendritiques
folliculaires CDFs
(prsentent lantigne
aux lymphos B)
Epidmiologie
page 139
En Europe, entre 1996 et 1999, 1550 cas de maladies de Creutzfeldt Jacob sont recenss
(nouveau variant et classique).
Le taux de mortalit est de 1 2 cas par million dhabitant : il sagit donc dune maladie rare.
La quasi totalit des cas (96 %) recenss correspondent la maladie de Creutzfeldt Jacob classique qui
existe et qui est connue depuis de trs nombreuses annes :
Certains des cas sporadiques pourraient tre des variants de lagent de lESB. Or il savre que les
Pays trs exposs (Grande Bretagne), exposs (France) ou non exposs (Canada et Australie) ont une
mme frquence de cas sporadiques.
Sur les 1550 cas sporadiques, moins dune centaine sont des variants de lESB (vMCJ) ; depuis le
dbut des enqutes et jusquen dbut 2001, 86 sujets britaniques ont succomb la vMCJ et la maladie
est en cours d volution chez 8 autres personnes. Ce variant y reprsente 17 % de lensemble des
maladies de Creutzfeldt Jacob.
Pour la France on a enregistr entre 1996 et 1999 380 cas de maladie de Creutzfeldt Jacob dont
trois cas li au variant ESB (3 cas / an Montpellier).
Le tableau clinique de la vMCJ est diffrent de celui de la MCJ classique : les sujets atteints sont
jeunes et le temps dvolution de la maladie est plus long ; elle commence par des dsordres
psychiatriques suivis par des troubles sensoriels, puis par lataxie (difficult de coordination des
mouvements) et la dmence. Dans le cerveau, les analyses anatomo-pathologiques montrent des
plaques amylodes entoures de vacuoles qui nexistent pas dans la MCJ mais qui se retrouvent dans
lESB ou la maladie de Kuru. Leur localisation est particulire.
Lorigine de la contamination ( ?) remonterait 10 ou 15 ans. Cest donc lpidmie bovine qui
expliquerait les cas survenus depuis 1996 et qui sont lis au variant ESB (entre 1988 et 1999 lESB
bovine reprsente 160 000 cas en GB, 332 en Suisse, 367 au Portugal, 80 en France).
Relation entre mode dalimentation et la maladie
Il semble nexister aucune diffrence entre les habitudes alimentaires des personnes touches par le
variant ESB de la maladie de Creutzfeldt Jacob et celles des personnes saines.
La voie dinfection est lingestion de viande provenant danimaux malades ou en priode
dincubation. Le muscle ne semble pas contenir de quantits dtectables de lagent infectieux, mais
les steaks hachs de basse qualit peuvent provenir de la viande spare mcaniquement (VSM) des
carcasses. Dans ce cas, la moelle pinire, les ganglions lymphatiques et les ganglions rachidiens,
riches en particules infectieuses, sont arrachs des os et mlangs la viande rouge. Lintestin grle
qui concentre lagent infectieux est utilis dans la fabrication de certaines saucisses et pourrait tre un
vecteur de linfection. Il nest pas exclu que certains produits pharmaceutiques et cosmtiques puissent
tre contaminants (glatine).
Les malades nont pas consomm des quantits plus importantes de viande bovine ou de produits
base de viande pouvant contenir des produits risque. Nanmoins lincubation tant peut tre de 15
ans (entre 5 et 30 ans.), il est trs difficile de faire une enqute posteriori.
Le risque est vraisemblablement li la dose infectante (100 000 molcules = 1 dose infectieuse ??? )
mais aussi des facteurs mal connus de susceptibilit la maladie qui dpendent des individus.
On ne connat ni la dure dincubation , ni la dose infectante, ni linfectivit des tissus bovins ingrs,
ni lefficacit des mesures dinterdiction de consommation de certains organes bovins, ni la
susceptibilit individuelle.
Estimation du nombre de cas venir : cest quasiment et raisonnablement impossible.
En GB, si lincubation est gale 20 ans : 110 cas venir mais si elle est de 60 ans : 6 000 130 000
cas attendus.
Il y a au 12 novembre 2000 en Europe 85 cas probables de variant ESB de la maladie de C.J.
En France dans la mme priode 2 cas confirms, 1 probable.
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Les moyens de diagnostic de la MCJ ont progress en 1997
(test de recherche de la protine 14.33 aprs ponction lombaire, cette protine traduisant la mort neuronale ; la nouvelle forme
de la MCJ ne rpond pas toujours ce test). Une personne dpiste ne se verra proposer aucun traitement.
Nanmoins aujourdhui seule lautopsie et la biopsie permettent de montrer les lsions crbrales caractristiques de la
maladie mais aussi de vrifier la nature du PRION (Type ESB ou autre).
Les modles exprimentaux pour ltude des maladies Prions

Les souris transgniques constituent un des modles les plus importants.
La tremblante du mouton est un autre modle.
Lutilisation de singes le lmurien Microcebus murinus a permis de dmontrer dune
manire indirecte linfection apr voie orale des primates par du cerveau de buf atteint par
lESB (N. BONS, EPHE UM II)
Lintrt des essais sur des cultures in vitro est soulign par S. LEHMANN.
En 1990 pidmie dESF (encphalite spongiforme fline) lie la consommation de leurs

ptes avec des produits carns dorigine bovine : do lide que les victimes humaines de la
variante de la MCJ ont t contamines par voie alimentaire.
Le rle des britanniques

Les Scientifiques britanniques ont recommand en 1988 lexclusion des farines animales de lalimentation du
btail : cette recommandation a t considre alors comme une mesure disproportionne dont les
consquences conomiques seraient insupportables. Cest pourquoi les farines infectes ont continu tre
utilises en Angleterre et exportes notamment pour nourrir les porcs et les volailles. Jusquen 1991 on na pas
compris que lusage des farines aggraverait lpidmie ; il en a rsult plus de 45 000 cas dESB nouveaux en
Grande-Bretagne.
En 1995 les franais ont consomm 110 000 tonnes de viande bovine britannique (sur un total de 1,6 millions de
tonne) et import 200 000 veaux.
En 1989, la Grande Bretagne a interdit la consommation des abats pour lhomme.
Entre 1988 et 1996, elle a export 75 000 tonnes dabats de bovins (contre 4 000 tonnes entre 78 et 87) dont 48
000 tonnes pour la France.
Entre 80 et 96 lexposition des franais a t 20 fois plus faible que celle de la population anglaise.
Des touristes ont consomm en GB, entre 88 et 89 (10 000 cas dESB) des organes risques et aucun cas de
MCJ na t dtect (cest rassurant).
Peut-on aujourdhui manger de la viande ?
Les niveaux dinfectiosit dtects sont les suivants :

Elev :
cervelle, moelle pinire
Faible :
rate, amygdales, ganglions lymphatiques, ilon, colon proximal
Trs faible : nerf sciatique, hypophyse, surrnales, colon distal, muqueuse nasale
Minimale : liquide cphalo-rachidien, thymus (ris), moelle osseuse, foie, poumon,
pancras
Non dtectable : muscles, cur, glande mammaire, lait, caillot sanguin, srum, fces,
rein, thyrode, glande
salivaire, ovaire, testicules, utrus.
Evidence : il faut interdire la consommation des parties infectantes : cervelle, ilon
(central) dans la fabrication de charcuteries, thymus, yeux, moelle pinire.
Le muscle, principal composant du beefsteak, ne semble pas porteur de
linfection.
Conseil : ne pas introduire dans la chane alimentaire de bovins de plus de trente mois.
Compte-tenu de la dure dincubation, le veau ne prsente pas les signes de la maladie de
mme que les bufs destins la boucherie tandis que les vaches laitires (plus ges,
nourries aux farines) sont les plus affectes.
Des animaux atteints ne prsentant pas les signes visibles de la maladie peuvent passer
dans lalimentation humaine. Le test employ permet de dtecter un animal malade 4 mois
avant lapparition des premiers symptmes. Avant cette priode (entre le moment de linfection
et le 32me mois) le test est alatoire et la vache atteinte passera dans lalimentation.
Eviter des produits qui contiennent des Viandes Spares Mcaniquement (VSM) qui
proviennent des colonnes vertbrales (lasagnes, raviolis..).
Les farines de viandes
page 141
Depuis que lhomme est leveur et agriculteur, les restes animaux taient utiliss pour
lalimentation des animaux. Cette pratique domestique dans laquelle un animal malade
tait souvent utilis comme source de nutriments en levage restait lchelle de la ferme.
Lutilisation des farines lchelle industrielle date des annes 1900-1920.
Les protines de viandes rsiduelles de lquarrissage (50 % de vache, 30 % de mouton)
taient jusquen 1980 dgraisses en discontinu par des solvants organiques (hexane,
dichlorothane) qui taient limins des graisses par la chaleur.
Carcasses surtout (250 millions de

tonnes)
Farines de viandes
Graisses animales
1/3 Agroalimentaire
450 000 T. Teneur leve en protines
2/3 cosmtique
2/3
volaille
1/3
Porc
La France importe 330 000 tonnes de porcs et 120 000

tonnes de volailles nourris aux farines carnes
A partir de 1980, le dgraissage est ralis par pression chaud en continu sans solvant
organique (pas deffet dfavorable potentiellement lis aux solvants, augmentation de la
productivit).
Les cossais qui ont conserv la mthode au solvant (hexane) font consommer ces
farines aux vaches : pas dESB.
Que faire aujourdhui ?
Il faut radiquer lagent de lESB pour que la variante de la maladie de Creutzfeldt Jacob devienne trs rare,
mais chronique du XXIme sicle.
Pour cela il faut absolument liminer le plus rapidement possible les animaux malades et procder des
abattages massifs (mme si cela cote cher plus de 1,5 MF pour un troupeau de 100 btes - et prend du
temps. Ces cots comprennent lindemnisation de lleveur mais aussi les frais annexes de traitement
dlimination des animaux.
Pour dtecter lESB cest le test suisse Prionics (distribu en France par AES) qui a t choisi (son cot est
lev et voisin de 400 F). Cest lAFSSA qui confirme.
Au laboratoire le pouvoir infectieux est dtruit aprs chauffage 133C pendant 20 minutes (utiliser bon
escient).
La cuisson de la viande natteint pas ces tempratures.
Interdire lusage des FVO de mammifres (farines de viande et dos) en alimentation animale (bovins, caprins,
animaux domestiques mais aussi volailles, cochons, poissons).
En France les crdits de recherche atteignent en 2001 210 MF.
Un GIS (groupement dintrt scientifique) sur les maladies PRIONS vient dtre cr en fvrier 2001.
Montpellier II accueillera une animalerie ESB en 2002 et les Labos Biorad ont dcid dimplanter dj un module
Pourquoi
les farines animales dgraisses avec des solvants chlors ou non
ESB
sur le site.
navaient-elles jamais dclench dESB ?

Au laboratoire le chloro-2-thanol permet la transition
; il est probable que les
solvants chlors utiliss jusquen 1978 80 aient ralis la transformation de la
protine PrPsc en protine Prion ce qui se traduirait alors par linactivation de
la particule active.
Lutilisation des solvants a t arrte pour leurs risques dexplosion, nutritionnels et
toxiques
page 142
TABLE DES MATIERES

I - Introduction
1) Terminologie fonction de la composition

1-1. Protides non hydrolysables
1- 2. Protides hydrolysables
1-2-1- Condensation dacides amins :
1)-peptides oligopeptide, polypeptide, protoses, peptones
2)-holoprotides ou protines simples ou homoprotines, protomre, oligomre
1-2-2- Holoprotides + groupement prosthtique : htroprotides ou htroprotines
ou protines conjugues. Nucloprotines, lipoprotines, glycoprotines,
phosphoprotines, hmoprotines, flavoprotines, chromoprotines, mtalloprotines
1
1
1
2) Terminologie fonction de la conformation

Conformation, structure primaire, structure secondaire, structure tertiaire, structure quaternaire
2-1. Les protines fibreuses
2-2. Les protines globulaires
3) Terminologie base sur la fonction

3-1. Les protines de structure
3-2. Les protines activit biologique : Enzymes, Hormone, Protines contractiles, de transport,
protectrices, de rserve, toxiques, anti-nutritionnelles, allergnes
3-3. Protines alimentaires
4) Terminologie fonction de proprits physico-chimiques

4-1. Albumines
4-2. Globulines
4-3. Glutlines
4-4. Prolamines
4-5. Albuminodes ou sclroprotines
4-6. Histones
4-7. Protamines
5) Taille des molcules protiques

5-1. Dfinitions : poids molculaire, masse molaire
5-2. Le poids molculaire de quelques protines
II -Protines : Les acides amins constitutifs
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2
2
4
5
5
1. Structure.
2. Les principaux acides amins.

2.1. Acides amins chane latrale apolaire.
2.1.1. Chane latrale aliphatique.
2.1.2. Chane latrale aromatique.
2.1.3. Chane latrale avec un atome de soufre.
2.2. Acides amins chane latrale polaire.
2.2.1. Chane latrale polaire non charge.
2.2.2. Chane latrale polaire charge (ionisable).
7
7
3 . Acides amins rares ou occasionnels.

3.1. Acides -amins prsents dans quelques protines.
3.2. Acides amins nentrant pas dans la composition de protines.
10
4. Strochimie.
13
5. Proprits physiques.
5.1. Cristallisation.
5.2. Solubilit.
5.3. Pouvoir rotatoire.
5.4. Proprits spectrales.
14
14
15
page 143
5.4.1. Absorption UV.

5.4.2. Fluorescence.
6. Dosage et Proprits chimiques.
6.1. Dosage des acides amins totaux.
6.1.1. Mthode de Kjeldahl.
6.2.2. Autres mthodes.
6.2. Caractrisation et dosage dacides amins sans sparation.
6.2.1. Ractions spcifiques.
6.2.2. Dosage microbiologique.
6.3. Ionisation, proprits acido-basiques.
6.3.1. Rappels & Dfinitions. Importance de lionisation.
6.3.2. Les deux ionisations des acides amins.
6.4. Proprits des groupements carboxyles.
6.4.1. Formation de sels en prsence de bases.
6.4.2. La fonction acide est estrifiable par des alcools.
6.4.3. En prsence de pentachlorure de phosphore ou de chlorure de thionyle ( SOCl2)
6.4.4. La fonction COOH peut tre rduite en alcool en prsence de borohydrure de Na
6.4.5. Dcarboxylation.
6.4.6. Amidation
6.5. Proprits de la fonction amine.
6.5.1. La fonction amine donne avec les acides des sels.
6.5.2. Diazotation par lacide nitreux .
6.5.3. Mthylation par liodure de mthyle.
6.5.4. Dsamination en milieu hypochlorite.
6.5.5. Dsamination par voie enzymatique.
6.5.6. Ractions de condensation.
1) liaison avec un chlorure dacide ou un anhydride dacide.
2) Raction avec l O-phtaldialdhyde (OPA).
3) Raction avec la fluorescamine (4-phnylspiro (furan-2(3H),1-phtalal)-3,34 dione).
4) Raction avec le chlorure de dansyle.
5) Raction au phnylisothiocyanate (PITC).
6) Raction avec le 9,fluornylmthyl-chloroformate (FMOC-HCl).
7) Raction avec le chlorure de dabsyl.
8) Raction avec le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzne (raction de Sanger).
9) Raction avec lacide 2,4,6-trinitrobenzne sulfonique (TNBS).
6.6. Ractions lies la prsence simultane des fonctions amins et carboxyliques.
6.7. Proprits des chanes latrales.
6.7.1. Les fonctions hydroxyles de SER et THR peuvent tre estrifies.
6.7.2. Les chanes latrales noyau aromatique.
6.7.3. Les fonctions thiols.
6.7.4. Hydrophobicit et hydrophilicit des chanes latrales des acides amins.
1) lhydrophobicit et got.
2) Hydrophilicit des acides amins et des protines.
7. Sparation et dosage des acides amins.
7.1. Gnralits sur la chromatographie en phase liquide et lHPLC.
Coefficient de distribution, volume et le temps de rtention, Facteur de capacit, Temps de rtention
Slectivit, Efficacit, Rsolution, Hauteur quivalente un plateau thorique.
7.2. Chromatographie dchange ionique et dtection post-colonne.
7.2.1. Gnralits sur lchange ionique.
7.2.2. Principaux types de groupements fonctionnels.
7.2.3.Principaux types de matrice.
7.2.4. Llution en chromatographie dchange ionique.
1) Influence du pH de la phase mobile.
2) Influence du type et de la concentration en contre-ion.
3) Effet de la temprature et de solvants organiques.
4) Prsence dantioxydants.
5) Ralisation de llution.
7.2.5. Dtection colorimtrique en dtecteur continu (ninhydrine).
7.2.6. Autres types de dtection post-colonne.
7.3. Chromatographie en phase inverse aprs drivatisation pr-colonne.
7.3.1. Gnralits sur la chromatographie dadsorption.
7.3.2. La chromatographie en phase inverse.
1) mcanisme de rtention.
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2) Influence de la phase mobile.

3) Augmentation de k' par modification du solut.
7.4. Etalons internes.
III - Les peptides
42
44
1. Structure de la liaison peptidique.
44
2. Dtermination de la composition en acides amins.
45
3. Dtermination de la squence.
3.1. Les acides amins terminaux.
3.1.1.Mthode chimiques.
1) Dtermination de lacide amin N-terminal.
2) Dtermination de lacide amin C-terminal.
3.1.2.Mthode enzymatiques.
1) Aminopeptidases.
2) Carboxypeptidases.
3.2. Les mthodes classiques de squenage.
3.2.1. Mthode chimiques.
3.2.2. Mthode enzymatiques.
3.3. Les mthodes automatises de squenage.
3.4. Les mthodes de squenage issues du gnie gntique.
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46
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47
4. Proprits des peptides.

4.1. Proprits physique
4.2. Proprits chimiques.
50
5. Synthse chimique.
5.1. Activation et prparation des acides amins.
5.2. Condensation.
50
6. Quelques exemples de peptides.

La carnosine et lansrine. Le glutathion, les pentapeptides (mthionine enkphaline et leucine enkphaline)
-endorphine, vasopressine et locytocyne, la corticotrophine, hormones hypothalamiques, TRF
Insuline, nisine, subtiline, polymyxines, bacitracine, thyrothricine, tyrocidine A, pnicillines
Toxines ( phallodine), peptides inhibiteurs
52
IV - Production et utilisations dacides amins et de peptides
48
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1. Les acides amins.

1.1. Production.
Hydrolysats de protines
Production dacides amins par voie fermentaire par voie enzymatique
1.2. Utilisations. (acides, amers, umamis) - Glutamate, glycine, L-lysine
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55
2. Peptides.
2.1.Peptides sucrs. (aspartame, alitame)
2.2. Peptides sals
2.3. Peptides umamis.
2.4. Peptides acides.
2.5. Peptides amers.
2.6. Peptidesalimentaires activit biologique.
2.7. Peptides activits diverses.
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57
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V. Dtermination des poids molculaires
56
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64
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1. Dfinitions La masse molculaire, le poids molculaire, la masse molaire.
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2. Mthodes chimiques.
2.1. Dosage dun ou plusieurs composants de la molcule.
2.2. Combinaison avec un ractif.
66
page 145
3. Mthodes physico-chimiques ou physiques.

3.1. Mesure de la pression osmotique.
gradient de densit
3.3. Diffusion et coefficient de diffusion.
3.4. Calcul du poids molculaire par sdimentation.
3.5. La chromatographie dexclusion ou gel filtration ou gel permation
Principe, diffrents types de gel (gels mous, semi-rigides, gels rigides)
3.6. Llectrophorse (Principe, llectrophorse en milieu dnaturant, SDS-PAGE,
lectrophorse simple en gradient de densit
3.7. Autres mthodes de dtermination des masses molculaires.
3.7.1.Diffraction de la lumire.
3.7.2. Viscosit.
VI - Conformation des protines
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Les structures secondaires, tertiaires, quaternaires, conformation native.

(dynamique des protines), protines chaperons, le PRION
1. Principales structures spatiales des protines.
1.1. Structures secondaires.
1.1.1. Lhlice . (L'hlice hlice 3,613 hlices 310, M, polyproline I ou II.)
1.1.2. Les feuillets .
1.1.3. Courbure .
Pelote statistique.
1.2. Structures tertiaires.
Structures de type , Structure de type , Structure /
1.3. Structures quaternaires ou supramolculaires.
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85
85
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87
88
88
2. Moyens dtudes de ces structures.

2.1. Mthodes physiques.
2.1.1. Microscopie (lectronique, transmission, balayage, microscopie platine froide,
environnementale, effet tunnel)
2.1.2. Les mthodes spectrales.
UV, fluorimtrie, dichrosme circulaire, spectroscopie aux rayons X, diffusion de neutrons,
spectroscopie Raman
2.1.3. Les mthodes nuclaires et lectroniques.
La rsonance magntique nuclaire, la ESR ou RPE
2.1.4. Les mthodes thermodynamiques, la calorimtrie diffrentielle balayage.
2.1.5. Les mthodes bases sur la charge et le volume et /ou la forme.
Llectrophorse en milieu dnaturant ( SDS-PAGE)
Llectrophorse en gel non dnaturant
Lisotachophorse.
Chromatographies.
2 .2. Mthodes chimiques.
Acide cis-parinarique, acide 8-anilino-1-naphtalne sulfonique (ANS), rtinol. Hydrophobicit de surface
2.3. Mthodes biologiques.
2.4. Mthodes prdictives.
2.4.1. Recherche des rgions codantes pour une protine donne dans le gnme.
2.4.2. Alignement des squences dacides amins.
2.4.3. Prdiction des structures secondaires.
92
92
92
3. Interactions impliques dans la conformation des protines.

3.1. Prise en compte des contraintes striques.
3.2. Les interactions de Van der Waals.
3.3. Les interactions dipolaires.
3.4. Les interactions ioniques (lectrostatiques).
3.5. Liaisons par pont hydrogne.
3.6. Interactions hydrophobes.
3.7. Ponts disulfure.
VII - Extraction & purification des protines

1. Objectifs de lextraction & purification.
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3.
page 146
2. Mthodes dextraction des protines.

Mthodes dextraction ngatives, mthodes dextraction positives
Le rendement dextraction , la slectivit, le cot dextraction
110
3. Les procds de destructuration.

3.1.Traitements de destructuration physique.
3.1.Traitements de destructuration chimique.
3.2. Traitements enzymatiques.
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4. Optimisation de la solubilisation.
113
5. Purification & concentration & rcupration des protines solubilises.

5.1. Prcipitation enzymatique.
5.2. Prcipitation isolectrique.
5.3. Prcipitation par augmentation de la force ionique.
5.4. Prcipitation par diminution de la constante dilectrique.
5.5. Coprcipitation par adsorbtion.
5.6. Lultrafiltration.
5.7. Mthodes bases sur la structure et les proprits des protines.
5.7.1. Mthodes bases sur la taille et la forme : chromatographie dexclusion
5.7.2. Mthodes bases sur la charge. Echange dions.
a) Choix de la matrice.
b) Choix du groupement fonctionnel.
c) Modalits de la sparation.
d) Applications en sciences des aliments.
5.7.3. Mthodes bases sur la charge. Chromatofocalisation
5.7.4. Mthodes bases sur lhydrophobicit de surface.
5.7.5. Mthodes bases sur ltablissement de liaisons covalentes.
5.7.6. Chromatographie sur hydroxyapatite.
5.7.7. Chromatographie par chlation.
5.7.8. Chromatographie daffinit.
a) Le choix du ligand.
b) Choix de la matrice.
c) Choix du bras espaceur.
d) Couplage.
6. Dtermination de la puret de la protine isole.
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125
VIII - Dnaturation
126
1. Dnaturation et changements de conformation
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2. Dnaturation rversible ou irrversible.
126
3. Facteurs lorigine de la dnaturation irrversible.

3.1. La chaleur.
3.2. Le froid.
3.3. Les traitements mcaniques (hautes pressions, ultra-sons)
3.4. Le positionnement dune protine une interface.
3.5. Protolyse et autolyse.
3.6. Agents chimiques.
Acides, bases, mtaux divalents, agents chlatants, solvants organiques, ure, le dodcyl sulfate de sodium
127
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129
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4. Contrle et minimisation de la dnaturation.
130
Annexe : La maladie de la vache folle et la variante de la maladie de Creutzfldt-Jacob
9 pages

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Dpartement Sciences et Technologies des

BIOCHIMIE DES PROTEINES

Biochimie des protines Polytech STIA 1

1. Terminologie fonction de la composition.

Biochimie des protines Polytech STIA 1

2. Terminologie fonction de la conformation.

Biochimie des protines Polytech STIA 1

2.1. Les protines fibreuses.

Cheveu (microscope lectronique balayage)

Biochimie des protines Polytech STIA 1

- fibrone (ver soie).

2.2. Les protines globulaires.

Biochimie des protines Polytech STIA 1

3.Terminologie base sur la fonction.

Biochimie des protines Polytech STIA 1

tableau 1 . Classification des protines selon Osborne. S : soluble, I insoluble

5. Taille des molcules protiques.

Biochimie des protines Polytech STIA 1

II. PROTEINES - LES ACIDES AMINES CONSTITUTIFS

Proline et hydroxyproline ne rpondent pas cette structure gnrale.

3 - Valine, leucine, isoleucine.

Biochimie des protines Polytech STIA 1

Les acides amins soufrs

les alcools aminoacides

Les acides amins acides

Les acides amins aromatiques

Les acides amins basiques

figure 1. Structure des acides amins par rapport lalanine.

2.1.2. Chane latrale aromatique.

2.1.3. Chane latrale avec un atome de soufre.

Biochimie des protines Polytech STIA 1

2.2. Acides amins chane latrale polaire.

X et Y donneurs de liaisons hydrogne

2.2.2. Chane latrale polaire charge (ionisable).

Biochimie des protines Polytech STIA 1

3 . Acides amins rares ou occasionnels.

3.1. Acides -amins prsents dans quelques protines.

Abondante dans certaines protines comme le collagne.

Biochimie des protines Polytech STIA 1

4 - 3-mthyl-histidine, -N-mthyl-lysine et -N-trimthyl-lysine sont prsentes dans les protines

5 - La desmosine et lisodesmosine de llastine rsultant de la condensation de 4 rsidus lysyls.

3.2. Acides amins nentrant pas dans la composition de protines.

Biochimie des protines Polytech STIA 1

Il existe des dipeptides contenant de la -aminoalanine importants parmi lesquels :

alanylhistidine (carnosine) currentpoint

Prsents dans lurine, ils constituent de bons marqueurs de lalimentation carne.

HOOC (CH2)3 - CH - COOH

6 Thyroxine, hormone thyrodienne.

7 - Chloramphnicol et acide para aminosalicylique (PAS).

acide p-aminosalicylique currentpoint 192837465

NH2 - CH2 - CH2 - SO3H

Biochimie des protines Polytech STIA 1

Elle est prsente dans la chair decurrentpoint

NH3 + currentpoint 192837465

figure 2 . Les stroisomres dacides amins

Biochimie des protines Polytech STIA 1

D ALLO THRcurrentpoint 192837465

figure 3 . Les diastroismres dacides amins

figure 4 . Isomres optiques de la cystine

Biochimie des protines Polytech STIA 1

A 20C, ! = [ ! ] D pour LEU est

figure 6. Variation du pouvoir rotatoire d'acides amins en fonction du pH

5.4. Proprits spectrales.